이 연구는 공공, 상업, 또는 하지-위한-비영리 부문에 자금 지원 기관에서 어떤 특정 그랜트를 받지 않았다.

모든 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 다이 이치 산 쿄 주식회사에 의해 승인 되었다
1. 샘플 준비
<ol><li>EDTA 2 K 포함 된 튜브에 cynomolgus 원숭이의 대 퇴 정 맥에서 혈액 (적어도 0.5 mL)를 수집 합니다. 참고: 시트르산과 헤 파 린 허용 되지 않습니다 때문에 이러한 응고 억제 이후 PCR14,15.</li>
	<li>즉시 얼음과 컬렉션의 2 시간 이내 플라즈마 격리 프로세스에 수집 된 샘플을 놓습니다.</li>
	<li>5 분 동안 4 ° C에서 10000 x g에서 샘플 원심</li>
	<li>2 mL microtube, 세포 파편 및 잔여 혈소판을 제거 하 5 분 동안 4 ° C에서 16000 x g에서 원심 분리 뒤에 상쾌한을 전송 합니다. 참고: 정량화 miRNAs의 혈소판 오염16에 의해 크게 달라질 수 있습니다.</li>
	<li>신선한 2 mL-microtubes에 상쾌한의 200 µ L aliquots를 놓고 사용까지-80 ° C에 저장 합니다. 참고: 각 샘플의 고정된 볼륨은 사용할 RNA 추출; 따라서,는 약 수의 볼륨 정확 해야 합니다.</li>
</ol>2. RNA 추출
<ol><li>냉동된 샘플 (1.5 단계)에서 얼음에 녹여<ol>
<li>계속 샘플 차가운 얼음에 RNA 추출 하는 동안. 세포 시 약을 진정 하 고 사용 하기 전에 얼음에 클로 프롬.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포 시 약, 포함 하는 샘플 (200 µ L), 페 놀 및 guanidine isothiocyanate monophasic 솔루션의 5 볼륨 (1000 µ L)를 추가 하 고 1 분 동안 vortexing에 의해 적극적으로 혼합.</li>
	<li>5 nM 합성의 5 µ L 추가 꼬마 선 충 미르 (Syn-cel-미르-238-3 p).</li>
	<li>클로 프롬의 1 볼륨 (200 µ L)를 추가 하 고 1 분 동안 vortexing에 의해 적극적으로 혼합.</li>
	<li>2 ~ 3 분 동안 얼음에 유지 하 고 15 분 동안 4 ° C에서 12000 x g에서 샘플을 원심.</li>
	<li>신중 하 게 새로운 microtube 수성 단계 전송. 참고: 유기 단계 (빨간색) 또는 interphase (흰색)를 전송 하지 않습니다. 수집 된 수성 단계의 볼륨 증가 기술 변화에서 결과 불일치를 처리 하지 않도록 균일 해야 한다. 이 프로토콜에 수성 단계의 일반적인 금액 650 µ L 이었다.</li>
	<li>에탄올, 1.5 볼륨 (975 µ L)를 추가 하 고 아래로 pipetting으로 잘 혼합.</li>
	<li>해당 열과 어댑터, 진공 건조 진공 매니폴드를 사용 하 여 3 분 뒤에 샘플을 전송 합니다. 샘플 볼륨 이상 700 µ L 이면 나머지 솔루션을 처리 하려면이 단계를 반복 합니다. 참고: 열 기반 RNA 격리 진공 및 원심 분리 방법와 호환 됩니다.</li>
	<li>뒤에 1 분 동안 진공 건조 열에 에탄올의 200 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>뒤에 2 분 동안 진공 건조 열 RWT 버퍼의 800 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>RPE 버퍼의 800 µ L 뒤에 2 분 동안 진공 건조 하 여 열을 추가 합니다.</li>
	<li>2.11 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>뒤에 1 분 동안 진공 건조 열에 에탄올의 300 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>새로운 microtube에 열을 배치 하 고 1 분 동안 실 온 (15 ~ 25 ° C)에서 12000 x g에서 원심.</li>
	<li>새로운 microtube에 열을 전송 하 고 nuclease 무료 물 50 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>실 온 (15 ~ 25 ° C)에서 3 분, 그리고 1 분 동안 실 온 (15 ~ 25 ° C)에서 8000 × g에서 원심 분리기에 대 한 서.</li>
	<li>다시는 eluate 열에 적용 됩니다.</li>
	<li>2.16, 단계를 반복 하 고 사용까지 eluate-80 ° C에서 저장.</li>
</ol>3입니다. cDNA 합성
<ol><li>(단계 2.18)에서 냉동된 샘플 녹여</li>
	<li>
대상 miRNAs에 해당 하는 합성 RNA oligonucleotides의 알려진된 농도 준비 합니다.
	<ol>
<li>합성 RNA oligonucleotide를 사용 하 여 정량에서 표준 곡선을 생성 하기 위한. 1 x 108 복사 / µ L 농도의 재고 솔루션 스토리지 목적을 위해 준비가 되어 있습니다.</li>
		<li>재고 솔루션을 1 x 107 복사 / µ L (하지 미리 증폭된 샘플) 또는 1 x 105 복사 / µ L (미리 증폭된 샘플) 작업 솔루션 표준 곡선을 만들기 위한 가장 높은 농도 10 배 희석. 일반적으로, 표준 곡선 농도 대 한 제안된 범위는 1 x 102 복사 / µ L (하지 미리 증폭된 샘플)을 1 x 107 또는 1 x 100 복사 / µ L (미리 증폭된 샘플)을 1 x 105 .</li>
	</ol>
</li>
	<li>멀티플렉스 RT 뇌관 수영장 대상 miRNAs에 대 한 20 x RT 뇌관의 동일한 볼륨을 혼합 하 여 준비 합니다. 참고: 지금까지 그림 2에서 같이에 포함 된 최대 4 대상 miRNAs 수영장 수영장에서 miRNAs의 각각의 20 배 RT 뇌관을 혼합 하 여 만들 수 있습니다. Cel-미르-238 (외부 제어) 각 관에서 대상 miRNAs의 하나로 포함 되어야 합니다. 미만 4 대상 miRNAs의 경우 20 x RT 뇌관 대신 1/10 테 버퍼의 동일한 볼륨을 추가 합니다.</li>
