우리는 마커 스 코일, Curtis Gumbs, 시퀀싱 지원에 대 한 MDACC에서 SMF 핵심을 감사합니다. 이 문서에서 설명 하는 작업 SMF 코어 NIH 그랜트 (CA016672)에서 교부 금에 의해 지원 되었다와 NCI K. R. (1K99CA160578 및 R00CA160578) 수상

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저자 없음 충돌 선언합니다.

이 프로토콜 chromatin 주에서 인간의 종양 조직 및 세포의 게놈 넓은 매핑 위한 완전 하 고 포괄적인 높은 처리량 칩 seq 모듈을 설명합니다. 어떤 칩 seq 프로토콜에서 가장 중요 한 단계 중 하나는 항 체 특이성입니다. 여기,이 메서드는 설명된 6 히스톤 수정, 모두 칩 등급 및 이전에 우리와 다른 실험실42,,4445 에 검증에 대 한 immunoprecipitation 조건 설명 . 동일한 항 체 농도 다른 다양 한 종양 종류에 성공적으로 적용 된, 하는 동안 그것은 관심27의 다른 요소를 공부 하는 경우 항 체 특이성을 결정 하는 중요 한.
성공적인 실험에 대 한 또 다른 주요 측면 쥡니다 조건의 최적화를 포함 한다. 쥡니다 시간과 샘플 및 조직 유형 사이 둘 다 다를 수 있습니다 그에 따라 조정 될 수 있다. 적절 한 최적화에 대 한 재판 실행 쥡니다 시간을 점진적으로 증가 하 고 지속적으로 조각 크기를 검사 하 여 각 샘플에 대 한 수행 됩니다. 초기 칩 실험에 대 한 염색 질 조각을 해야 최적의 immunoprecipitation에 대 한 200 ~ 1000 bp 사이 고 정화 칩-DNA 도서관 준비를 진행 하기 전에 계량 한다. 최적의 생성 및 증폭 된 DNA의 보존을 보장 하는이 단편 크기 (200 ~ 600 bp)를 멀티플렉싱 및 NGS 사용 될 것 이다. 높은 처리량으로 이러한 실험을 수행 하는 경우 시퀀싱에 대 한 레인 당 ~ 8 샘플 수영장 다중화에 대 한 좋은 시작 지점이입니다. 이 양의 샘플 얕은 시퀀싱 깊이 생성 될 수 있습니다, 하는 동안 계속 하기 전에 항 체 품질을 테스트 하기 위한 유용 합니다. 여러 샘플 풀링 병목 게시물 시퀀싱 같지 않은 범위입니다. 그러나 일반적으로 fluoremetric 따라 정량은 사용 되는 방법,, 많은--번 아니다 각 도서관에서 시퀀싱 준비 분자에 해당. 라이브러리 DNA의 정량에 대 한 가장 좋은 방법은 정량 기준을 만든의 pre-determined 시퀀싱 준비 DNA 분자를 사용 하 여 활용 하는 것입니다.
칩 Seq 데이터 집합 분석에 또 다른 중요 한 단계는 데이터 처리를 시퀀싱 포스트는. 중요 한 것은, 다운스트림 분석의 어떤 양상 든 지에 진행 하기 전에 먼저 충족 해야 하는 다양 한 품질 관리 통계가 없습니다. FastQC 프로그램 패스의 형태에서 원시 fastq 연속 읽기의 품질에 대 한 정보를 제공 하거나 테스트 실패. Fastq 읽기 통계의 대부분을 통과 해야, 하는 동안 더 중요 한 테스트의 일부 시퀀스 기본 품질 시퀀스 품질 평가 점수, 그리고 어댑터 오염 당 당 기본 통계를 포함 합니다. FastQC 처리 읽기 인간 게놈에 정렬 되 고 한 불일치의 최대 ~ 50-80%의 비율로 한다. 가격 낮은 보다 50% 칩, 도서관 준비 또는 시퀀싱에에서 문제를 나타낼 수 있습니다 및 오염, 낮은 품질 칩-DNA 또는 PCR 동안 오버 증폭 포함 될 수 있습니다. 샘의 BAM 파일 변환, 동안 중복 읽기 먼저 표시 해야 하 고 이후 다운 샘플링을 진행 하기 전에 SAMBLASTER를 사용 하 여 제거. 어느 정도의 중복은 PCR 동안 정상, 복제의 높은 수준의 일반적으로 나타내는 낮은 품질 칩-DNA, 또는 도서관 준비에 문제가 있습니다. FastQC, bowtie, 및 samblaster (flagstat에 결합)에서 출력 수 모든 모든 품질 관리 결과의 완전 한 대화형 요약을 제공 하는 MultiQC로 전달 될. MultiQC는 fastqc, bowtie, 및 samblaster 기본 통계, 맞춤 비율, PCR 이중 요금에 관한 정보를 제공 하는 것은 각각의 출력 파일에서 품질 관리 통계를 표시 합니다.
다음 그리고 아마 가장 중요 한 단계 다운 샘플링 정규화 후 데이터 시각화 사용 하는 예: IGV 또는 UCSC 게놈 브라우저. 각 히스톤 수정 후 성적인 규정 풍경, H3K27ac를 포함 하 여의 주요 구성 요소를 나타냅니다 (강화), H3K4me1 (활성 및 태세 강화), H3K4me3 (발기인), H3K79me2 (복사할 영역), H3K27me3 (polycomb 억압), 그리고 H3K9me3 (heterochromatic 억압). 혼자 또는 조합에서 이러한 표시를 사용 하 여 이러한 히스톤 활성, 태세 또는 억압 된 강화 및 발기인, 뿐만 아니라 지역 코딩의 transcriptional 상태를 확인할 수 있습니다. 이 억압 하 고 활성 도메인을 나타내는 기능적으로 뚜렷한 chromatin 상태 확인 되었다 ChromHMM를 사용 하 여 시연 했다. 이러한 상태는 활성 증강 (H3K4me1 및 H3K27ac) 처럼 조합 부호 뿐만 아니라 polycomb 억압 (H3K27me3), hetrochromatic (H3K9me3), 억압과 활성 전사 (H3K79me2) 처럼 단 수 부호에 의해 정의 되었고 변하게 강화 제 (H3K4me1, H3K27ac 및 H3K79me2)
제시 통합된 플랫폼은 히스톤 또는 조직 샘플에서 녹음 방송 요인의 인의 결정에 적합. 우리는 성공적으로 생 검-크기 흑색 종 샘플에서 상기 6 마크의 점령의 결정에 대 한이 프로토콜을 활용 하 고. 그러나, 우리는 여전히 결정 되지 때문에 depenedent는 조직 유형으로 사용할 수 있는 항 체에 성공적인 칩 Seq 응용 프로그램에 필요한 조직의 최저 금액. 또한, 비록 우리가 정기적으로이 냉동 신선한, 플래시에 프로토콜 및 샘플을 동결 하는 10 월 활용, 우리가 하지 FFPE 직물에 대 한이 프로토콜을 최적화 했습니다. 일부 최근 연구 프로토콜 같은 조직46,47 에 대 한 보고 하 고 거기에 제안 된 변경 사항을 제시 플랫폼 FFPE 직물에서 도움이 될 것입니다 여부를 테스트 하기 위해이 플랫폼의 프레임 워크에 통합 될 수 있다. 우리는이 임상 시험에서 환자에서 얻은 임상 자료에서 chromatin 상태 패턴의 결정에 매우 도움이 될 것입니다 믿습니다. 전반적으로,이 프로토콜 설명 인간의 종양 조직, chromatin의 게놈 넓은 매핑 위한 완전 하 고 포괄적인 칩 seq 모듈 쉽게 성공적인 실험에 대 한 필요한 구성 요소를 모두 포괄 하는 지시를 따릅니다.

