이 작품은 한국 정부 (MSIP) (NRF-2014K1A4A7A01074642), 한국 국가 연구 재단 (NRF) 개별 과학자 지원 프로그램 (NRF-2013M3A9B5076486/NRF-2015R1D1A1A09057239)에 의해 투자 된 교부 금에 의해 지원 되었다.

1. lentivirus 생산 참고: 생산과 lentiviral 벡터의 조작 재조합 관련 된 연구를 위한 국가 학회 (NIH) 지침에 따라 실시 DNA입니다. 플라스 미드는 야생 형 및 A4V 돌연변이 체 SOD1 (SOD1WT-YFP 및 SOD1A4V YFP) 향상 된 YFP 태그로 인코딩 김 외에 설명 되어 있습니다. 11 두 유전자 융합 제품 PCR 뇌관 쌍 5를 사용 하 여 증폭 했다 &#8242;-ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGTGC-3 &#8242; 5 &#8242;-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3 &#8242; pTRIP 델타 U3 CMV에 삽입 플라스 미드 19 XhoI 및 BsrGI 금지 사이트를 사용 하 여. 이전 실험에서 HEK 293T 세포는 매 2 일 1:6 1: 4의 비율로 분할 했다. 20 개 이상의 통로 적은 60 %confluency 하는 데 도움이 좋은 transfection 효율 보장에서 세포의 유지 보수의 회피.
<ol><li>에 1 일, 바이러스 생산을 위한 세포 배양 매체 (10 %FBS 4 m L-글루타민 m 높은 포도 당 DMEM) 10 mL에 10 cm 직경 조직 문화 접시 (3 x 10 6 셀/접시)에 30-40% 합류에서 HEK 293T 세포 분할.</li>
	<li>유지 10 cm 직경 조직 문화는 CO 2 배양 기 (37 ° C, 5% CO 2)에서 하룻밤 접시.</li>
	<li>주 2에 준비 lentiviral 벡터 10 µ g를 포함 하는 DNA transfection 솔루션 (pTRIP-델타 U3 CMV-SOD1WT-YFP 또는-SOD1A4V-YFP)는 lentiviral 함께 플라스 미드 (5 µ g의 pVSVg, pCMV dR8.71의 10 µ g) (포장 그림 2A) 20. 1 M CaCl 2 125 µ L을 추가 하 고 증류수를 사용 하 여 500 µ L에 양을 맞추십시오. 부드럽게 혼합물에 0.05 M HEPES의 500 µ L을 추가 하 고 실 온에서 10 분 동안 품 어.</li>
	<li>바꾸기 HEK 293T 세포 10 mL가 미리 데워 진 신선한 문화 매체 항생제 무료 매체 1 mL DNA transfection 솔루션 혼합 하 고 37 ° C, 5% CO 2에서 밤새 품 어.</li>
	<li>3 일에서 신선한 문화 매체와 셀 표면에 뜨는 바꿉니다.</li>
	<li>에 4 일, 수확 15 mL 튜브와 죽은 세포와 파편 제거 하 x 500g에 5 분 동안 원심 분리기에 상쾌한. 더 큰 60 mL 주사기를 사용 하 여 0.45 μ m 필터를 통해 그것을 전달 하 여는 상쾌한 정화. 즉시 단일 사용 aliquots (300 µ L)으로 분배 하 고-80 ° c.에 저장 최대 제품 활동을 유지 하기 위해 피하 동결-해 동 주기.</li>
</ol> 2. Lentiviral 변환 <ol><li>분할 셀 라인 60% 합류에 감염 (HEK 293 세포와 SH-SY5Y; 잘 당 5 x 10 5 셀 및 U2OS; 잘 당 1 x 10 5 셀) 보충 DMEM 미디어의 2 mL에는 6 잘 조직 문화 접시 10 %FBS.</li>
	<li>6 잘 조직 배양 플레이트 37 ° C 배양 기에서 5% CO 2에서 하룻밤 유지.</li>
	<li>-80 ° C 냉장고에서 냉동된 lentivirus를 제거 하 고 각 사용 하기 전에 얼음에 약 수를 녹여; refreeze 하지.</li>
	<li>동안 바이러스 녹고 따뜻한 세포 배양 포함 하는 혈 청의 셀 라인와 호환. 일단 바이러스가 완전히 해 동 준비 희석의 범위 (1:3, 1:10, 1:30, 그리고 1: 100) 1.5 mL 신선한 microfuge 관에서 DMEM에.</li>
	<li>감소 된 혈 청 매체 1 ml 튜브에 볼륨을 키울.</li>
	<li>바이러스/미디어의 1 ml (4 µ g / µ L의 재고)에서 Polybrene의 추가 2 µ L. Pipetting으로 잘 혼합 하 고 셀에 혼합물의 1 mL를 추가 합니다. 24 헤에 대 한 바이러스 세포를 품 어</li>
	<li>바이러스 미디어를 제거 하 고 정상적인 DMEM 미디어 10% 보충 바꿉니다 FBS. 37 ° C, 5% CO 2에서 셀 유지.</li>
	<li>셀의 성장 모니터링 하 고 변경 문화 미디어 매 2 일. 에 합류, 10 cm 직경 조직 문화 접시로 6-잘 접시 확장.</li>
	<li>일단 셀 충분히 확장 되었으며, 384-잘 분석 결과 접시는 YFP 식 수준 확인 하기에 DMEM 미디어의 50 µ L에 잘 당 씨 1.5 x 10 4 셀 현미경 검사 법에 의해 단백질을 태그. 신호 대 잡음 비율 표시는 YFP 태그 단백질 셀 식 &#8805; 3, 해당 셀 라인 셀 재고 준비.</li>
</ol> 3. 시간 프로테아좀 억제제의 단백질 집계에 종속 효과 참고: 자동된 현미경을 사용 하 여 이미지 수집을 수행 (자료 참조).
<ol><li>특 면 100 %DMSO (ALLN, 2 mM)에 녹아 있는 384-잘 플랫 바닥 접시에 DMSO 또는 프로테아좀 억제제의 0.25 µ L.</li>
	<li>DMEM의 50 µ L에 잘 당 수동으로 씨 1.5 x 10 4 셀 미디어 같은에 시험 접시. 프로테아좀 억제제 (ALLN) 최종 농도 10 µ M 이어야 합니다.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO 2 현미경 시스템 환경 제어 장치를 설정합니다. 실험적인 체제의 화면 그림 3에 표시 됩니다.</li>
	<li>운영 소프트웨어를 사용 하 여 다음 설정을 가진 넓은 필드 형광 모드로 현미경: 시간 캡처 간격 목표, 비 confocal 모드, 4 필드/글쎄, LWD 20. 각 실행의 끝에, 캡처된 이미지는 서버에 자동으로 업로드 한다.</li>
</ol> 4. 시간 경과 영상 살아있는 세포에 YFP 식에 대 한 및 이미지 분석 (단일 채널) 참고: 다음 단계에서는 응용 프로그램 (예를 들어, 콜럼버스) 소프트웨어의 설명.
기본 개체 (cytosol 및 집계) 세그먼트 <ol><li>선택 적절 한 알고리즘입니다. 필요한 경우 조정 배경 임계값 및 대비 매개 변수 ( 그림 4).</li>