	<li>RT 반응 혼합 준비: 3 µ L RT 뇌관의 dTTP와 100mm dNTPs의 0.15 µ L, 역전사 (50 U / µ L), RT 버퍼 x 1.5 µ L 10, RNase 억제제 (20 U / µ L)의 0.19 µ L의 1 µ L (3.3 단계)에서 수영장 및 4.16 µ L nuclease 무료의 물.</li>
	<li>RT 반응의 믹스 10 µ L pipetting, 여 (3.1 단계)에서 RNA 샘플 또는 (3.2 단계)에서 oligonucleotides의 5 µ L를 혼합 하 고 5 분 동안 얼음에 품 어.</li>
	<li>열 cycler 기구에 반전 녹음 방송 실행: 16 ° C 30 분, 30 분 동안 42 ° C에 대 한 다음 5 분에 85 ° C에서 최종 역전사 비활성화 단계 저장소 역방향 베낀된 샘플-80 ° C에서 사용까지.</li>
</ol>4입니다. preamplification (선택 사항)
참고: Cq 값 35 또는 후속 정량에 더 이상 보여 주는 miRNAs는 미리 증폭.
<ol><li>냉동된 샘플 (3.6 단계)에서 녹여</li>
	<li>10 직렬 희석 합성 RNA oligonucleotides;에서 실시간 제품의 확인 1 x 10을 1 x 100 복사 / µ L 표준 곡선을 생성 하기 위한5 .</li>
	<li>대상 miRNAs 200-fold 묽 게 되 고 각 분석 결과 뇌관의 최종 농도 대 한 분석 결과 뇌관 x 20의 다중 분석 결과 뇌관 풀 같은 볼륨 (5 µ L)를 혼합 하 여 준비 테 버퍼 1000 µ L의 최종 볼륨에 의해. 참고: 해당 대상 miRNAs 사전 증폭 없이 cel-미르-238 (외부 제어)에 대 한 후속 정량에서 감지 수 분석 결과 뇌관 뇌관 수영장에는 포함 되지 않습니다.</li>
	<li>사전 증폭 반응 혼합물 준비: 2 x 준비-사용 preamplification 시 약, 분석 결과 뇌관 풀 (4.3 단계)에서 3.75 µ L nuclease 무료 물 6.25 µ L의 12.5 µ L.</li>
	<li>사전 증폭 반응의 µ L 믹스 22.5 pipetting, 여 역 베낀된 샘플 (4.1 단계) 또는 (4.2 단계)에서 oligonucleotides의 2.5 µ L를 혼합 하 고 5 분 동안 얼음에 품 어.</li>
	<li>반응 열 cycler 기구에 실행: 95 ° C 10 분; 15 s 및 4 분 동안 60 ° C까지 사용-80 ° C에 미리 증폭된 샘플을 저장 하는 동안 95 ° C의 12 주기 다음.</li>
</ol>5. 정량 실시간 PCR (정량)
<ol><li>냉동된 샘플 (3.6 단계 또는 단계 4.6)에서 녹여</li>
	<li>5-fold 샘플을 희석 소독 물.</li>
	<li>합성 RNA oligonucleotides;에서 파생 된 RT 제품의 10 연속 희석을 준비 1 x 102 복사 / µ L (하지 미리 증폭된 샘플)을 1 x 107 또는 1 x 105 1 x 100 복사 / µ L (미리 증폭된 샘플) 표준 곡선을 생성 합니다.</li>
	<li>정량 Pcr 반응 혼합 준비: 준비-사용 증폭 시 약, 분석 시 약, 앞으로 또는 반전 PCR 뇌관 및 조사 대상 미르에 포함 된 x 20의 1 µ L과 nuclease 무료 물 7 µ L x 2의 10 µ L.</li>
	<li>정량 Pcr 반응 혼합에서 빠른 광학 96-잘 반응 판 18 µ L를 전송 하 고 우물에 (단계 5.2 또는 5.3 단계)에서 희석 샘플 2 µ L를 추가 합니다. 참고: 샘플 및 정량에 대 한 표준을 설정 됩니다 중복에.</li>
	<li>접착 필름, 접시를 봉인 하 고 짧게 원심.</li>
	<li>반응 실시간 열 cycler에서 실행: 20 95 ° C 95 ° C의 45 주기 다음 s 1 s 및 20 60 ° C에 대 한 s.</li>
</ol>6. 데이터 분석
<ol><li>해당 실시간 열 cycler와 함께 작동 하는 데이터 분석 소프트웨어를 사용 하 여 각 샘플의 원시 복사본 수를 계산 합니다. 참고: 임계값 줄 설정 됩니다 수동으로 "1.0"은 연구에 모든 접시에 그들의 Cq vales 비교해보면 재현성 확인 하. Cq에서 차단 수준 설정 > 40 주기.</li>
	<li>중복에서 각 샘플의 원시 복사본 수의 평균을 계산 합니다.</li>
	<li>해당 관의 모든 샘플에서 cel-미르-238의 복사본 수의 평균에 의해 cel-미르-238 각 샘플에서의 복사본 수를 분할 하 여 수정 계수를 계산 합니다. 참고: 그림 2에서처럼 각 튜브 4 대상 miRNAs cel-미르-238 (외부 제어) 등까지 포함 합니다. 따라서, cel-미르-238의 해당 값을 사용 하 여 각 튜브에 대 한 수정 계수를 계산 합니다.</li>
	<li>(단계 6.2)에서 각 샘플의 평균된 원시 복사본 수를 분할 하 여 각 샘플 (단계 6.3)에서 수정 계수에 의해 조정된 복사본 수를 계산 합니다.</li>
	<li>여 (단계 6.4)에서 각 샘플의 조정된 원시 복사본 수를 곱하여 절대 복사본 수를 계산는 각 샘플에 대 한 희석 비율. 참고: 희석 요인은 단계 5.2에서 파생 되는이 프로토콜에 "5"입니다.</li>
	<li>로그 cDNA 농도 대 한 각 직렬 희석 Cq 값의 작의의 사면에서 PCR 증폭의 효율을 계산 합니다. 참고: 수식을 계산 하는 효율성; E = (10(-1/경사) -1) x 100%.</li>