포유류 게놈 (98-99%)의 대다수는 noncoding 시퀀스, 구성 그리고 알려진 유전자 발현 및 염색 질 조직1,2에 참여 하는 규제 요소를 포함 하는이 nocoding 지역. 정상 세포에서 게놈 DNA의 특정 어셈블리 압축된 chromatin 구조에이 공간 조직, 규정 및 다양 한 DNA 관련 된 프로세스3,,45의 정확한 타이밍에 대 한 중요 합니다. 그러나 암 세포에, chromatin 수정 후 성적인 탈 선 메커니즘에 의해 chromatin 구조, 규제 요소, 염색체 루핑 시스템 및 유전자 표현 패턴6에 대 한 액세스를 포함 하 여 부적절 한 조직에 발생할 수 있습니다. 7,8,,910.
최근 발전에도 불구 하 고 우리 후 변경 관련 된 종양의 진행 이나 치료 응답의 이해를 제한 했다. epigenome 수정, 히스톤 부호, DNA 메 틸 화, 총칭 impinges 유전자 식 네트워크와 유지에 대 한 중요 한 다른 프로세스는 동적 상태 (chromatin 상태 라고 함)를 형성 등의 구성 세포 id입니다. 최근, 강화 변경 H3K27Ac 프로필11공부 하 여 여러 악성 종양에 표시 되었습니다. 100 개 이상의 후 성적인 수정 확인 된12,13 그들의 생물 학적 역할의 명확한 이해 없이 되었습니다 이러한 연구 격리 후 성적인 부호의 상관 관계에 대 한 통찰력을 제공, 그리고 상호 의존입니다. 또한, 이러한 히스톤과 DNA 수정 가능한 조합 패턴의 더 큰 수가 있다 며 이러한 조합 패턴-개별 수정-epigenetic 국가14를 지정 하는. 따라서, 암 진행 이나 치료. 에 대 한 응답 하는 동안 이러한 chromatin 상태 변경 식별 엄청난 필요는 암에 epigenome 변경의 포괄적인 지식 기술 (예: 작은 양의 임상 자료/단일 셀에서 대규모 데이터의 발생)으로 인해 일부 후행 되었습니다 있다 및 분석 (예: 알고리즘을 정의 조합 국가) 도전. 따라서, 필요도 중요 한 임상 자료와 구현 하기 쉬운 전산 접근에서 히스톤 수정 표시의 많은 수를 프로 파일링에 대해 강력한 높은 처리량 방법 촉진 한다 조합 패턴 예측 epigenetic 상태 tumorigenesis 및 치료 저항의 다른 단계와 관련 된 결정. 최근 epigenome 프로 파일링 연구15,,1617,18,19,20,21에서 사용할 수 있는 추가, 데이터 정상 조직 및 세포에서 22,23 chromatin 프로필에 대 한 추가 epigenome 기여 종양 생물학에 종양의 통합 될 수 있다.
Chromatin 프로 파일링 다양 한 chromatin 수정15,24의 글로벌 바인딩 패턴을 식별 하기 위한 강력한 도구가 되고있다. 최근 몇 년 동안에 칩 seq 세계적인 규모25,,2627에 DNA 단백질 상호 작용 연구 "금 표준" 되고있다. 어떤 칩 seq 실험에 대 한 단계가 중요 한 성공, 조직 처리 및 연관 해제를 포함 하 여, 최적의 쥡니다 조건, 강 수, 도서관 준비에 대 한 최적의 항 체 농도 determing determing에 필요한 -시퀀싱 데이터 처리 및 다운스트림 분석입니다. 각이 단계 주요 품질 관리 검사점을 포함 하 고 함께 찍은 때 제대로 기능 유효성 검사에 대 한 잠재적인 대상을 식별 하는 데 중요 한 있다. 이 단계에서 혁신을 통해 여러 이전 연구에서 적은 양의 조직28,,2930,31,32 칩 또는 칩 Seq를 수행 하는 방법론 개발 . 또한, 일부 연구는 높은 처리량 칩 실험 뒤에 PCR 프로토콜 기반 정량33,34건의 했다. 마지막으로, 일부 공개적으로 사용 가능한 분석 플랫폼 칩 Seq 데이터에 대 한 Easeq35 등 은36사용할 수 지금 있습니다. 그러나, 하나의 마크 chromatin 상태 분석 수행을 계산 파이프라인 함께 높은 처리량 패션에 칩 Seq를 수행 하기 위한 통합된 플랫폼 부족 되었습니다.
이 프로토콜 설명 종양 조직에 셀 라인, chromatin의 게놈 넓은 매핑 위한 완전 하 고 포괄적인 칩 seq 워크플로 쉽게 성공적인 실험에 필요한 단계를 모두 포괄 하는 지침에 따라. 이전 Blecher 고 넨 외. 에 의해 설명 하는 높은 처리량 방법을 채택 하 여 37이 프로토콜 병렬로 샘플의 수십에서 수행할 수 있습니다 그리고 암 세포 선 및 흑색 종, 전립선, 콜론과 세포종 님 같은 인간 종양에 성공적으로 적용 되었습니다. 6 코어 히스톤 수정 인간 흑색 종 세포 선 및 종양 샘플에 epigenetic 규제 프리의 주요 구성 요소를 나타내는 방법을 보여 줍니다. 이러한 수정 포함 H3K27ac (강화), H3K4me1 (활성 및 태세 강화), H3K4me3 (발기인), H3K79me2 (복사할 영역), H3K27me3 (polycomb 억압), 및 H3K9me3 (heterochromatic 억압). 이러한 표시 억압 및 활성 도메인을 나타내는 기능적으로 뚜렷한 chromatin 상태를 식별 하기 위해 단독으로 또는 조합에서 사용할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ChIP-grade H3K4me1 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP-grade H3K27ac antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab4729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP-grade H3K4me3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP-grade H3K79me2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP-grade H3K27me3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP-grade H3K9me3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris HCl, pH 8.0</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T1080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma - Life Sciences</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>74255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>492016-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% TWEEN-20</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA - IgG-free</td>
			<td>Sigma - Life Sciences</td>
			<td>A2058-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibo</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS C tube</td>
			<td>GentleMACS</td>
			<td>120-008-466</td>
