시간 경과 현미경 실험에는 바이오 검사 시설 (BSF), EPFL을 수행 했다. 우리는 videography 및 영화 편집을 위한 마크 Delachaux (서비스 Audiovisuel, EPFL) 감사 합니다.

참고:이 연구에서 E14 ES 세포 라인 사용 되었다. 그러나,이 프로토콜 어떤 다른 마우스 ES 세포 라인 생 단백질을 태그 하거나 overexpression를 사용 하 여 스냅인 태그에 융합 하는 관심사의 단백질을 표현에 직접 적용 됩니다. Doxycycline 유도할 수 있는 스냅인 태그 퓨전 셀 라인 사용한 결과 섹션에 표시 된 예제에 대 한 (다음 단백질을 융합 하는 스냅-태그: Nanog, Oct4, Srsf11, 또는 형광 단백질 mOrange2 및 sfGFP, 및의 통제에 넣어 한 doxycycline 유도할 수 있는 발기인. 참조 대 한 자세한 내용은11 doxycycline 유도할 수 있는 스냅인 태그 퓨전 셀 라인의 생성에 사용 되는 플라스 미드에). Doxycycline 유도할 수 있는 시스템은 특히 유용할 수 있습니다, 그것은 밀접 하 게 제어 하는 타이밍 및 관심사의 단백질의 식의 강도 대 한 수로. 스냅-태그의 C-터미널 위치는 것이 좋습니다, 그리고 N 맨끝 변경 아미노산 시퀀스는 대상 단백질 (N-엔드 규칙12)의 반감기를 변경할 가능성이 더.
1. E-cadherin 코팅 및 셀 시드
<ol><li>스냅인 태그4를 융합 하는 관심사의 단백질을 표현 하는 ES 세포 라인을 생성 합니다.</li>
	<li>코트 100 mm 셀 문화 요리 4 mL의 0.1% 젤라틴 (Ca2 +/Mg2 +없이 버퍼링 인산 염 분 (PBS)에 희석) 1 헤에 대 한 젤라틴을 제거 및 1 h. 사용에 대 한 건조 즉시 하거나 최대 2 개월까지 코팅된 접시를 저장.</li>
	<li>ES 세포 배양 매체 (글래스고 최소 필수 보통 10 %ES 세포 자격 태아 둔감 한 혈 청, 2mm 나트륨 pyruvate, 1% 비 본질적인 아미노산, 1% 페니실린/스, 2 mM L-글루타민, 100 µ M 2-보충의 셀 라인을 성장 mercaptoethanol, 백혈병 금지 요인 (LIF), 3 µ M CHIR99021 및 0.8 µ M PD184352) 젤라틴 코팅 요리 접시 당 10-20 미 오 셀의 합류를 도달할 때까지 2 일 동안 37 ° C, 5% CO2 . 참고: 여기, LIF HEK 293T 세포, 표면에 뜨는 수집 및 필터링의 과도 transfection에 의해 제작 되었다. LIF의 각 배치 pluripotency를 유지 하기 위해 그것의 잠재력에 대 한 테스트를 했다 하지만 농도 결정 하지 했다. 그러나, 재조합 형 LIF 또한 상업적으로 사용할 수 있으며 마우스 ES 세포 배양에 대 한 일반적으로 사용 되는 농도 1000 단위/mL13.</li>
	<li>96 잘 접시 재조합 마우스의 30 µ L로 잘 (5 ng / µ L, 캘리포니아2 +/Mg2 +PBS에 희석 당 전자 cadherin Fc 키메라 단백질 (E-cad-Fc) 이미징에 대 한 적합 한 코트. 사용 하 여 재고 농도 100 ng / µ L,-80 ° C에 저장). 전자 cad Fc은 매우 깨지기 쉬운 광범위 한 pipetting 하지 마십시오. 1.5 h 37 ° C에서 품 어. 참고: 현미경에 따라 다른 형식은 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>전자 cad Fc를 발음 하 고 캘리포니아2 +/Mg2 +, PBS의 100 µ L로 한 번 씻어 미리 따뜻하게 ES 세포 배양 매체의 100 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>없이 Ca2 +/Mg2 +PBS의 5 mL와 관심사의 세포를 씻어. 발음 하 고 0.25% Trypsin EDTA의 2 개 mL를 추가 합니다. 37 ° c.에 4 분 동안 품 어 ES 세포 배양 매체의 4 개 mL를 추가, resuspend 그리고 4 분 Aspirate는 상쾌한 1000 x g에서 스핀 다운 신선한 ES 세포 배양 매체의 2 mL에 펠 릿을 resuspend. 참고: 없이 Ca2 +/Mg2 + PBS 한다 사용할 수 세척 trypsinization 전에 세포에 세포 접착에 필요한 캘리포니아2 + 이온을 제거 하기 위해. 반면, 전자 cad Fc 희석 및 코팅 (1.4 단계), PBS를 사용 하 여 Ca2 +/Mg2 +, 전자 cad Fc를 ES 세포의 접착 이후 코팅된 요리는 캘리포니아2 +-종속14.</li>
	<li>ES 세포 배양 매체 및 횟수, 세 실 (0.1 m m 깊이의 챔버에 대 한 부하 10 µ L)를 사용 하 여 1 ml resuspended 셀 1시 10분 희석.</li>
	<li>전자 cad Fc에서 시드 30000 셀/cm2 이미징 플레이트 코팅. ES 세포 배양 매체에 잘 당 최대 200 µ L 채우십시오. Doxycycline 유도할 수 있는 셀 라인, doxycycline의 적절 한 복용량으로 유도 (복용량과 사전에 유도의 타이밍 최적화. 여기에 사용 되는 셀 라인 치료 했다 500 ng/mL doxycycline 이미징 하기 전에 24 시간으로). 37 ° C, 5% CO2 incubate 고 라벨 및 셀 시드 후 24 h를 이미징 펄스와 함께 진행 합니다.</li>
</ol>2. 펄스 스냅인 태그 라벨
