Name: immuno-fluorescent labeling of microtubules and centrosomal proteins in ex vivo intestinal tissue and 3d in vitro intestinal organoids
Uploaded: 2017-12-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids at JoVE.com

저자 폴 토마스 현미경 조언과 도움 감사합니다. 여기에 관련 된이 작품은 BBSRC에 의해 지원 되었다 (no를 부여 합니다. M.M.M. 및 T.W. BB/J009040/1).

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저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

장 조직의 절연 작은 장 지하실과 villi 저 승 지하실의 분리 막 표면, EDTA 솔루션 셀 연락처, 분류 (동요) 및 원심 분리를 완화 하는 치료를 노출 포함 됩니다. 제시 장 villi/토 굴 격리 프로토콜 Belshaw 외. 화이트 헤드 외 에서 수정 되었습니다. 17 , 18
점 막 표면 노출 우리가이 절차의 개발에 장내 관의 점 막 표면 노출 방법의 번호와 실험을 했습니다. 기존의 방식 (안쪽 바깥쪽으로 회전) evert 것 세그먼트 약 100 m m 긴, 보통 튜브 튜브19위로 미끄러져 한쪽 끝 그리고 나머지 튜브에 조직의 배에 잡은 금속 막대를 사용 하 여. 마우스 조직에 대 한 끝부분을 금속 막대 (2.4 m m 직경)는 이상적 이다. 이 방법은 PBS와 EDTA에 대 한 더 나은 액세스를 허용 하는 점 막 표면 확대의 이점이 있습니다. 우리는 처음이 접근 방식을 사용 하지만 짧은 길이 (약 5cm)으로 튜브를 절단 하 고이 쉽게 입증가 위를 해 부와 각 섹션을 열고로 이동. 이 방식은 적절 한 경우에 몇 가지 내장이 필요; 경우 더 많은 동물을 했다 그러나 사용 실험에서 다음 목적 장치 절단 열기 튜브 경도, 요네다 외 설명 14 더 효율적일 것 이다입니다.
Villi와 근육 층에서 지하실의 분리 처음 우리 느슨하게 기본 조직17,18점 막 표면에 3 mM EDTA PBS에 비교적 긴 보육 시간 최대 60 분의 사용. EDTA의이 농도에서 우리는 보육 시간 30 분의 마우스 콜론 으로부터 지하실을 풀고 충분 한 발견. 그러나, 소장 토 굴/모 격리에 대 한 효율적인 접근 입증 짧은 시간에 대 한 더 많은 집중된 EDTA를 사용 하 여 것이 보았습니다. 모든 후속 작업 생성 villi 또는 지하실에 대 한 관련 분수 30 mM EDTA 기법을 사용 하 여 추출 하는 조직으로 착수 했다. 지하실, 우리가 일반적으로 고정 하기 전에 분수 3-5을 풀링된 하지만 타이밍 창 자 위치 등 요인의 숫자, 마우스, 염증, 이전 다이어트의 나이에 따라 달라 집니다로이 적절 한 분수 지 확인 하는 것이 중요 하다 등 유사 하 게, 시간 조직 EDTA 치료 효과 따라 흔들릴 필요가 다른 조건 하에서 다를 수 있습니다. 격리 된 조직 분수 villi 지하실 또는 주로 villi 및 지하실 (그림 2)의 혼합물을 포함 하는. 콜론 없는 villi로 토 굴 추출 수 있습니다 달성 한 단계에 30에 대 한 튜브에 조직을 떨고 하 여 s. 이 분수 다음 고정 하 고 면역 라벨에 대 한 처리 수 있습니다.
지 매트릭스에서 장 organoids의 격리 절연 지 매트릭스 돔에서 organoids의 세포 복구 솔루션을 사용 하 여 얻을 수 있습니다. Depolymerizing gelled 지하실 매트릭스 하지만 온도 필요 2-8 ° c.에 의해 작동 하는 솔루션 주의의 참고는 동적 microtubules 유지 되지 않을 수 있습니다. 따라서, 동적 microtubules의 면역 라벨에 대 한과 + EBs 셀 등 팁, 고정 이전 지 매트릭스에서 복구 권장 하지 않습니다. 그러나, 차별화 organoid 셀에 microtubules의 대부분은 상대적으로 안정적인 고이 (그림 6)를 보존 했다. 그것은 또한 세포 마커 뿐만 아니라 centrosomal 및 접합 단백질의 면역 라벨에 대 한 잘 일했다.
기정 프로토콜 포름알데히드 (PFA에서 만든 갓) 가역 형성 하는 상대적으로 빠른 연기 정착 액 크로스 링크 이며 4 %PFA 등 면역 라벨 microtubules 및 감마-tubulin Phalloidin 얼룩 걸 필 라 멘 트를 위해 잘 작동 합니다. 더 잘 근무 등 면역 라벨 토 굴 줄기 세포 틈새 시장 내에서 줄기 세포 마커 Lgr5 및 Paneth 세포 마커 CD24와 PFA의 높은 농도 작동 하지 않았다 동안 1 %PFA 솔루션을 희석.
도의 추가 제공 microtubules 3.7 %PFA, 0.05%도 및 PHEMO 버퍼 (68 m m 파이프, 25mm HEPES, 15mm EGTA 및 3mm MgCl2)2 에서 0.5% 세제의 혼합물로 구성 된 이른바 PHEMO 고정의 더 나은 보존 antigenicity을 타협 하지 않고 microtubules의 우수한 보존을 제공 합니다. 그것은 또한 면역 라벨 감마-tubulin, β-catenin, 그리고 E-cadherin, phalloidin 착 걸 필 라 멘 트에 대 한 잘 작동합니다. 그러나, 3 차원 조직, organoid 문화 PHEMO 고정 일관성 없는 결과 생산 하 고 그러므로 사용 하지.
메탄올은 상대적으로 잘 침투를 제공 하 고 antigenicity을 보존 하는 경향이 응집 정착 액. 100% 메탄올 (-20 ° C)와 고정 어떤 수축 량을 소개 하 고 적당 한 형태 보존을 제공 microtubules, + 팁, 그리고 ninein를 포함 하 여 2 차원 세포 배양에 많은 centrosomal 항 체에 대 한 작동 합니다. 그러나, 일부 organoids이 고정 방법을 사용할 때 쓰 러 졌다. 또한, 전체 지하실, villi, 또는 organoids를 통해 항 체의 보급률은 처음에 문제가 있지만 0.1% 세제 세척 솔루션을 장기간된 세척의 추가 더 나은 결과 달성.
포름알데히드와 메탄올의 조합이 Rogers 그 외 여러분 에 의해 사용 이전 했다 20 에 면역 레이블 EB1 초파리. 포 름 알 데히드의 혼합물을 기반으로 고정 프로토콜 및 메탄올 따라서 개발 장 조직 및 organoids 3% 포름알데히드와 97% 메탄올-20 ° C에 냉장 하지만 로저스에 의해 사용 되었다 혼합물에서 탄산 나트륨 5 m m를 생략에 따라 외. 20 또한, 샘플-20 ° c.에 냉장고에서 수정 된 이 특히 면역 라벨에 대 한 잘 + 클립-170 등 EBs, 팁, 근무 하지만 또한 우수한 고정 및 면역 라벨 microtubules 및 조직 및 3D organoids 내 걸 입증 했다. 아주 좋은 구조 보존 되었다 분명 하 고 메탄올으로 더 일관 되 게 일 ninein에 대 한 라벨 비록 antigenicity 감마-tubulin 등 ninein, centrosomal 단백질 뿐만 아니라 여러 cytoskeletal와 관련 된 단백질에 대 한 보존 되었다 고정입니다.

