우리는 프레드 허 친 슨 흐름 Cytometry 코어에 FACS에 앤드류 버거, 스테이 시 Dozono, 그리고 브라이언 라덴을 감사 하 고 싶습니다. 이 작품 보조 공동 그랜트 #HL099997, 그리고 NIDDK 부여 #RC2DK114777 #HL100395, 건강 NHLBI UO1의 국가 학회 교부 금에 의해 지원 되었다. 브랜든 Hadland 알렉스의 레모네이드 스탠드 재단 희망과 현대 바퀴 기초에 의해 지원 됩니다.

<ol>
	<li>Copley, M. R., Beer, P. A., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+heterogeneity+takes+center+stage.">Hematopoietic stem cell heterogeneity takes center stage.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 690-697 (2012).</li><li>Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origin+of+the+adult+hematopoietic+system:+advances+and+questions.">Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions.</a> Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).</li><li>Kumaravelu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+developmental+anatomy+of+definitive+haematopoietic+stem+cells/long-term+repopulating+units+(HSC/RUs):+role+of+the+aorta-gonad-mesonephros+(AGM)+region+and+the+yolk+sac+in+colonisation+of+the+mouse+embryonic+liver.">Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells/long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver.</a> Development. 129 (21), 4891-4899 (2002).</li><li>Taoudi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+hematopoietic+stem+cell+generation+in+the+AGM+region+via+maturation+of+VE-cadherin+CD45++pre-definitive+HSCs.">Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs.</a> Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).</li><li>Rybtsov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+organization+and+early+hematopoietic+specification+of+the+developing+HSC+lineage+in+the+AGM+region.">Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region.</a> J Exp Med. 208 (6), 1305-1315 (2011).</li><li>Rybtsov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+the+origin+of+the+HSC+hierarchy+reveals+an+SCF-dependent,+IL-3-independent+CD43(-)+embryonic+precursor.">Tracing the origin of the HSC hierarchy reveals an SCF-dependent, IL-3-independent CD43(-) embryonic precursor.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 489-501 (2014).</li><li>McGrath, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Sources+of+Hematopoietic+Progenitors+Emerge+before+HSCs+and+Provide+Functional+Blood+Cells+in+the+Mammalian+Embryo.">Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo.</a> Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).</li><li>Lin, Y., Yoder, M. C., Yoshimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid+progenitor+emergence+in+the+murine+embryo+and+yolk+sac+precedes+stem+cell+detection.">Lymphoid progenitor emergence in the murine embryo and yolk sac precedes stem cell detection.</a> Stem Cells Dev. 23 (11), 1168-1177 (2014).</li><li>Medvinsky, A., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitive+hematopoiesis+is+autonomously+initiated+by+the+AGM+region.">Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region.</a> Cell. 86 (6), 897-906 (1996).</li><li>Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+generation+of+reaggregated+organotypic+cultures+that+permits+juxtaposition+of+defined+cell+populations.">A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations.</a> Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).</li><li>Yoder, M. C., Hiatt, K., Mukherjee, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+repopulating+hematopoietic+stem+cells+are+present+in+the+murine+yolk+sac+at+day+9.0+postcoitus.">In vivo repopulating hematopoietic stem cells are present in the murine yolk sac at day 9.0 postcoitus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6776-6780 (1997).</li><li>Arora, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+developmental+stage+of+HSC+and+recipient+on+transplant+outcomes.">Effect of developmental stage of HSC and recipient on transplant outcomes.</a> Dev Cell. 29 (5), 621-628 (2014).</li><li>Butler, J. M., Rafii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+vascular+niche+for+studying+stem+cell+homeostasis.">Generation of a vascular niche for studying stem cell homeostasis.</a> Methods Mol Biol. 904, 221-233 (2012).</li><li>Butler, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+are+essential+for+the+self-renewal+and+repopulation+of+Notch-dependent+hematopoietic+stem+cells.">Endothelial cells are essential for the self-renewal and repopulation of Notch-dependent hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 6 (3), 251-264 (2010).</li><li>Kobayashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiocrine+factors+from+Akt-activated+endothelial+cells+balance+self-renewal+and+differentiation+of+haematopoietic+stem+cells.">Angiocrine factors from Akt-activated endothelial cells balance self-renewal and differentiation of haematopoietic stem cells.</a> Nat Cell Biol. 12 (11), 1046-1056 (2010).</li><li>Hadland, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium+and+NOTCH+specify+and+amplify+aorta-gonad-mesonephros-derived+hematopoietic+stem+cells.">Endothelium and NOTCH specify and amplify aorta-gonad-mesonephros-derived hematopoietic stem cells.</a> J Clin Invest. 125 (5), 2032-2045 (2015).</li><li>Hadland, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Common+Origin+for+B-1a+and+B-2+Lymphocytes+in+Clonal+Pre-+Hematopoietic+Stem+Cells.">A Common Origin for B-1a and B-2 Lymphocytes in Clonal Pre- Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1563-1572 (2017).</li><li>Wilson, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+Single-Cell+Functional+and+Gene+Expression+Analysis+Resolves+Heterogeneity+within+Stem+Cell+Populations.">Combined Single-Cell Functional and Gene Expression Analysis Resolves Heterogeneity within Stem Cell Populations.</a> Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).</li><li>Schulte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Index+sorting+resolves+heterogeneous+murine+hematopoietic+stem+cell+populations.">Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations.</a> Exp Hematol. 43 (9), 803-811 (2015).</li><li>Morgan, K., Kharas, M., Dzierzak, E., Gilliland, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+early+hematopoietic+stem+cells+from+murine+yolk+sac+and+AGM.">Isolation of early hematopoietic stem cells from murine yolk sac and AGM.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li><li>deBruijn, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+localize+to+the+endothelial+cell+layer+in+the+midgestation+mouse+aorta.">Hematopoietic stem cells localize to the endothelial cell layer in the midgestation mouse aorta.</a> Immunity. 16 (5), 673-683 (2002).</li><li>Lorsbach, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+RUNX1+in+adult+hematopoiesis:+analysis+of+RUNX1-IRES-GFP+knock-in+mice+reveals+differential+lineage+expression.">Role of RUNX1 in adult hematopoiesis: analysis of RUNX1-IRES-GFP knock-in mice reveals differential lineage expression.</a> Blood. 103 (7), 2522-2529 (2004).</li><li>Holmes, R., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+OP9-DL1+system:+generation+of+T-lymphocytes+from+embryonic+or+hematopoietic+stem+cells+in+vitro.">The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), pdb.prot5156 (2009).</li><li>Yoshimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+wave+of+B+lymphopoiesis+develops+independently+of+stem+cells+in+the+murine+embryo.">The first wave of B lymphopoiesis develops independently of stem cells in the murine embryo.</a> Ann N Y Acad Sci. 1362, 16-22 (2015).</li><li>Kobayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+B-1+progenitor+cells+are+present+in+the+hematopoietic+stem+cell-deficient+embryo+and+depend+on+Cbf&#946;+for+their+development.">Functional B-1 progenitor cells are present in the hematopoietic stem cell-deficient embryo and depend on Cbf&#946; for their development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12151-12156 (2014).</li><li>Yoshimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+murine+T-cell+progenitor+production+in+the+extra-embryonic+yolk+sac+before+HSC+emergence.">Autonomous murine T-cell progenitor production in the extra-embryonic yolk sac before HSC emergence.</a> Blood. 119 (24), 5706-5714 (2012).</li><li>Inlay, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+progenitors+that+emerge+prior+to+hematopoietic+stem+cells+in+embryonic+development.">Identification of multipotent progenitors that emerge prior to hematopoietic stem cells in embryonic development.</a> Stem Cell Reports. 2 (4), 457-472 (2014).</li><li>Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell-independent+hematopoiesis:+emergence+of+erythroid,+megakaryocyte,+and+myeloid+potential+in+the+mammalian+embryo.">Hematopoietic stem cell-independent hematopoiesis: emergence of erythroid, megakaryocyte, and myeloid potential in the mammalian embryo.</a> FEBS Lett. 590 (22), 3965-3974 (2016).</li></ol>