참고: 단백질 부패 실험에 대 한 그것은 적절 한 스냅 염료 농도 사용 하 여 중요 한입니다. 농도, 시간 경과의 시작 부분에 밝은 신호를 충분히 높은 해야로 형광 시간이 지남에 저하 됩니다. 그러나, 너무 높은 염료 농도 사용 하 여 세척 후에 매체에 또는 셀에 남아 잔류 염료를 발생할 수 있습니다. 무료 염료 수 이후에 바인딩할 새로 생산된 스냅인 태그 분자 감퇴 곡선 왜곡 됩니다 동영상의 과정을 통해. 관찰 된 형광 신호는 해당 단백질 식 수준 뿐만 아니라 염료, 사용, 셀 라인의 속성에 따라 달라 집니다. 따라서, 테스트 다른 희석, 희석 제조업체가 라이브 셀 이미징에 대 한 제안에서 시작 하 여 염료 농도 최적화 하기 위해 결정적 이다. 이 연구를 위해 빨강 형광 기판 사용 되었다. 12의 최적 농도 nM doxycycline 유도할 수 있는 overexpression 셀 라인에 대 한 결정 했다.
<ol><li>미리 데워 진된 ES 세포 배양 매체에 적절 한 농도에 스냅 염료 희석. 부드럽게 96 잘 접시에 시드 이전 세포에서 매체를 제거 하는 피 펫을 사용 하 고 잘 당 희석된 스냅 염료의 50 µ L를 추가 합니다. 37 ° c.에 30 분 동안 품 어</li>
	<li>피 펫과 희석된 염료를 발음 하 고 미리 데워 공영 (없이 캘리포니아2 +/Mg2 +)의 200 µ L 3 x를 씻어. ES 세포 배양 매체의 200 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 15 분 동안 품 어</li>
	<li>이전 세 단계를 두 번 더 반복 합니다. 참고: 광범위 한 세척은 어떤 언바운드 염료를 제거 하기 위해 중요 합니다. PBS 가진 반복된 세척 단계 15 분 외피 강력한 이미징 실험을 시작 하기 전에 스냅인 태그 융해 단백질의 라벨을 확인 하는 반면, 매체에서 잔여 extracellular 염료를 제거 합니다. 그러나, 부드러운 pipetting으로 세척 단계를 수행 하 고 셀 전자 cad Fc에 시드 쉽게 분리 하는 경향이 자동 흡 인기를 사용 하지 마십시오.</li>
	<li>영상 매체의 200 µ L를 추가 합니다. 줄이기 위해 형광 배경, 페 놀 레드 무료 매체를 사용 하 여 (보충 10 %ES 세포 자격 태아 둔감 한 혈 청, 2mm 나트륨 pyruvate, 1% 비 본질적인 아미노산, 1% 페니실린/스, 2 m m L-글루타민, 100 µ M 2-mercaptoethanol, LIF, 3 µ M CHIR99021 및 0.8 µ M PD184352).</li>
</ol>3. 시간 경과 현미경
<ol><li>라이브 영상, 제어 온도 CO2를 위해 적당 한 현미경을 사용 합니다. 설정 온도 37 ° C, 5% CO2 를 사용 하 고 1-2 h에 대 한 equilibrate를 허용 하기 전에.</li>
	<li>접시를 현미경에 놓고 이미징에 대 한 적합 한 장소를 찾을 합니다. 관광 명소 어디 세포는 균등 하 게 분산, 하지만 너무 조밀한,이 분석을 용이 하 게 합니다를 선택 합니다. 분석에 필요한 셀의 수 선택 된 관광 명소의 수를 조정 합니다. 이 연구에서는 셀 라인 당 3-5 관광 명소를 기록 했다.</li>
	<li>목표를 선택 합니다. 20 X 목표는 ES 세포의 크기에 적합 합니다.</li>
	<li>기록 형광 채널에 대 한 조명 설정을 선택 합니다. 레이저 파워 및 관심사의 세포에서 형광 신호 강도 따라 노출 조정 합니다. 하지만, 영화의 과정을 통해 감소, phototoxicity 및 photobleaching을 최소화 하기 위해 30% 보다 높은 레이저 능력을 방지 이후 강한 초기 신호를 얻을 수 있는지 확인 합니다. 이 연구, 632/22 여기 필터에 대 한 nm (파장/대역), 679/34의 방출 필터 nm (파장/대역), 100 ms의 10% 및 노출 시간의 레이저 파워를 사용 했다.</li>
	<li>이미징 간격 및 시간 경과 실험 기간을 선택 합니다. 2-20 h의 예상된 반감기와 단백질에 대 일 분의 시간 간격으로 12-24 h의 수집 시간을 선택 합니다. Shorter-lived 단백질에 대 한 간격 및 수집 시간을 최소로 단백질 증가에 따라 줄일.</li>
	<li>이미징 시작 합니다.</li>
</ol>4. 이미지 처리 및 분석
<ol><li>스택 tiff 형식에서으로 얻은 이미지를 수집 합니다. 추가 처리 및 분석에 대 한 피지 소프트웨어15를 사용 합니다. 저속 데이터 현미경 소프트웨어 스택으로 수집 되지 않습니다, 소프트웨어에서 시간 경과 실험의 모든 프레임을 열고 ( 파일 을 클릭 하 여 | 오픈... 또는 드래그 앤 도구 모음에 해당 하는 파일) 이미지 클릭 | 스택 | 이미지 스택입니다.</li>
	<li>Subtract 배경 함수를 사용 하 여 스택의 모든 그림에서 배경을 제거 하. 이렇게 하려면 프로세스 | 배경 빼기. 팝업 창에서 롤링 볼 radius를 선택 합니다. 반지름은 적어도 몇 군데 셀의 크기를 사용 합니다. 배경 빼기 스택의 모든 셀에 적용 하려면 선택 예 에 프로세스 스택? 팝업 창.</li>
	<li>관심의 셀을 선택 하 고 도구 모음을 사용 하 여 주위 (ROI) 관심 영역을 그립니다. 핵 신호에 대 한 첫 번째 도구 모음에서 해당 탭을 클릭 하 고 다음 클릭 하 여 관심의 핵 조정 주위 타원형 타원형 선택을 사용 합니다. 세포질 신호 또는 매우 조밀한 지역에 대 한 자유형 선택을 사용 하 여 밀접 하 게 셀 윤곽선을 따를 수 있을. 비록 모든 배경 픽셀 (단계 4.8-4.9)의 후속 빼기 때문에 정확 하 게 셀 윤곽선을 따라 하는 데 필요한 배경, 너무 큰 영역을 포함 하지 마십시오.</li>