Apico 기초 극성으로 epithelia의 형성 개발에서 기본 과정 이며 microtubules centrosomal 단백질의 극적인 개편을 포함 한다. 방사형 microtubule 배열 위치 centrosomal microtubule 센터 조직에서 나오는 (MTOC) 많은 동물 세포에서 저명한 이며 이것이 비교적 평평한 세포에 적합. 반면, 원주 상피 세포, 소장의 그들과 같은 더 나은 모양 및 이러한 셀의 특수 기능을 지 원하는 비 방사형 transcellular microtubule 배열 조립. microtubules의이 극적인 개편 transcellular microtubules1,2 의 앵커리지에 대 한 책임 되는 centrosome 꼭대기와 꼭대기 비 centrosomal MTOCs (n MTOCs) 형성, 이동에 의해 이루어집니다. , 3 , 4 , 5.
상피 분화와 관련된 microtubule 개편의 우리의 지식을 많은 2D 체 외에서 세포 층 vivo에서 조직 아키텍처를 표시 하지 않는의 조사에서 왔다. 6Clevers와 동료 의해 개척 organoid 문화, 3 차원 생체 외에서 개발 그들은 모방 vivo에서 아키텍처 및 개발 주요 기술적 진보를 나타냅니다. 상피 분화의 계층은 분명 소장; 지하실의 하단에 줄기 세포 미 숙 이동 증폭 세포를 증식 하 고 점차적으로 그들은 완전히 이전 되 고 분화 되는 작은 장 모 또는 저 승 표면에 토 굴을 마이그레이션할로 차별화를 일으키합니다 루멘7에 창. 중요 한 것은,이 장 organoids 줄기 세포 틈새에서 셀 이후에 아래와 낭종 지역으로 점차적으로 진행 하는 차별화에 줄기 세포와 토 굴 같은 싹을 생성 하는 형성 cysts을 증식에 복제 됩니다. 이 모 같은8된다. 장 organoid 따라서 microtubule 상피 분화 하지만 다른 수많은 단백질 뿐만 아니라, 의약품 및 식품의 심사에 대 한 이상적인 플랫폼을 제공 하는 동안 centrosomal 개편 뿐만 아니라 공부 하 고 강력한 모델을 나타냅니다. 화합물의 잠재적인 치료 혜택9,10.
Organoids 형광 태그 단백질의 라이브 이미징에 대 한 적합은 둘 다 노크-에서 노크 아웃 organoids11,12편집 CRISPR/Cas9 유전자를 사용 하 여 생성 될 수 있습니다. 그러나, 식 및 공부 생 단백질의 지역화 설정 태그 단백질의 동작을 확인 하기 위해 특히 중요 하다. 면역 라벨 3D organoids 지 매트릭스 또는 전 비보 고립에서 성장 조직 차원에서 문화 요리에서 성장 하는 세포 보다 더 복잡 하다. 기정 프로토콜 (즉, 항 체 바인딩을 위한 epitopes) 항 체 antigenicity 유지 하면서 organoids의 섬세 한 3D 건축을 보존 해야 합니다. 예를 들어 4 %paraformaldehyde (PFA) 일반적으로 정착 액으로 사용 하지만 상대적으로 빠른 행동 정착 액은 그것 좋은 형태 보존을 제공 하는 동안 우리의 경험에 그것 자주 antigenicity의 손실 귀착되 고 많은 적합 하지 않습니다. centrosomal 항 체입니다. 3 차원 구조와 조직에 침투 하는 정착 제와 항 체의 능력 또한 고려 되어야 한다. 이 위해, 우리 수정 하 고 조직 격리 및 간접 면역 3 차원 생체 외에서 organoids 및 전 비보 의 라벨에 대 한 개발된 프로토콜 고립 장 조직. 우리는 작은 장 지하실과 villi 조직과 저 승, 격리 하 고 해결 하 고 지하실 매트릭스 내에서 면역 라벨 대신 3D organoids의 격리에 대 한 프로토콜을 포함 하는 방법을 설명 합니다. 선물이 microtubules와 centrosomal, ninein, 등 단백질과의 microtubule 플러스-엔드 추적 단백질 (+ 팁), EB 단백질 및 클립-170 (참고 참조8, 같은 면역 라벨에 대 한 세 가지 대안 기정 프로토콜 13). 우리는 또한 각 프로토콜 관련 된 장단점 토론.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537-500ML</td><td>washing and PFA</td></tr><tr><td>Cell Recovery Solution</td><td>Corning</td><td>354253</td><td>isolate organoids</td></tr><tr><td>lobind microcentrifuge tubes</td><td>Eppendorf</td><td>30108116</td><td>prevent cells sticking</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA solution, pH 8.0</td><td>Sigma</td><td>03690-100ML</td><td>Crypt isolation</td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m cell strainer</td><td>Fisher Scientific</td><td>11517532</td><td>Isolate crypts from villi</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>detergent</td></tr><tr><td>goat serum</td><td>Sigma</td><td>G6767</td><td>blocking agent</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td></td><td>used as non-stick agent</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 4% in PBS</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61899</td><td>fixative</td></tr><tr><td>Formaldehyde solution (36.5&amp;ndash;38% in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td>used as fixative</td></tr><tr><td>Methanol 99.9% Analytical grade</td><td>Fisher</td><td>M/4000/17</td><td>used as fixative</td></tr><tr><td>MaxFluor Mouse on Mouse Immunofluorescence Detection Kit</td><td>Maxvision&lt;br/&gt; Biosciences</td><td>MF01-S</td><td>commercial immunofluorescence kit; to reduce non-specific labelling</td></tr><tr><td>Rotator SB2 or SB3</td><td>Stuart</td><td></td><td>microcentrifuge tube rotator</td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td></td><td></td><td>antigen retrieval</td></tr><tr><td>Hydromount</td><td>National Diagnostics</td><td>HS-106</td><td>mountant</td></tr><tr><td>DABCO - 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane</td><td>Sigma</td><td>D27802</td><td>anti-fade agent</td></tr><tr><td>Permanent Positive Charged, Pre-Washed, 90 Degree Ground Edges</td><td>Clarity</td><td>N/C366</td><td>slides</td></tr><tr><td>Glass coverslip - thickness no. 1, 22 x 50 mm</td><td>Clarity</td><td>NQS13/2250</td><td>coverslips</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Basement matrix for 3D organoid culture</td></tr><tr><td>50 mL conical tubes</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td>for processing tissue/organoids</td></tr><tr><td>15 mL conical tubes</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td>for processing tissue/organoids</td></tr><tr><td>1.5 mL LoBind tubes</td><td>Eppendorf</td><td>30108051</td><td>for isolated organoids</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti-E-cadherin antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>610181</td><td>primary antibody 1:500</td></tr><tr><td>Rat monoclonal anti-tubulin YL1/2 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab6160</td><td>primary antibody 1:100</td></tr><tr><td>Rabbit alpha-tubulin antibody</td><td>Abcam</td><td>ab15246</td><td>primary antibody 1:100</td></tr><tr><td>Rabbit anti-beta-actin antibody</td><td>Abcam</td><td>ab8227</td><td>primary antibody 1:100</td></tr><tr><td>Rat monoclonal anti-p150Glued antibody</td><td>BD Bioscience</td><td>610473/4</td><td>primary antibody 1:100</td></tr><tr><td>Rat monoclonal EB3KT36 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab53360</td><td>primary antibody 1:200</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal EB1 antibody</td><td>BD Bioscience</td><td>610535</td><td>primary antibody 1:200</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Lgr5 antibody</td><td>Abgent</td><td>AP2745d</td><td>primary antibody 1:100</td></tr><tr><td>Dylight anti-rat 488</td><td>Jackson</td><td>112545167</td><td>seconday antibody 1:400</td></tr><tr><td>Dylight anti-mouse 488</td><td>Jackson</td><td>ST115545166</td><td>seconday antibody 1:400</td></tr><tr><td>Dylight anti-rabbit 647</td><td>Jackson</td><td>111605144</td><td>seconday antibody 1:400</td></tr></tbody></table>