저자는 공개 없다.

배아 개발 HSC 창세기 연구 HSC hemogenic 선구자 아직 이식 성인 받는 사람의 장기 multilineage 조 혈 재구성을 제공 하기 위해 능력 부족에서 가능성을 감지 하는 수단을 필요로 합니다. 이 프로토콜에서 선물이 배아 hemogenic 선구자의 클론 분석 결과 혈관 틈새 ECs stromal 공동 문화 지원 HSC에 선구자의 성숙, AGM에서 이식 분석 실험에서 후속 기능 분석. 허가 정렬 하는 인덱스의 phenotypic 매개 변수 사전-HSC 표면 표식으로 정의 된 속성 특성의 회고전 분석 분석 결과에 포함 됩니다. 이 방법은 효율적인 잠재적인 표식에 대 한 검사 수 있도록 다시 aggregation 기반 HSC 분석 실험4,5,10, 전조 인구의 대량 정렬에 의존 하는 다른 방법에 비해 이점을 제공합니다 사전-HSC 각 개별 셀에 대 한 표면 마커 상대 식 수준에 대 한 정보를 제공 하는 동시에 하면서. 이 방법론을 사용 하 여, 예를 들어 우리가 이전에 보고 된, 개발의 다른 단계에서 사전-HSC 인구에 대 한 풍부 하 게 하는 EPCR 사용 하 여, 뿐만 아니라 중간 식 노치 ligand Dll4의 추가 정의 클론의 부분 모집단 잠재적인, Dll4 VE Cadherin+EPCR+ hemogenic 전 주로 부정적인 반면 HSC와 VE Cadherin+EPCR+ 선구자 HSC 잠재적인17부족.
이 방법의 또 다른 장점은 HSC 잠재력에 대 한 스크린 수는 표현 형으로 조 혈 자손의 검출에 따라 공동 문화 다음 즉시 (VE Cadherin-/Gr1--F4/80 CD45+Sca1 안녕하세요EPCR안녕하세요)는 장기, multilineage engraftment와 상관 된다. 이 이러한 식민지 이식 분석 실험에 장기 engraftment를 제공 하지 않습니다 부족이 HSC 표현 형으로 조 혈 자손 식민지를 이식 하는 필요가 없습니다. 또한, HSC 잠재력 공동 문화, 장기 engraftment 분석 실험에서 결과 기다릴 필요 없이 바로 다음 부족 hemogenic 선구자에서 잠재적인 사전-HSC를 구별 하는 초기 정보 유용, 등에서 빠르게 HSC-선구자의 후보 마커를 상영. 그러나, 다음 이식 장기 engraftment phenotypic 데이터의 상관 관계 추가 귀중 한 통찰력을 사전-HSC 클론의 정확한 engraftment 속성의 유사를 제공 합니다. 우리가 발견, 예를 들어 E9.5와 E11.5 사이의 P-Sp/관련해 지역에서 그 클론 중-HSC 독특한 잠재력이 있다 B1a와 B2-림프 톨, 둘 다에 게 상승 B1a 림프 구 잠재력은 성인 HSC17부족 한 반면. 또한, 우리 감지 진화 E9.5 사이의 E11.5 사전-HSC 클론의 engraftment 속성에서 이전 예약-HSC 강력한 자기 갱신 잠재력 기반 복 막 B1a 구절 B2-림프 구 engraftment 쪽으로 갈수록 상대 스큐 시연 2 차 이식에17분석 실험.
이 프로토콜은 클론 HSC 선구자의 독특한 속성을 명료 하 게 하는 귀중 한 접근을 제공 한다, 인정 해야 하는 몇 가지 제한이 있습니다. FACS AGM-EC 공동 문화를 다음에 의해 phenotypic HSC와 자손의 탐지는 일반적으로 장기 multilineage engraftment를 상관 하 고,이 표현 형으로 일부 식민지 단기 engraftment 또는 하나 이상의 engraftment 결핍만 제공 조 혈 모 계보 (그림 4B; 데이터 표시 되지 않음) 따라서, 이식 검증 기능 HSC 황금 표준 남아 있습니다. 또한, 그것은 배제할 수 없다는 engraftment 속성 사전-HSC의 차이의 일부를 복제, 보다는 오히려 hemogenic에 셀 본질적인 차이 반영 전조 가능성, AGM-EC 공동 문화 중 확률의 변화에서 발생할 수 있습니다. 자체-갱신 구절에서 차별화 의사 결정, 사전-HSC 동시에 HSC에 성숙 되며 세포 분열을 겪고. 사실,이 부분에서 식민지 형태학의 관찰된이 고 개별 사전-HSC 클론 (예를 들어, 그림 3A-C)에서 생성 하는 세포의 표현 형에 대 한 계정 수 있습니다. 그리고 여 사전-HSC의 과소에 발생할 수 있습니다. 이 분석 결과 하지 않을 경우 모든 잠재적인 사전-HSC 클론 기능 HSC AGM-EC 공동 문화를 다음 세대에 의해 검색 됩니다. 그러나이 방법으로 활성화 (Dll417) 같은 독특한 phenotypic 감 적의 그들의 차동 식으로 기능적으로 뚜렷한 hemogenic 클론을 구별할 수 있는 능력와 hemogenic 일어나 모집단을 식별 하는 수단을 제공 하는, 고유한 셀 본질적인 차이입니다.
이 기본 프로토콜에 건물, 다양 한 확장된 응용 프로그램 클론 hemogenic 선구자의 조 혈 잠재력 개발 과정 진학을 포함할 수 있습니다. 마커의 표면 식 형광 마커 유전자 변형 태아에서의 검출을 위한 항 체를 사용 하 여 넘어 (예., Ly6a-GFP21 또는 Runx1-GFP22 hemogenic 내 피/사전-HSC에서 표현) 될 수 있습니다 hemogenic 선구자의 인덱스 정렬에 대 한 통합. 이식 분석 putative 사전-HSC를 감지 하 AGM-EC 공동 문화에 따라, 뿐만 아니라 자손 또한 평가 될 수 있다 보조 생체 외에서 분석 실험, OP9 또는 OP9 Dl1 B 및 T 세포를 감지 하는 문화 등에 따라 조 혈 혈통 잠재력에 대 한 잠재적인23또는 clonogenic 식민지 erythromyeloid 가능성을 감지 하는 스에 분석 실험을 형성. 사실, 일부 비-HSC hemogenic 클론 (예를 들어, 그림 3D)의 가능성이 multipotent 창시자, erythromyeloid 창시자, 또는 T 및 B 세포 창시자 이전 앞 고 HSC 개발의 독립을 설명 8 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28, 그리고이 분석 결과 조 혈 선구자의 이러한 뚜렷한 파도의 클론 연구 촉진 추가 수 있습니다. 마지막으로, 사전-HSC의 인덱스 정렬 단일 셀 RNA 시퀀싱, HSC 선구자 개발의 글로벌 transcriptional 프로필 phenotypic 속성을 연결할 같은 다른 다운스트림 분석 결합할 수 있습니다. 전부,이 프로토콜 HSC 개발에 대 한 새로운 통찰력을 제공 한다 미 발달 hemogenic 선구자에서 클론 조의 강력한 분석에 대 한 메서드를 제공 합니다.