	<li>계산 셀을 사용 하 여 &#39; 셀을 찾을 &#39; 0.1 YFP 강도 채널에 대 한 개별 임계값. 집계를 사용 하 여 결정 한 &#39; 장소를 찾을 &#39; 상대 YFP 자리 강도 알고리즘 &#62; 0.2와 1.0의 분할 계수.</li>
</ol> 5. 복용량 응답의 효과 프로테아좀 억제제 단백질 집계에 살아있는 세포의 핵 (2 채널)에 대 한 스테인드 참고: 자동된 현미경을 사용 하 여 이미지 수집을 수행. 최적의 곡선 적합 되도록 예상된 IC 50 값에 따라 프로테아좀 억제제 (ALLN, Epoxomicin, 및 MG132)의 농도 범위 결정.
384 잘 저장 폴 리 프로필 렌에 화합물의 <ol><li>준비 직렬 희석 1:3 희석 시리즈 표준 접시. 복합 희석 혼합 확인 잘 되도록 화합물 농도 정확.</li>
	<li>빈 플랫-하단 검은 384-잘 시험 접시에 프로테아좀 억제제의 0.25 µ L 분배. 384-모 세관 머리 볼륨을 전송할 수를 갖춘 액체 처리기 사용.</li>
	50에 잘 당 10 4 셀 x <li>씨 1.5 µ L DMEM 미디어의 분석 결과 접시에. 분석 결과 접시 24 h. 위해 37 ° C, 5% CO 2를 품 어</li>
	<li>솔루션 (10 mg/mL의 재고에 Hoechst 33342) 얼룩과 DMEM 미디어 (37 ° C에서 미리 예 열)의 10 µ L을 추가 하 고 10 분에 대 한 실 온에서 품 어</li>
	<li>발사는 마이크로운영 소프트웨어 대처. 실험 설정의 화면 캡처는 그림 6에 표시 됩니다. 선택은 &#34; 구성 &#34; 탭 하 고 객관적이 고 정확한 판형 X 20을 선택 합니다. 확인 &#34; 칼라 &#34; 다른 접시 종류와 적절 한 초점을 수 있도록 하는 목적에 올바른 값으로 설정 됩니다.</li>
	<li>선택은 &#34; 현미경 &#34; 탭 정의 노출 YFP로 1 (488 레이저) 및 노출 2 Hoechst (405 레이저). 모두 노출에 필터를 활성화 하 고 카메라 1 카메라 2 노출 2 노출 1을 할당 합니다. 노출 1 ~ 800 ms 노출 시간 설정 노출 2 ~ 40 ms.</li>
	<li>선택 노출 1입니다. 0 µ m. 선택 초점 높이 설정 &#34; 초점 &#34;. 일단 초점, 노출 카메라 1. 최적화 노출 평면을 클릭 초점 높이 조정 &#34; 높이 걸릴 &#34;. 노출 시간을 변경 하 고 ~ 3, 000의 최대 픽셀 강도 게 전원 레이저. 노출 매개 변수를 저장 합니다. 반복 노출 2.</li>
	<li>선택 &#34; 실험 정의 &#34; 탭 만들기 레이아웃 및 sublayout. 드래그 앤 드롭 관련 레이아웃, 노출, 참조 이미지, skewcrop 파일 및 sublayout. 실험 저장.</li>
	<li>선택 &#34; 자동 실험 &#34; 탭 및 이미지. 각 실행의 끝에, 캡처된 이미지는 서버에 자동으로 업로드 한다.</li>
</ol> 6. 두 이미지의 분석 이미지 <ol><li>세그먼트는 기본 개체 (핵, cytosol, 및 집계) 소프트웨어 알고리즘을 선택 합니다 ( 그림 7).</li>
	<li>세그먼트 개체의 검사에 의해 정확 하 게 핵을 세그먼트 방법을 선택 합니다. Hoechst 스테인드 개체 1 채널에서 (Ch1) 셀의 수를 결정 하기 위해 사용 됩니다. 돌연변이 체 SOD1-채널 2 (Ch2) A4V의 양을 결정 하는 데 사용 됩니다에서 YFP 얼룩.</li>
	<li>계산 셀을 사용 하는 &#39; 핵을 찾을 &#39; 알고리즘 Hoechst 얼룩 영역으로 &#62; 20 µ m 2, 7.0, 0.40, 그리고 대조의 개별 임계값의 분할 계수와 &#62; 0.10.</li>
	<li>데이터 테이블을 만들고 사용 하 여 화합물의 각각에 대 한 EC 50를 결정는 &#39; 비 선형 회귀 &#39; 방정식 그래프 소프트웨어에서.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Schulte, J., Sepp, K. J., Wu, C., Hong, P., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+chemical+and+rnai+screens+for+suppressors+of+neurotoxicity+in+a+huntington's+disease+model.">High-content chemical and rnai screens for suppressors of neurotoxicity in a huntington's disease model.</a> PLoS ONE. 6 (8), e23841 (2011).</li><li>Honarnejad, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+implementation+of+a+high-throughput+compound+screening+assay+for+targeting+disrupted+ER+calcium+homeostasis+in+Alzheimer's+disease.">Development and implementation of a high-throughput compound screening assay for targeting disrupted ER calcium homeostasis in Alzheimer's disease.</a> PLoS ONE. 8 (11), 1-12 (2013).</li><li>Burkhardt, M. 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J., Kesavapany, S., Pant, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathobiology+of+amyotrophic+lateral+sclerosis:+a+proteinopathy?.">The pathobiology of amyotrophic lateral sclerosis: a proteinopathy?.</a> J neuropathol exp neurol. 64 (8), 649-664 (2005).</li><li>Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Charcot+to+Lou+Gehrig:+deciphering+selective+motor+neuron+death+in+ALS.">From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS.</a> Nat rev Neurosci. 2 (11), 806-819 (2001).</li><li>Bruijn, L. I., Miller, T. M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+Mechanisms+Involved+in+Motor+Neuron+Degeneration+in+Als.">Unraveling the Mechanisms Involved in Motor Neuron Degeneration in Als.</a> Annu Rev Neurosci. 27 (1), 723-749 (2004).</li><li>Vassall, K. a., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+stability+and+increased+formation+of+soluble+aggregates+by+immature+superoxide+dismutase+do+not+account+for+disease+severity+in+ALS.">Decreased stability and increased formation of soluble aggregates by immature superoxide dismutase do not account for disease severity in ALS.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (6), 2210-2215 (2011).</li><li>Hwang, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonamyloid+aggregates+arising+from+mature+copper/zinc+superoxide+dismutases+resemble+those+observed+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Nonamyloid aggregates arising from mature copper/zinc superoxide dismutases resemble those observed in amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Biol Chem. 285 (53), 41701-41711 (2010).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerization,+Oligomerization,+and+Aggregation+of+Human+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+Copper/Zinc+Superoxide+Dismutase+1+Protein+Mutant+Forms+in+Live+Cells.">Dimerization, Oligomerization, and Aggregation of Human Amyotrophic Lateral Sclerosis Copper/Zinc Superoxide Dismutase 1 Protein Mutant Forms in Live Cells.</a> J Biol Chem. 289 (21), 15094-15103 (2014).</li><li>Shaw, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent-insoluble+aggregates+associated+with+amyotrophic+lateral+sclerosis+in+transgenic+mice+contain+primarily+full-length,+unmodified+superoxide+dismutase-1.">Detergent-insoluble aggregates associated with amyotrophic lateral sclerosis in transgenic mice contain primarily full-length, unmodified superoxide dismutase-1.</a> J Biol Chem. 283 (13), 8340-8350 (2008).</li><li>Banci, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOD1+and+amyotrophic+lateral+sclerosis:+Mutations+and+oligomerization.">SOD1 and amyotrophic lateral sclerosis: Mutations and oligomerization.</a> PLoS ONE. 3 (2), 1-8 (2008).</li><li>Johnston, J. a., Dalton, M. J., Gurney, M. E., Kopito, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+high+molecular+weight+complexes+of+mutant+Cu,+Zn-superoxide+dismutase+in+a+mouse+model+for+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Formation of high molecular weight complexes of mutant Cu, Zn-superoxide dismutase in a mouse model for familial amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci. 97 (23), 12571-12576 (2000).</li><li>Niwa, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide+bond+mediates+aggregation,+toxicity,+and+ubiquitylation+of+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis-linked+mutant+SOD1.">Disulfide bond mediates aggregation, toxicity, and ubiquitylation of familial amyotrophic lateral sclerosis-linked mutant SOD1.</a> J Biol Chem. 282 (38), 28087-28095 (2007).