immuno-fluorescent labeling of microtubules and centrosomal proteins in ex vivo intestinal tissue and 3d in vitro intestinal organoids

Vivo에서 조직 아키텍처와 morphogenesis 모방 3D 생체 외에서 organoids의 출현 크게 세포 및 개발 생물학에서 중요 한 생물 학적 질문을 공부 하는 능력을 고급 있습니다. 또한, 유전자 편집 및 바이러스 성 유전자 전달에 최근의 기술 진보와 함께 organoids 의료 연구 및 질병의 처리를 위한 새로운 약물의 개발을 약속 드립니다. Organoids에서 생체 외에서 지 매트릭스에서 성장 문제를 연구 하 고 다양 한 단백질의 기능에 대 한 강력한 모델 시스템을 제공 하 고 형광 태그 단백질의 라이브 이미징에 대 한 적합. 그러나, 설립 식 및 생 단백질의 지역화 ex vivo 조직에 생체 외에서 organoids는 태그 단백질의 동작을 확인 해야 합니다. 이 위해 우리 개발 하 고 조직 분리, 고정, 및 전 비보 장 조직 및 체 외에 장 organoids microtubules, centrosomal, 및 관련 단백질의 지역화에 대 한 면역 라벨 프로토콜 수정. 또한 항 체 antigenicity을 보존 하 고 좋은 침투 및 정착 액 및 항 체의 사용 하는 동안 organoids/조직의 3 차원 구조를 보존 하기 위해 정착 제에 대 한 목표가 이었다. 안정적인 microtubules 제외한 모든 감기에 노출 depolymerizes 그리고 다양 한 프로토콜을 수정할 때 중요 한 요소 했다. 우리는 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 농도 3 밀리미터에서 30 밀리미터에 증가 했다 villi 및 소장에 있는 지하실의 효율적인 분리 3 mM EDTA가 저 승 지하실에 대 한 충분 한 발견. 개발 된 포름알데히드/메탄올 기정 프로토콜 antigenicity microtubules, 말라와 최종 바인딩 (EB) 단백질의 효과적인 라벨에 대 한 보존 하는 동안 아주 좋은 구조 보존을 했다. 그것은 또한 centrosomal 단백질 ninein 메탄올 프로토콜 일 더 일관 되 게 비록 근무. 우리는 더 고정 및 microtubules과 관련 된 단백질의 면역 라벨 organoids에서 격리 또는 지 매트릭스 내 남아 있는과 달성 될 수 있었다 설립.