클론 연구 노화1동안 HSC 하위 및 HSC 행동의 변화에 새로운 통찰력을 제공 하는 성인 HSCs의 장기 engraftment 속성에서이 밝혀졌다. 그러나, 배아 HSCs의 비슷한 연구와 그들의 선구자 되었습니다 더 많은 도전. HSCs 과도 과정에서 내 피 hemogenic 라고 알려진 선구자의 인구에서 발생 하는 초기 배아 개발 중으로 조 혈 전환2내 피. 강력 하 고, 장기 이식 조건된 성인 받는 사람에 따라 multilineage engraftment를 제공 하는 그들의 능력에 의해 정의 된 첫 번째 HSC 배아 이날 10.5 (E10.5) murine 태아에 매우 낮은 주파수3 이후까지 검색 되지 않습니다. . 그들의 발전 동안 3300 HSC (pre-HSC) hemogenic 피에서 발생 하는 이식 분석 실험4,5 에서 효율적인 engraftment 허용 성인 HSC의 속성을 획득 하기 전에 성숙 겪어야 한다 , 6. 희귀 HSC 기원, 다양 한 erythroid와 조 혈 창시자의 연구를 왜곡 골수성, 림프 잠재력 사전-HSC7,8에서 HSC의 출현 전에 이미 감지는. 따라서, 다른 조 혈 창시자에서 사전-HSC 구별 방법 clonally 세포를 분리 하 여 이식 분석 실험에서 engraftment 속성을 검색 하기 위해 HSC에 그들의 성숙에 대 한 충분 한 신호를 제공 필요 합니다.
다양 한 접근 HSC에 비보 전 또는 vivo에서 성숙 하 여 사전-HSC의 검출을 허용 하는 기술 되었다. 방법을 ex vivo는 첫 번째 HSC 개발9에서 감지 되는 AGM 지역과 같은 배아 조직의 문화에 달려 있었다. 이 방법, 분리, 통합 하는 프로토콜에 정렬, AGM 조직의 재 집계는 허용 파라 대동맥에 E11.5 E9.5에서 개발 하는 동안 HSC 선구자를 포함 하는 정렬 된 인구의 특성 splanchnopleura (P-Sp) / 관련해 지역4,,510; 그러나, 이러한 방법 클론 분석에 필요한 단일 세포 수준에서 일어나 높은 처리량 분석에 순종 하지 않습니다. 마찬가지로, 신생아 쥐에 이식 하 여 성숙 vivo에서 어디는 microenvironment HSC 선구자의 초기 단계 지원을 위해 더 적합 한 것으로 추정 되는 또한 활성화 노른자위 sac 및 AGM에서 정렬 된 인구의 연구 / P-Sp (P-Sp는 AGM에 선구자 지역) 사전-HSC, 하지만이 방법의 특성을 가진 또한 단일에 대 한 강력한 플랫폼을 제공 하는 실패 세포 분석11,12.
Rafii 외 에서 연구 보여주었다 그 내 피 세포 Akt 활성화 (EC) 기질 성인 HSC 자체 갱신 생체 외에서13,,1415의 지원에 대 한 틈새 기질을 제공할 수 있습니다. 우리는 최근 Akt 활성화 EC 관련해 지역 (AGM-EC)에서 파생 된 hemogenic 선구자, E9 성인 engrafting HSC 개발에서 뿐만 아니라 후속 빠르면 절연의 성숙에 대 한 적합 한 생체 외에서 틈새를 제공 한다 결정 생성 된 HSC16의 자체 갱신. 감안할 때이 시스템 사용 간단한 2 차원 공동 문화, 그것은 개별적으로 고립 된 hemogenic 선구자의 HSC 잠재력의 클론 분석을 위해 쉽게 적응.
우리는 최근 클론 hemogenic 선구자의 HSC 잠재력 AGM-EC 공동 문화 및 이식에서 이후의 기능 분석 murine 배아에서 개별 hemogenic 선구자의 인덱스 정렬 결합 하 여 분석 결과에 대 한 접근을 보고 17분석 실험. 인덱스 정렬 세포 형광 활성화의 모드 phenotypic의 모든 매개 변수 (즉, 앞으로 분산형 (FSC-A), 측면 살포 (SSC-A), 형광 매개 변수) 각 개별적으로 정렬된 셀 같은 정렬 (FACS) (인덱스)를 기록 하는이 기능 소급 정렬 다음 후속 기능적 분석 상관 될 수 있다. FACS 소프트웨어 위치/잘 두었다는 96 잘 접시의 각 셀에 대 한 두 phenotypic 정보를 기록 합니다. 이 기술은 이전 우아하게 사용 되었습니다 성인 HSC에서이 확인, 추가 HSC, 장기 engrafting 하위 집합에 대 한 풍부 하 고 연관 HSC의 phenotypic 매개 변수 transcriptional phenotypic 매개 변수 결정 단일 속성 셀 레벨18,19. 여기, 우리는 배아 개발의 초기 단계 동안 독특한 phenotypic 매개 변수 식별 및 사전-HSC의 혈통 기여를 가능 하 게이 방법의 상세한 방법론을 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;AGM-EC culture media &lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials for culture of endothelial cells&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td>Use to dissociate AGM-EC monolayers</td></tr><tr><td>Gelatin 0.1% in water</td><td>StemCell Technologies</td><td>7903</td><td>Use to adhere AGM-EC monolayers to plastic</td></tr><tr><td>96-well tissue culture plates</td><td>Corning</td><td>3599</td><td>Use to co-culture AGM-EC monolayers and index sorted clones</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Use for dissection and FACS staining</td></tr><tr><td>500 ml filter bottles</td><td>Fisher Scientific</td><td>9741202</td><td>Use to sterile filter Endothelial media</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;AGM-EC culture media (500 mls)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iscove&#039;s Modified Dulbecco&#039;s Medium (IMDM)</td><td>Gibco</td><td>12440-053</td><td>400 mls</td></tr><tr><td>Hyclone Fetal Bovine Serum</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30088.03</td><td>100 mls</td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>5 mls</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td>50 mg dissolved in 10 mls media</td></tr><tr><td>L-glutamine (200 mM)</td><td>StemCell Technologies</td><td>7100</td><td>5 mls</td></tr><tr><td>Endothelial Mitogen (ECGS)</td><td>Alfa Aesar</td><td>J64516 (BT-203)</td><td>Add 10 mls media to dissolve and add</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials for AGM index sort&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase (0.25%)</td><td>StemCell Technologies</td><td>7902</td><td>Use for dissociation of embryonic tissues</td></tr><tr><td>3ml syringe</td><td>BD Biosciences</td><td>309657</td><td>Use to sterile filter antibody solutions for FACS</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;M syringe-driven filter</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td>Use to sterile filter antibody solutions for FACS</td></tr><tr><td>5 ml polystyrene tube with cell-strainer cap</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>Use to remove cell clumps prior to FACS</td></tr><tr><td>DAPI (prepared as 1 mg/ml stock in H2O)</td><td>Millipore</td><td>268298</td><td>Use to exclude dead cells from sort</td></tr><tr><td>anti-mouse CD16/CD32 (FcR block)</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td>Use to block non-specific staining to Fc receptors</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibodies for AGM index sort&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7</td><td>eBioscience</td><td>25-1441-82</td><td>Staining</td></tr><tr><td>Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE-Cyanine7</td><td>eBioscience</td><td>25-4301-81</td><td>Isotype control for CD144 PE-Cyanine7</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710</td><td>eBioscience</td><td>46-2012-80</td><td>Staining</td></tr><tr><td>Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP-eFlour710</td><td>eBioscience</td><td>46-4031-80</td><td>Isotype control for CD201 PerCP-eFluor710</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD41 