			<td>disassociation tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Formaldehyde</td>
			<td>Peierce</td>
			<td>28906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miniProtease inhibitor&#160;</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11836153001</td>
			<td>protease inhibitor tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Protein G&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10009D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor NGS tubes 0.65 mL</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C30010011</td>
			<td>sonication tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag - 96 Side Skirted</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>120.27</td>
			<td>96-well magnetic stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V6231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12091021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>100005393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63882</td>
			<td>paramagnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit ds DNA High Sensitivity Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>high sensitivity DNA reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7645L</td>
			<td>DNA Library Prep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High sensitivity D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5584</td>
			<td>high sensitivity DNA reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High sensitivity D1000 reagents</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5585</td>
			<td>high sensitivity DNA reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplex Oligos (Index primers- Set 1)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7335L</td>
			<td>Multiplex Oligos&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplex Oligos (Index primers- Set 2)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7500L</td>
			<td>Multiplex Oligos&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TapeStation 4200</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td>high sensitivity DNA electropherogram instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor Pico sonication device&#160;</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01060001</td>
			<td>water bath disruputor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer</td>
			<td>Nutator</td>
			<td>421105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851196</td>
			<td>PCR Thermal cycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Pipet</td>
			<td>Denville</td>
			<td>1003123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Skirted Plate</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>47744-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X-12R Centrifuge&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99464</td>
			<td>benchtop centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5424</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620461</td>
			<td>tabletop centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical tube strips (8x Strip)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical tube strip caps (8x strip)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading Tips, 10 Pk</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKA MS3 vortex</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3617000</td>
			<td>vortex</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an integrated platform for genome-wide mapping of chromatin states using high-throughput chip-sequencing in tumor tissues