장 조직의 면역 라벨에 대 한 절연 보존과 microtubules과 관련 된 단백질의 면역 라벨에 대 한 하지만 줄기 세포 생존 능력 및 organoid 생성 (그림 1 및 표 1 결 장 및 작은 창 자에 대 한 설명된 조직 격리 프로토콜 최적화 되었다 ). 목표 암호를 생성 하 고로 모 파 벌 구조를 보존 하 고 유도 하는 얼음 차가운 솔루션 microtubules의 depolymerization을 방지 EDTA와 추위 노출 최소화 하면서 최대한 (없는 점액 및 다른 조직) 청소 모든 하지만 안정적인 microtubules의 depolymerization입니다. 주로 지하실 (그림 2C 포함 villi 지하실 (그림 2A, B), 분수 3 동안 둘 다의 혼합물을 포함 하는 분수 2 그림 2 에서 격리 된 작은 창 자 조직, 분수 2와 3의 이미지의 예를 보여 줍니다. D).
고정 및 절연 장 조직의 면역 라벨 개별 또는 결합 된 분수 다음 고정을 위한 처리 및 면역 표시 된 일련의 고정을 포함 하는 단계를 통해, 세제, 차단, 항 체, 그리고 다시 마지막 villi/지하실을 중단 하기 전에 솔루션을 세척 설치 미디어, 펠 렛 슬라이드, 전송 하 고 유리 coverslips 커버. Crypts과 villi 다음 confocal 현미경에는 몇 군데 있었다.
좋은 보존과 microtubules의 말라 villi와 지하실에서 라벨 다음에 의해 달성 되었다:-20 ° C에서, 반복 PBS 0.1% 세제와 1% 혈 청을 포함 하 고 PBS에 0.1% 차단에 세척 포름알데히드/메탄올 고정 조합 세제와 10% 혈 청, 야간 보육 1 차 항 체에 4 ° C 그리고 실내 온도 (그림 3)에서 2 차 항 체에 2 h에 의해 따라. 포름알데히드/메탄올 고정도 잘 라벨에 대 한 일 + EBs 등 클립-격리 된 지하실과 villi (그림 4)에서 170 팁. 안정적인 microtubules의 격자에 따라 협회 villi 샘플 (그림 4C)에서 볼 수 (혜성 라고도 함) microtubules의 플러스 끝 EB3 축적 지하실 (그림 4A)에서 분명 했다. 고유한 지역화 클립-170 및 p150Glued (dynactin의 소 단위) 격리 villi (그림 4B)에서 꼭대기 n MTOCs에서 명확 하 게 분명 했다. 포름알데히드/메탄올 프로토콜 고정 ninein 지역화 마우스 ninein에 대 한 우리의 Pep3 항 체를 사용 하 여 격리 된 장의 조직에 일관 되 게 작동 하지 않았다. 그러나,-20 ° C에서의 메탄올 고정 뒤 같은 세척 그리고 격리 된 지하실과 villi (그림 5; 참조8) 내에서 ninein의 매우 좋은 현지화 했다 포름알데히드/메탄올에 관해서는 솔루션을 차단. 흥미롭게도, ninein는 꼭대기 centrosomes에 집중 하는 동안 일부 축적 셀 기지에서 분명 했다 격리 된 지하실 (그림 5) 내의 일부 셀에. 이 일반적인 라벨 또는 격리 절차 지연의 결과 때문 인지 고정 (그리고 따라서 보존에 영향을 미치는) 필요 합니다 추가 조사. 그러나, villi (8 그림 3bi 참조)의 메탄올 고정 (-20 ° C) cryostat 섹션은 또한 그 ninein를 제안 하는 일부 셀에 기본 셀 ninein microtubules의 기저 인구와 연결할 수 있습니다 밝혔다.
고정 및 면역 지 매트릭스에서 분리 된 organoids의 라벨 작은 창 자 organoids 생성 하 고 지하실 매트릭스 3 주 이상 (그림 6A; 참조6,15)에서 성장 했다. 감기 (4 ° C) 세포 복구 솔루션 지 매트릭스에서 organoids를 분리 하는 데 사용 되었다. Organoids와 depolymerized 지 매트릭스 솔루션 튜브로 전송 되었고 정착 immuno 라벨 이전 centrifuged. 이 매우 깨끗 한 준비를 생산 하 고 다양 한 솔루션에는 organoids에 좋은 액세스할 수 있습니다. Organoid 모 도메인 내에서 차별화 된 셀 포함 안정적인 apico 기저 microtubules; 이 표시 된 대부분의 경우 (그림 6B, C) 고 EB1 microtubule 격자 (그림 6E;13참조)에 따라도 볼 수 있습니다. 그러나, 차가운 세포 복구 솔루션 발생할 수 있습니다 동적 microtubules의 depolymerization에 있는 EB1 혜성 (이 성장 microtubules의 플러스 끝에 바인딩할) 기저 암호 도메인 (그림 6 층 내에서 부족에 의해 일부 샘플에서 분명 했다 ). 다른 샘플에서 아 스 트 랄 (동적) microtubules (그림 6D) 보존 되었다. Organoid 절연 고정 이전 및 면역 라벨 또한 접합 단백질, ninein, 클립-170, 그리고 잔 셀 및 chromogranin A enteroendocrine 세포는 mucin 같은 셀 표식에 대 한 일 했습니다.
고정 및 지하실 매트릭스 내에서 organoids의 면역 라벨 그림 7 크립 트 개발 (D), 포름알데히드/메탄올에 고정 및 microtubules 및 ninein에 대 한 면역 분류의 초기 단계에는 organoid 낭종 단계 (A-C)에서 보여줍니다. 좋은 microtubule 보존 및 라벨로 꼭대기 n-MTOCs에서 ninein에 대 한 라벨 분명 했다. 그림 8A, B 하루 6 organoid 메탄올 프로토콜 고정 고 microtubules EB1 내 크립 트 도메인을 보여 줍니다. Microtubules EB1 혜성의 좋은 보존 분명 동적 microtubules의 보존을 제안 했다.
Organoids 되었고 또한 고정 면역 표시 지 매트릭스 내 남아 있는 동안. 이 절차의 단점 두 경우에서 자주 때 0.1% 세제는 포함 되어 있지만 정착 액에 정착 액의 가난한 침투 및 트래핑 지 매트릭스 (그림 8B) 내에서 항 체의 수 및 솔루션을 씻어 수 있습니다. 또한, 4 %PFA 하지 않았다 보존 지 매트릭스 잘 하지만 원인이 분해, 이것은 이렇게 더 적은 1 %PFA.메탄올 고정, 다른 한편으로, 때로는 organoid 붕괴를 유도 한다.