	<li>분석을 클릭 하 여 투자 수익 관리자에 관심 영역을 추가 | 도구 | 투자 수익 관리자 | 추가, 또는 키보드에서 T 를 눌러.</li>
	<li>스택 창에서 탭을 이동 하 여 또는 shift 키를 누르면 다음 프레임으로 진행 + < 키보드, 다음 이전 작업을 반복. 동영상의 과정을 통해 관심의 셀 따라 고 각 프레임의 ROI ROI 관리자 추가. 최종 투자 수익 더 를 클릭 하 여 추적 된 각 셀에 대 한 설정 저장 | 저장...에 ROI 관리자. 참고: 셀 분할 후 두 딸 셀을 개별적으로 추적 하 고 배경 빼기 후 그들의 통합된 강렬을 합계 (단계 4.6 4.9 참조) 세포 분열 동안 단백질 희석에 대 한 계정. 두 딸 세포에 대 한 투자 수익 집합을 저장 합니다.</li>
	<li>일단 관심의 셀은 영화 내내 추적, 측정, 평균 강도와 ROIs의 영역에 대 한 값을 클릭 합니다. 전자 스프레드시트 프로그램으로 얻은 값을 복사 하 고 각 시간 지점에 대 한 셀의 원시 통합된 강도 다음과 같이 계산. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq1.jpg"> 어디 c의미평균 강도 및지역C해당 투자 수익의 영역.</li>
	<li>로컬 백그라운드를 예상 하려면 각 시간 프레임에 대 한 관심의 셀에 가까운 수익을 추가 합니다. 어떤 세포 형광 신호를 포함 하지 마십시오. 셀의 크기는 대략 원형 ROI를 사용 하 여 이동 하거나 필요한 경우, 예를 들어 인접 셀 간섭 하는 경우 적절 하 게 축소 합니다. 투자 수익 배경 투자 수익을 얻으려면 설정 설정 휴대와 앞에서 설명한 대로 진행 하 고 스프레드시트에 측정된 강도 값을 복사 합니다.</li>
	<li>셀의 통합 된 강도 대 한 배경 수정 값을 가져오려면 먼저 각 시간 지점에 대 한 백그라운드의 통합된 강도 계산: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq2.jpg"> 배경 신호 및 지역C 의 평균 강도 BG 의미 셀 포위 망 투자 수익의 영역입니다. 두 영역 모두 동일한 크기를 가지 않는 한 ROI, 배경 영역을 사용 하지 마십시오.</li>
	<li>각 시간 지점에 대 한 셀의 마지막 배경 빼고 통합된 강도 계산: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq3.jpg">
</li>
	<li>정규화 단일 셀 감퇴 곡선, 첫째 시간 점의 강도 값으로 각 시간 점의 강도 값을 나눕니다. 참고: 커브 피팅 (단계 4.11 참조)도 수행할 수 있습니다 각 단일 셀에서 또는 인구 평균에. 기반 인구 평균 셀 사이의 다른 형광 강렬에서 편견을 피하기 위해 계산 하는 경우에 정규화가 필요 합니다. 정규화는 따라서 각 셀 마지막 감퇴 곡선을 같은 무게로 공헌 한다 다는 것을 보장 합니다. 또한, 정상화 ( 그림 3A-3 C참조) 그들의 절대 형광 강렬은 별도로 단일 셀 부패 한다를 시각화 하기 위해 유용할 수 있습니다. 그러나, 경우에 단일 셀 반감기를 결정 하 고 데이터 평균 하지, 정규화 단계를 생략할 수 있다 고 커브 피팅 원시 데이터에서 직접 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>단백질 반감기 예측에 대 한 커브 피팅 도구를 사용 합니다. 이 연구의 MATLAB 사용자 인터페이스 애플 리 케이 션 섹션에서 기본적으로 위치한 MATLAB 커브 피팅 도구 상자 3.4.1가 사용 되었다. 형광 강도 가져오기 및 가져오기 데이터 탭에서 클릭 하 여 MATLAB에 전자 스프레드시트에서 시간 값 커브 피팅 도구 상자를 열고 선택한 시간 포인트 및 형광 붕괴 데이터 X 데이터 및 Y 데이터 탭 선택 사용자 정의 방정식 곡선 맞춤 탭을 입력 하는 지 수 감퇴의 공식: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq4.jpg"> f (t) 주어진 시간 포인트, 형광 강도가 는 초기 강도 및 b 감퇴 속도. 맞는 옵션탭, 0 모두 a 와 b의 낮은 한도 대 한 선택. A 와 b 에 대 한 예상된 값 결과 창에 나타납니다. 다음과 같이 반감기를 계산. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq5.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhou, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+Protein+Half-Lives.">Determining Protein Half-Lives.</a> Signal Transduct Protoc. , 67-77 (2004).</li><li>Schwanh&#228;usser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HaloTag:+A+Novel+Protein+Labeling+Technology+for+Cell+Imaging+and+Protein+Analysis.">HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis.</a> ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).</li></ol>