</li><li>Juneja, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognosis+in+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis:+progression+and+survival+in+patients+with+glu100gly+and+ala4val+mutations+in+Cu,Zn+superoxide+dismutase.">Prognosis in familial amyotrophic lateral sclerosis: progression and survival in patients with glu100gly and ala4val mutations in Cu,Zn superoxide dismutase.</a> Neurology. 48 (1), 55-57 (1997).</li><li>Kaur, S. J., McKeown, S. R., Rashid, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+SOD1+mediated+pathogenesis+of+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Mutant SOD1 mediated pathogenesis of Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Gene. 577 (2), 109-118 (2016).</li><li>de Bruyns, A., Geiling, B., Dankort, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Modular+Lentiviral+Vectors+for+Effective+Gene+Expression+and+Knockdown.">Construction of Modular Lentiviral Vectors for Effective Gene Expression and Knockdown.</a> Methods Mol Biol. 1448, 3-21 (2016).</li><li>Sirven, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Transgene+Expression+in+Cord+Blood+CD34+-Derived+Hematopoietic+Cells,+Including+Developing+T+Cells+and+NOD/SCID+Mouse+Repopulating+Cells,+Following+Transduction+with+Modified+TRIP+Lentiviral+Vectors.">Enhanced Transgene Expression in Cord Blood CD34+-Derived Hematopoietic Cells, Including Developing T Cells and NOD/SCID Mouse Repopulating Cells, Following Transduction with Modified TRIP Lentiviral Vectors.</a> Mol Ther. 3 (4), 438-448 (2001).</li><li>Wu, C., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-titre+retroviral+vector+system+for+efficient+gene+delivery+into+human+and+mouse+cells+of+haematopoietic+and+lymphocytic+lineages.">High-titre retroviral vector system for efficient gene delivery into human and mouse cells of haematopoietic and lymphocytic lineages.</a> J gen virol. 91 (Pt 8), 1909-1918 (2010).</li><li>Irshad, H., Veillard, A., Roux, L., Racoceanu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+nuclei+detection,+segmentation,+and+classification+in+digital+histopathology:+A+review-current+status+and+future+potential.">Methods for nuclei detection, segmentation, and classification in digital histopathology: A review-current status and future potential.</a> IEEE Rev Biomed Eng. 7, 97-114 (2014).</li><li>Purschke, M., Rubio, N., Held, K. D., Redmond, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototoxicity+of+Hoechst+33342+in+time-lapse+fluorescence+microscopy.">Phototoxicity of Hoechst 33342 in time-lapse fluorescence microscopy.</a> Photochem Photobiol Sci. 9 (12), 1634-1639 (2010).</li><li>Jaskova, K., Pavlovicova, M., Jurkovicova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+transporters+and+their+role+in+the+development+of+neuronal+disease+and+neuronal+damage.">Calcium transporters and their role in the development of neuronal disease and neuronal damage.</a> Gen physiol biophys. 31 (4), 375-382 (2012).</li><li>Kieran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+with+arimoclomol,+a+coinducer+of+heat+shock+proteins,+delays+disease+progression+in+ALS+mice.">Treatment with arimoclomol, a coinducer of heat shock proteins, delays disease progression in ALS mice.</a> Nat Med. 10 (4), 402-405 (2004).</li></ol>

