이 작품 의학 및 영양 연구에 대 한 록펠러 대학, 록펠러 대학에 로버트 슨 치료 개발 기금 그리고 Sackler 센터에서 의사 과학자에 대 한 버나드 L. 슈워츠 프로그램에 의해 지원 되었다는 록펠러 대학입니다.

모든 절차는 록펠러 대학에 의해 승인 되었다 &#39; 기관 동물 관리 및 사용 위원회. 모든 동물은 특정 병원 체 자유로운 조건에서 보관 되어 있었다.
 1. 체 외에서 Chemotaxis <ol><li>문화 THP-1 세포와 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 4-(2-hydroxyethyl)-1 보충 로스웰 파크 기념 연구소 1640 (RPMI 1640)에 6- piperazineethanesulfonic 산 (HEPES; 25 m m) (미디어 완료), 0.5-1.0 x 10 6 셀/mL 사이 밀도 유지.</li>
	<li>에는 35 m m 세포 배양 접시, 30 분에 대 한 calcein acetoxymethyl (calcein-오전; 2.5 µ M) 또는 37 ° C에서 완전 한 미디어에 적합 한 형광 성 염료 다른 조건 당 3.5 x 10 라벨 5 THP-1 셀 
	참고: 염료 세포 막 투과성 및 라이브 셀 라벨와 호환 되어야 합니다.</li>
	<li>사전 따뜻한 플레이트 리더를 37 ° c. 
	참고: 뿐만 아니라 온도 제어, 하단-읽기 기능이입니다 또한 필요. 마이그레이션 단계 1.10.2 정량화에 대 한 플레이트 리더를 대안에 대 한 참조 셀.</li>
	<li>셀 라벨는 하는 동안 준비 시험 접시와 낮은 챔버.
	<ol><li>사용 24-잘 조직 배양 플레이트, 잘 당 한 상태. 3 중에 수행 하는 각 조건.</li>
		<li>행 크의 추가 750 µ L &#39; s Buffered 소금물 (HBSS) 24-잘 접시에 25 mM HEPES 및 0.1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 버퍼. 이 기저 제어 상태 역할을 합니다.
		비교 조건, 750 µ L에서 아래쪽 챔버에 전체 볼륨을 항상 유지에 대 한 <ol><li>다른 사용 우물. 
			참고:이 예제에서는 인간 monocyte chemoattractant 단백질-1 (MCP-1) 역할을 chemotaxis 7에 대 한 긍정적인 제어 합니다.
			<li>어셈블 시 혼합물 25 mm HEPES HBSS, BSA (0.1%), 및 MCP-1을 결합 하 여 <ol>(75 ng/mL). 성인 소 혈 청을 사용 하 여 (2.7 %v / v) 추가 긍정적인 컨트롤로 MCP-1. 
				참고: Chemokine 및 chemokine 농도 연구에서 혈 축에 따라 달라 집니다. 동결 건조 된 MCP-1 최종 농도 50 μ g/mL의 재고 솔루션 BSA (0.1%)와 증류수에 resuspended 이다. 이 작업 솔루션 10 μ g/mL의 물에 희석 수 있습니다. 더 낮은 약 실에이 솔루션의 5.6 μ 추가.</li>
			</ol></li></ol></li> <li>아래쪽 챔버의 구성이 완료 된 후 삽입 탭 플레이트의 노치와 정렬 있도록 각 잘 다공성 삽입 장소. 
		참고: 삽입에 대 한 적절 한 기 공 크기를 선택 하십시오. Monocytes, lymphocytes 3 μ m의 기 공 크기를 잘 수행합니다. 일부 세포 유형 및 chemokine 시스템은 최적의 마이그레이션에 대 한 매트릭스 코팅 표면이 필요할 수 있습니다. 예를 들어 측정 THP 1 monocyte chemotaxis MCP-1으로, fibronectin 또는 콜라겐 코팅 삽입은 것이 좋습니다. 정량에 대 한 플레이트 리더, 삽입 있어야 빛 impermeant 코팅, 폴 리 에틸렌 테 레프 탈 레이트, 등 비 마이그레이션의 탐지를 방지 하기 위해 상단에 셀 챔버 8.</li>
	</ol></li> <li>Calcein 오전와 30 분에 대 한 셀을 잠복기 후 15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송. 2 분에 대 한 1000 x g에서 원심 분리기 세포 육안으로 직접 검사 calcein-오전 ( 그림 1)의 확인을 셀.</li>
	<li>신중 하 게 상쾌한 진공 흡 인기를 사용 하 여 제거 합니다. 혈 청 무료 RPMI 1640 HEPES 25 m m와 보완에 레이블된 셀을 씻어. 1000 x g 2 분 동안에 세포를 원심 및 삭제는 상쾌한.</li>
	<li>Resuspend 셀 세럼 무료 RPMI 1640 HEPES 25 m m로 보완. 셀 및 셀 10 6 셀/mL x 1.0-1.5의 최종 농도에 볼륨 조정.</li>
	<li>삽입 (위 약 실)에 세포 현 탁 액의 분배 250 μ.</li>
	<li>모든 상단 챔버 채워 졌, 부드럽게 접시를 올리고 마이그레이션 및 탐지를 방해할 수 있는 공기 방울의 존재에 대 한 밑면을 검사 후. 거품을 제거 하려면 먼저 다음 다시 삽입 위치를 제거해 보십시오. 실패할 경우 27 G 니 들을 사용 하 여 거품을 찔린 다음 삽입 위치를.</li>
	<li>37 ° C에 미리 데워 진된 플레이트 리더에 접시를 놓습니다.