	<li>계산 수식 E를 사용 하 여 모든 샘플에서 cel-미르-238의 Cq 값을 사용 하 여 기술 변화 = (2 x 확대 효능)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)). 참고: 6.5, 6.7 단계 절차의 품질 평가에 사용 됩니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sch&#246;ler, N., Langer, C., D&#246;hner, H., Buske, C., Kuchenbauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+microRNAs+as+a+novel+class+of+biomarkers:+a+comprehensive+review+of+the+literature.">Serum microRNAs as a novel class of biomarkers: a comprehensive review of the literature.</a> Exp. Hematol. 38, 1126-1130 (2010).</li><li>Viereck, J., Thum, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+Noncoding+RNAs+as+Biomarkers+of+Cardiovascular+Disease+and+Injury.">Circulating Noncoding RNAs as Biomarkers of Cardiovascular Disease and Injury.</a> Circ. Res. 120 (2), 381-399 (2017).</li><li>D'Alessandra, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+are+new+and+sensitive+biomarkers+of+myocardial+infarction.">Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction.</a> Eur Heart J. 31 (22), 2765-2773 (2010).</li><li>Chen, Y., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+of+quantitative+RT-PCR+array+in+miRNA+expression+profiling+and+comparison+with+microarray+analysis.">Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis.</a> BMC Genomics. 10, 407 (2009).</li><li>Nassirpour, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+tubular+injury+microRNA+biomarkers+in+urine:+comparison+of+next-generation+sequencing+and+qPCR-based+profiling+platforms.">Identification of tubular injury microRNA biomarkers in urine: comparison of next-generation sequencing and qPCR-based profiling platforms.</a> BMC Genomics. 15, 485 (2014).</li><li>Derveaux, S., Vandesompele, J., Hellemans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+do+successful+gene+expression+analysis+using+real-time+PCR.">How to do successful gene expression analysis using real-time PCR.</a> Methods. 50 (4), 227-230 (2010).</li><li>Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+the+need+for+qPCR+publication+guidelines?--The+case+for+MIQE.">Why the need for qPCR publication guidelines?--The case for MIQE.</a> Methods. 50 (4), 217-226 (2010).</li><li>Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+microRNA+biomarkers+in+plasma+and+serum+using+quantitative+reverse+transcription-PCR+(qRT-PCR).">Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR).</a> Methods. 50 (4), 298-301 (2010).</li><li>Thompson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+Measurement+of+Cardiac+Injury-Induced+microRNAs+in+Biofluids+across+Multiple+Test+Sites.">Absolute Measurement of Cardiac Injury-Induced microRNAs in Biofluids across Multiple Test Sites.</a> Toxicol Sci. 154 (1), 115-125 (2016).</li><li>Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S., Sakurai, K., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Analysis+of+Circulating+microRNA+Specific+to+the+Liver,+Heart,+and+Skeletal+Muscle+of+Cynomolgus+Monkeys.">Comprehensive Analysis of Circulating microRNA Specific to the Liver, Heart, and Skeletal Muscle of Cynomolgus Monkeys.