히스톤 수정은 epigenome의 주요 구성 요소를 구성 하며 중요 한 역할을 규제 관련된 loci의 transcriptional 상태를 결정 합니다. 또한, 특정 수정의 존재 위치와 강화 등 비 코딩 기능 요소 정체성을 결정 하 사용 되었습니다. 최근 몇 년 동안, chromatin immunoprecipitation 다음 세대 시퀀싱 (칩 seq) 다음 개별 히스톤 수정의 게놈 넓은 프로필 결정에 강력한 도구가 되고있다. 그러나, 그것은 점점 더 분명 chromatin 수정, Chromatin 상태 라고의 조합 패턴 정체성과 관련 된 genomic 소재 시의 결정 되고있다. 따라서, 다양 한 전산 분석 파이프라인 수 뿐만 아니라 히스톤 수정 표시를 프로 파일링에 대 한 강력한 높은 처리량 (HT) 방법론의 구성 된 워크플로 처리 칩 Seq의 무수의 프로 파일링 데이터 집합에 필요한 샘플의 많은 수에 있는 epigenomic 국가의 포괄적인 결정. 여기는 HT 칩 Seq 워크플로 두 개의 모듈로 구성: 1) 적은 양의 종양 샘플 및 96-잘 형식; 셀 라인에서 여러 히스톤 수정 프로 파일링 실험 프로토콜 그리고 2) 개별 마크 인 및 조합 chromatin 상태 패턴을 계산 하는 기존 도구를 결합 하 여 전산 데이터 분석 파이프라인. 함께,이 두 가지 모듈 쉽게 처리 칩 Seq 샘플의 수백의 신속 하 고 효율적인 방식으로 촉진 한다. 여기에 제시 된 워크플로 chromatin 상태 패턴 흑색 종 종양 세포에서 6 히스톤 마크 프로필에서 파생 하는 데 사용 됩니다. 전반적으로, 우리는 인간의 종양 샘플 및 다양 한 악성 종양에 epigenomic 착오를 결정 하기 위해 암 세포 라인에 적용할 수 있는 포괄적인 칩 seq 워크플로 제시.