	<li>취득 형광 읽기 1-3 분 간격 아래에서 <ol>. Calcein 오전에 사용 하 여, 형광 흥분 및 방출 파장에서 설정 485 nm와 520 nm, 각각. 셀 유형 및 chemokine 시스템에 따라 chemotaxis 일반적으로 이상의 1-4 h ( 그림 2A) 발생 합니다.</li>
		<li>연속 측정 하는 대신 485에는 거꾸로 형광 현미경 ( 그림 2B) 흥분 하 고 빛의 감지를 사용 하 우물 이미지 플레이트 리더를 사용 하 여 및 520 nm, 각각. 낮은 확대를 사용 하 여 삽입의 밑면의 대부분을 잡으려고. ImageJ 또는 유사한 소프트웨어 9 이미지를 처리 하 여 셀을 계량.</li>
	</ol></li></ol> 2. Murine Lymphocytes 입양 전송 <ol><li>기증자 세포의 준비 <ol><li>Anesthetize 8-12 주-isoflurane 마 취 (1-3%)는 기화 기를 사용 하 여 오래 된 C57BL/6J 남성 기증자 쥐. 발가락-핀치에 의해 마 취의 적절 한 깊이 확인.</li>
		<li>부정사 위치에 마우스를 놓습니다. 메스와 중간 절 개를 만들고 상단 왼쪽된 복 막 공간에서 비장을 찾습니다. 삭제할 모든 비장 고 완벽 한 미디어 (RPMI 10 %FBS 25mm HEPES 보충, 1 mL/비장) 얼음에 합니다. 잘린에 의해 마 취 기증자 동물을 안락사.</li>
		<li>단일 셀 펜션과 전송 15 mL 원뿔 튜브에 게 주사기 플런저의 끝을 사용 하 여 완전 한 미디어 (1 mL /spleen)로 40 µ m 나일론 메시 부드럽게 통해 비장 조직 갈기.</li>
		<li>추가 4 염화 염화 칼륨 (ACK) 세포의 버퍼 볼륨과 lyse 적혈구를 실 온에서 5 분 동안 품 어.</li>
		<li>1000 x g 실 온에서 2 분 동안에 세포를 원심 고 상쾌한 삭제. 적혈구는 펠 릿에 남아, 경우 ACK 세포의 용 해 버퍼에서 resuspend, 실 온에서 5 분 동안 품 어, 1000 x g 2 분 동안에 세포를 원심 및 상쾌한 삭제.</li>
		<li>Resuspend 2 5 10 7 셀/mL, x의 농도에 완전 한 미디어에 셀 다음 40 µ m 나일론 메쉬 셀 파편 제거를 통해 세포 현 탁 액을 변형.</li>
		<li>레이블 1 형광 염료와 호환 10 7 셀/받는 사람 마우스 x 셀 생활과 그 5-chloromethylfluorescein diacetate (최종 농도 2 μ M) 10 등 이후 고정 시 유지 될 것 이다 . 30 분 동안 37 ° C에서 품 어 
		참고: 하나 이상의 세포 인구를 추적 하려면 추가 셀 인구와 다른 형광 성 염료를 사용 합니다. 5-(and-6)-(((4-chloromethyl) 벤 조일와 기증자 세포의 부분을 표시 하는 예를 들어,) 아미노) tetramethylrhodamine (최종 농도 2 μ M) 11.</li>
		<li>추가 4 볼륨 HBSS 보충 25mm HEPES, 다음 2 분 및 폐기 상쾌한 1000 x g에서 원심 분리기. HBSS HEPES 25 m m 1 x 10 8 셀/mL의 최종 농도에 보충에 펠 릿을 resuspend.