저자는 공개 없다.

안정적인 세포를 생성 하기 위한 두 가지 주요 방법 있다. 처음 몇 주를 소요 하며 게놈 통합된 플라스 미드 DNA 벡터의 과도 transfection 및 저항 선택. 두 번째는 제한 노력으로 여러 셀 라인에서이 프로토콜을 대상 단백질의 효과적인 표현 의무가 만들기 lentivirus, 사용 시간의 문제를 걸립니다. 여행-CMV 벡터19 지속적인된 벡터 보존된 변환 효율과 안정적인 transgene 식 사용 했다. 놀?...

단백질 집계는 생물학 과정을 단백질 그룹을 misfolded 및 신경 퇴행 성 질환 (amyloidosis)에 원인이 되는 에이전트 역할을 할 수는 있습니다. 단백질 집계 특성화 촉진은 병의 발병에 영향을 주는 새로운 요인의 발견에서 세포 장애 뿐만 집계의 역할 이해에 필수적 이다. 살아있는 세포에 형광 태그 단백질의 시각화 높은 콘텐츠 심사 (HCS)1,2,,34에 적용 가능한 분석 실험의 개발에 도움이 수 있는 강력한 방법입니다.
루 경화 증 (ALS) 집계 가족 ALS (fALS)에 산발적 ALS (염)5,6 모터 신경에서 축적 하는 성향으로 misfolded 단백질의 존재로 인 한 proteopathic 질병으로 간주 됩니다. . FALS 경우의 ~ 20%의 하위 집합 관련 된 인코딩 cytosolic 항 산화 효소 유전자에 지배적인 돌연변이와 구리-아연 superoxide dismutase 입력 1 (SOD1)7,8. SOD1 변형, 탈 선 안정성, 증가 전개 속도, 집계9, 성향 등의 기능과 구조에 변화를 포함 하 여이 유전자 파생된 전에 대 한 몇 가지 잠재적인 원인 제안 되었습니다. 10. 특히, 두 ALS 연결 된 SOD1 이체에 의해 공유 하는 유일한 확인 하 고 잠재적으로 유독한 속성 이며 야생-타입 (WT) SOD1 compartmentalized 단백질 집계 또는 배치할 포함11,12 형태로 증가 성향 . Misfolded 돌연변이 체 SOD1, 지속적으로 polyubiquitinated 이며, 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에 의해 타락. 그 결과, 프로테아좀의 활동의 억제의 저수준 SOD1 집계13,14, 수용 성 돌연변이 체 SOD1와 교환할 수 있는 수용 성 구성 요소 형태로 비정 질 구조를 구성 하는 돌연변이의 축적에 리드 cytosol15. 특히, SOD1 돌연변이 A4V에서 (알라닌 codon 4에서 valine 변경) 가장 일반적인 ALS를 일으키는 돌연변이 이며 2 년 미만 질병 발병16후의 평균 생존 시간 빠른 neurodegeneration을 리드. 화학적, SOD1 A4V monomerize, 집계, 녹말 체 모;를 형성 하는 증가 경향이 있다 그것의 기 공 같은 집계 다른 질병에 연결 된 돌연변이 형태, α-synuclein와 β 아 밀 로이드 단백질17등의 녹말 체 모와 비슷합니다. SOD1 집계 축적의 역학 연구, 가용성과 불용 성 SOD1 집계 형태를 모니터링 하기 위한 방법 개발 유지.
우리는 이전, 라이브 셀 이미징 사용 하 여 및 HEK 293 세포 형광 단백질 태그 SOD1, ALS 관련 돌연변이 SOD1 이합체 화 및 집계11손상으로 뚜렷이 페. 과도 식 시스템 단기 유전자 overexpression의 생물 학적 결과 대 한 유용한 정보를 제공할 수 있습니다, 방법 원하는 유전자의 안정적인 통합을 제공 하는 분석 결과 개발에 대 한 선호 있을 수 있습니다. 따라서, lentiviral 벡터 포유류 세포 18에 장기 및 규제 유전자 발현을 부여 하는 기능을 제공 합니다. 이 연구에서 우리가 재조합 lentivirus WT 베어링으로 불리고 안정적인 셀 라인의 세대에 집중 하 고 돌연변이 체 SOD1 태그 노란 형광 성 단백질 (YFP)와. 라이브 셀 이미징 현미경 SOD1 집계의 자동화 된 정량화에 사용 하 여, 우리는 실행 하 고 SOD1 집계 이벤트는 프로테아좀의 억제 시 계량.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ALLN (C20H37N3O4)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>208719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MG132 (C26H41N3O5)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxomicin (C28H50N4O7)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H-3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>OP-QEHS-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera EvoShell software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Ver 1.8.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operetta</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>OPRT1288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harmony Imaging software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Ver 3.0.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbus Image analysis software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Ver 2.3.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyBi Hummingwell liquid handling</td>
			<td>CyBio AG</td>
			<td>OL 3387 3 0110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assay development for high content quantification of sod1 mutant protein aggregate formation in living cells

루 경화 증 (ALS) 유전자 인코딩 구리-아연 superoxide dismutase 1 (SOD1)에서 상속 된 돌연변이 의해 발생할 수 있는 치명적인 신경 질환 이다. SOD1의 구조적 불안정 및 가족 ALS 환자에 SOD1 긍정적인 포함 검색 misfolded 또는 집계 SOD1 ALS 병 리에 대 한 잠재적인 원인 역할을 지원합니다. 이 연구에서 우리는 높은 콘텐츠 접근을 차단 하 여 살아있는 세포에 SOD1 집계의 역학을 계량 하도록 세포 기반 분석 결과의 개발을 설명 합니다. 안정적인 셀 라인 표현 야생-타입 및 돌연변이 A4V SOD1 태그로 노란 형광 성 단백질 및 두 단백질 집단의 흔적 없이 cytosol에 표현 되었다 발견 lentiviral 벡터를 사용 하 여 생성 되었습니다. 흥미롭게도,만 SOD1 A4V HEK 293 안정적으로 표현 하지만 하지 U2OS 또는 SH SY5Y 셀 라인에 프로테아좀 억제제 처리 시 집계를 형성 했다. 우리는 다양 한 프로테아좀 억제제의 복용량 응답 분석을 기반으로 집계를 계량 하 고 시간 경과 현미경 검사 법에 의해 집계 형성 속도 론을 추적 가능 하다는 것을 보여줍니다. 우리의 접근 ALS 돌연변이의 역할에 SOD1 집계 형성에 효과 측정 SOD1 A4V 집계를 방지 하는 작은 분자에 대 한 심사의 가능성을 소개 합니다.