줄기 세포 마커 Lgr5 그리고 Paneth 세포 표식에 대 한와 같은 일부 항 체로 CD24 4 %PFA, 메탄올, 또는 포름알데히드/메탄올 프로토콜 실패 입증. 그러나, 1%는 organoids 지 매트릭스 내에서 고정 0.1% 세제 실 온에서 PBS에 PFA 않았다 결과 Lgr5 및 CD24 라벨 (그림 9).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig1.jpg"> 
그림 1: 작은 창 자 villi 및 지하실의 격리. 주요 단계 작은 장 모와 정착 immuno 라벨 이전 암호 격리의 흐름 다이어그램. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56662/56662fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig2.jpg"> 
그림 2: 절연 villi 및 마우스 소장 으로부터 지하실. Villi (큰 화살표) 지하실 (작은 화살표)을 보여주는 장 분수의 명시 야 현미경 이미지. (A, B) 분수 2 villi의 지하실, 혼합물 포함 하 고 모 고 토 굴에 형태학의 보존은 B에 분명 하다. (C, D) 분수 3 지하실의 고립과 villi 및 C에서 분기 토 굴을 포함 하 여 그대로 지하실의 부재를 보여준다. 스케일 바 = 500 μ (A, C); 100 μ (B, D) <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56662/56662fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig3.jpg"> 
그림 3: 작은 장 모와 토 굴 포름알데히드/메탄올에 고정 및 microtubules와 걸에 대 한 면역 표시 된 절연. 표시 하는 다른 세포 유형으로 모와 토 굴 상피의 (A) 회로도 강조 상자 B 및 C에서 몇 군데 대표적인 영역을 나타냅니다. (B, C) 모 (B)와 기저 크립 트 (C) 30 mM EDTA를 사용 하 여 포름알데히드/메탄올에 고정, 1% 염소 혈 청 및 0.1% 세제를 포함 하는 PBS로 세척, PBS에 차단 작은 창 자에서 분리의 부분을 통해 공초점 광학 섹션 10% 염소 혈 청 및 0.1% 세제, 그리고 쥐 단일 클로 널 항 tubulin 항 체 (녹색)와 microtubules와 토끼 polyclonal 안티-β-말라 항 체 (레드)와 말라 레이블이 포함 된. 잘 apico 기저 보존 microtubule 번들 분명 모와 토 굴 셀, 그리고 말라 루멘 (화살표)를 직면 하 고 꼭대기 지역에 집중 되어 볼 수 있습니다. 스케일 바 5 μ m를 =. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56662/56662fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig4.jpg"> 
그림 4: 고립 된 작은 장 토 굴과 villi 포름알데히드/메탄올에 고정 및 microtubules, EB3, p150Glued및 클립-170에 대 한 면역 분류. 토 굴과 villi 지역의 공초점 광학 섹션 30 mM EDTA를 사용 하 여 작은 창 자에서 분리 및 포름알데히드/메탄올, 10% 염소 혈 청 및 0.1% 세제, 포함 하는 PBS로 세척에서 고정 10% 염소 혈 청 및 0.1% 세제, 포함 하는 PBS에 차단 및 면역-표시. (A) 토 굴 토끼 α tubulin polyclonal 항 체 (빨간색)와 쥐 단일 클로 널 EB3KT36 항 체 (녹색) 표시와 DAPI (블루) apico 기저 microtubules EB3 혜성을 보여주는와 DNA에 대 한 스테인드. 거꾸로 단일 채널 이미지는 명확 하 게 안정적인 microtubules 뿐만 아니라 동적의 좋은 보존 제안 기저 크립 트 셀 통해 EB3 혜성을 보여줍니다. (B) 모 상피 세포 토끼 polyclonal 클립-170 항 체와 함께 표시 (빨간색 참조16참조)와 단일 클로 널 p150Glued 항 체 (녹색) 꼭대기 보여주는 공동 지역화를 마우스. 거꾸로 단일 채널 이미지는 아래와 같습니다. (C) 모 셀 토끼 α tubulin polyclonal 항 체 (빨간색)와 쥐 단일 클로 널 EB3 KT36 항 체 (녹색)으로 표시 하 고 격자 따라 EB3와 apico 기저 microtubules 보여주는 DAPI (파란색)와 DNA에 대 한 스테인드. EB3 격자 협회 거꾸로 단일 채널 이미지 EB3 혜성과 격자 협회 제안 하는 동안 확대 이미지에 강조 표시 됩니다. 스케일 바 5 μ m를 =. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56662/56662fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig5.jpg"> 
그림 5: 고립 된 콜론 토 굴 메탄올, ninein 및 E-cadherin 면역 표시에 고정 및 DAPI 물. 기저의 공초점 광학 섹션 토 굴의 지역 교통 증폭 3 mM EDTA를 사용 하 여 콜론에서 고립 된 메탄올에 고정, 1% 염소 혈 청 및 0.1% 세제, 포함 하는 PBS로 세척 고 10% 염소 혈 청 및 0.1% 세제를 포함 하는 PBS에 차단. 토 굴 토끼 polyclonal ninein 항 체와 함께 분류 되었다 (Pep3, 또한 참조 참조8, 빨간색) 단일 클로 널 항 체를 (녹색) 전자 cadherin 마우스와 DAPI (파란색)으로 물. 거꾸로 단일 채널 이미지 ninein만 보여줍니다. 이미지는 ninein 꼭대기 centrosomes에 집중 하 고 개별 셀의 윤곽을 드러내는 E cadherin와 잘 보존 된 토 굴을 보여 줍니다. 그것은 좋은 침투 고정 제와 항 체, 및 antigenicity의 보존 제안. 눈금 막대 5 μ m를 =. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56662/56662fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig6.jpg"> 