이 프로토콜에는 냉동된 종양 조직 및 높은 처리량 방법 (그림 1A)를사용 하 여 병렬로 샘플의 수십에 수행할 수 있는 셀 라인에서 immunoprecipitation 수 있습니다. 염색 질 조각을 위한 최적의 immunoprecipitation ~ 200-1000 bps 사이 범위 해야 합니다. 우리는 같은 전단 길이 달성 하는 데 필요한 시간이 다른 조직 및 세포 유형에 대 한 다른 지적 했다. 적은 양의 조직에서 칩의 성공 특히 쥡니다 동안 항상 lysate 감기 유지에 따라 달라 집니다. 순화 칩 DN 사들이 도서관 준비 (그림 2A)를 진행 하기 전에 측정할 수 있습니다. 완성 된 라이브러리 멀티플렉싱 및 NGS 적합 해야 ~ 200-600 bp 사이 고 어떤 뇌관 이합체 없는 (그림 2B). -시퀀싱 시 맥 같은 파이프라인의 추가 단계를 진행 하기 전에 충족 해야 하는 많은 품질 관리 통계는 피크-전화 또는 ChromHMM 분석 (그림 3). 이러한 통계의 많은 FastQC 및 MultiQC 같은 프로그램을 사용 하 여 확인할 수 있습니다. 품질 fastq 읽기 한 불일치의 최대 ~ 50-80%의 비율로 인간 게놈에 정렬 됩니다. 권장된 시퀀싱 깊이 ~ 10-15 백만 고유 하 게 매핑된 "포인트 소스" 요소에 대 한 읽기 이며 ~ 20-30 백만 고유 하 게 매핑된 "광범위 한 소스" 요인27,41,,4243에 대 한 읽기. 정렬 된 인덱싱된 BAM 파일 IGV 등 UCSC 게놈 브라우저를 사용 하 여 시각 될 수 있는 중요 파일을 생성 하는 데 사용 됩니다. 칩 샘플 입력된 DNA를 통해 농축 해야 하 고 각 히스톤 수정 epigenetic 프리 (그림 4A)의 특정 구성 요소를 나타내는 고유한 프로필을 표시 한다. 그 어떤 조직에 있을 것입니다 칩 seq 신호를 어둡게 수 있는 배경 잡음의 높은 수준이 가능 하다. 이 경우, 입력된 뺀된 중요 파일을 생성 하 고 다시 게놈 브라우저에서 시각화 하는 것이 좋습니다. Chromatin 상태 프로필을 확인, 우리는 ChromHMM 알고리즘24를 이용 한다. ChromHMM는 가장 눈에 띄는 다시 발생 조합 식별 하기 위해 복수 숨겨진 마르코프 모델을 사용 하 고 공간 chromatin 패턴 히스톤 수정에 따라 공부 (그림 5). 이러한 6 수정을 사용 하 여 ChromHMM 식별 polycomb 억압 (상태 1) heterochromatic 억압 (주 5), 활성 전사 (주 8 및 9) 같이 억압 및 활성 도메인을 나타내는 기능적으로 뚜렷한 chromatin 상태와 활성 증강 인자 (주 13와 14) ChromHMM에서 출력 추가 다운스트림 분석을 위해 사용 될 수 있는 각 상태에 대 한 세그먼트 침대 파일을 포함 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56972/56972fig1.jpg"> 그림 1: 칩 모듈에 대 한 작업 흐름. Biopsied 종양 조직은 먼저 분리 하 고 단백질 DNA 상호 작용을 캡처 했더라도. 조직 염색 질 조각을 immunoprecipitation 적합을 얻기 위해 sonicated 다음은 고 히스톤 DNA 단지 6 표시 된 항 체를 사용 하 여 침전 된다. 샘플 세차, 크로스 링크 반대 하 고 칩-DNA 정제 및 정량. 라이브러리는 순화 된 DNA에서 생성 하 고 고유 인덱스에 따라 멀티플렉스. <a href="/files/ftp_upload/56972/56972fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56972/56972fig2.jpg"> 그림 2 : 순화 된 칩-DNA 및 완성 된 라이브러리의 Electropherogram 분석. (A) 대표 electropherogram 정화 칩-DNA 포함 chromatin에서 라이브러리 준비에 적합 ~ 200-600 bp 파편. (B) 대표 electropherogram 증폭 및 멀티플렉싱 및 NGS 적합 양면 상자성 크기 선택 후 완료 된 도서관에서. <a href="/files/ftp_upload/56972/56972fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56972/56972fig3.jpg"> 그림 3 : 칩 seq 데이터 처리 모듈에 대 한 작업 흐름. 작업 흐름 표시 칩 seq 데이터 처리에 대 한 중요 한 단계 및 다운스트림 분석을 위한 준비. 그러나이 프로토콜에서 사용 하는 파이프라인 snakemake를 사용 하 여 생성 했다,, 각이 단계도 수행할 수 있습니다 설명 하는 대로 개별적으로. <a href="/files/ftp_upload/56972/56972fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56972/56972fig4.jpg"> 그림 4 : 히스톤 수정 칩 seq 추적의 게놈 브라우저 보기. A) 칩 seq 트랙 NRAS 로커 스 대표 흑색 종 종양 샘플에서을 둘러싼 활발 하 고 억압 된 영역을 표시 하는 deeptools에 의해 생성 된. NRAS, CSDE1 같은 유전자는 SIKE1 모든 활성 히스톤 수정 (H3K27ac, H3K4me3 및 H3K4me1) 및 활성 전사 (H3K79me2)와 관련 된 측면에 서는 유전자 AMPD1, DENND2C, 및 SYCP1 polycomb 억압 적인 마크 H3K27me3를 포함 하 고 하지 않는 반면 활성 전송 포함 되어 있습니다. B) 칩 seq 트랙 흑색 종 종양 샘플 ZNF 유전자 대표에 걸쳐 태세 섬으로 표시 하는 deeptools에 의해 생성. <a href="/files/ftp_upload/56972/56972fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56972/56972fig5.jpg"> 그림 5 : 흑색 종 종양 샘플을 기반으로 ChromHMM 모델. 6 히스톤 수정에 따라 15-상태 LearnModel에서 방출 프로 파일을 공부 했다. ChromHMM 식별 polycomb 억압 (주 1), heterochromatic 억압 (주 5), 활성 전사 (주 8 및 9) 활성 증강 등 억압 및 활성 도메인을 나타내는 기능적으로 뚜렷한 chromatin 상태 (State13 14 ). <a href="/files/ftp_upload/56972/56972fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues at JoVE.com