Lentivirus를 사용 하 여 생성 안정적인 셀 라인: SOD1 단백질 집계 모니터링에 대 한 전반적인 전략은 그림 1에 나와 있습니다. 첫 번째 단계에서 셀 라인 (1 단계)에 SOD1 안정적인 유전자 배달에 대 한 식 lentiviral 벡터를 생성 했습니다. 인코딩 SOD1 WT YFP 태그 및 SOD1 A4V 두 lentiviral 벡터 (SOD1WT-YFP 및 SOD1A4V-YFP, 각각) 포장 및 봉투 플라스 미드 (<stro...

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Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

계량 misfolded 단백질의 집계 하는 방법을 설명 합니다. 우리의 프로토콜 세부 사항을 lentiviral 안정적인 셀 라인 생성, 자동된 confocal 영상, 및 단백질의 이미지 분석을 유도 한다. 설명 응용 프로그램으로 우리는 SOD1 집계 시간 복용량에 따라 방식에서 홍보에 작은 분자의 효과 공부 했습니다.

살아있는 세포에 Sod1 돌연변이 단백질 집계 형성의 높은 콘텐츠 정량화에 대 한 분석 결과 개발

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

assay-development-for-high-content-quantification-sod1-mutant-protein

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.1K 조회수.  Institut Pasteur Korea. 계량 misfolded 단백질의 집계 하는 방법을 설명 합니다. 우리의 프로토콜 세부 사항을 lentiviral 안정적인 셀 라인 생성, 자동된 confocal 영상, 및 단백질의 이미지 분석을 유도 한다. 설명 응용 프로그램으로 우리는 SOD1 집계 시간 복용량에 따라 방식에서 홍보에 작은 분자의 효과 공부 했습니다.

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Preparation of Living Isolated Vertebrate Photoreceptor Cells for Fluorescence Imaging

In the vertebrate retina, phototransduction, the conversion of light to an electrical signal, is carried out by the rod and cone photoreceptor cells1-4. Rod photoreceptors are responsible for vision in dim light, cones in bright light. Phototransduction takes place in the outer segment of the photoreceptor cell, a specialized compartment that contains a high concentration of visual pigment, the primary light detector. The visual pigment is composed of a chromophore, 11-cis retinal, attached to a protein, opsin. A photon absorbed by the visual pigment isomerizes the chromophore from 11-cis to all-trans. This photoisomerization brings about a conformational change in the visual pigment that 
initiates a cascade of reactions culminating in a change in membrane potential, and bringing about the transduction of the light stimulus to an electrical signal. The 
recovery of the cell from light stimulation involves the deactivation of the intermediates activated by light, and the reestablishment of the membrane potential. Ca2+ modulates the activity of several of the enzymes involved in phototransduction, and its concentration is reduced upon light stimulation. In this way, Ca2+ plays an important role in the recovery of the cell from light stimulation and its adaptation to background light.
Another essential part of the recovery process is the regeneration of the visual pigment that has been destroyed during light-detection by the 
photoisomerization of its 11-cis chromophore to all-trans5-7. This regeneration begins with the release of all-trans retinal by 
the photoactivated pigment, leaving behind the apo-protein opsin. The released all-trans retinal is rapidly reduced in a reaction utilizing NADPH to all-
trans retinol, and opsin combines with fresh 11-cis retinal brought into the outer segment to reform the visual pigment. All-trans retinol is 
then transferred out of the outer segment and into neighboring cells by the specialized carrier Interphotoreceptor Retinoid Binding Protein (IRBP).
Fluorescence imaging of single photoreceptor cells can be used to study their physiology and cell biology. Ca2+-sensitive fluorescent dyes can be used to examine in detail the interplay between outer 
segment Ca2+ changes and response to light8-12 as well as the role of inner segment Ca2+ stores in Ca2+ homeostasis13,14. 
Fluorescent dyes can also be used for measuring Mg2+ concentration15, pH, and as tracers of aqueous and membrane compartments16. 
Finally, the intrinsic fluorescence of all-trans retinol (vitamin A) can be used to monitor the kinetics of its formation and removal in single 
photoreceptor cells17-19.

A method is described for the preparation of single living photoreceptor cells from different vertebrate species for fluorescence imaging. The method can be used to image the fluorescence of endogenous fluorophores, such as NADH or vitamin A, or that of exogenously added fluorescent dyes sensitive to Ca2+ or other factors.

형광 이미징을위한 절연 척추 Photoreceptor 세포를 생활 준비

In the vertebrate retina, phototransduction, the conversion of light to an electrical signal, is carried out by the rod and cone photoreceptor cells1-4.  ...