그림 6: Organoid 개발, 고정, 및 면역의 라벨 절연 organoids. (A) 위상 대비 이미지 보여주는 개발의 다른 단계 organoid 셀 집계에서 버드 개시와 완전히 낭종을 형성 토 굴 및 모 도메인 organoids.(B-F) Organoids 지 매트릭스 포름알데히드/메탄올 고정, 10% 염소를 포함 하는 PBS에 차단 10% 염소 혈 청 및 0.1% 세제, PBS에 세척 하 여 다음 4 ° C (10 분)에서 세포 복구 솔루션을 사용 하 여 격리를 통해 공초점 광학 섹션 혈 청 및 세제, 그리고 면역 microtubules, β-catenin, EB1 라벨 0.1%. (B) Organoid 낭종 microtubules (파란색)와 β-catenin (레드) 좋은 microtubule 보존 공개 하 고 대부분의 세포에서 라벨에 대 한 분류. (C) 뚜렷한 apico 기저 microtubules organoid 낭종에서 이러한 확대 상피 세포에 분명 하다. (D) 분할 셀 microtubules 보여주는 아 스 트 랄 (동적) microtubules (화살표)를 포함 하는 스핀 들에 대 한 분류. (E, F) 모 도메인 (E) 및 암호 도메인 (F) organoid 지역 일부 EB1 라벨, 모에 특히 안정적인 microtubules의 격자에 따라 거의 EB1 혜성 그 동적 제안 기저 토 굴 안에서 볼 수 있습니다 하는 동안 보여주는 microtubules 하지 보존 되었다. 바 규모 = 20 μ m (A); 2 μ m (D); 5 μ m (B, C, E-F) <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56662/56662fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig7.jpg"> 
그림 7: 포름알데히드/메탄올에 지하실 매트릭스 내에서 고정 및 microtubules 및 ninein에 대 한 면역 분류 Organoids. Organoids의 공초점 광학 섹션 포름알데히드/메탄올에 고정, 세척 및 10% 염소 혈 청 및 0.1% 세제, 포함 하는 PBS에 차단 고 지 매트릭스에 남아 있는 하는 동안 표시. A-(C) Organoid 낭종 물 들일 DAPI A 에 병합 된 이미지를 보여주는 (파란색)와 microtubules (B) ninein (C)에 대 한 단일 채널 이미지를 거꾸로 microtubule (녹색) 및 ninein (Pep3; 참조8, 레드)에 대 한 분류. 이미지 표시 apico 기저 microtubules 꼭대기 ninein 지역화, 언바운드 항 체는 뿐만 아니라 아주 좋은 구조는 organoid의 보존과 항 체의 침투를 제안. (D, E) 크립 트 고정 하 고 위와 같이 표시 하 고 다시 보여주는 우수한 구조 보존 개발, 라벨, 그리고 항 체는 Organoid. 고유 apico 기저 microtubules 및 꼭대기 n MTOC ninein 지역화가 분명 하 고 d에서박스형 영역의 확대 이미지 (E)에서 강조 표시 된. 스케일 바 = 10 μ m (A-D); 5 μ m (E) <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56662/56662fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig8.jpg"> 
그림 8: 메탄올에 지하실 매트릭스 내에서 고정 및 microtubules와 EB1 면역 표시 Organoids. Organoids의 공초점 광학 섹션 메탄올에 고정, 세척 및 10% 염소 혈 청 및 0.1% 세제, 포함 하는 PBS에 막히고 지 매트릭스에 남아 있는 하는 동안 표시. (A) 낭종에서 완전 개발된 organoid 도메인 표시 polyclonal α-tubulin (레드) 토끼와 단일 클로 널 EB1 (녹색) 항 체를 보여주는 apico 기저 microtubules, 마우스 두 나누어 셀과 별개 EB1 혜성에 스핀 들 (화살표). 언바운드 EB1 항 체의 일부 트랩은 분명 하다. 그러나, 좋은 구조 보전과 microtubules EB1의 라벨은 관찰 된다. EB1 혜성의 존재는 동적 microtubules 보존 제안 (A, 반전). (B) organoid 낭종 지역 주변 지 매트릭스 (화살표) 안에 갇혀 α-tubulin 상당한 항 체와 항 체 라벨 표시의 거꾸로 이미지. 스케일 바 5 μ m를 =. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56662/56662fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56662/56662fig9.jpg"> 
그림 9: Organoids 1%에서 지 매트릭스 내에서 고정 PFA와 Lgr5 및 CD24 면역 표시. 1%의 지 매트릭스 내에서 고정 하는 organoids의 공초점 광학 섹션 PFA 0.1% 세제를 포함 하는 PBS에 PBS에서 1% 염소 혈 청 및 0.1% 세제, 세척 그리고 Lgr5 및 CD24에 대하여 항 체와 분류. (A, B) 보여주는 Paneth 세포 긍정적인 CD24 (빨간색) 토 굴 도메인 내에서 줄기 세포 틈새. Confocal 및 위상 대비 이미지는 A에 병합 되었습니다. B 단일 채널 CD24 라벨을 표시합니다. (C) Lrg5 양수 줄기 세포를 보여주는 암호 도메인 내에서 줄기 세포 지역. 스케일 바 = 10 μ m. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56662/56662fig9large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/56662/56662table1.jpg"> 
표 1: 작은 창 자 토 굴과 villi 격리 및 정착의 타임 라인. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56662/56662table1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