An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

종양 조직에 높은 처리량 칩 시퀀스를 사용 하 여 Chromatin의 게놈 넓은 매핑 위한 통합된 플랫폼

여기, 우리는 최적화 된 높은 처리량 칩 시퀀싱 프로토콜 및 냉동된 종양 조직 및 세포에서 게놈 넓은 chromatin 상태 패턴의 결정에 대 한 전산 분석 파이프라인을 설명합니다.

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of ...

an-integrated-platform-for-genome-wide-mapping-chromatin-states-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

10.2K 조회수.  University of Texas MD Anderson Cancer Center. 여기, 우리는 최적화 된 높은 처리량 칩 시퀀싱 프로토콜 및 냉동된 종양 조직 및 세포에서 게놈 넓은 chromatin 상태 패턴의 결정에 대 한 전산 분석 파이프라인을 설명합니다.

비디오: An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the context of a whole organism. Sophisticated techniques to generate genetic mosaics facilitate induction of visually marked, genetically defined clones surrounded by normal tissue. The clones can be analyzed through diverse molecular, cellular and omics approaches. This study describes how to generate fluorescently labeled clonal tumors of varying malignancy in the eye/antennal imaginal discs (EAD) of Drosophila larvae using the Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. It describes procedures how to recover the mosaic EAD and brain from the larvae and how to process them for simultaneous imaging of fluorescent transgenic reporters and antibody staining. To facilitate molecular characterization of the mosaic tissue, we describe a protocol for isolation of total RNA from the EAD. The dissection procedure is suitable to recover EAD and brains from any larval stage. The fixation and staining protocol for imaginal discs works with a number of transgenic reporters and antibodies that recognize Drosophila proteins. The protocol for RNA isolation can be applied to various larval organs, whole larvae, and adult flies. Total RNA can be used for profiling of gene expression changes using candidate or genome-wide approaches. Finally, we detail a method for quantifying invasiveness of the clonal tumors. Although this method has limited use, its underlying concept is broadly applicable to other quantitative studies where cognitive bias must be avoided.

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

This protocol demonstrates how to generate fluorescently marked, genetically defined clonal tumors in the Drosophila eye/antennal imaginal discs (EAD). It describes how to dissect the EAD and brain from the third instar larvae and how to process them to visualize and quantify gene expression changes and tumor invasiveness.

그만큼<em&gt; 초파리</em&gt; 가상적인 디스크 종양 모델 : 유전 모자이크를 사용하여 유전자 발현 및 종양 침윤의 시각화 및 정량화

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

연구

암 연구학

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by CTCs critically contributes to early lung metastatic processes, has been vigorously investigated. As such, animal models are the only approach that captures the full systemic process of metastasis. Given that problems occur in previous experimental designs for examining the contributions of CTCs to blood vessel extravasation, we established an in vivo lung colonization assay in which a long-term-fluorescence cell-tracer, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), was used to label suspended tumor cells and lung perfusion was performed to clear non-specifically trapped CTCs prior to lung removal, confocal imaging, and quantification. Polymeric fibronectin (polyFN) assembled on CTC surfaces has been found to mediate lung colonization in the final establishment of metastatic tumor tissues. Here, to specifically test the requirement of polyFN assembly on CTCs for lung colonization and extravasation, we performed short term lung colonization assays in which suspended Lewis lung carcinoma cells (LLCs) stably expressing FN-shRNA (shFN) or scramble-shRNA (shScr) and pre-labeled with 20 &#956;M of CFSE were intravenously inoculated into C57BL/6 mice. We successfully demonstrated that the abilities of shFN LLC cells to colonize the mouse lungs were significantly diminished in comparison to shScr LLC cells. Therefore, this short-term methodology may be widely applied to specifically demonstrate the ability of CTCs within the circulation to colonize the lungs.

An animal model is needed to decipher the role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting lung colonization during cancer metastasis. Here, we established and successfully performed an in vivo assay to specifically test the requirement of polymeric fibronectin (polyFN) assembly on CTCs for lung colonization.

순환 종양 세포 시각화 폐 조직에 대 한 폐 식민 분석 결과의 설립

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus replication. Here we present the application of this technology to uncovering host targets that specifically modulate the replication of Maraba virus, an oncolytic rhabdovirus, and vaccinia virus with the goal of enhancing therapy. While the protocol has been tested for use with oncolytic Maraba virus and oncolytic vaccinia virus, this approach is applicable to other oncolytic viruses and can also be utilized for identifying host targets that modulate virus replication in mammalian cells in general. This protocol describes the development and validation of an assay for high-throughput RNAi screening in mammalian cells, the key considerations and preparation steps important for conducting a primary high-throughput RNAi screen, and a step-by-step guide for conducting a primary high-throughput RNAi screen; in addition, it broadly outlines the methods for conducting secondary screen validation and tertiary validation studies. The benefit of high-throughput RNAi screening is that it allows one to catalogue, in an extensive and unbiased fashion, host factors that modulate any aspect of virus replication for which one can develop an in vitro assay such as infectivity, burst size, and cytotoxicity. It has the power to uncover biotherapeutic targets unforeseen based on current knowledge.

Here we describe a protocol for employing high-throughput RNAi screening to uncover host targets that can be manipulated to enhance oncolytic virus therapy, specifically rhabodvirus and vaccinia virus therapy, but it can be readily adapted to other oncolytic virus platforms or for discovering host genes that modulate virus replication generally.