</a> Int. J. Toxicol. 36 (3), 220-228 (2017).</li><li>Matsuzaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+novel+serum+biomarkers,+miR-1,+miR-133a,+and+miR-206+for+Limb-girdle+muscular+dystrophy,+Facioscapulohumeral+muscular+dystrophy,+and+Becker+muscular+dystrophy.">Three novel serum biomarkers, miR-1, miR-133a, and miR-206 for Limb-girdle muscular dystrophy, Facioscapulohumeral muscular dystrophy, and Becker muscular dystrophy.</a> Environ. Health. Prev. Med. 19 (6), 452-458 (2014).</li><li>Starkey Lewis, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+as+potential+markers+of+human+drug-induced+liver+injury.">Circulating microRNAs as potential markers of human drug-induced liver injury.</a> Hepatology. 54 (5), 1767-1776 (2011).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs,+potential+biomarkers+for+drug-induced+liver+injury.">Circulating microRNAs, potential biomarkers for drug-induced liver injury.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (11), 4402-4407 (2009).</li><li>Moldovan, L., Batte, K., Wang, Y., Wisler, J., Piper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+Circulating+MicroRNAs+in+Exosomes/Extracellular+Vesicles+from+Serum+or+Plasma+by+qRT-PCR.">Analyzing the Circulating MicroRNAs in Exosomes/Extracellular Vesicles from Serum or Plasma by qRT-PCR.</a> Methods Mol. Biol. 1024, 129-145 (2013).</li><li>Li, S., Chen, H., Song, J., Lee, C., Geng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+heparin+inhibition+in+circulating+MicroRNAs+amplification.">Avoiding heparin inhibition in circulating MicroRNAs amplification.</a> Int. J. Cardiol. 207, 92-93 (2016).</li><li>Cheng, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+processing+conditions+substantially+influence+circulating+microRNA+biomarker+levels.">Plasma processing conditions substantially influence circulating microRNA biomarker levels.</a> PLoS One. 8 (6), e64795 (2013).</li><li>Serafin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+set+of+endogenous+reference+genes+for+miRNA+expression+studies+in+Parkinson's+disease+blood+samples.">Identification of a set of endogenous reference genes for miRNA expression studies in Parkinson's disease blood samples.</a> BMC Res. Notes. 7, 715 (2014).</li><li>Akiyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+set+of+external+reference+controls/probes+that+enable+quality+assurance+between+different+microarray+platforms.">A set of external reference controls/probes that enable quality assurance between different microarray platforms.</a> Anal. Biochem. 472, 75-83 (2015).</li><li>Kirschner, M. B., van Zandwijk, N., Reid, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+microRNAs:+potential+biomarkers+in+need+of+standardized+reporting.">Cell-free microRNAs: potential biomarkers in need of standardized reporting.</a> Front Genet. 4, 56 (2013).