저자는 프로세스 개발 및 장치 제작에 그들의 귀중 한 지원을 위해 하는 ChiLab, 재료 및 마이크로 실험실-Politecnico 디 토리노-교수 C F Pirri, 닥터 M Cocuzza와 박사 S L Marasso의에서 DISAT 인정 하... 우리는 토론 및 이미지 처리에서 지원에 대 한 Quantacell에서 빅터 라신 감사합니다. 우리는 GFP LifeAct 마우스를 제공에 대 한 마우스에 대 한 그들의 지원에 대 한 인 퀴리와 파블로 바 가스와 아나 마리아 레논 (인 퀴리)의 동물 시설에서 이자벨 Grandjean를 마 농 샤 감사. 우리는 형광 배제 방법의 이해에 그들의 도움 인 Langevin 및 Clotilde Cadart, 라 리사 Venkova, Matthieu Piel 인 퀴리-UMR 144에서에서 올리비에 Thouvenin에 감사. 마지막으로, 우리 소에 그들의 지원 위한 인 피에르-질 드 Gennes (CNRS UMS 3750)의 기술 플랫폼을 감사합니다. 이 작품은 유럽 연구 위원회 고급 부여 번호 321107 "첼로,"에 의해 부분적으로 지원 되었다 PSL 대학교 (SwithNeuroTrails 프로젝트), ANR Investissement d'Avenir, IPGG Labex 및 Equipex.

<ol>
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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+graphene+based+nanocomposite+for+application+in+3D+flexible+micro-supercapacitors.">A novel graphene based nanocomposite for application in 3D flexible micro-supercapacitors.</a> Materials Research Express. 3 (6), 065001 (2016).</li><li>Welch, C. C., Goodyear, A. L., Wahlbrink, T., Lemme, M. C., Mollenhauer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+etch+process+options+for+micro-and+nanotechnology+using+inductively+coupled+plasmas.">Silicon etch process options for micro-and nanotechnology using inductively coupled plasmas.</a> Microelectronic Engineering. 83 (4), 1170-1173 (2006).</li><li>Fath, T., Ke, Y. D., Gunning, P., G&#246;tz, J., Ittner, L. 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저자는 충돌의 관심을 선언합니다.

뉴런의 볼륨 이미지 구성 때문에이 세포의 길고 얇은 확장 FXm 기술에 대 한 도전. 이 프로토콜 신경 영상 전용 미세 장치의 동일한 종류의 변종을 설명 합니다.
미세 디자인의 측면, 옆에 목표의 형광 제외 이미징에 대 한 기본 이며 절충 한 측면 해상도 이미지 선명도 의미 합니다. 그것은에 게재 되었습니다 13 챔버 높이 보다 작은 초점의 깊이를 선도 높은 NA 없음을 볼륨 측정의 정밀도 대 한 해로운 영상 초점에서 수행한 및 충분 한 마진의 개체의 윤곽선 사이 남아 있는 경우 nterest 그리고 통합의 경계입니다. 그러나, 초점의 깊이 보다 훨씬 더 높은 상공의 사용 때문에 광자 확산는 부드럽게 이미지 선명도 관심사의 목표의 가장자리를 손상 한다. 3 µ m 높은 챔버의 제조 측면 흐리게이 감소 하 고 매우 잘 정의 된 형광 제외 이미지도 높은 NA를 사용 하 여 제공 (0.8) 40 X 목표 측면 고해상도 신경 분 지를 시각화.
3 µ m 높은 챔버의 경우 칩 조립은 중요 한 단계, 특히 하지만 주의 조작 4.1.2에 설명 된 대로 방지 지붕 붕괴. 이러한 얇은 실에 관련 된 볼륨 비율 높은 표면 또한 시간이 지남에 Dextran 농도의 안정성의 문제를 제기. 우리 보육의 1 박 후는 Dextran의 표면 흡수 했다 무시할 수 확인: PBS에서 Dextran을 교체 후 기둥와 배경 사이의 강도 차이 사이 초기 강도 대비 1000 당 약 1 Dextran의 면 전에 서이 두 영역입니다. 참고 아래쪽 coverslip에 및 PDMS 지붕에 신경 준수 수 있습니다. 이 효과 코팅으로 꽃무늬 coverslips (즉, 우리가 하지 PDMS 챔버 내 접착 분자를 품 어 할 때)를 사용 하 여 따라서 엄격 하 게 지역화 챔버의 바닥에 때 사라집니다.
그렇다 하 고 그들의 도전적인 형태 뉴런 FXm 오히려 적합 한 방법, 즉 dextran endocytosis의 주요 한계 중 하나는 매우 제한 된는 사실 때문에이 셀. 우리 선택 10 kDa 정립에에서 억제 범위 (시간) 어떤 보이는 endocytosis 현상.
결론적으로에 FXm의 개념적 단순 일련의 실험적인 문제는 현재 프로토콜, nanometric PDMS 거칠기 및 미세 챔버 높이, 또는 배경 교정의 흘 수에 대 한 수정에 의해 해결 되었습니다에 의해 균형 PDMS 기둥 사이의 천장입니다. 그러나, 형광 매체 제한에 가까운 미세 챔버를 사용 하 여 효과적인 표면 세포 접착, 또는 중앙에서 소마를 제외 하는 필요성을 절감 하 지원 기둥의 필요성 같은 몇 가지 특정 제약 조건 생성 높은 해상도 관측에 액세스할 수 있는 셀의 영역을 제한 하는 높은 선명도와 신경 확장 관찰 하 약 실. 이 방법의 한 가지 가능한 진화 한 광학 교체 물리적 감 금이를 제거 하는 것입니다. 빛 시트 현미경의 새로운 개발 있습니다 결합 될 advantageously FXm 미래에.