RNAi 게놈 넓은 검사 Oncolytic 바이러스 치료 변조 호스트 요소를 식별 하

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

Native Chromatin Immunoprecipitation Using Murine Brain Tumor Neurospheres

Epigenetic modifications may be involved in the development and progression of glioma. Changes in methylation and acetylation of promoters and regulatory regions of oncogenes and tumor suppressors can lead to changes in gene expression and play an important role in the pathogenesis of brain tumors. Native chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a popular technique that allows the detection of modifications or other proteins tightly bound to DNA. In contrast to cross-linked ChIP, in native ChIP, cells are not treated with formaldehyde to covalently link protein to DNA. This is advantageous because sometimes crosslinking may fix proteins that only transiently interact with DNA and do not have functional significance in gene regulation. In addition, antibodies are generally raised against unfixed peptides. Therefore, antibody specificity is increased in native ChIP. However, it is important to keep in mind that native ChIP is only applicable to study histones or other proteins that bind tightly to DNA. This protocol describes the native chromatin immunoprecipitation on murine brain tumor neurospheres.

Epigenetic mechanisms are frequently altered in glioma. Chromatin immunoprecipitation could be used to study the consequences of genetic alterations in glioma that result from changes in histone modifications which regulate chromatin structure and gene transcription. This protocol describes native chromatin immunoprecipitation on murine brain tumor neurospheres.

네이티브 Chromatin Immunoprecipitation Murine 뇌 종양 Neurospheres를 사용 하 여

Epigenetic modifications may be involved in the development and progression of glioma. Changes in methylation and acetylation of promoters and regulatory ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is exposed to in vivo. Solid tumors grow not as a sheet attached to plastic, but instead as a collection of clonal cells in a three-dimensional (3D) space interacting with their neighbors, and with distinct spatial properties such as the disruption of normal cellular polarity. These interactions cause 3D-cultured cells to acquire morphological and cellular characteristics which are more relevant to in vivo tumors. Additionally, a tumor mass is in direct contact with other cell types such as stromal and immune cells, as well as the extracellular matrix from all other cell types. The matrix deposited is comprised of macromolecules such as collagen and fibronectin.
In an attempt to increase the translation of research findings in oncology from bench to bedside, many groups have started to investigate the use of 3D model systems in their drug development strategies. These systems are thought to be more physiologically relevant because they attempt to recapitulate the complex and heterogeneous environment of a tumor. These systems, however, can be quite complex, and, although amenable to growth in 96-well formats, and some now even in 384, they offer few choices for large-scale growth and screening. This observed gap has led to the development of the methods described here in detail to culture tumor spheroids in a high-throughput capacity in 1536-well plates. These methods represent a compromise to the highly complex matrix-based systems, which are difficult to screen, and conventional 2D assays. A variety of cancer cell lines harboring different genetic mutations are successfully screened, examining compound efficacy by using a curated library of compounds targeting the Mitogen-Activated Protein Kinase or MAPK pathway. The spheroid culture responses are then compared to the response of cells grown in 2D, and differential activities are reported. These methods provide a unique protocol for testing compound activity in a high-throughput 3D setting.

Across a wide variety of disease indications, more physiologically relevant models are being developed and implemented into drug discovery programs. The new model system described here demonstrates how three-dimensional tumor spheroids can be cultured and screened in a high-throughput 1536-well plate-based system to search for new oncology drugs.

마약 검사에 대 한 높은 처리량 3 차원 종양 Spheroids의 생성

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as tumors. Because digital polymerase chain reactions (PCR) enable the precise quantification of DNA copy number variants, they are becoming an essential tool for detecting rare genetic variations, such as drug-resistant mutations. It is expected that molecular diagnoses using digital PCR (dPCR) will be available in clinical practice in the near future; thus, how to efficiently conduct dPCR with human genetic material is a hot topic. Here, we introduce a method to detect Adenomatous polyposis coli (APC) somatic mosaicism using dPCR with the chip-in-a-tube format, which allows eight dPCR reactions to be simultaneously conducted. Care should be taken when filling and sealing the reaction mixture on the chips. This article demonstrates how to avoid the over- and underestimation of positive partitions. Furthermore, we present a simple procedure for collecting the dPCR product from the partitions on the chips, which can then be used to confirm the specific amplification. We hope that this methods report will help promote the dPCR with the chip-in-a-tube method in genetic research.

Digital polymerase chain reaction (PCR) is a useful tool for the high-sensitivity detection of single nucleotide variants and DNA copy number variants. Here, we demonstrate key considerations for measuring rare variants in the human genome using digital PCR with the chip-in-a-tube format.