</li><li>Malentacchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDIA-RNA:+second+external+quality+assessment+for+the+pre-analytical+phase+of+blood+samples+used+for+RNA+based+analyses.">SPIDIA-RNA: second external quality assessment for the pre-analytical phase of blood samples used for RNA based analyses.</a> PLoS One. 9 (11), e112293 (2014).</li><li>Sourvinou, I. S., Markou, A., Lianidou, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+circulating+miRNAs+in+plasma:+effect+of+preanalytical+and+analytical+parameters+on+their+isolation+and+stability.">Quantification of circulating miRNAs in plasma: effect of preanalytical and analytical parameters on their isolation and stability.</a> J Mol Diagn. 15 (6), 827-834 (2013).</li><li>Yamaura, Y., Nakajima, M., Takagi, S., Fukami, T., Tsuneyama, K., Yokoi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+microRNA+profiles+in+rat+models+of+hepatocellular+injury,+cholestasis,+and+steatosis.">Plasma microRNA profiles in rat models of hepatocellular injury, cholestasis, and steatosis.</a> PLoS One. 7 (2), e30250 (2012).</li><li>Kirschner, M. B., Edelman, J. J., Kao, S. C., Vallely, M. P., van Zandwijk, N., Reid, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Hemolysis+on+Cell-Free+microRNA+Biomarkers.">The Impact of Hemolysis on Cell-Free microRNA Biomarkers.</a> Front Genet. 4, 94 (2013).</li><li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+stem-loop+RT-qPCR+miRNA+expression+profiling+using+minute+amounts+of+input+RNA.">High-throughput stem-loop RT-qPCR miRNA expression profiling using minute amounts of input RNA.</a> Nucleic Acids Res. 36 (21), e143 (2008).</li><li>Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling:+approaches+and+considerations.">MicroRNA profiling: approaches and considerations.</a> Nat. Rev. Genet. 13 (5), 358-369 (2012).</li><li>Moldovan, L., Batte, K. E., Trgovcich, J., Wisler, J., Marsh, C. B., Piper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+challenges+in+utilizing+miRNAs+as+circulating+biomarkers.">Methodological challenges in utilizing miRNAs as circulating biomarkers.</a> J. Cell. Mol. Med. 18 (3), 371-390 (2014).</li><li>Mangolini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+and+prognostic+microRNAs+in+the+serum+of+breast+cancer+patients+measured+by+droplet+digital+PCR.">Diagnostic and prognostic microRNAs in the serum of breast cancer patients measured by droplet digital PCR.</a> Biomark. Res. 3, 12 (2015).</li><li>Miotto, E., Saccenti, E., Lupini, L., Callegari, E., Negrini, M., Ferracin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+circulating+miRNAs+by+droplet+digital+PCR:+comparison+of+EvaGreen-+and+TaqMan-based+chemistries.">Quantification of circulating miRNAs by droplet digital PCR: comparison of EvaGreen- and TaqMan-based chemistries.</a> Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 23 (12), 2638-2642 (2014).</li></ol>