세포질 볼륨의 정확한 지식은 셀 크기 항상성 단 세포 미생물 1 그리고 더 일반적으로 mitotic 세포 2의 문제에 의해 구동 지난 몇 년 동안에서 증가 주목을 받고 있다. 그러나, 셀 볼륨의 질문은 또한 포스트 mitotic 세포는 뉴런 전형적인 예제 구성에 대 한 관련.
볼륨은 참으로 다양 한 스케일과 시간 지점에서 생리 및 병리학 사건의 중요 한 서명 전기 활동 (밀리초 단위) 3 에 돌이킬 수 없는 관련 된 과도 axonal 변형에서 신경 삶에 신경 붓기가 발생 하는 신경 퇴행 성 질병 (인간에서 년간) 4의 무 증상 단계. 그러나, 가장 큰 볼륨의 변화 신경 성장 동안 (고려 유기 체)에 따라 주 또는 일의 중간 시간 규모에서 발생합니다. 뉴런의 확장 하 고 복잡 한 형태는 배수 문제를 제기 셀 크기의 규칙. Axonal 길이 직경 실제로 단단히 규제 vivo에서, 각 신경 유형 5,6값 특정 있습니다.
이러한 문제 vivo에서, 해결 하기 위해 복잡 한 또한 단순화 된 방법으로 해결할 수 있습니다 생체 외에서. 그 목표에 빨리 볼륨 측정 전용 메서드 충분히 성장 역학 (즉 분의 시간 규모에서) 및 호환 관찰 시간 또는 일이 필요 합니다. 여러 가지 방법은 세포 볼륨 시험관에 직접 또는 간접적으로 액세스할 수 년 동안 개발 되었습니다. Confocal 영상에서 셀 재건, 그들 중 하나 이지만이 방법은 약 500 nm 7의 제한 된 축 해상도 표시 하는 동안 빛에 라벨 부착 및 반복 노출 의미. Note 격자 빛 시트 현미경 8라는 더 정교 하 고 최근 방법으로 부분적으로이 두 마지막 단점을 극복할 수 있다는. 원자 힘 현미경 검사 법 사용된 9 되었지만이 검색 방법은 느리고 지루한 본질에 의해. 또한, 육체적 인 접촉을 셀 필요 고려 신경 10의 극단적인 부드러움 측정 방해할 수 있습니다. 다른 세포 유형 11, 하지만 대 한 부적 절 한 확장 뉴런 처럼 접착제 셀 임피던스 또는 공명을 사용 하 여 간접 방법 고용 있다.
가장 유망한 방법 중 하나는 형광 염료로 가득 가까운 챔버에 세포의 제외 된 볼륨의 측정을 기반으로 합니다. 형광 제외 방법 (FXm) 라벨, 필요로 그것의 원리에서 간단 하 고 빠르고, 긴 기간 세포 인구 잠재적으로 하위 광학 축 해상도 광학 이미징 적합 하다. 더 정확 하 게, z에서 해상도 있지만이 궁극적인 해결책을 제한 하는 잡음의 여러 소스 (즉, 세포가 없는 지역에서), 카메라의 동적 범위를 나눈 문화 챔버에 최대 형광 강도에 따라 다릅니다. 이 방법은 매우 강력한 마이그레이션 부착 셀 12 의 볼륨에 따라 또는 철저 하 게 13에 설명 된 대로 포유류 세포의 유사 분열 동안 볼륨 변화 연구 되었습니다. 그러나, 뉴런 FXm 하위 미세 프로세스에 광범위 한 그들의 분파를 고려에 대 한 방법론 문제를 구성 합니다.
선물이 여기 신경 가지와 동적 구조 성장 콘 같은 신경 성장에 관여의 높이와 고정밀 볼륨 액세스를 부드러운 FXm 챔버의 제조를 선도 하는 방법.
실 축 해상도 최적화 하기 위해 측정 하는 개체 보다 비슷한 높이 있어야 합니다. 따라서, 우리는 세 가지 서로 다른 높이의 중앙 측정 챔버 특징 다른 FXm 장치 설계. Neurite 측정에 전념 하는 가장 얇은 (3 µ m 높이):이 낮은 높이 제외 소마는 근처 15 µ m 높은 중간 챔버에 남아. 두꺼운 중앙 챔버 (10과 12 µ m) 전체 세포 성장에 따라 충분히 높다. 장치는 또한 중앙 챔버의 양쪽에 위치한 두 개의 저수지를 포함 한다. 4 개의 주입 구멍 (IH)은 이렇게 구현 하 고 다음과 같이 지정 된다: 입구와 출구 역할 칩, 휴대폰 정지를 반면 다른 두 저수지를 피드.
우리는 알려진된 기하학의 포토 레지스트 구조를 사용 하 여 높이 측정에 대 한 첫 번째 조립된 교정 coverslips가 있다. 우리는 다음 몇 군데 무료 성장 신경, 하지만 또한 형태학 상으로 제한 된 뉴런 접착의 micropatterns에.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmalab System 100</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>To perform DRIE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MJB4 mask aligner</td>
			<td>SUSS MicroTec</td>
			<td></td>
			<td>SU-8 photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NXQ 4006 Mask aligner</td>
			<td>Neutronix Quintel</td>
			<td></td>
			<td>Photolithography associated to DRIE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>Pico PCCE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td>ADS Laminaire</td>
			<td>Optimale 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Heraeus Multifuge X1R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator 37 &#176;C 5% CO2</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170AICUVH-PE IncuSafe CO2 Incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS Oven between 65 and 80 &#176;C</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical profilometer</td>
			<td>Veeco</td>
			<td>Dektak 6M Stylus Profiler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical profilometer</td>
			<td>Veeco</td>
			<td>Wyko NT9100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Verrerie Villeurbanaise (Kartel Labware)</td>
			<td>230KAR</td>
			<td>Diameter 200 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath sonicator</td>
			<td>Labo Moderne</td>
			<td>SHE1000</td>
			<td>Volume of the bath: 0.8 liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>Stuart SD162</td>
			<td>SD162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRIE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Su8 Mask 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Su8 Mask 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Su8 Mask 3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1805 calibration stripes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small laboratory equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm hole puncher</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>29002519 (US reference)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel or razor blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; Stainless Steel Flat Spatula with Spoon</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82027-532</td>
			<td>To demold PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Lip Wafer Handling</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>63042-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tweezer</td>
			<td>FST</td>
			<td>Dumont #7 Forceps - Standard / Dumoxel</td>
			<td>To manipulate glass coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Prolog Semicor Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24x24 mm glass coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresists and developpers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 1518 positive photoresist</td>
			<td>Microchemicals GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Before DRIE process, thicknes 1.8 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 351B developer</td>
			<td>Microchemicals GmbH</td>
			<td></td>
			<td>To develop positive AZ 1518 photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2007</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2025</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2050</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGMA developer</td>
			<td>Technic</td>
			<td></td>
			<td>To develop SU-8 negative photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microposit S1805 resist</td>
			<td>Chimie Tech Services</td>
			<td></td>
			<td>Positive photoresist used to obtain 0.5&#181;m high structures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF 26A developer</td>
			<td>Chimie Tech Services</td>
			<td></td>
			<td>To develop positive S1805 photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic pipette 3 mL</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P100 Petri dishes</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS+20ES1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent scotch tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square wipes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>115-2148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>DUTSCHER</td>
			<td>90260</td>
			<td>Plastic paraffin film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Methacryloxypropyl)trichlorosilane</td>
			<td>abcr</td>
			<td>AB 109004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS and curing agent Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropanol</td>
			<td></td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957 - 50 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>02865</td>
			<td>99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-methacryloxypropyl-trimethoxysilane</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>M6514-25ML</td>
			<td>(C4H5O2)-(CH2)3- Si(OCH3)3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>71251-5ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 10kW conjugated with Alexa488</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>D22910</td>
			<td>Absoprtion at 488 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 10kW conjugated with Alexa647</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>D22914</td>
			<td>Absoprtion at 647 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>21090-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax 200 mM</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate GIBCO 100 mM</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>15710-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 10x</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>14180-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes 1M</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59418C-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal without phenol red</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>12348-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine in Matlab for background normalization</td>
			<td>Quantacell</td>
			<td>Contact Victor Racine: victor.racine@quantacell.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To select specific ROI for image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine</td>
			<td>Matlab</td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution volume imaging of neurons by the use of fluorescence exclusion method and dedicated microfluidic devices