저자는 공개 없다.

가장 중요 한 단계는 아니 잔여 언바운드 염료 남아 매체 또는 셀으로 세척 후 그것을 보장 하기 위해 수도 바인딩할 새로 단백질 부패 모니터링 스냅인 태그를 사용 하 여 생산 실험 및 거기 동안 나중 스냅인 태그 분자 eby 타협 감퇴 곡선입니다. 이것은 한 손으로 모든 설명된 세척 단계를 신중 하 게 수행 하 여 달성 에입니다. 다른 한편으로, 염료 농도 유지 되어야 한다, 가능한 한 낮은 여전히 좋은 신호 대 잡음 비를 얻기 위해 허락 하는 범위에 있는 동안. 그림 2에서 같이 염료 농도 다른 희석을 테스트 하 여 각 실험에 대 한 최적화 되어야 합니다. 우리의 경우, doxycycline 유도할 수 있는 셀 라인 상대적으로 높은 식 레벨, 따라서 낮은 염료 농도 사용 하 여 수 있다.
이 프로토콜 시간 경과 형광 이미징 하 여 단일 셀의 단백질 저하를 계량 하는 일반적인 접근 방식을 설명 합니다 및 프로토콜의 다양 한 측면, 실험 조건 및 해당 목표에 따라 수정할 수 있습니다. 실험입니다. 단백질 저하는 대부분 첫 번째 순서 지 수 감퇴를 따른다. 단백질에 대 한 부패 한다 여기에 맞는의 R2 값은 상당히 높은 표시 (0.95 ~ 0.99) 및 멀티-지 수를 사용 하 여 하지 크게 개선 했습니다 맞는. 그러나, 단일 지 수 맞는에서 얻은 결과 만족 하는 경우 수 있습니다 멀티-지 수를 피팅 고려는 서로 다른 속도와 부패는 여러 레이블이 단백질 부분 모집단의 존재를 함축 할 것입니다. 또한, 우리의 이미지 분석 파이프라인 실현 되 면 세포의 제한 된 숫자는 분석만 상당한 수동 작업이 포함 됩니다. 셀의 높은 숫자에 대 한 자동화 된 접근을 고려해 야 합니다. 다양 한 자동화 도구 세그먼트 및 셀16,17의 더 큰 숫자를 추적할 수 있는 지난 몇 년 동안 개발 되었습니다. 그러나, 세포와 자주 셀 사단의 움직임은 도전과 세그멘테이션 오류가 발생 하는 경향이. 또한, 단백질 부패 한다, 이미징 때 형광 신호가 줄어듭니다 시간이 지남에 세분화에 대 한 임계값의 선택을 더욱 어렵게. 따라서, 추적 도구 시험 되어야 한다 신중 하 게이 프로토콜에 대 한 구현 되 고 전에 세분화 오류 데이터를 상당히 왜곡 수 있습니다. 또한, 다른 배경 빼기 방법을 고려할 수 있습니다, 인수 이미지의 품질에 따라. 여기 우리는 오히려 띄엄띄엄 시드 셀과 균등 하 게 조명된 이미지에 적합은 피지의 롤링 볼 보정을 사용 합니다. 그러나, 이미지 고르지 조명에서 고생을 하는 경우에 특히 더 전문적인된 배경 빼기 방법 적용된18,19수 있습니다.
우리의 접근 한 제한은 시간 경과 기록 분석 될 수 있는 기간입니다. 상대적으로 짧은 단백질에 대 한 약 12 h의 획득 시간 충분 하다. 예를 들면 Srsf11, 최소로 단백질에 대 한 12 h의 시간 범위에 피팅 곡선을 수행 가능 하다. 그러나, 그것은 지 수 맞는를 획득 시간 및 이미징 간격은 증가 되어야 한다 최소로 단백질에 대 한 정확히 있을 다는 것을 명심 하는 것이 중요. 빠른 자전거 셀 몇 군데 되 고는, 긴 수집 시간 분석 딸 세포의 증가 수의 분석, 복잡 하 게 됩니다. 다시 말하지만,이 경우에, 자동화 된 분석 파이프라인 유용할 수 있습니다. 또한, 단백질 감소율을 스냅인 태그 융해 단백질을 사용 하 여 때 스냅-태그 내 생 단백질의 반감기를 변경 가능성 고려 되어야 한다. 여기에 사용 되는 셀 라인의 경우 우리가 이러한 효과 대 한 증거를 참조 하는 Oct4 및 Nanog 결정된 반감기 게시 값3,20,,2122일치로. 스냅-태그의 단백질 저하에는 효과 추가 규칙, 특히 반감기에 데이터를 사용할 수 있는, 하나의 옵션 것 cycloheximide 하 여 단백질 합성을 차단 하 고 항 체를 사용 하 여 다른 시간 지점에서 서쪽 오 점 수행 하 내 생 적인 단백질을 인식 하 고 태그 내 생 버전 스냅 태그 후보 단백질의 부패를 직접 비교.
단백질 반감기에 가장 이전 게시 된 데이터 대량 생화학 실험, cycloheximide에 의해 단백질 합성의 억제에 주로 시간 코스 서쪽 오 점 실험을 기반으로 합니다. 그러나,이 방법은 단일 셀 해상도 제공 하지 않습니다 그리고 그것의 임시 해결책은 고려 될 수 있는 시간 포인트의 제한 된 수의 낮은. 대조적으로, 우리의 단일 셀 접근 단백질 합성 억제제의 사용을 요구 하지 않는다 고 단백질 저하 속도에 셀 변화를 식별할 수 있습니다. 그것은 또한 다른 반감기, 셀의 잠재적인 모집단은 특히 heterogeneously 표현한 단백질의 조사에 대 한 흥미로운 수 있습니다 식별 하는 데 있습니다. 우리의 방법의 더 이점은 이며 철에 가능성 셀 동기화 따라서 하프 라이프, 세포 주기를 통해 예 과도 변화를 모니터링. 그러나, 스냅-태그 기술 그것의 주요 단점이 될 수도 있는 해당 스냅인 태그 셀 라인의 세대가 필요 합니다. 중요 한 것은, 우리의 접근 endogenously 태그 단백질9에 적용할 수 있습니다. 위에서 언급 한 우리가 우리가 공부 하는 단백질에 대 한 내 생 단백질 반감기 변경 스냅인 태그의 어떤 증거를 준수 하지 않는 다른 방법으로 같은 범위에 스냅-태그 접근 방법의 정확도 제안.
여기에 제시 하는 방법은 다양 한 애플리케이션에 유용할 것 이다. 가장 중요 한 것은, 그것은 관심의 모든 스냅인 태그 융합 단백질에 대 한 반감기에 셀 가변성을 공부 옵션을 제공 합니다. 있다 여러 다른 태그 (예: 클립 태그23 또는 헤일로 태그24) 사용할 수 그 작동 원리는 동일. 펄스 라벨 및 잔여 염료의 세척 매체에 염료를 떠나 반면 단백질 반감기를 결정 수 있는 감퇴 곡선으로 이어질 것입니다 (비 형광은 리간드의 경우 하지 않으면 태그에 바인딩된) 단백질의 장기 이미징 가능 관심. 때문에 사용 가능한 형광 ligands의 큰 선택을, 스냅-태그 따라서 결합할 수 있습니다 다른 여러 붙일 레이블된 분자 또는 다른 태그와 다양 한 문맥에 기술을 적용 하기 위한 수 있도록.