저자는 공개 충돌의 관심이 있다.

우리의 포괄적인 평가 개별 샘플 사이 변이의 크기는 매우 다른 miRNAs 테스트 중 명확 하 게 표시 동적 범위의 넓이의 더 엄격한 통계 분석을 제공 합니다. 비록 이러한 유사 체액에 그들의 작은 수량에 기인 수 있습니다, 생물학 변화 뿐만 아니라 기술 변화 반영 하는 이러한 데이터 주목 해야한다. 기술 변화의 대부분은 다른 분석 결과 플랫폼18에서 사용 되는 외부 제어 (cel-미르-...

연구의 증가 진단 및 암의 예 후에 대 한 생체로 microRNAs (miRNAs)를 탐험 또는 모니터링 및 nonclinical 및 임상 연구1,2,3에에서 다른 질병을 감지 . 양이 많은 실시간 반전 녹음 방송 PCR (RT-정량)이이 기술은 microarray4 와 RNA 시퀀싱 플랫폼5기반 보다 더 중요 한 있기 때문에 개별 대상 miRNAs, 평가 하는 데 사용 하는 가장 일반적인 방법 중 하나입니다. 일반적으로, 미르 식6의 ΔCq 메서드 사용 하 여 참조 샘플을 기준으로 측정 됩니다. 이 방법은 조사 대상 유전자 식 수준에 생리 적 변화에 대 한 적절 한입니다. 그러나, 순환 miRNAs의 상대 부 량 그들의 소량 때문에 유틸리티를 제한 했다. 또한, 기술 변형 하기가 다른 실험실 사용자 정의 실시간 정량 Pcr 실험 프로토콜 다르게, 일관성에 이르게 하거나 심지어 모순에서 결과 때문에 다른 연구에서 결과 비교 하기 어려운 다른 연구7.
위에서 언급 한 문제에 비추어 절대 정량화는 더 작은 양의 체액에서 miRNAs의 평가 적합 수 있습니다. 절대 정량화 방법은 해당 대상 미르8의 시퀀스와 동일한 합성 RNA oligonucleotides의 알려진된 농도에서 생성 된 표준 곡선을 사용 합니다. 건강과 환경 과학 연구소 (HESI) 유전체학 회 최근 여러 테스트 사이트에서 플라즈마 miRNAs의 절대 측정의 결과 비교 하는 포괄적인 연구를 실시 했다. 결과 여러 테스트 사이트9에서 유사한 결과 굴복 miRNAs의 절대 정량에 대 한 표준 프로토콜을 사용 하 여 보였다. 현재 연구에서 설명 하는 실시간 정량 분석 방법을 거의 여러 miRNA 표적, 및 낮은 식 miRNAs의 검색을 돕기 위해 사전 증폭의 다중화 분석 포함 HESI의 표준 프로토콜.
이 연구에서 EDTA-혈장 혈액에서 준비의 고정된 볼륨 (200 µ L) 의식 cynomolgus 원숭이의 대 퇴 정 맥에서 수집 (n = 50) 사용10. 다음과 같은 프로토콜의 추출, miRNA 및 RT-정량, 사전 증폭을 포함 하 여 플라즈마 샘플의 준비를 위한 절차를 설명 합니다. 샘플에서 대상 miRNAs의 수량 충분 한 자격이 프로세스와 함께에서 유효성을 검사할 수 있도록 더 중요 하 게는 프로토콜에 대 한 추가 기술 정보 포함 되었습니다. 첫째, 각 미르의 표준 곡선 생물학 견본에서 그것의 부 량 이전의 개별 검색 범위에 대 한 유효성을 검사 했다. 둘째, 현재 방법론의 품질 외부 컨트롤 (cel-미르-238)의 Cq 값에 의해 종합적으로 평가 되었습니다. 따라서,이 플랫폼은 다른 연구 나 실험실에서 결과 비교 하기 위한 더 유익 하 고 신뢰할 수 있는 데이터를 생성 합니다.
8 miRNAs의 프로필 대표 결과로이 보고서에 포함 된 시험 방법을 여기에 설명 된에서. 이러한 miRNAs (미르-1, 미르 208a, 미르-208b, 그리고 미르-499a), 심장 및 골격 근육 (133a 미르와 미르-206) 설치류와 인간3, 잠재적인 안전 생체 (122 미르와 미르-192), 간 조직 상해와 관련 된으로 제안 되어 11,,1213.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="697">
	<tbody>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:216px;">BD Microtainer tube (K2EDTA)</td>
			<td style="width:195px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:119px;">365974</td>
			<td style="width:167px;">For blood collection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mL</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">0030124359</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Eppendorf Safe-Lock micro test tubes&#160; 1.5 mL</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">0030120086</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Eppendorf Safe-Lock micro test tubes&#160; 2.0 mL</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">0030120094</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Synthetic oligonucleotide</td>
			<td style="width:195px;">Hokkaido System Science</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Individual miRNA (0.2 &#956;mol,HPLC grade)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris-EDTA Buffer&#160; (pH 8.0)</td>
			<td style="width:195px;">Nippon Gene</td>
			<td style="width:119px;">314-90021</td>
			<td style="width:167px;">TE buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Buffer RPE</td>
			<td style="width:195px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Contents in miRNeasy mini kit&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Buffer RWT</td>
			<td style="width:195px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Contents in miRNeasy mini kit&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">miRNeasy Mini Kit</td>
			<td style="width:195px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">217004</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nuclease-Free Water&#160;</td>
			<td style="width:195px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">129114</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">QIAzol Lysis Reagent</td>
			<td style="width:195px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Contents in miRNeasy mini kit&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic&#160;</td>
			<td style="width:195px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">219600</td>
			<td style="width:167px;">ID:MSY0000293, 5 nmol</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SC Adapters</td>
			<td style="width:195px;">TAIGEN Bioscience Corporation</td>
			<td style="width:119px;">S0120</td>
			<td style="width:167px;">For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">VacEZor 36 Complete System</td>
			<td style="width:195px;">TAIGEN Bioscience Corporation</td>
			<td style="width:119px;">M3610</td>
			<td style="width:167px;">For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">7900HT Fast Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4351405</td>
			<td style="width:167px;">Fast 96-Well Block</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">9700</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4346907</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4311971</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4444557</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4427975</td>
			<td style="width:167px;">Assay ID: 000248</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4427975</td>
			<td style="width:167px;">Assay ID: 002245</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4427975</td>
			<td style="width:167px;">Assay ID: 002246</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4427975</td>
			<td style="width:167px;">Assay ID: 002222</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4427975</td>
			<td style="width:167px;">Assay ID: 000491</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4427975</td>
			<td style="width:167px;">Assay ID: 000510</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4427975</td>
			<td style="width:167px;">Assay ID: 000511</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4427975</td>
			<td style="width:167px;">Assay ID: 002290</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4427975</td>
			<td style="width:167px;">Assay ID: 001352</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan MicroRNA Reverse 
			Transcription Kit</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4366597</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan PreAmp Master Mix (2&#215;)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4391128</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloroform&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Wako Pure Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">035-02616</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol (99.5)</td>
			<td style="width:195px;">Wako Pure Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">057-00456</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