볼륨은 다른 시간의 척도에 신경 세포의 생리 및 병리학 특성에 관한 중요 한 매개 변수입니다. 신경은 그들의 확장된 없는 형태학에 관한 매우 독특한 셀 고 따라서 볼륨 측정에 대 한 여러 방법론 도전을 모집. 신경 성장 체 외에서 의 특별 한 경우 선택한 방법론 하위 미세 축 해상도 전체 필드 관찰 시간 또는 일 분에서 시간의 척도에 함께 포함 되어야 합니다. 셀 모양 재건 confocal 영상, 전기 기반 측정 또는 원자 힘 현미경을 사용 하 여 같은 다른 방법과 달리 최근에 개발 된 형광 제외 방법 (FXm) 이러한 과제를 수행 하기 위해 잠재력이 있다. 그러나, 그것의 원리에서 간단한 되 고, 있지만 신경에 대 한 고해상도 FXm 구현의 여러 조정 및 전용된 방법론 필요 합니다. 선물이 여기 형광 제외, 낮은 거칠기 다중 구획 미세 장치, 그리고 마지막으로 로컬 신경 볼륨의 생체 외에서 측정을 달성 하기 위해 micropatterning의 조합에 따라 하는 방법. 장치에서 제공 하는 높은 해상도 사용 하 여 신경 프로세스 (neurites)의 로컬 볼륨 및 볼륨 성장 콘 (Gc) 같은 신경 성장에 관련 된 몇 가지 특정 구조의 측정 수 있었습니다.