선물이 vivo에서 조직에서 장 3 차원 구조의 절연에 대 한 프로토콜 및 지하실 매트릭스 생체 외에서 organoids, 및 세부 다른 정착 immuno-microtubule의 라벨에 대 한 최적화 된 프로토콜을 얼룩이 지 포함 centrosomal, 그리고 접합 단백질도로 표식 줄기 세포 단백질 Lgr5를 포함 하 여 셀.

Microtubules 및 전 비보 장 조직 및 장 Organoids 3 차원 생체 외에서 Centrosomal 단백질의 면역 형광 라벨

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

immuno-fluorescent-labeling-microtubules-centrosomal-proteins-ex-vivo

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

15.3K 조회수.  University of East Anglia. 선물이 vivo에서 조직에서 장 3 차원 구조의 절연에 대 한 프로토콜 및 지하실 매트릭스 생체 외에서 organoids, 및 세부 다른 정착 immuno-microtubule의 라벨에 대 한 최적화 된 프로토콜을 얼룩이 지 포함 centrosomal, 그리고 접합 단백질도로 표식 줄기 세포 단백질 Lgr5를 포함 하 여 셀.

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The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the lumen and basolateral membranes contacting each other and/or the extracellular matrix. How this distinctive membrane asymmetry is established and maintained during organ morphogenesis is still an unresolved question of cell biology. This protocol describes the C. elegans intestine as a&#160;model for the analysis of polarized membrane biogenesis during tube morphogenesis, with emphasis on apical membrane and lumen biogenesis. The C. elegans twenty-cell single-layered intestinal epithelium is arranged into a simple bilaterally symmetrical tube, permitting analysis on a single-cell level. Membrane polarization occurs concomitantly with polarized cell division and migration during early embryogenesis, but de novo polarized membrane biogenesis continues throughout larval growth, when cells no longer proliferate and move. The latter setting allows one to separate subcellular changes that simultaneously mediate these different polarizing processes, difficult to distinguish in most polarity models. Apical-, basolateral membrane-, junctional-, cytoskeletal- and endomembrane components can be labeled and tracked throughout development by GFP fusion proteins, or assessed by in situ antibody staining. Together with the organism&#39;s genetic versatility, the C. elegans intestine thus provides a unique in vivo model for the visual, developmental, and molecular genetic analysis of polarized membrane and tube biogenesis. The specific methods (all standard) described here include how to: label intestinal subcellular components by antibody staining; analyze genes involved in polarized membrane biogenesis by loss-of-function studies adapted to the typically essential tubulogenesis genes; assess polarity defects during different developmental stages; interpret phenotypes by epifluorescence, differential interference contrast (DIC) and confocal microscopy; quantify visual defects. This protocol can be adapted to analyze any of the often highly conserved molecules involved in epithelial polarity, membrane biogenesis, tube and lumen morphogenesis.

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analy

The transparent C. elegans intestine can serve as an "in vivo tissue chamber" for studying apicobasal membrane and lumen biogenesis at the single-cell and subcellular level during multicellular tubulogenesis. This protocol describes how to combine standard labeling, loss-of-function genetic/RNAi and microscopic approaches to dissect these processes on a molecular level.

C. 선 충 장 한 모델으로 루멘 Morphogenesis 세포를 단일 세포 수준에서 Vivo에서 편광 막 속: 항 체 얼룩이 지기, RNAi 손실의 기능 분석 및 이미징 라벨

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the ...

연구

발생학

Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not routinely employed in animal models. Conventional experimental readouts often rely on post mortem and ex vivo analyses, which prevent intra-individual follow-up examinations and increase the number of study animals needed. Fluorescence-mediated tomography enables the non-invasive, repetitive, quantitative, three-dimensional assessment of fluorescent probes. It is highly sensitive and permits the use of molecular makers, which allows for the specific detection and characterization of distinct molecular targets. In particular, targeted probes represent an innovative tool for analyzing gene activation and protein expression in inflammation, autoimmune disease, infection, vascular disease, cell migration, tumorigenesis, etc. In this article, we provide step-by-step instructions on this sophisticated imaging technology for the in vivo detection and characterization of inflammation (i.e., F4/80-positive macrophage infiltration) in a widely used murine model of intestinal inflammation. This technique might also be used in other research areas, such as immune cell or stem cell tracking.

Target-specific probes represent an innovative tool for analyzing molecular mechanisms, such as protein expression in various types of disease (e.g., inflammation, infection, and tumorigenesis). In this study, we describe a quantitative three-dimensional tomographic assessment of intestinal macrophage infiltration in a murine model of colitis using F4/80-specific fluorescence-mediated tomography.

검색 및 대 식 세포 관련 Murine 창 자 염증의 정량화에 대 한 단층 형광 중재

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not ...

의학

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal epithelium. Due in part to the lack of a definitive ligand for the &#947;&#948; T cell receptor, our understanding of the regulation of &#947;&#948; IEL activation and their function in vivo remains limited. This necessitates the development of alternative strategies to interrogate signaling pathways involved in regulating &#947;&#948; IEL function and the responsiveness of these cells to the local microenvironment. Although &#947;&#948; IELs are widely understood to limit pathogen translocation, the use of intravital imaging has been critical to understanding the spatiotemporal dynamics of IEL/epithelial interactions at steady-state and in response to invasive pathogens. Herein, we present a protocol for visualizing IEL migratory behavior in the small intestinal mucosa of a GFP &#947;&#948; T cell reporter mouse using inverted spinning disk confocal laser microscopy. Although the maximum imaging depth of this approach is limited relative to the use of two-photon laser-scanning microscopy, spinning disk confocal laser microscopy provides the advantage of high speed image acquisition with reduced photobleaching and photodamage. Using 4D image analysis software, T cell surveillance behavior and their interactions with neighboring cells can be analyzed following experimental manipulation to provide additional insight into IEL activation and function within the intestinal mucosa.

We describe a method to visualize GFP-labeled &#947;&#948; IELs using intravital imaging of murine small intestine by inverted spinning disk confocal microscopy. This technique enables the tracking of live cells within the mucosa for up to 4 h and can be used to investigate a variety of intestinal immune-epithelial interactions. &#160;

뮤린 소장에서 상피 내 림프구의 활력 영상

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal ...