그것은 잘 알려진 세포질 단백질 합성 및 분해 속도 특정 각 단백질에 대 한 및 생리 적 규정이 적용 되 고 광범위 한 회전율, 받 다. 전통적으로, 단백질 저하 속도 측정 된 방사성 펄스 체이스 분석 같은 대량 방법을 사용 하 여 또는 cycloheximide1단백질 합성 억제제와 관련 된 되었습니다. 더 최근에, 안정 동위 원소 질량 분석 함께에서 세포 배양 (SILAC) 아미노산으로 세계적인 규모2단백질 회전율 계량에 설립 되었습니다. 그러나, 이러한 방법은 인구 평균에 의해 제한 되 고 셀 다양성에 대 한 정보 손실 따라서 됩니다. 또한, 세포 인구에서 동기화 되는 단백질 저하의 과도 변화를 확인할 수 수 없습니다.
또는, 단백질 반감기 또한 종종 단일 셀 해상도 제공 하는 이점을 있는 형광-기반 접근에 의해 결정 수 있습니다. 예를 들어 photoactivatable 녹색 형광 단백질 (paGFP) 초기 포유류 배아3Oct4 반감기를 결정 하기 위해 사용 되었습니다. 살아있는 세포에서 단백질 부패를 감시 하는 또 다른 방법은 형광 시간 경과 영상에와 함께 스냅인 태그의 사용 이다. 스냅-태그는 DNA 수리 효소 O6-alkylguanine를 DNA-alkyltransferase (AGT) 특별히 benzylguanine와 반응 분자 프로브4,5, 로 결합 될 수 있다 (BG) 파생 하의 돌연변이 체 버전 6. 따라서, 모든 스냅인 태그 융해 단백질 수 irreversibly 표시 형광, 세포 투과성 염료와. 펄스 잔여 염료의 희미하게 다음 스냅인 태그에 융합 하는 관심사의 단백질의 라벨 표시 단백질 인구의 저하를 모니터링 및 따라서 단백질 반감기를 결정 수 있습니다. 스냅-태그 펄스 체이스 단백질의 라벨에 대 한 성공적으로 사용 된 고 단백질을 결정 하기 위한 점착에 반감기 셀 문화 그리고 vivo에서5,7,,89. 일반적으로 사용 되 포함 하는 스냅인 태그 기판의 큰 다양 한 형광 스펙트럼 상업적으로, 각 특정 응용 프로그램에 대 한 최적의 염료의 선택 사용 사용할 수 있습니다. 따라서, 스냅-태그 다른 형광 성 융해 단백질 또는 염료와 함께 멀티 컬러 이미징에 대 한 또한 사용할 수 있습니다. 셀 스며들 지 않는 염료는 세포 투과성 염료는 세포내, 막 바인딩 단백질을 모니터링에 적용 하는 반면 단백질 막 곁의 라벨 적합 합니다. 또한, 일부 이러한 프로브 거의 없는 기저 형광을 전시 하 고만 스냅인 태그10바인딩 시 강한 형광 신호를 방출 시작 합니다.
이 프로토콜 스냅인 태그를 사용 하 여 단일 셀에 대 한 관심의 다른 단백질의 저하 속도 측정 하는 방법을 설명 합니다. 여기 우리가 마우스 배아 줄기 (ES) 세포 E cadherin에 교양된이 방법 적용 하지만 모든 부착 교양된 셀 종류 사용 가능 해야 한다. 우리 표시 펄스 라벨 형광 시간 경과 영상 다음 스냅인 태그 융해 단백질의 관심의 다양 한 단백질의 단일 셀 반감기를 결정 하기 위한 허용에 반감기의 셀 다양성에 대 한 견적을 제공 한다는 경작된 한 세포의 인구입니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ES cell line expressing a SNAP-tag fusion protein of interest</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate</td><td>Corning</td><td>353219</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer-improved counting chamber, 0.1 mm</td><td>Marienfeld-superior</td><td>640030</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubator</td><td>Panasonic</td><td>MCO-170AICUV-PE</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5804 R</td><td>Eppendorf</td><td>5804000528</td><td></td></tr><tr><td>InCell Analyzer 2200 Cell Imaging System</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>29027886</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glasgow Minimum Essential Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5154</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, embyonic stem cell-qualified</td><td>ThermoFisher</td><td>16141-079</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>113-24-6</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium&amp;nbsp; Non-Essential Amino Acids</td><td>ThermoFisher</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>BioConcept</td><td>4-01F00H</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 200mM</td><td>ThermoFisher</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63689-25ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Leukemia Inhibitory factor</td><td>-</td><td>-</td><td>Produced in the lab by transient transfection of HEK-293T cells, followed by collection and filtering of the supernatant.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CHIR99021 (GSK-3 Inhibitor XVI)</td><td>Merck Millipore</td><td>361559</td><td></td></tr><tr><td>PD 0325901</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>391210-10-9</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin from bovine skin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9000-70-8</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s PBS 10x concentrated</td><td>BioConcept</td><td>3-05K00-I</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s PBS Without Ca++/Mg++</td><td>BioConcept</td><td>3-05F29-I</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA-Solution 0.25%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse E-Cadherin Fc Chimera protein</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>748-EC-050</td><td></td></tr><tr><td>Doxycycline hyclate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>SNAP-Cell 647-SiR</td><td>New England BioLabs</td><td>S9102S</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>A18967-01</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>-</td><td>-</td><td>Open-source image analysis software</td></tr><tr><td>MATLAB R2014a</td><td>Mathworks</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