섹션 1과 2에에서 설명 된 제조 과정의 결과 그림 1A의 이미지에 의해 설명 된다-1B 및 그림 1C의 곡선. 그림 1D 의 PDMS 칩, 즉 중앙에서과 20 µ m 높은 다음 중간 챔버의 2 개의 다른 대표 지역의 거칠기 값을 표시합니다. 약 7 배 거칠기 감소 수-8 포토 레지스트 대신 에칭된 Si 웨이퍼를 사용 하 여 얻은 되었습니다. 다음, FXm 10 µ m 높은 챔버 내에서 알려진된 형상 (그림 2A)의 감광 스트라이프에 적용 처음 했다. 이미지 처리 및 강도 높이 변환 후 ( 그림 2B의 그래프 참조),이 스트라이프 (그림 2C) 따라 횡단면에 FXm 프로필 원하는 높이 프로필 (그림 2D) 제공. 그림 2D 기계 profilometry 및 FXm 메서드를 사용 하 여 얻은 프로필 간의 비교를 보여 줍니다. 가장자리와 고원 값을 포함 하 여 이러한 프로필은 매우 유사 하 고, 메서드를 유효성 검사. FXm 데이터의 분산 더 그림 3 및 그림 4, 평가 방법의 궁극적인 해상도의 대표는 하지만 결과 낮은 강도에서 매우 약한의 가능한 효과 피하기 위해 고용 자동-감광 GFP 채널에서의 형광.
그런 다음, 3 µ m에 10 µ m 높은 챔버 (그림 3) neurites를 관찰합니다. 배경 잡음의 표준 편차는 약 18 nm 강도 높이 변환 및 배경 개정 후. 이 값은 실제 실리콘 표면에 casted PDMS 표면 거칠기 보다 약간 더 높은 (12 nm, 그림 1D의 표 참조) 수 8 금형에서 얻은 PDMS에 측정 하는 거칠기 보다 훨씬 낮은 하지만. 이러한 결과 기둥을 쓰-8 포토 레지스트로 구멍을 열고 보다는 실리콘 웨이퍼에 우물을 시추의 부가 가치를 강조 표시 합니다. 이러한 낮은 값 그림 3A에 표시 된 것 같은 볼륨에서 높은 신호를 잡음 비율과 매우 명확한 이미지를 수 있습니다. 그러한 이미지에서 검색할 수 있는 데이터의 예를 들어, 우리는 1.6 µ m (즉, 10 픽셀) 넓은 neurite 볼륨 계산 슬라이스 ( 그림 3B의 그래프 참조). 약 400의 평균 neurite 높이 가치를 제공를 사용 하 여 첫 번째 근사에서 이러한 데이터의 선형 적합 nm, 비교 예 10 일 신체 callosum 5내의 오래 된 새끼 있는 500 nm axonal 직경. 우리 또한 함께 FXm 접착 직렬 abutted 2 µ m와 6 µ m 길이에서 30 µ m의 넓은 줄무늬의 구성의 micropatterns. 우리의 목표는 3D 모양에 neurite 폭의 영향을 연구 했다. 그림 3C 3D 표현 10 µ m 높은 상공에서 얻은 이미지를 전체 신경의 잘못 된 색상 표시 합니다. Soma는 큰 줄무늬의 말단에 위치 하 고 있습니다 반면 Neurites 2 µ m와 6 µ m 넓은 줄무늬에 퍼지고 있다. 높이 프로 파일은 세 가지 다른 횡단면에 당겨 졌다. 그림 3A에 표시 하는 그래프와 일관성, 표면 (그림 3D) neurite 폭 횡단면 증가 이상의 통합.
우리는 또한 성장 콘 (GC) 3D 구조에 집중 했다. 그림 4 A B 두 가지 GC 프로필 3 µ m 높은 상공에는 그들의 분기 하위 구조를 강조 표시 합니다. 또한, 우리는 12 µ m 높은 상공에서 Gc의 볼륨의 역학에 따라 시간 경과 실험을 수행. 그림 4C 축소의 주기 및 몇 분의 시간 규모에서 주어진된 GC의 재 활성화를 표시합니다. GFP lifeact 마우스를 사용 하 여, 덕분에 성장 콘 GFP 방출 파장에 현지 했다 (510 nm) 그들의 높은 걸 집중에서. 파장에서 식별 하는 표면 647에서 dextran 방출 파장에 통합 하는 데 사용 되었다 GC 볼륨을 계산 하는 nm. 그림 4D 마침내 약 6 µ m3의 값을 중심으로 3 개의 다른 뉴런에 다른 시간 지점 및 위치에서 GC 볼륨의 분포가 표시 됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2.jpg"> 그림 1: FXm PDMS 챔버. (A)는 4 개의 다른 단계 최종 금형에 지도 제작의의 음모. 입구, 출구 및 저수지의 위치 표시 됩니다. 스케일 바: 1 mm. (B) 광 profilometer를 사용 하 여 얻은 PDMS FXm 챔버의 이미지. 이 이미지는 10 µ m 높은 기둥의 3 행과 20, 50, 90 µ m 높이 중간 챔버를 포함 하는 중앙 챔버를 보여줍니다. 눈금 막대: 500 µ m. (C) (B)에 그려진 두 개의 점선 따라 칩의 횡단면 뷰. 옐로우/골드: 기둥, 블루 따라 횡단면: 기둥 사이의 횡단면. (D) PDMS 거칠기의 값 측정 50 × 50 µ m2 지역에 실리콘 성형 20 µ m 높은 수-8 중간 챔버에 의미 (이 분야의 위치에 대 한 화살표 참조). 평균 값은 세 가지 영역 측정에서 얻은 했다. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig2.jpg"> 그림 2: 감광 제 스트라이프를 사용 하 여 관심의 대상으로 FXm 방법의 교정. (A)는 10 µ m 높은 상공에서 찍은 GFP 형광 이미지 가득한 10000 MW dextran 488에서 흡수 1 mg/mL에서 nm. (B: 배경, p: 기둥)입니다. 건조 40 X 나 0.8 목표 관찰. 눈금 막대: 50 µ m. (B) 선형 보정 법칙은 두 색된 사각형 (A)에 표시 된 파란색 파선의 수준에서 얻은 대답 (C) 형광 강도 프로필에 표시는 포토 레지스트 교차의 평균 강도에서 얻은 스트라이프 (0.45 μ m 높은 긍정적인 감광 제)입니다. (D) (B) (파란색 점)의 데이터의 높이 변환 강도 후 기계 profilometer (검은 점) 및 FXm에서 얻어진 프로 파일의 비교. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56923/56923fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig3.jpg"> 그림 3: Neurite 볼륨 이미징. (A) Neurite 다음 15 µ m 중간 챔버에 위치한 소마에서 중앙 3 µ m 높은 챔버로 확장. 488에서 10000 MW dextran 흡수를 사용 하 여 수행 하는 이미징 및 40 X, 나 0.8 건조 목표. 인세트 두 neurites와 오른쪽에 그래프를 선택한 배경 감소 일상적인 하이라이트의 사용 후 얻은. 스케일 바: 30 µ m. (B) Neurite 슬라이스 볼륨 neurite 폭의 기능으로 (A)에 표시 된 22 프로필 (평균 10 픽셀, 즉 1.6 µ m "neurite 조각"에)에서 얻은. 실선은 슬로프 0.4 µ m 원점 통과의 선형 적합을 나타냅니다. (C) 접착 부분에 꽃무늬 신경의 거짓 컬러 이미지 연속 2 µ m와 6 µ m 넓은 젊고 아름 다운 여자 (흰색에서 표현) 했다. 647에서 흡수 10000 MW dextran 가득 10 µ m 높은 상공에서 측정 되었다 및 40 x 나를 사용 하 여 0.8 건조 목표. ((D)) 높이 프로 파일에 해당 하는 색된 점선된 라인 (C)에 표시 된 동일한 색상 코드를 유지. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56923/56923fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig4.jpg"> 그림 4: 정적 및 동적 성장 콘 영상. (A-B) 성장 원뿔 높이 프로 파일 관련된 이미지에 표시 된 노란색 라인을 따라 높이 변환 강도 후 3 µ m 높은 상공에서 얻은. 10000 MW dextran 488에서 흡수와 채우기를 사용 하 여 수행 하는 관측 및 40 X, 나 0.8 건조 목표. (C) 전체 신경 영상 12 µ m 높은 상공에 가득 10000 MW dextran 647에서 흡수 nm. 관찰 두 가지 형광 채널 변경: 성장 콘 지역화 (노란 점선), 및 형광 제외에서 GC 볼륨 계산 CY5 GFP. 파선 노란색으로 포함 하는 표면 GC 볼륨을 계산 하기 위해 사용 되었다. 그래프는 두 대표 다른 시간 지점에서 GFP와 CY5 채널에 시간, 및 관련 된 형태학 GC 볼륨의 변화를 보여줍니다. 모든 데이터는 40 x 나를 사용 하 여 인수 했다 0.8 건조 목적은 모든 3 분 스케일 바: 10 µ m. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56923/56923fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>단계</td>
			<td>1:8 µ m 레이어 마스크</td>
			<td>마스크 2시 30분 µ m 층</td>
			<td>마스크 3시 40분 µ m 층</td>
		</tr>
<tr>
<td>수-8 종류</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s @ 2000 rpm</td>
			<td>30 s 3050 rpm @</td>
			<td>30 s 3250 rpm @</td>
		</tr>
<tr>
<td>부드러운 빵</td>
			<td>95 ° C @ 3 분</td>
			<td>65 ° C + 6 분 95 ° C @ @ 2 분</td>
			<td>65 ° C + 7 분 95 ° C @ @ 3 분</td>
		</tr>
<tr>
<td>노출 에너지</td>
			<td>110 mJ/cm2
</td>
			<td>155 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>사후 노출 빵</td>
			<td>95 ° C @ 4 분</td>
			<td>1 분 65 ° C + 6 분 95 ° C @ @</td>
			<td>65 ° C + 7 분 95 ° C @ @ 2 분</td>
		</tr>
<tr>
<td>개발</td>
			<td>2 분 30 초</td>
			<td>5 분</td>
			<td>6 분</td>
		</tr>
<tr>
<td>하드 빵 (옵션)</td>
			<td>200 ° C @ 3-5 분</td>
			<td>200 ° C @ 3-5 분</td>
			<td>200 ° C @ 3-5 분</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 사진 평판 단계 12 μ m 높이 중앙 챔버를 포함 하는 장치를 만들려고 수행. 중간 챔버의 높이: 20, 50, 90 µ m.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>단계</td>
			<td>마스크 1시 10분 µ m 층</td>
			<td>마스크 2시 30분 µ m 층</td>
			<td>마스크 3시 40분 µ m 층</td>
		</tr>
<tr>
<td>수-8 종류</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s 1500 rpm @</td>
			<td>30 s 3050 rpm @</td>