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>558040</td><td>Staining</td></tr><tr><td>Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE</td><td>BD Biosciences</td><td>553925</td><td>Isotype control for CD41 PE</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45 FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-85</td><td>Staining</td></tr><tr><td>Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4031-81</td><td>Isotype control for CD45 FITC</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;AGM-serum free media (10mls)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-Vivo 20</td><td>Lonza</td><td>04-448Q</td><td>10 mls</td></tr><tr><td>recombinant murine stem cell factor (SCF)</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td>10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml</td></tr><tr><td>recombinant human FLT3 Ligand (FLT3L)</td><td>Peprotech</td><td>300-19</td><td>10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml</td></tr><tr><td>recombinant human thrombopoietin (TPO)</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td>2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml</td></tr><tr><td>recombinant murine interleukin-3 (IL3)</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td>2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials for Staining co-cultured cells&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 well plate, V-bottom</td><td>Corning</td><td>3894</td><td>Use for FACS analysis</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibodies for analysis of Index sorted clones co-cultured with endothelial cells&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-0451-82</td><td>Staining</td></tr><tr><td>Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE-Cyanine5.5</td><td>eBioscience</td><td>35-4031-80</td><td>Isotype control for CD45 PerCP-Cyanine5.5</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD201 (EPCR) PE</td><td>eBioscience</td><td>12-2012-82</td><td>Staining</td></tr><tr><td>Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4031-81</td><td>Isotype control for CD201 PE</td></tr><tr><td>Anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) APC</td><td>eBioscience</td><td>17-5981-83</td><td>Staining</td></tr><tr><td>Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC</td><td>eBioscience</td><td>17-4321-81</td><td>Isotype control for Ly-6A/E APC</td></tr><tr><td>Anti-mouse F4/80 FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4801-81</td><td>Staining</td></tr><tr><td>Rat IgG2a kappa Isotype Control, FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4321-41</td><td>Isotype control for F4/80 FITC</td></tr><tr><td>Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>553127</td><td>Staining</td></tr><tr><td>Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>556923</td><td>Isotype control for Ly-6G/C and CD3 FITC</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials for tail vein injection for transplant&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1/2 ml insulin syringes with 29G 1/2&quot; needles</td><td>BD Biosciences</td><td>309306</td><td>Use for tail vein injection for transplantation</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibodies for Peripheral Blood analysis following translant&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP</td><td>Biolegend</td><td>108426</td><td>Staining</td></tr><tr><td>Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP</td><td>Biolegend</td><td>400629</td><td>Isotype control for Ly-6G/C PerCP</td></tr><tr><td>Anti-mouse F4/80 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4801-82</td><td>Staining</td></tr><tr><td>Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4321-80</td><td>Isotype control for F4/80 PE</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD3 FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555274</td><td>Staining</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD19 APC</td><td>BD Biosciences</td><td>550992</td><td>Staining</td></tr><tr><td>Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC</td><td>BD Biosciences</td><td>553932</td><td>Isotype control for CD19 APC</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45.1 (A20) PE-Cyanine7</td><td>eBioscience</td><td>25-0453-82</td><td>Staining</td></tr><tr><td>Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7</td><td>eBioscience</td><td>25-4321-81</td><td>Isotype control for CD45.1 PE-Cyanine7</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45.2 (104) APC-eFluor780</td><td>eBioscience</td><td>47-0454-82</td><td>Staining</td></tr><tr><td>Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC-eFluor780</td><td>eBioscience</td><td>47-4321-80</td><td>Isotype control for CD45.2 APC-eFluor780</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II with DIVA software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II with plate reader</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Haemocytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17040</td><td>For counting cells</td></tr><tr><td>Multi-channel pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-559-417</td><td>For dispensing cells</td></tr><tr><td>FACS analysis software</td><td>FlowJo/BD Biosciences</td><td></td><td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td></tr></tbody></table>