single-cell quantification of protein degradation rates by time-lapse fluorescence microscopy in adherent cell culture

단백질 합성의 동적 상태에 있고 저하 및 그들의 반감기는 다양 한 상황에서 조정 될 수 있다. 그러나, 가장 일반적으로 사용 되 접근 단백질 반감기는 결정 하기 위해 인구 평균 lysed 세포에서 제한 하거나 단백질 합성 억제제의 사용을 필요로. 이 프로토콜 단백질 반감기 하나의 살아있는 부착 세포에 형광 현미경 검사 시간 경과 함께에서 스냅인 태그 융해 단백질을 사용 하 여 측정 하는 방법을 설명 합니다. 스냅인 태그를 융합 하는 관심사의 어떤 단백질 covalently에 바인딩될 수 있는 결합 된 형광, 세포 투과성 염료에 의해 benzylguanine 파생, 그리고 잔여 염료의 세척 후 레이블이 단백질 인구의 감퇴를 모니터링할 수 있습니다. 이후 셀 추적 그리고 통합된 형광 강도 곡선 기준으로 단일 세포에서 단백질 저하 속도 결정 하기 위한 수 있도록 추적 된 각 셀에 대 한 지 수 감퇴 곡선에서 시간 결과 정량화. 이 메서드는 다른 방법으로 쉽게 평가 될 수 없는 경작된 한 세포의 인구에 반감기의이 대 한 견적을 제공 합니다. 여기에 제시 된 접근 스냅인 태그를 융합 하는 관심사의 단백질을 표현 하는 교양된 부착 세포의 모든 종류에 적용 됩니다. 여기 전자 cadherin 코팅 세포 배양 배지에서 자란 마우스 배아 줄기 (ES) 세포 사용 하 여 단백질의 반감기의 광범위 한 범위와 속도 확인할 수 있습니다 어떻게 단일 셀 저하를 설명 하기 위해.