			<td>30 s 3250 rpm @</td>
		</tr>
<tr>
<td>부드러운 빵</td>
			<td>95 ° C @ 3 분</td>
			<td>65 ° C + 6 분 95 ° C @ @ 2 분</td>
			<td>65 ° C + 7 분 95 ° C @ @ 3 분</td>
		</tr>
<tr>
<td>노출 에너지</td>
			<td>125 mJ/cm2
</td>
			<td>155 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>사후 노출 빵</td>
			<td>95 ° C @ 4 분</td>
			<td>1 분 65 ° C + 6 분 95 ° C @ @</td>
			<td>65 ° C + 7 분 95 ° C @ @ 2 분</td>
		</tr>
<tr>
<td>개발</td>
			<td>2 분 30 초</td>
			<td>5 분</td>
			<td>6 분</td>
		</tr>
<tr>
<td>하드 빵 (옵션)</td>
			<td>200 ° C @ 3-5 분</td>
			<td>200 ° C @ 3-5 분</td>
			<td>200 ° C @ 3-5 분</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 사진 평판 단계 높이에서 10 μ m의 중앙 챔버를 포함 하는 장치를 만들려고 수행. 중간 챔버의 높이: 20, 50, 90 µ m.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>단계</td>
			<td>마스크 1시 12분 µ m 층</td>
			<td>마스크 2시 32분 µ m 층</td>
			<td>마스크 3시 40분 µ m 층</td>
		</tr>
<tr>
<td>수-8 종류</td>
			<td>2015</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s 3250 rpm @</td>
			<td>30 s 2500 rpm @</td>
			<td>30 s 3250 rpm @</td>
		</tr>
<tr>
<td>부드러운 빵</td>
			<td>95 ° C @ 3 분</td>
			<td>65 ° C + 5 분 95 ° C @ @ 2 분</td>
			<td>65 ° C + 7 분 95 ° C @ @ 3 분</td>
		</tr>
<tr>
<td>노출 시간</td>
			<td>140 mJ/cm2
</td>
			<td>157 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>사후 노출 빵</td>
			<td>95 ° C @ 4 분</td>
			<td>1 분 65 ° C + 5 분 95 ° C @ @</td>
			<td>65 ° C + 7 분 95 ° C @ @ 2 분</td>
		</tr>
<tr>
<td>개발</td>
			<td>3 분</td>
			<td>5 분</td>
			<td>6 분</td>
		</tr>
<tr>
<td>하드 빵 (옵션)</td>
			<td>200 ° C @ 3-5 분</td>
			<td>200 ° C @ 3-5 분</td>
			<td>200 ° C @ 3-5 분</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3: 사진 평판 단계 높이에서 3 μ m의 중앙 챔버를 포함 하는 장치를 만들려고 수행. 중간 챔버의 높이: 18, 50, 90 µ m.
추가 데이터 1: masks_neuron_volume_chips.tiff. PDMS 장치 (DRIE 마스크와 마스크 1-3)를 조작 하는 데 사용 하는 마스크의 개요 보기. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.tiff">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 데이터 2: 파일 "masks_neuron_volume_chips.dxf". 전자 파일 조작 DRIE 마스크와 마스크 1-3 하 수 있도록 합니다. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.dxf">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 데이터 3: "Mask_Photoresist stripes.dxf". 전자 파일 레지스트 줄무늬의 포토 리소 그래피에 사용 되는 마스크를 조작 수 있도록 합니다. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56923/Mask_Photoresist-stripes.dxf">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 데이터 4: 파일: conversion_mattotiff.m <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56923/conversion_mattotiff.m">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 데이터 5: 파일: importfilevol.m <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56923/importfilevol.m">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