면역학 및 감염병학

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota and the vertebrate gut. The spatial landscape of the gut microbiota is tightly controlled by physical features - intestinal mucus, crypts, and folds - and is affected by host-controlled properties such as pH, oxygen availability, and immune factors. These properties limit the ability of commensal microbes and pathogens alike to colonize the gut stably. At the micron-scale, microbial organization determines the close-range interactions between different microbes as well as the interactions between microbes and their host. These interactions then affect large-scale organ function and host health.
This protocol enables the visualization of the gut microbiota spatial organization from distances between cells to organ-wide scales. The method is based on fixing gut tissues while preserving intestinal structure and mucus properties. The fixed samples are then embedded, sectioned, and stained to highlight specific bacterial species through fluorescence in situ hybridization (FISH). Host features, such as mucus and host cell components, are labeled with fluorescently labeled lectins. Finally, the stained sections are imaged using a confocal microscope utilizing tile-scan imaging at high magnification to bridge the micron to centimeter length scales. This type of imaging can be applied to intestinal sections from animal models and biopsies from human tissues to determine the biogeography of the microbiota in the gut in health and disease.

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

This streamlined protocol details a workflow to detect and image bacteria in complex tissue samples, from fixing the tissue to staining microbes with fluorescent in situ hybridization.

시투 혼성화, 렉틴 염색 및 이미징에서 형광을 통한 장내 미생물군유립 상호 작용의 시각화

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota ...

Investigating Intestinal Barrier Breakdown in Living Organoids

Organoids and three-dimensional (3D) cell cultures allow the investigation of complex biological mechanisms and regulations in vitro, which previously was not possible in classical cell culture monolayers. Moreover, monolayer cell cultures are good in vitro model systems but do not represent the complex cellular differentiation processes and functions that rely on 3D structure. This has so far only been possible in animal experiments, which are laborious, time consuming, and hard to assess by optical techniques. Here we describe an assay to quantitatively determine the barrier integrity over time in living small intestinal mouse organoids. To validate our model, we applied interferon gamma (IFN-&#947;) as a positive control for barrier destruction and organoids derived from IFN-&#947; receptor 2 knock out mice as a negative control. The assay allowed us to determine the impact of IFN-&#947; on the intestinal barrier integrity and the IFN-&#947; induced degradation of the tight junction proteins claudin-2, -7, and -15. This assay could also be used to investigate the impact of chemical compounds, proteins, toxins, bacteria, or patient-derived probes on the intestinal barrier integrity.

Here we describe a technique to quantify the barrier integrity of small intestinal organoids. The fact that the method is based on living organoids enables the sequential investigation of different barrier integrity modulating substances or combinations thereof in a time-resolved manner.

살아있는 오르가노이드의 장 장벽 고장 조사

Organoids and three-dimensional (3D) cell cultures allow the investigation of complex biological mechanisms and regulations in vitro, which previously was ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

에 대한 마우스 태아의 전체 소장 문화 시스템<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 신호 전달 경로와 융모 개발의 3 차원 라이브 영상의 조작

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

생물학

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

단세포 분해능 3차원 알래기 알코노이드

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

파라핀 Embedding을 이용한 3D 장 점막 모델 구축

Basic Three-Dimensional (3D) Intestinal Model System with an Immune Component

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the pharmacological screening of potentially beneficial substances, and for toxicity studies on potentially harmful food components. Of relevance, there is a current demand for the development of cell-based in vitro models to substitute animal models. Here, a protocol for a basic, &#8220;healthy tissue&#8221; three-dimensional (3D) intestinal equivalent model using cell lines is presented with the dual benefit of providing both experimental simplicity (standardized and easily repeatable system) and physiological complexity (Caco-2 enterocytes with a supporting immune component of U937 monocytes and L929 fibroblasts). The protocol also includes paraffin embedding for light microscopic evaluation of fixed intestinal equivalents, thereby providing the advantage of analyzing multiple visual parameters from a single experiment. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) stained sections showing the Caco-2 columnar cells forming a tight and regular monolayer in control treatments are used to verify the efficacy of the model as an experimental system. Using gluten as a pro-inflammatory food component, parameters analyzed from sections include reduced monolayer thickness, as well as disruption and detachment from the underlying matrix (H&#38;E), decreased tight junction protein expression as shown from occludin staining (quantifiable statistically), and immune-activation of migrating U937 cells as evidenced from the cluster of differentiation 14 (CD14) staining and CD11b-related differentiation into macrophages. As shown by using lipopolysaccharide to simulate intestinal inflammation, additional parameters that can be measured are increased mucus staining and cytokine expression (such as midkine) that can be extracted from the medium prior to fixation. The basic three-dimensional (3D) intestinal mucosa model and fixed sections can be recommended for inflammatory status and barrier integrity studies with the possibility of analyzing multiple visual quantifiable parameters.

저자 스포트라이트: 3D 인간 세포주 모델을 사용하여 화합물이 장 조직에 미치는 영향 조사 

Here we describe constructing a basic three-dimensional (3D) intestinal cell line model system and a paraffin embedding protocol for light microscopic evaluation of fixed intestinal equivalents. Staining of selected proteins permits the analysis of multiple visual parameters from a single experiment for potential use in preclinical drug screening studies.

면역 성분이 있는 기본 3차원(3D) 장 모델 시스템

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the ...

Microtubules 및 전 비보 장 조직 및 장 Organoids 3 차원 생체 외에서 Centrosomal 단백질의 면역 형광 라벨

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C. 선 충 장 한 모델으로 루멘 Morphogenesis 세포를 단일 세포 수준에서 Vivo에서 편광 막 속: 항 체 얼룩이 지기, RNAi 손실의 기능 분석 및 이미징 라벨

검색 및 대 식 세포 관련 Murine 창 자 염증의 정량화에 대 한 단층 형광 중재

뮤린 소장에서 상피 내 림프구의 활력 영상

시투 혼성화, 렉틴 염색 및 이미징에서 형광을 통한 장내 미생물군유립 상호 작용의 시각화

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면역 성분이 있는 기본 3차원(3D) 장 모델 시스템

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