clonal analysis of embryonic hematopoietic stem cell precursors using single cell index sorting combined with endothelial cell niche co-culture

배아 개발 하는 동안 조 혈 줄기 세포 (HSC) 창세기를 공부 하는 능력은 초기 배아에 HSC 선구자의 희귀 한 고 기능의 장기 multilineage engraftment 잠재력을 식별 하는 분석 실험의 부족에 의해 제한 되어 개별 putative HSC 선구자입니다. 여기, 우리가 격리와 단일 세포 수준에서 기능적으로 검증된 HSC 선구자의 방법론을 설명 합니다. 첫째, 우리 활용 개별적으로 정렬 된 각 셀의 정확한 phenotypic 매개 변수 카탈로그 인덱스 정렬 phenotypic 감 적의 조합 실험 분석에 대 한 추가 마커 HSC 선구자에 대 한 풍부 하 게 사용 하 여. 둘째, 각 인덱스 정렬 셀이 공동 지 원하는 multilineage, 장기 engraftment에서 가능성과 기능성 HSC에 HSC 선구자 비 engrafting의 성숙 대동맥-생식-mesonephros (AGM) 지역에서 혈관 틈새 기질과 교양 이식 분석 실험입니다. 이 방법을 수 있도록 그들의 기능적인 engraftment 잠재력 클론 hemogenic 선구자의 phenotypic 속성 또는 HSC 전조의 상세한 분석을 위한 수단을 제공 하는 transcriptional 프로필 등의 다른 속성의 상관 관계 단일 세포 수준에서 개발입니다.