볼륨은 세포의 생리 및 병리학 적 특성에 관한 중요 한 매개 변수입니다. Neurites 및 신경 성장에 동적 구조 분석에 필요한 하위 미세 축 분해능으로 생체 외에서 신경 볼륨의 전체 필드 측정을 허용 하는 형광 제외 방법을 설명 합니다.

고해상도 볼륨 이미징의 뉴런 형광의 사용 제외 방법에 의해 및 미세 장치 전용

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique ...

high-resolution-volume-imaging-neurons-use-fluorescence-exclusion

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.0K 조회수.  Université PSL, CNRS. 볼륨은 세포의 생리 및 병리학 적 특성에 관한 중요 한 매개 변수입니다. Neurites 및 신경 성장에 동적 구조 분석에 필요한 하위 미세 축 분해능으로 생체 외에서 신경 볼륨의 전체 필드 측정을 허용 하는 형광 제외 방법을 설명 합니다.

비디오: High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

출생 후의 두뇌에의 연결을 마이 그 레이션의 고해상도 시간 경과 이미징을위한 Organotypic 슬라이스 분석

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

연구

신경과학

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are characteristic to neurons in both normal and diseased brain. Towards this, a great deal of effort has been placed on building high-resolution neuroanatomical maps1-3. With the expansion of molecular genetics and advances in light microscopy has come the ability to query not only neuronal morphologies, but also the molecular and cellular makeup of individual neurons and their associated networks4. Major advances in the ability to mark and manipulate neurons through transgenic and gene targeting technologies in the rodent now allow investigators to 'program' neuronal subsets at will5-6. Arguably, one of the most influential contributions to contemporary neuroscience has been the discovery and cloning of genes encoding fluorescent proteins (FPs) in marine invertebrates7-8, alongside their subsequent engineering to yield an ever-expanding toolbox of vital reporters9. Exploiting cell type-specific promoter activity to drive targeted FP expression in discrete neuronal populations now affords neuroanatomical investigation with genetic precision.
Engineering FP expression in neurons has vastly improved our understanding of brain structure and function. However, imaging individual neurons and their associated networks in deep brain tissues, or in three dimensions, has remained a challenge. Due to high lipid content, nervous tissue is rather opaque and exhibits auto fluorescence. These inherent biophysical properties make it difficult to visualize and image fluorescently labelled neurons at high resolution using standard epifluorescent or confocal microscopy beyond depths of tens of microns. To circumvent this challenge investigators often employ serial thin-section imaging and reconstruction methods10, or 2-photon laser scanning microscopy11. Current drawbacks to these approaches are the associated labor-intensive tissue preparation, or cost-prohibitive instrumentation respectively.
Here, we present a relatively rapid and simple method to visualize fluorescently labelled cells in fixed semi-thick mouse brain slices by optical clearing and imaging. In the attached protocol we describe the methods of: 1) fixing brain tissue in situ via intracardial perfusion, 2) dissection and removal of whole brain, 3) stationary brain embedding in agarose, 4) precision semi-thick slice preparation using new vibratome instrumentation, 5) clearing brain tissue through a glycerol gradient, and 6) mounting on glass slides for light microscopy and z-stack reconstruction (Figure 1).
For preparing brain slices we implemented a relatively new piece of instrumentation called the 'Compresstome' VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). This instrument is a semi-automated microtome equipped with a motorized advance and blade vibration system with features similar in function to other vibratomes. Unlike other vibratomes, the tissue to be sliced is mounted in an agarose plug within a stainless steel cylinder. The tissue is extruded at desired thicknesses from the cylinder, and cut by the forward advancing vibrating blade. The agarose plug/cylinder system allows for reproducible tissue mounting, alignment, and precision cutting. In our hands, the 'Compresstome' yields high quality tissue slices for electrophysiology, immunohistochemistry, and direct fixed-tissue mounting and imaging. Combined with optical clearing, here we demonstrate the preparation of semi-thick fixed brain slices for high-resolution fluorescent imaging.

Here we describe a rapid and simple method to image fluorescently labeled cells in semi-thick brain slices. By fixing, slicing, and optically clearing brain tissue we describe how standard epifluorescent or confocal imaging can be used to visualize individual cells and neuronal networks within intact nervous tissue.

세미 두께 뇌 조각의 고해상도 형광 이미징에 대한 빠른 접근

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

인간 Midbrain위한 고해상도 기능성 자기 공명 영상 방법

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

개발 Neuroepithelium의 세포 문제의 고해상도 라이브 영상

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has been heavily studied. While many imaging studies treat the hippocampus as a single unitary neuroanatomical structure, it is, in fact, composed of several subfields that have a complex three-dimensional geometry. As such, it is known that these subfields perform specialized functions and are differentially affected through the course of different disease states. Magnetic resonance (MR) imaging can be used as a powerful tool to interrogate the morphology of the hippocampus and its subfields. Many groups use advanced imaging software and hardware (&#62;3T) to image the subfields; however this type of technology may not be readily available in most research and clinical imaging centers. To address this need, this manuscript provides a detailed step-by-step protocol for segmenting the full anterior-posterior length of the hippocampus and its subfields: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus (DG), strata radiatum/lacunosum/moleculare (SR/SL/SM), and subiculum. This protocol has been applied to five subjects (3F, 2M; age 29-57, avg. 37). Protocol reliability is assessed by resegmenting either the right or left hippocampus of each subject and computing the overlap using the Dice&#39;s kappa metric. Mean Dice&#39;s kappa (range) across the five subjects are: whole hippocampus, 0.91 (0.90-0.92); CA1, 0.78 (0.77-0.79); CA2/CA3, 0.64 (0.56-0.73); CA4/dentate gyrus, 0.83 (0.81-0.85); strata radiatum/lacunosum/moleculare, 0.71 (0.68-0.73); and subiculum 0.75 (0.72-0.78). The segmentation protocol presented here provides other laboratories with a reliable method to study the hippocampus and hippocampal subfields in vivo using commonly available MR tools.

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The goal of this manuscript is to study the hippocampus and hippocampal subfields using MRI. The manuscript describes a protocol for segmenting the hippocampus and five hippocampal substructures: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus, strata radiatum/lacunosum/moleculare, and subiculum.