튜브에 칩 형식을 사용 하 여 산발적 인 가족 용 대 환자에 있는 유전 변이 대 한 디지털 중 합 효소 연쇄 반응 분석 결과

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a malignant brain tumor with no cure, has up to a half the tumor mass TAMs. TAMs can be pro-tumoral or anti-tumoral, depending on the activation of specific genes in the cells. Genetic mutations in the tumors, through regulating cytokine expression, can affect recruitment of TAMs to the tumor microenvironment. Here, we describe a quantitative cell-based assay to assess macrophage recruitment by the conditioned medium from the tumor cells. This assay uses the human macrophage cell line MV-4-11 to study macrophage attraction by the conditioned medium from glioblastoma, allowing for high reproducibility and low variability. Data generated with this assay can contribute to a better understanding of the interaction between the tumor and the tumor microenvironment. Similar assay can be used to assess interaction between the tumor cells and other immune cells, including T cells and natural killer (NK) cells.

This article represents a useful in vitro assay to evaluate the capability of conditioned medium from tumor cells to attract macrophages.

종양 대식 세포 상호 작용을 연구 하는 시험관 내 분석

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited because very few patient derived SBNET cell lines have been generated. Well-differentiated SBNET cells are slow growing and are hard to propagate. The few cell lines that have been established are not readily available, and after time in culture may not continue to express characteristics of NET cells. Generating new cell lines could take many years since SBNET cells have a long doubling time and many enrichment steps are needed in order to eliminate the rapidly dividing cancer-associated fibroblasts. To overcome these limitations, we have developed a protocol to culture SBNET cells from surgically removed tumors as spheroids in extracellular matrix (ECM). The ECM forms a 3-dimensional matrix that encapsulates SBNET cells and mimics the tumor micro-environment for allowing SBNET cells to grow. Here, we characterized the growth rate of SBNET spheroids and described methods to identify SBNET markers using immunofluorescence microscopy and immunohistochemistry to confirm that the spheroids are neuroendocrine tumor cells. In addition, we used SBNET spheroids for testing the cytotoxicity of rapamycin.

Neuroendocrine tumors (NETs) originate from neuroendocrine cells of the neural crest. They are slow growing and challenging to culture. We present an alternative strategy to grow NETs from the small bowel by culturing them as spheroids. These spheroids have small bowel NET markers and can be used for drug testing.

작은 창자 신경 내분비 종양 스페로이드의 설치 그리고 특성화

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Genome-Wide Analysis of DNA Methylation in Gastrointestinal Cancer

DNA methylation is an important epigenetic change that is biologically meaningful and a frequent focus of cancer research. Genome-wide DNA methylation is a useful measure to provide an accurate analysis of the methylation status of gastrointestinal (GI) malignancies. Given the multiple potential translational uses of DNA methylation analysis, practicing clinicians and others new to DNA methylation studies need to be able to understand step by step how these genome-wide analyses are performed. The goal of this protocol is to provide a detailed description of how this method is used for the biomarker identification in GI malignancies. Importantly, we describe three critical steps that are needed to obtain accurate results during genome-wide analysis. Clearly and concisely written, these three methods are often lacking and not noticeable to those new to epigenetic studies. We used 48 samples of a GI malignancy (gastric cancer) to highlight practically how genome-wide DNA methylation analysis can be performed for GI malignancies.

Herein, we describe a procedure for genome-wide analysis of DNA methylation in gastrointestinal cancers. The procedure is of relevance to studies that investigate relationships between methylation patterns of genes and factors contributing to carcinogenesis in gastrointestinal cancers.

위장암에서 DNA 메틸화의 게놈 전체 분석

DNA methylation is an important epigenetic change that is biologically meaningful and a frequent focus of cancer research. Genome-wide DNA methylation is ...

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable preclinical models that can accurately predict patient responses. One of the disadvantages of existing preclinical models is the inability to contextually preserve the human tumor microenvironment (TME) and accurately represent intratumoral heterogeneity, thus limiting the clinical translation of data. By contrast, by representing the culture of live fragments of human tumors, the patient-derived explant (PDE) platform allows drug responses to be examined in a three-dimensional (3D) context that mirrors the pathological and architectural features of the original tumors as closely as possible. Previous reports with PDEs have documented the ability of the platform to distinguish chemosensitive from chemoresistant tumors, and it has been shown that this segregation is predictive of patient responses to the same chemotherapies. Simultaneously, PDEs allow the opportunity to interrogate molecular, genetic, and histological features of tumors that predict drug responses, thereby identifying biomarkers for patient stratification as well as novel interventional approaches to sensitize resistant tumors. This paper reports PDE methodology in detail, from collection of patient samples through to endpoint analysis. It provides a detailed description of explant derivation and culture methods, highlighting bespoke conditions for particular tumors, where appropriate. For endpoint analysis, there is a focus on multiplexed immunofluorescence and multispectral imaging for the spatial profiling of key biomarkers within both tumoral and stromal regions. By combining these methods, it is possible to generate quantitative and qualitative drug response data that can be related to various clinicopathological parameters and thus potentially be used for biomarker identification.

This paper describes methods for the generation, drug treatment, and analysis of patient-derived explants for assessing tumor drug responses in a live, patient-relevant, preclinical model system.

환자 유래 종양은 환자의 약물 내성을 예측하기위한 "라이브"전임상 플랫폼으로 이월합니다.

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...