그림 1A 는 실험적인 디자인의 회로도 보여준다. P-Sp/관련해 조직 해 부, 풀링, 그리고 콜라에 해리, 일단 그들은 인덱스 정렬에 대 한 VE Cadherin와 EPCR 항 체와 얼룩이 있습니다. 사전-HSC VE Cadherin+EPCR높은 (그림 1B)에 정렬 셀 농축 됩니다. 다른 형광 색소 활용 된 항 체는 소급 인덱스 정렬 하는 동안 각 셀에 대 한 기록 되는 추가 phenotypic 매개 변수를 분석에 포함 될 수 있습니다. E11 AGM에서 대표적인 실험에서 세포는 또한 FITC 활용 된 안티-CD45와 안티-CD41 PE 활용 된 항 체 얼룩이 진다. 이러한 조 혈 특정 표식에 대 한 VE Cadherin+EPCR높은 인구 내의 (그림 1C), 관찰이 단계5에서 조 혈 모 개발에 알려진된 비동기와 일치.
인덱스는 개별 96-웰 스에 단일 VE Cadherin+EPCR높은 관련해 셀의 정렬에 따라 포함 AGM-EC 관련해 혈 청 무료 미디어 및 cytokines, 식민지 형성에서 발생 합니다. 처음에, 정렬된 VE Cadherin+EPCR높은 관련해 셀에 통합 관련해 EC 레이어 모아 조 혈 클러스터 (그림 2A, GFP를 표현 하는 유전자 변형 murine 배아에서 정렬 셀에서 여기에 표시 된 형성을 시작 하기 전에 아래는 Ly6a 발기인21, AGM-EC 기질을 구분 하기 위해). 5-7 일 후 공동 문화, 다양 한 크기와 형태학의 식민지는 대표적인 실험, 6 일 E11 AGM에서 정렬에서 여기에 표시 된 (그림 2B), 거꾸로 현미경으로 검사 하 여 검색할 수 있습니다.
FACS에 의해 다음, phenotypic 분석 조 혈 식민지를 형성 하고있다 각 VE Cadherin+EPCR높은 세포의 자손의 절반에 수행 됩니다. 식민지 HSC 표현 형을 가진 세포를 포함 하는 VE Cadherin 됨으로-/Gr1--F4/80 CD45+Sca1안녕하세요EPCR안녕 (그림 3). 여기, 우리가 다음 취득의 다른 식민지 4 개 공동 인덱스 정렬 E11 관련해 VE-Cadherin+EPCR높은 셀, 3 다른 분화 세포 유형 (그림 3A와 phenotypic HSC의 다른 비율을 포함의 문화 보기 -C), 4 부족 HSC 표현 형 (그림 3D)와 셀. 도금 하는 전지와 백분율 귀착되 었 다 engraftable 줄기 세포 식민지의 수를 관찰 하는 식민지의 수 배아 나이 및 수행 하는 정렬에 따라 다릅니다. VE Cadherin-/Gr1--F4/80 CD45+Sca1안녕하세요EPCR안녕하세요 E11 관련해 클론 5% ± 1.3 %192 오래 engrafted 그 복제 생성 하는 도금 도금 192 세포에서 생성 된 53 ± 15 식민지 기간 (평균 ± SD 3 실험).
와 상관 관계를 표현 형 engraftment 잠재적인, HSC 형 FACS에 의해 감지와 셀 나머지 절반을 포함 하는 조 혈 식민지 형성은 각 VE Cadherin+EPCR높은 셀의 자손 (예를 들어는 그림 3A-C에서 식민지) B6 CD45.1 골 수에서 구조 셀의 복용량 함께 조사 (1000 cGy) 성인 congenic 긴장 (B6 CD45.1) 쥐에 이식. 장기 multilineage engraftment 골수성 (Gr1 및 f 4/80), 기증자 (CD45.2) 기여에 따라 각 복제에 대 한 확인은 B 셀 (CD19), 및 (그림 4A) 동안 말 초 혈액의 T-세포 (CD3) 구획. HSC 형 FACS에 의해 감지 된 셀을 포함 하는 대부분 식민지 장기 engraftment 제공, 이식 서 일부 클론 (그림 4B), 시간이 지남에 engraftment 잃거나 표시 기능 multilineage engraftment를 확인할 필요는 림프 바이어스 engraftment (데이터 표시 되지 않음) 같은 독특한 engraftment 속성입니다. 각 VE Cadherin+EPCR높은 복제의 기능 HSC 잠재력 결정 되 면이 다시 그 클론의 인덱스의 정확한 phenotypic 특성을 식별 하는 매개 변수를 정렬에 상관 된다. 이 예제에서 우리는 기능 확인 사전-HSC 클론 (빨간 점) CD41 CD45, HSC (그림 4C)를 사전-HSC 성숙 하는 동안 이러한 마커 설립된 동적 표현 일치의 그들의 표정에서 이기종 참조. 클론 phenotypic 심사 또는 장기의 부재 하거나 부족 HSC 잠재력을 하지만 조 혈 식민지를 형성, 이식 (비 HSC hemogenic 클론, 파란색 점) 다음 multilineage engraftment이 있습니다 CD41 및 CD45, 이기종 비록 일부 표현 CD41의 상부 주로 CD41낮은pre-HSC 클론과 비교 합니다. (비 hemogenic 클론, 밝은 녹색 점) 조 혈 모 식민지를 형성 하지 않았다 클론은 주로 CD41-/CD45-는 아마 비 hemogenic VE Cadherin+EPCR높은 내 피 세포를 반영.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56973/56973fig1.jpg"> 그림 1: 프로토콜 개요 및 인덱스의 정렬에 대 한 대표적인 흐름 cytometry 분석 단일 셀. (A) 프로토콜의 도식 적인 표현입니다. (B) 흐름 끊된 E11 AGM의 cytometry 분석 세포 VE Cadherin+EPCR높은 셀 사전-HSC (FACS 분석 소프트웨어로 분석)에 대 한 농축의 인덱스 정렬에 대 한 표시 제어 전략. 각 게이트에서 번호 셀의 비율을 나타냅니다. (C) Flow cytometry 분석 보여주는 CD41 CD45 VE Cadherin+EPCR높은 인구 내의 얼룩. <a href="/files/ftp_upload/56973/56973fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56973/56973fig2.jpg"> 그림 2: AGM-EC 공동 문화 중 조 혈 식민지의 형성. VE-Cadherin+EPCR Ly6a-GFP 유전자 변형 태아21 관련해 적에 공동 경작에서높은GFP+ 정렬 셀 (A) 시간 경과 영상 µ M에서 눈금 막대는 각 이미지의 왼쪽 아래에에서 표시 됩니다. (B) 대표적인 식민지에서에서 형성 VE Cadherin+EPCR높은 인덱스 정렬 단일 셀 후 6 일 공동 관련해 적에 문화 <a href="/files/ftp_upload/56973/56973fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56973/56973fig3.jpg"> 그림 3: 흐름 관련해 적에 공동 문화를 다음 단일 E11 관련해 파생 VE-Cadherin+EPCR높은 세포의 자손의 cytometry 분석 VE Cadherin은 하위 집합으로 표시 됩니다 HSC 잠재력 셀 게이팅-/Gr1-F4/80- (왼쪽된 패널), CD45+ (중간 패널), 및 Sca1안녕하세요EPCR안녕 (오른쪽 패널). (A) 대표적인 식민지 HSC 표현 형을 가진 세포의 균질 인구의 구성. (CB-) HSC 형와 더 차별화 된 셀 형식 셀의 혼합을 포함 하는 대표적인 식민지. (D) 대표적인 식민지 부족 HSC 표현 형 세포로 구성 된. <a href="/files/ftp_upload/56973/56973fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56973/56973fig4.jpg"> 그림 4: 매개 변수를 정렬 하는 인덱스와 관련해 EC 공동 문화 및 상관 관계에 따라 개별 클론의 자손의 주변 혈액 engraftment 분석. (A) 주변 혈액 기증자 CD45.2 파생 engraftment 골수성 (Gr1와 f 4/80), B-세포 (CD19), 및 T-세포 (CD3) 하위 집합 대표 받는 (B6 CD45.1)와 자손의 개별 E11 VE-Cadherin+EPCR높은 이식 복제 AGM-EC 공동 문화에 따라. (B) 주변 혈액 기증자 CD45.2 파생 engraftment AGM-EC 공동 문화에 따라 개별 E11 VE Cadherin+EPCR높은 클론의 자손의 이식 후 시간이 지남에. (C) CD41 상관 관계 및 CD45 식 각 인덱스 정렬 VE Cadherin+EPCR높은 대 한 장기, multilineage engraftment 이식 분석 결과에서 기반으로 다음 AGM-EC 공동 문화 HSC 잠재력과 클론. <a href="/files/ftp_upload/56973/56973fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

단일 셀 인덱스 정렬 내 피 세포 틈새 공동 문화 결합을 사용 하 여 배아 조 혈 줄기 세포 선구자의 클론 분석

여기 우리 murine 배아 개발 하는 동안 조 혈 줄기 세포 선구자의 클론 분석을 위한 방법론을 제시. 우리는 내 피 세포 공동 문화 및 phenotypic 속성 및 단일 조 혈 일어나 engraftment 잠재력 하 이식 배아 대동맥-생식-mesonephros 지역에서 단일 셀의 인덱스 정렬 결합.