연구

신경과학

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout the developing vertebrate embryo. In addition to providing peripheral glia and neurons, NCC generate melanocytes as well as most of the cranio-facial skeleton. NCC migration and differentiation is controlled by a combination of their axial origin along the neural tube and their exposure to regionally distinct extracellular cues. Such contribution of extracellular ligands is especially evident during the formation of the enteric nervous system (ENS), a complex interconnected network of neural ganglia that locally controls (among other things) gut muscle movement and intestinal motility. Most of the ENS is derived from a small initial pool of NCC that undertake a long journey in order to colonize - in a rostral to caudal fashion - the entire length of the prospective gut. Among several signaling pathways known to influence enteric NCC colonization, GDNF/RET signaling is recognized as the most important. Indeed, spatiotemporally controlled secretion of the RET ligand GDNF by the gut mesenchyme is chiefly responsible for the attraction and guidance of RET-expressing enteric NCC to and within the embryonic gut. Here, we describe an ex vivo cell migration assay, making use of a transgenic mouse line possessing fluorescently labeled NCC, which allows precise quantification of enteric NCC migration potential in the presence of various growth factors, including GDNF.

We present an ex vivo cell migration assay that allows precise quantification of enteric neural crest cell migration potential in the presence of various growth factors.

쥐과 장내 신경 전구 세포에 대한 양이 세포 이동의 분석

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic neurotransmitter release. Botulinum neurotoxin serotype A (BoNT/A) is a zinc metalloprotease that blocks exocytosis of neurotransmitter by cleaving the SNAP-25 component of the SNARE complex. Currently there are no licensed medicines to treat BoNT/A poisoning after internalization of the toxin by motor neurons. The development of effective therapeutic measures to counter BoNT/A intoxication has been limited, due in part to the lack of robust high-throughput assays for screening small molecule libraries. Here we describe a high content imaging (HCI) assay with utility for identification of BoNT/A inhibitors. Initial optimization efforts focused on improving the reproducibility of inter-plate results across multiple, independent experiments. Automation of immunostaining, image acquisition, and image analysis were found to increase assay consistency and minimize variability while enabling the multiparameter evaluation of experimental compounds in a murine motor neuron system.

Botulinum neurotoxin is one of the most potent toxins among Category-A biothreat agents, yet a post-exposure therapeutic is not available. The high content imaging approach is a powerful methodology for identifying novel inhibitors as it enables multiparameter screening using biologically relevant motor neurons, the primary target of this toxin.

보툴리눔 신경독 억제제의 식별을 위해 높은 콘텐츠 이미징 분석

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic ...

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by stressed conspecifics due to an odorant released during stress known as the Drosophila stress odorant (dSO). Through the use of the T-maze apparatus, one can quantify the avoidance of the dSO by responder flies in a very affordable and robust assay. Conditions necessary to obtain a strong performance are presented here. A stressful experience is necessary for the flies to emit dSO, as well as enough emitter flies to cause a robust avoidance response to the presence of dSO. Genetic background, but not their group size, strongly altered the avoidance of the dSO by the responder flies. Canton-S and Elwood display a higher performance in avoiding the dSO than Oregon and Samarkand strains. This behavioral assay will allow identification of mechanisms underlying this social behavior, and the assessment of the influence of genes and environmental conditions on both emission and avoidance of the dSO. Such an assay can be included in batteries of simple diagnostic tests used to identify social deficiencies of mutants or environmental conditions of interest.

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Here, we present a protocol to quantify the avoidance of stressed individuals. This paradigm is powerful yet user-friendly and can be used to assess the influence of genes and environment on one kind of social interaction in Drosophila melanogaster.

사회 회피의 정량화에 대한 간단한 분석<em&gt; 초파리</em

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

에서 냄새 유도 행동의 고해상도 정량화<em&gt; 초파리</em사용&gt;<em&gt; Flywalk</em&gt; 패러다임

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other neurological diseases at an increasing speed. However, little is known about the molecular mechanisms that underlie these disorders. The genetic, molecular, and behavioral toolbox of Drosophila melanogaster makes this model organism particularly useful to characterize new disease genes and mechanisms in a high-throughput manner. Nevertheless, high-throughput screens require efficient and reliable assays that, ideally, are cost-effective and allow for the automatized quantification of traits relevant to these disorders. The island assay is a cost-effective and easily set-up method to evaluate Drosophila locomotor behavior. In this assay, flies are thrown onto a platform from a fixed height. This induces an innate motor response that enables the flies to escape from the platform within seconds. At present, quantitative analyses of filmed island assays are done manually, which is a laborious undertaking, particularly when performing large screens.
This manuscript describes the &#34;Drosophila Island Assay&#34; and &#34;Island Assay Analysis&#34; algorithms for&#160;high-throughput, automated data processing and quantification of island assay data. In the setup, a simple webcam connected to a laptop collects an image series of the platform while the assay is performed. The &#34;Drosophila Island Assay&#34; algorithm developed for the open-source software Fiji processes these image series and quantifies, for each experimental condition, the number of flies on the platform over time. The &#34;Island Assay Analysis&#34; script, compatible with the free software R, was developed to automatically process the obtained data and to calculate whether treatments/genotypes are statistically different. This greatly improves the efficiency of the island assay and makes it a powerful readout for basic locomotion and flight behavior. It can thus be applied to large screens investigating fly locomotor ability, Drosophila models of movement disorders, and drug efficacy.

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

The island assay is a relatively new, cost-effective assay that can be used to evaluate the basic locomotor behavior of Drosophila melanogaster. This manuscript describes algorithms for automatic data processing and objective quantification of island assay data, making this assay a sensitive, high-throughput readout for large genetic or pharmacological screens.