설명된 프로토콜 스냅인 태그 융합 어떤 주어진된 단백질에 대 한 하프 라이프 셀 가변성의 견적을 제공 합니다. 이미징 판의 코팅에 대 한 재조합 형 전자 cadherin Fc를 사용 하 여 단일 셀 해상도 ES 세포는 식민지에서 성장에 대 한 수 있습니다. 단일 셀 영화 ( 그림 1A)의 과정을 통해 개별적으로 추적할 수 있습니다.
각 단일 셀에 대 한 단백질 반감기를 결정 하기 위하여 그것은 약술에 두 딸 세포의 통합된 농도와 시간별 ( 그림 1B), 통합, 배경 빼고 스냅인 태그 형광 신호를 측정 하는 중요 한 사단의 경우입니다. 이 결과는 부패 속도 따라서 반감기 추출 될 수 있다 ( 그림 1C) 피팅 곡선에 의해 각 셀에 대 한 지 수 감퇴 곡선. 중요 한 것은, 평균 감퇴 곡선을 계산 하는 경우 단일 셀 추적 각 셀 셀 사이의 초기 형광 강도 상 상속 차이도 불구 하 고 평균에 동일한 무게는 되도록 첫 번째 프레임을 정규화 해야 합니다.
적절 한 염료 농도 염료의 종류에 따라 셀 라인 사용 하 고 따라서 각 실험에 대 한 최적화 합니다. 이 설명 하기 그림 2 빨강 형광 기판 그림과, doxycycline 유도할 수 있는 스냅인 태그 퓨전 셀 라인에서 테스트 하는 모든 실험을 위해 사용의 다른 농도의 감퇴 곡선을 보여준다. 3 µ M의 초기 염료 농도 제조업체의 지침에 따라 선정 되었다와 1: 3의 직렬 희석 1.4의 농도 도달할 때까지 수행한 nM. 두 개의 높은 농도 대 한 신호 감소 하지 않습니다, 관찰 된 부패는 111 아래 농도 대 한 지 수 nM. 12의 최적 농도 그것 세척, 후 매체에 남아 잔류 염료의 최소한의 금액을 보장 하지만 신호는 분명 관찰 하에 충분히 밝은 염료의 nM 추가 실험을 위해 선택 되었다 doxycycline 유도할 수 있는 다양 한 곡선을 부패 셀 라인입니다.
그림 3A-3 C 쇼 단일 셀 자연 붕괴 및 다른 평균 반감기와 3 단백질을 위해 인구 평균을 포함 하 여 대표 결과:는 pluripotency 관련 된 녹음 방송 요인 Oct4 및 Nanog (평균 반감기 2.9 h) (평균 하프 라이프: 4.8 h), 및 Srsf11 요소는 많은 오래 살 았된 사전 mRNA 처리 (평균 반감기 25.3 h). Boxplots ( 그림 3D) 곡선에 피팅 하 여 단일 셀 감퇴 곡선에서 얻은 반감기와 3 개의 단백질에 대 한 반감기의이 설명 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56604/56604fig1.jpg"> 그림 1 : 시간 경과 수집 및 분석 A: 셀 펄스 스냅 염료와 표시에 형광의 감퇴를 보여주는 대표적인 이미지의 시리즈. 셀 라인: doxycycline 유도할 수 있는 TRE3G-Oct4-SNAPtag, 500 ng/mL doxycycline 이미징 하기 전에 7 h와 유도. B: 영화 분석 및 통합 강도 계산입니다. 내가c: 나BG셀의 통합: 통합 나C BG배경의 강도: 강도 통합 배경 수정. C: 지 수 곡선 피팅 MATLAB에서 수행합니다. 단일 셀 감퇴 추적, 해당 적합 및 부패 매개 변수에 대 한 결과 예측의 예 a와 b. 반감기는 다음과 같이 계산 됩니다: t1/2 = ln (2) /b. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56604/56604fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56604/56604fig2.jpg"> 그림 2 : 염료 농도의 최적화. 스냅 염료의 다른 농도로 표시 셀 펄스의 형광 붕괴. 3 µ M에서 시작 하는 염료의 직렬 희석 수행 되었다. 자취는 평균 5 셀 각각의 첫 번째 프레임으로 정규화 하 고 12 헤 셀 라인에 대 한 추적: doxycycline 유도할 수 있는 TRE3G-sfGFP-mOrange2-SNAPtag-해충, 500 ng/mL doxycycline 이미징 하기 전에 24 시간으로 유도. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56604/56604fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56604/56604fig3.jpg"> 그림 3 : 단일 셀 다른 스냅인 태그 후보 단백질에 대 한 반감기의 변화. A-c: 단일 셀 부패 한다 (밝은 파랑)와 아목시실린과 유도할 수 있는 Nanog, Oct4 및 Srsf11-스냅-태그 융합 단백질에 대 한 (진한 파란색)를 평균 한다. D: 반-각 단일 셀에 대 한 피팅 지 수 곡선에 의해 계산 되었다 개별 셀의 삶. boxplots 로그2 눈금에 표시 됩니다. 상자 표시 interquartile 범위 (IQR), 검은 선 중간을 나타냅니다. 수염 이상 1.5 x는 IQR에서 벗어난 값으로 정의 되는 outliers (검은 점)을 제외 하 고 최소 및 최대 값을 나타냅니다. N = 20 셀. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56604/56604fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

이 프로토콜에서는 단백질 반감기 하나의 살아있는 부착 세포, 펄스 라벨 및 스냅인 태그 융해 단백질의 형광 시간 경과 이미징 사용 하 여 결정 하는 방법을 설명 합니다.

부착 세포 배양에서 시간 경과 형광 현미경 검사 법에 의해 단백질 저하의 단일 셀 정량화

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

single-cell-quantification-protein-degradation-rates-time-lapse

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.5K 조회수.  École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL). 이 프로토콜에서는 단백질 반감기 하나의 살아있는 부착 세포, 펄스 라벨 및 스냅인 태그 융해 단백질의 형광 시간 경과 이미징 사용 하 여 결정 하는 방법을 설명 합니다.

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Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological systems. In FDAP experiments, the clearance of proteins within living organisms can be measured. A protein of interest is tagged with a photoconvertible fluorescent protein, expressed in vivo and photoconverted, and the decrease in the photoconverted signal over time is monitored. The data is then fitted with an appropriate clearance model to determine the protein half-life. Importantly, the clearance kinetics of protein populations in different compartments of the organism can be examined separately by applying compartmental masks. This approach has been used to determine the intra- and extracellular half-lives of secreted signaling proteins during zebrafish development. Here, we describe a protocol for FDAP experiments in zebrafish embryos. It should be possible to use FDAP to determine the clearance kinetics of any taggable protein in any optically accessible organism.

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Protein levels in cells and tissues are often tightly regulated by the balance of protein production and clearance. Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP), the clearance kinetics of proteins can be experimentally measured in vivo.