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

clonal-analysis-embryonic-hematopoietic-stem-cell-precursors-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.5K 조회수.  Fred Hutchinson Cancer Research Center. 여기 우리 murine 배아 개발 하는 동안 조 혈 줄기 세포 선구자의 클론 분석을 위한 방법론을 제시. 우리는 내 피 세포 공동 문화 및 phenotypic 속성 및 단일 조 혈 일어나 engraftment 잠재력 하 이식 배아 대동맥-생식-mesonephros 지역에서 단일 셀의 인덱스 정렬 결합.

비디오: Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

쥐 배아 Hemogenic 내피 세포의 분리

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

연구

발생학

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is inherently a single-cell assay, however prior to molecular analysis, the target cells are often prospectively isolated in bulk, thereby losing single-cell resolution. Single-cell gene expression analysis provides a means to understand molecular differences between individual cells in heterogeneous cell populations. In bulk cell analysis an overrepresentation of a distinct cell type results in biases and occlusions of signals from rare cells with biological importance. By utilizing FACS index sorting coupled to single-cell gene expression analysis, populations can be investigated without the loss of single-cell resolution while cells with intermediate cell surface marker expression are also captured, enabling evaluation of the relevance of continuous surface marker expression. Here, we describe an approach that combines single-cell reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) and FACS index sorting to simultaneously characterize the molecular and immunophenotypic heterogeneity within cell populations.
In contrast to single-cell RNA sequencing methods, the use of qPCR with specific target amplification allows for robust measurements of low-abundance transcripts with fewer dropouts, while it is not confounded by issues related to cell-to-cell variations in read depth. Moreover, by directly index-sorting single-cells into lysis buffer this method, allows for cDNA synthesis and specific target pre-amplification to be performed in one step as well as for correlation of subsequently derived molecular signatures with cell surface marker expression. The described approach has been developed to investigate hematopoietic single-cells, but have also been used successfully on other cell types.
In conclusion, the approach described herein allows for sensitive measurement of mRNA expression for a panel of pre-selected genes with the possibility to develop protocols for subsequent prospective isolation of molecularly distinct subpopulations.

Bulk gene expression measurements cloud individual cell differences in heterogeneous cell populations. Here, we describe a protocol for how single-cell gene expression analysis and index sorting by Florescence Activated Cell Sorting (FACS) can be combined to delineate heterogeneity and immunophenotypically characterize molecularly distinct cell populations.

분자 특성 조합 단일 셀 접근 및 인간의 줄기 및 조상 인구 Immunophenotypic이

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

유전학

Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM

In the mouse embryo, early hematopoiesis occurs simultaneously in multiple organs, which includes the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region. These regions are crucial in establishing the blood system in the embryos and leads to the eventual movement of stem cells into the fetal liver and then development of adult stem cells in the bonemarrow. Early hematopoietic stem cells can be isolated from these organs through microdissection of the embryo followed by flow cytometric sorting to obtain a more pure population. It remains unclear how these stem cell populations contribute to the fetal and adult stem cell pool.   Also, our lab investigates how early stem cells functionally differ from fetal and adult hematopoietic stem cells. Furthermore, our lab sorts different populations of hematopoietic stem cells and test their functional role in the context of a variety of genetic models. In this video, we demonstrate the micro-dissection procedure we commonly use and also show the results of a typical FACS plotfter isolating these rare populations, it is possible to perform a variety of functional assays including: colony assays and bone marrow transplants. 



This video shows how to micro-dissect the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region from embryos and use flow cytometry to sort hematopoietic stem cells.

Murine 난황과 AGM에서 조기 조혈 줄기 세포의 분리

In the mouse embryo, early hematopoiesis occurs simultaneously in multiple organs, which includes the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region. These ...

생물학

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous transplants to treat hematological and malignant disorders. Hemogenic endothelium (HE) is an amenable platform to produce functional HSPCs by transcription factors or to induce lymphocytes in a robust manner. However, current methods to derive HE are either costly or variable in yield. In this protocol, we established a cost-effective and precise method to derive HE within 4 days in a feeder- and xeno-free defined condition. The resultant HE underwent an endothelial-to-hematopoietic transition and produced CD34+CD45+ clonogenic hematopoietic progenitors. The potential capacity of our platform for generating functional HSPCs will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Here, we present a protocol to precisely form hemogenic endothelium from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free condition. This method will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

피더 및 제노 프리 정의 상태에서 인간 다능성 줄기 세포에서 혈생 내피 분화

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...

Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial cells, which line blood vessel lumens, from human pluripotent stem cells is crucial for a multitude of tissue engineering and regeneration applications. In vivo, primordial endothelial cells are derived from the mesodermal lineage and are specified toward specific subtypes, including arterial, venous, capillary, hemogenic, and lymphatic. Hemogenic endothelial cells are of particular interest because, during development, they give rise to hematopoietic stem and progenitor cells, which then generate all blood lineages throughout life. Thus, creating a system to generate hemogenic endothelial cells in vitro would provide an opportunity to study endothelial-to-hematopoietic transition, and may lead to ex vivo production of human blood products and reduced reliance on human donors. While several protocols exist for the derivation of progenitor and primordial endothelial cells, generation of well-characterized hemogenic endothelial cells from human stem cells has not been described. Here, a method for the derivation of hemogenic endothelial cells from human embryonic stem cells in approximately 1 week is presented: a differentiation protocol with primitive streak cells formed in response to GSK3&#946; inhibitor (CHIR99021), then mesoderm lineage induction mediated by bFGF, followed by primordial endothelial cell development promoted by BMP4 and VEGF-A, and finally hemogenic endothelial cell specification induced by retinoic acid. This protocol yields a well-defined population of hemogenic endothelial cells that can be used to further understand their molecular regulation and endothelial-to-hematopoietic transition, which has the potential to be applied to downstream therapeutic applications.