Drosophila 섬 분석 결과에서 운전 행동의 높은 처리량 분석

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. Transcytosis across the BBB regulates the delivery of hormones, metabolites, and therapeutic antibodies to the brain parenchyma. Here, we present a protocol that combines immunofluorescence of free-floating sections with laser scanning confocal microscopy and image analysis to visualize subcellular organelles within endothelial cells at the BBB. Combining this data-set with 3D image analysis software allows for the semi-automated segmentation and quantification of capillary volume and surface area, as well as the number and intensity of intracellular organelles at the BBB. The detection of mouse endogenous immunoglobulin (IgG) within intracellular vesicles and their quantification at the BBB is used to illustrate the method. This protocol can potentially be applied to the investigation of the mechanisms controlling BBB transcytosis of different molecules in vivo.

Here we present a microscopy-based protocol for high-resolution imaging and a three-dimensional reconstruction of the mouse neurovascular unit and blood-brain barrier using brain free-floating sections. This method allows for the visualization, analysis, and quantification of intracellular organelles at the BBB.

혈액-뇌 장벽의 고해상도 Confocal 영상: 영상, 3 차원 재구성 및 Transcytosis의 정량화

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which enables them to seek out their preferred thermal landscape. To define the temperature preferences of larvae over a defined linear range, we developed an assay using a temperature gradient. To establish a single-directional gradient, two aluminum blocks are connected to independent water baths, each of which controls the temperature of individual blocks. The two blocks set the lower and upper limits of the gradient. The temperature gradient is established by placing an agarose-coated aluminum plate over the two water-controlled blocks so that the plate spans the distance between them. The ends of the aluminum plate that is set on the top of the water blocks defines the minimum and maximum temperatures, and the regions in-between the two blocks form a linear temperature gradient. The gradient assay can be applied to&#160;larvae of different ages and can be used to identify mutants that exhibit phenotypes, such as those with mutations affecting genes encoding TRP channels and opsins, which are required for temperature discrimination.

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

Here, we present a protocol to determine the preferred environmental temperature of Drosophila larvae using a continuous thermal gradient.

초파리 애벌레의 열 환경 설정을 결정 하는 온도 분석 결과

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which ...

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it is thought that dysregulation of protein synthesis in the nervous system may be a core phenotype in some developmental disorders. Accurate measurement of rates of cerebral protein synthesis in animal models is important for understanding these disorders. The method that we have developed was designed to be applied to the study of awake, behaving animals. It is a quantitative autoradiographic method, so it can yield rates in all regions of the brain simultaneously. The method is based on the use of a tracer amino acid, L-[1-14C]-leucine, and a kinetic model of the behavior of L-leucine in the brain. We chose L-[1-14C]-leucine as the tracer because it does not lead to extraneous labeled metabolic products. It is either incorporated into protein or rapidly metabolized to yield 14CO2 which is diluted in a large pool of unlabeled CO2 in the brain. The method and the model also allow for the contribution of unlabeled leucine derived from tissue proteolysis to the tissue precursor pool for protein synthesis. The method has the spatial resolution to determine protein synthesis rates in cell and neuropil layers, as well as hypothalamic and cranial nerve nuclei. To obtain reliable and reproducible quantitative data, it is important to adhere to procedural details. Here we present the detailed procedures of the quantitative autoradiographic L-[1-14C]-leucine method for the determination of regional rates of protein synthesis in vivo.

Protein synthesis is&#160;a critical biological process for cells. In brain, it is required for adaptive changes. Measurement of rates of protein synthesis in the intact brain requires careful methodological considerations. Here we present the L-[1-14C]-leucine quantitative autoradiographic method for determination of regional rates of cerebral protein synthesis in vivo.

생체 내 뇌 단백질 합성의 지역 비율 측정을 위한 정량적 자가 방사선 측정 방법

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...

A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different stimuli. The &#945;-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) receptors, which are responsible for fast excitatory synaptic transmission in neurons, are trafficked to and from the postsynaptic surface to dynamically alter neuronal excitability. AMPA receptor trafficking is essential for synaptic plasticity and can be disrupted in neurological disease. However, prevalent approaches for quantifying receptor trafficking ignore entire receptor pools, are overly time- and labor-intensive, or potentially disrupt normal trafficking mechanisms and therefore complicate the interpretation of resulting data. We present a high-content assay for the quantification of both surface and internal AMPA receptor populations in cultured primary hippocampal neurons using dual fluorescent immunolabeling and a near-infrared fluorescent 96-well microplate scanner. This approach facilitates the rapid screening of bulk internalized and surface receptor densities while minimizing sample material. However, our method has limitations in obtaining single-cell resolution or conducting live cell imaging. Finally, this protocol may be amenable to other receptors and different cell types, provided proper adjustments and optimization.

Neuronal excitability can be modulated through a dynamic process of endo- and exocytosis of excitatory ionotropic glutamate receptors. Described here is an accessible, high-content assay for quantifying surface and internal receptor population pools.

AMPA 모니터링을 위한 하이 콘텐츠 분석 결과 수용 체 매매

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different ...