absolute quantification of plasma microrna levels in cynomolgus monkeys, using quantitative real-time reverse transcription pcr

실시간 정량 Pcr 개별 대상 miRNAs 평가 하는 가장 일반적인 방법 중 하나입니다. MiRNAs 수준 일반적으로 참조 샘플을 기준으로 측정 됩니다. 이 방법은 조사 대상 유전자 식 수준에 생리 적 변화에 대 한 적절 한입니다. 그러나, 더 나은 통계 분석을 사용 하 여 절대 정량화 유전자 식 레벨의 포괄적인 평가 위해 바람직합니다. 절대 부 량은 여전히 공통 사용 하지. 이 보고서 또는 사전 증폭 없이 실시간 정량 Pcr를 사용 하 여 플라즈마 miRNA의 절대 레벨을 측정 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다.
EDTA 플라스마의 고정된 볼륨 (200 µ L) 의식 cynomolgus 원숭이의 대 퇴 정 맥에서 수집 된 혈액에서 준비 되었다 (n = 50). 총 RNA는 상업적으로 사용 가능한 시스템을 사용 하 여 추출 되었다. 플라즈마 miRNAs는 프로브 기반 실시간 정량 Pcr 분석 실험 미르 관련 앞으로 또는 반전 PCR 뇌관 및 프로브를 포함 하 여 정량 했다. 절대 정량화에 대 한 표준 곡선 상용 합성 RNA oligonucleotides를 사용 하 여 생성 되었다. 합성 cel-미르-238 표준화 및 품질 평가 대 한 외부 제어로 사용 되었다. MiRNAs는 정량화 35 위 주기 (Cq) 값 정량 단계 전에 미리 증폭 했다.
가운데 8 miRNAs 검사, 미르-122, 미르-133a, 및 미르-192 했다 사전 증폭 없이 감지 미르-1, 미르-206, 그리고 미르-499a 그들의 낮은 식 수준 때문에 사전 확대를 요구 하는 반면. 미르-208a와 미르 208b 했다 감지 전 확대 후에. 샘플 처리 효율 아군된 cel-미르-238의 Cq 값에 의해 평가 되었다. 이 분석 방법에서 기술 변화 3 미만 이기 위하여 견적 되었다 하 고 정량화 (LLOQ)의 하한값은 102 복사 / µ L, 시험된 miRNAs의 대부분을 위해.
이 프로토콜 플라즈마 miRNAs의 수량의 더 나은 견적을 제공 하 고 다른 연구에서 해당 하는 데이터의 품질 평가 허용 한다. 체액, 사전 증폭 miRNAs의 낮은 수는 저조한의 탐지를 향상 시키기 위해 유용 고려 miRNAs 표현.

실시간 정량 Pcr에 의해 분석 결과 miRNA의 워크플로 및 품질 assessment 그림 1 에서 정량10를 사용 하 여 혈액 샘플 분석 결과 miRNA의 워크플로 보여 줍니다. Cel-미르-238는 외부 컨트롤을 포함 하 여 실험의 품질을 확인할 수 있습니다. 이 RNA 추출 기술 변화를 보여줄 것입니다 및 후속 실시간 정량 Pcr 처리 합니다. 이 ...

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Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

이 보고서 또는 사전 증폭 없이 양적 실시간 반전 녹음 방송 PCR를 사용 하 여 플라즈마 miRNA의 절대 레벨을 측정 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜 플라즈마 miRNAs의 수량의 더 나은 이해를 제공 하 고 다른 연구 나 실험실에서 해당 데이터의 질적 평가 허용 한다.