Presented here is a simple protocol for the directed differentiation of hemogenic endothelial cells from human pluripotent stem cells in approximately 1 week.

인간 만능 줄기 세포로부터 혈구 내피 세포의 유도 분화

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

종양 특이 내피 세포의 분리 및 문화 확장

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

의학

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Few techniques can assess phenotype and fate for the same cell simultaneously. Most of the current protocols used to characterize phenotype, although able to generate large datasets, necessitate the destruction of the cell of interest, making it impossible to assess its functional fate. Heterogeneous biological differentiating systems like hematopoiesis are therefore difficult to describe. Building on cell division tracking dyes, we further developed a protocol to simultaneously determine kinship, division number, and differentiation status for many single hematopoietic progenitors. This protocol allows the assessment of the ex vivo differentiation potential of murine and human hematopoietic progenitors, isolated from various biological sources. Moreover, as it is based on flow cytometry and a limited number of reagents, it can quickly generate a large amount of data, at the single-cell level, in a relatively inexpensive manner. We also provide the analytical pipeline for single-cell analysis, combined with a robust statistical framework. As this protocol allows the linking of cell division and differentiation at the single-cell level, it can be used to quantitatively assess symmetric and asymmetric fate commitment, the balance between self-renewal and differentiation, and the number of divisions for a given commitment fate. Altogether, this protocol can be used in experimental designs aiming to unravel the biological differences between hematopoietic progenitors, from a single-cell perspective.

Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Presented here is a flow cytometry-based technique that allows for simultaneously measuring the number of cell divisions, surface cell phenotype, and cellular kinship. Those properties can be tested statistically using a permutation-based framework.

조혈 줄기 및 전구 세포에 대한 유세포 분석을 통한 친족, 분열 수 및 표현형의 동시 평가

Few techniques can assess phenotype and fate for the same cell simultaneously. Most of the current protocols used to characterize phenotype, although able ...

면역학 및 감염병학

Flow Cytometry Analysis of Murine Bone Marrow Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and Stromal Niche Cells

The bone marrow (BM) is the soft tissue found within bones where hematopoiesis, the process by which new blood cells are generated, primarily occurs. As such, it contains hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs), as well as supporting stromal cells that contribute to the maintenance and regulation of HSPCs. Hematological and other BM disorders disrupt hematopoiesis by affecting hematopoietic cells directly and/or through the alteration of the BM niche. Here, we describe a method to study hematopoiesis in health and malignancy through the phenotypic analysis of murine BM HSPCs and stromal niche populations by flow cytometry. Our method details the required steps to enrich BM cells in endosteal and central BM fractions, as well as the appropriate gating strategies to identify the two key niche cell types involved in HSPC regulation, endothelial cells and mesenchymal stem cells. The phenotypic analysis proposed here may be combined with mouse mutants, disease models, and functional assays to characterize the HSPC compartment and its niche.

Here, we describe a simple protocol for the isolation and staining of murine bone marrow cells to phenotype hemopoietic stem and progenitor cells along with the supporting niche endothelial and mesenchymal stem cells. A method to enrich cells located in endosteal and central bone marrow areas is also included.

The bone marrow (BM) is the soft tissue found within bones where hematopoiesis, the process by which new blood cells are generated, primarily occurs. As ...

인간 중간엽 줄기 세포의 형광 활성화 단일 세포 분류

Single-Cell Sorting of Immunophenotyped Mesenchymal Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous Teeth

The mesenchymal stem cells (MSCs) of an organism possess an extraordinary capacity to differentiate into multiple lineages of adult cells in the body and are known for their immunomodulatory and anti-inflammatory properties. The use of these stem cells is a boon to the field of regenerative biology, but at the same time, a bane to regenerative medicine and therapeutics owing to the multiple cellular ambiguities associated with them. These ambiguities may arise from the diversity in the source of these stem cells and from their in vitro growth conditions, both of which reflect upon their functional heterogeneity.
This warrants methodologies to provide purified, homogeneous populations of MSCs&#160;for therapeutic applications. Advances in the field of flow cytometry have enabled the detection of single-cell populations using a multiparametric approach. This protocol outlines a way to identify and purify&#160;stem cells from&#160;human exfoliated deciduous teeth (SHEDs) through fluorescence-assisted single-cell sorting. Simultaneous expression of surface markers, namely, CD90-fluorescein isothiocyanate (FITC), CD73-peridinin-chlorophyll-protein (PerCP-Cy5.5), CD105-allophycocyanin (APC), and CD44-V450, identified the &#34;bright,&#34; positive-expressors of MSCs&#160;using multiparametric&#160;flow cytometry. However, a significant drop was observed in percentages of quadruple expressors of these positive markers from passage 7 onwards to the later passages.
The immunophenotyped subpopulations were sorted using the single-cell sort mode where only two positive and one negative marker constituted the inclusion criteria. This methodology ensured the cell viability of the sorted populations and maintained cell proliferation post sorting. The downstream application for such sorting can be used to evaluate lineage-specific differentiation for the gated subpopulations. This approach can be applied to other single-cell systems to improve isolation conditions and for acquiring multiple cell surface marker information.

저자 스포트라이트: 중간엽 줄기 세포의 정제된 집단을 분리하는 데 있어 단일 세포 분류의 중요성 

This protocol describes the use of fluorescence-activated cell sorting of human mesenchymal stem cells using the single-cell sorting method. Specifically, the use of single-cell sorting can achieve 99% purity of the immunophenotyped cells from a heterogeneous population when combined with a multiparametric flow cytometry-based approach.

인간 박리 낙엽 치아에서 면역 표현형 중간엽 줄기 세포의 단일 세포 분류

The mesenchymal stem cells (MSCs) of an organism possess an extraordinary capacity to differentiate into multiple lineages of adult cells in the body and ...