광 변환 한 후 형광 붕괴를 사용하여 생활 Zebrafish의 태아의 단백질 안정성을 측정 (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

연구

발생학

Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases. Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest that typically occurs in response to exposure to sub-lethal stresses. However, like other non-dividing cells, senescent cells remain metabolically active and carry out many functions that require unique transcriptional and translational demands and widespread changes in the intracellular and secreted proteomes. Understanding how protein synthesis and decay rates change during senescence can illuminate the underlying mechanisms of cellular senescence and find potential therapeutic avenues for diseases exacerbated by senescent cells. This paper describes a method for proteome-scale evaluation of protein half-lives in non-dividing cells using pulsed stable isotope labeling by amino acids in cell culture (pSILAC) in combination with mass spectrometry. pSILAC involves metabolic labeling of cells with stable heavy isotope-containing versions of amino acids. Coupled with modern mass spectrometry approaches, pSILAC enables the measurement of protein turnover of hundreds or thousands of proteins in complex mixtures. After metabolic labeling, the turnover dynamics of proteins can be determined based on the relative enrichment of heavy isotopes in peptides detected by mass spectrometry. In this protocol, a workflow is described for the generation of senescent fibroblast cultures and similarly arrested quiescent fibroblasts, as well as a simplified, single-time point pSILAC labeling time-course that maximizes coverage of anticipated protein turnover rates. Further, a pipeline is presented for the analysis of pSILAC mass spectrometry data and user-friendly calculation of protein degradation rates using spreadsheets. The application of this protocol can be extended beyond senescent cells to any non-dividing cultured cells such as neurons.

This protocol describes the workflow for metabolic labeling of senescent and non-dividing cells with pulsed SILAC, untargeted mass spectrometry analysis, and a streamlined calculation of protein half-lives.

대사 표지 및 질량 분광법으로 노화 및 비분할 배양된 세포에서의 단백질 회전율 측정

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...

생화학

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

단일 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 Efferocytosis의 정량화

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

면역학 및 감염병학

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

분열 효모의 양적 라이브 세포 형광 - 현미경 분석

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

생물학

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts 

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

단일 및 다세포 상황에서 Invadopodia로 인한 세포 외 기질 Proteolysis의 양적 측정

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

단일 효모 세포에서 MAPK 유도 표현의 시간적 정량화

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard approach to determining intracellular protein degradation relies on biochemical assays for following the kinetics of protein decline. Such methods are often laborious and time consuming and therefore not amenable to experiments aimed at assessing multiple substrates and degradation conditions. As an alternative, cell growth-based assays have been developed, that are, in their conventional format, end-point assays that cannot quantitatively determine relative changes in protein levels.
Here we describe a method that faithfully determines changes in protein degradation rates by coupling them to yeast cell-growth kinetics. The method is based on an established selection system where uracil auxotrophy of URA3-deleted yeast cells is rescued by an exogenously expressed reporter protein, comprised of a fusion between the essential URA3 gene and a degradation determinant (degron). The reporter protein is designed so that its synthesis rate is constant whilst its degradation rate is determined by the degron. As cell growth in uracil-deficient medium is proportional to the relative levels of Ura3, growth kinetics are entirely dependent on the reporter protein degradation.
This method accurately measures changes in intracellular protein degradation kinetics. It was applied to: (a) Assessing the relative contribution of known ubiquitin-conjugating factors to proteolysis (b) E2 conjugating enzyme structure-function analyses (c) Identification and characterization of novel degrons. Application of the degron-URA3-based system transcends the protein degradation field, as it can also be adapted to monitoring changes of protein levels associated with functions of other cellular pathways.

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

단백질 분해의 체계적인 분석을위한 기자 기반의 성장 분석

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

세포의 잘못 폴딩 된 단백질의 분해에 대한 분석

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...

Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main lysosome-dependent pathway is called autophagy, while the primary non-lysosomal method for protein catabolism is the ubiquitin-proteasome system. Recent studies in model organisms suggest that the activity of both autophagy and the ubiquitin-proteasome system is not constant across the day but instead varies according to a daily (circadian) rhythm. The ability to measure biological rhythms in protein turnover is important for understanding how cellular quality control is achieved and for understanding the dynamics of specific proteins of interest. Here we present a standardized protocol for quantifying autophagic and proteasomal flux in vivo that captures the circadian component of protein turnover. Our protocol includes details for mouse handling, tissue processing, fractionation, and autophagic flux quantification using mouse liver as the starting material.

We describe our protocol for measuring biological rhythms in protein catabolism via autophagy and the proteasome in mouse liver.

자동 및 프로테아소말 플럭스에서 일주 리듬 측정

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main ...

Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) - a Versatile Technique to Quantify Cellular Kinetics

Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) is a versatile method to collect time courses of fluorescence signals from individual cells in high throughput. In general, the acquisition of single-cell time courses from cultured cells is hampered by cell motility and diversity of cell shapes. Adhesive micro-arrays standardize single-cell conditions and facilitate image analysis. LISCA combines single-cell microarrays with scanning time-lapse microscopy and automated image processing. Here, we describe the experimental steps of taking single-cell fluorescence time courses in a LISCA format. We transfect cells adherent to a micropatterned array using mRNA encoding for enhanced green fluorescent protein (eGFP) and monitor the eGFP expression kinetics of hundreds of cells in parallel via scanning time-lapse microscopy. The image data stacks are automatically processed by newly developed software that integrates fluorescence intensity over selected cell contours to generate single-cell fluorescence time courses. We demonstrate that eGFP expression time courses after mRNA transfection are well described by a simple kinetic translation model that reveals expression and degradation rates of mRNA. Further applications of LISCA for event time correlations of multiple markers in the context of signaling apoptosis are discussed.

Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays LISCA - a Versatile Technique to Quantify Cellular Kinetics

We present a method for the acquisition of fluorescence reporter time courses from single cells using micropatterned arrays. The protocol describes the preparation of single-cell arrays, the setup and operation of live-cell scanning time-lapse microscopy and an open-source image analysis tool for automated preselection, visual control and tracking of cell-integrated fluorescence time courses per adhesion site.

세포 역학을 정량화하는 다목적 기술인 단세포 어레이(LISCA)의 라이브 셀 이미징

Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) is a versatile method to collect time courses of fluorescence signals from individual cells in high ...