Cynomolgus 원숭이, 양적 실시간 반전 녹음 방송 PCR를 사용 하 여 플라즈마 예측에 관한 레벨의 절대 정량화

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

absolute-quantification-plasma-microrna-levels-cynomolgus-monkeys

Research

JoVE Journal

Biology

11.5K 조회수.  Daiichi Sankyo Co., Ltd.. 이 보고서 또는 사전 증폭 없이 양적 실시간 반전 녹음 방송 PCR를 사용 하 여 플라즈마 miRNA의 절대 레벨을 측정 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜 플라즈마 miRNAs의 수량의 더 나은 이해를 제공 하 고 다른 연구 나 실험실에서 해당 데이터의 질적 평가 허용 한다.

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Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

써모 과학 솔라리스 qPCR 어세를 사용하여 정량 실시간 PCR

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

연구

생물학

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

에메랄드 애쉬 보러에서 유전자 발현 분석 ( Agrilus planipennis)를 사용하여 정량 리얼 타임 PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

정량 실시간 PCR (qPCR) 배열을 사용하여 사전 마이크로 RNAS과 microRNAs의 프로 파일링

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

의 유전자 표현 프로필 결정 C. 엘레간스 Microarray 및 실시간 PCR을 사용하여

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

펩타이드 면역 친 화성 농축을 사용하여 단백질의 양을 정함은 질량 분광법과 함께

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base excision repair (BER) molecular beacons. The substrate (beacon) is comprised of a deoxyoligonucleotide containing a single base lesion with a 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) moiety conjugated to the 5'end and a Dabcyl moiety conjugated to the 3' end of the oligonucleotide. The BER molecular beacon is 43 bases in length and the sequence is designed to promote the formation of a stem-loop structure with 13 nucleotides in the loop and 15 base pairs in the stem1,2. When folded in this configuration the 6-FAM moiety is quenched by Dabcyl in a non-fluorescent manner via F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET)3,4. The lesion is positioned such that following base lesion removal and strand scission the remaining 5 base oligonucleotide containing the 6-FAM moiety is released from the stem. Release and detachment from the quencher (Dabcyl) results in an increase of fluorescence that is proportionate to the level of DNA repair. By collecting multiple reads of the fluorescence values, real-time assessment of BER activity is possible. The use of standard quantitative real-time PCR instruments allows the simultaneous analysis of numerous samples. The design of these BER molecular beacons, with a single base lesion, is amenable to kinetic analyses, BER quantification and inhibitor validation and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor cell lysates or with purified proteins. The analysis of BER activity in tumor lysates or tissue aspirates using these molecular beacons may be applicable to functional biomarker measurements. Further, the analysis of BER activity with purified proteins using this quantitative assay provides a rapid, high-throughput method for the discovery and validation of BER inhibitors.

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates. The assay yields rates of DNA Repair activity amenable to kinetic analysis and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor lysates or with purified proteins.

병변 특정 분자 비콘을 활용 세포 Lysates의 기본 절단 복구 활동의 양적, 실시간 분석

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs. Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and specific carrier of vitamin A in the blood. Here we describe an optimized technique to produce and purify holo-RBP and two real-time monitoring techniques to study the transport of vitamin A by the high-affinity RBP receptor STRA6. The first technique makes it possible to produce a large quantity of high quality holo-RBP (100%-loaded with retinol) for vitamin A transport assays. High quality RBP is essential for functional assays because misfolded RBP releases vitamin A readily and bacterial contamination in RBP preparation can cause artifacts. Real-time monitoring techniques like electrophysiology have made critical contributions to the studies of membrane transport. The RBP receptor-mediated retinol transport has not been analyzed in real time until recently. The second technique described here is the real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol release or loading. The third technique is real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol transport from holo-RBP to cellular retinol binding protein I (CRBP-I). These techniques provide high sensitivity and resolution in revealing RBP receptor's vitamin A uptake mechanism.

Here we describe an optimized technique to produce high-quality vitamin A/RBP complex and two real-time monitoring techniques to study vitamin A transport by STRA6, the RBP receptor.

플라즈마 레티놀 바인딩 단백질의 막 수용체의 레티놀 전송의 실시간 분석

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

정량적 RT-PCR에 의해 개별 인간 배아 줄기 세포를 프로파일 링

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

프로브 기반의 실시간 PCR은 마이크로 RNA의 정량 측정을위한 접근 방법

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag 분석 - 높은 처리량, Sc2.0 유전형에 대한 실시간 PCR 분석

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...