높은 해상도<em&gt; 생체</em&gt; 3T 자기 공명 영상을 이용하여 인간의 해마 서브 필드에 대한 수동 분할 프로토콜

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena are not well understood yet. In particular, the role of innervation in tooth development and regeneration is neglected.
Several in vivo studies have provided important information about the patterns of innervation of dental tissues during development and repair processes of various animal models. However, most of these approaches are not optimal to highlight the molecular basis of the interactions between nerve fibres and target organs and tissues.
Co-cultures constitute a valuable method to investigate and manipulate the interactions between nerve fibres and teeth in a controlled and isolated environment. In the last decades, conventional co-cultures using the same culture medium have been performed for very short periods (e.g., two days) to investigate the attractive or repulsive effects of developing oral and dental tissues on sensory nerve fibres. However, extension of the culture period is required to investigate the effects of innervation on tooth morphogenesis and cytodifferentiation.
Microfluidics systems allow co-cultures of neurons and different cell types in their appropriate culture media. We have recently demonstrated that trigeminal ganglia (TG) and teeth are able to survive for a long period of time when co-cultured in microfluidic devices, and that they maintain in these conditions the same innervation pattern that they show in vivo.
On this basis, we describe how to isolate and co-culture developing trigeminal ganglia and tooth germs in a microfluidic co-culture system.This protocol describes a simple and flexible way to co-culture ganglia/nerves and target tissues and to study the roles of specific molecules on such interactions in a controlled and isolated environment.

Co-cultures represent a valuable method to study the interactions between nerves and target tissues and organs. Microfluidic systems allow co-culturing ganglia and whole developing organs or tissues in different culture media, thus representing a valuable tool for the in vitro study of the crosstalk between neurons and their targets.

미세 유체 공동 문화 장치를 사용하여 치아 세균 신경 분포를 개발 분석

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of structural MRI in vivo is ultimately limited by physiological noise, including pulsation, respiration and head movement. Although imaging hardware continues to improve, it is still difficult to resolve structures on the millimeter scale. For example, the primary visual sensory pathways synapse at the lateral geniculate nucleus (LGN), a visual relay and control nucleus in the thalamus that normally is organized into six interleaved monocular layers. Neuroimaging studies have not been able to reliably distinguish these layers due their small size that are less than 1 mm thick.
The resolving limit of structural MRI, in a postmortem brain was tested using multiple images averaged over a long duration (~24 h). The purpose was to test whether it was possible to resolve the individual layers of the LGN in the absence of physiological noise. A proton density (PD)1 weighted pulse sequence was used with varying resolution and other parameters to determine the minimum number of images necessary to be registered and averaged to reliably distinguish the LGN and other subcortical regions. The results were also compared to images acquired in living human brains. In vivo subjects were scanned in order to determine the additional effects of physiological noise on the minimum number of PD scans needed to differentiate subcortical structures, useful in clinical applications.

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Here we present a protocol to determine the minimum number images that needed to be registered and averaged to resolve subcortical structures and test whether the individual layers of the LGN could be resolved in the absence of physiological noise.

인간 Subcortex의 고해상도 구조 자기 공명 영상<I&gt; 생체</I&gt; 및 사후

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible are badly known. Excitotoxicity, a process believed to contribute to neuron damage induced by both insults, is mediated by activation of glutamate receptors that promotes Ca2+ influx and mitochondrial Ca2+ overload. A substantial change in intracellular Ca2+ homeostasis or remodeling of intracellular Ca2+ homeostasis may favor neuron damage in old neurons. For investigating Ca2+ remodeling in aging we have used live cell imaging in long-term cultures of rat hippocampal neurons that resemble in some aspects aged neurons in vivo. For this end, hippocampal cells are, in first place, freshly dispersed from new born rat hippocampi and plated on poli-D-lysine coated, glass coverslips. Then cultures are kept in controlled media for several days or several weeks for investigating young and old neurons, respectively. Second, cultured neurons are loaded with fura2 and subjected to measurements of cytosolic Ca2+ concentration using digital fluorescence ratio imaging. Third, cultured neurons are transfected with plasmids expressing a tandem of low-affinity aequorin and GFP targeted to mitochondria. After 24 hr, aequorin inside cells is reconstituted with coelenterazine and neurons are subjected to bioluminescence imaging for monitoring of mitochondrial Ca2+ concentration. This three-step procedure allows the monitoring of cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to relevant stimuli as for example the glutamate receptor agonist NMDA and compare whether these and other responses are influenced by aging. This procedure may yield new insights as to how aging influence cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to selected stimuli as well as the testing of selected drugs aimed at preventing neuron cell death in age-related diseases.

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

하는 세포 칼슘의 형광 및 생물 발광 영상<sup&gt; 2 +</sup&gt; 노인 해마 신경 세포에서

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

망막 리본 시냅스에서 막 수용체의 고해상도 양이 Immunogold 분석

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. Transcytosis across the BBB regulates the delivery of hormones, metabolites, and therapeutic antibodies to the brain parenchyma. Here, we present a protocol that combines immunofluorescence of free-floating sections with laser scanning confocal microscopy and image analysis to visualize subcellular organelles within endothelial cells at the BBB. Combining this data-set with 3D image analysis software allows for the semi-automated segmentation and quantification of capillary volume and surface area, as well as the number and intensity of intracellular organelles at the BBB. The detection of mouse endogenous immunoglobulin (IgG) within intracellular vesicles and their quantification at the BBB is used to illustrate the method. This protocol can potentially be applied to the investigation of the mechanisms controlling BBB transcytosis of different molecules in vivo.

Here we present a microscopy-based protocol for high-resolution imaging and a three-dimensional reconstruction of the mouse neurovascular unit and blood-brain barrier using brain free-floating sections. This method allows for the visualization, analysis, and quantification of intracellular organelles at the BBB.

혈액-뇌 장벽의 고해상도 Confocal 영상: 영상, 3 차원 재구성 및 Transcytosis의 정량화

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...