		<ol><li>하나 이상의 형광 염료를 사용 하는 경우 계속 주입 직전까지 분리 하는 세포 인구.</li>
			<li>이후의 흐름 cytometry 보상 통 솔루션 (1 mL)을 각 색의 세포의 작은 약 수 (10 μ) 전송.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>림프 톨의 전송 <ol><li>8-12 주 Anesthetize-isoflurane (1-3%);는 기화 기를 사용 하 여의 오래 된 C57BL/6J 남성 받는 사람 마우스 발가락 핀치에 의해 마 취의 깊이 확인. 동물에 수의 연 고를 적용 &#39; 건조 방지 하기 위해 s 눈.</li>
		<li>짧게 소용돌이 기증자 세포 (1 s) 및 1 mL 주입 주사기 27 g, 바늘, 0.5에 해당 하는 경우 차동 레이블이 세포 인구를 결합.
		<ol><li>이후의 흐름 cytometry 분석 통 솔루션 (1 mL) 혼합된 셀의 작은 약 수 (10 μ) 전송.</li>
		</ol></li> <li>기증자 동물 발생 하기 쉬운 위치에 배치. 눈, 약간 내 다 눈알을 일으키는 등 피부에 가벼운 꼬리 압력 적용.</li>
		<li>Medially 바늘을 직접 하 고 각 받는 사람 마우스에 복고풍 orbitally 기증자 세포 현 탁 액의 100 µ L를 주입. 셀도 꼬리 정 맥을 통해 주입 할 수 있습니다.</li>
		<li>는 점차적으로 주사 바늘을 철회 하 고 복구에 혼자 마우스를 놓습니다. 그것은 의식; 회복 될 때까지 동물을 모니터링 일단 완전히 복구 된 반환 동물 사회 주택.</li>
	</ol></li> <li>수집 및 분석 <ol><li>1 시간 후 anesthetize 한 기화 기를 사용 하 여 받는 사람 마우스 isoflurane 마 취 (1-3%)와 함께, 발가락-핀치에 의해 마 취의 깊이 확인. 비장 (또는 관심의 다른 조직) 수확 (2.1.2 단계.) 각 받는 사람 마우스와 완전 한 미디어 (1 mL/받는 사람)에 장소에서. 잘린에 의해 마 취 동물을 안락사. 
		참고: 조직 수확 전에 더 긴 간격으로 적어도 24 h. 통해 조직 축적 증가</li>
		<li>주사기 플런저의 끝을 사용 하 여 단일 세포 현 탁 액 및 전송 15 mL 원뿔 튜브에 게 완전 한 미디어로 40 µ m 나일론 메시 부드럽게 통해 비장 조직 갈기.</li>
		<li>추가 4 볼륨 ACK 세포의 버퍼링 하 고 실 온에서 5 분을 품 어. 실 온에서 2 분 동안 1000 x g에 세포 현 탁 액을 원심 및 상쾌한 삭제.</li>
		<li>얼룩에서 resuspend 셀 버퍼 (인산 염 버퍼 염 분 보충 1 %FBS). 셀 고 3 x 10 7 셀/mL의 최종 농도를 조정 합니다. 세포 현 탁 액의 100 µ L 하단 플레이트 라운드 96 잘 전송.</li>
		<li>Cytometry에 의해 분석을 위해 원하는 마커 (재료의 표 참조)에 대 한 얼룩 셀. 원하는 표시에 대 한 fluorophore 활용 된 항 체 (재료의 표 참조)를 추가 하 고 어둠 속에서 20 분 동안 4 ° C에서 품 어. 100 µ L를 추가 3 분 1000 x g에서 세포를 원심 버퍼, 얼룩 및 삭제는 상쾌한.</li>
		<li>200 µ L에 펠 릿을 resuspend 3 분 1000 x g에서 세포를 원심 버퍼, 얼룩 및 삭제는 상쾌한.</li>
		<li>Resuspend 125 µ L 얼룩에 펠 릿 버퍼 및 표준 절차를 사용 하 여 교류 cytometer를 사용 하 여 샘플을 수집. 
		참고: 녹색 염료 488 nm 레이저에 의해 흥분 되 고 방출 505 530/30 dichroic 필터 감지. 주황색 염료는 561에 의해 흥분 및 방출 582/15의 dichroic 필터에 의해 검출 된다.
		<ol><li>2.1.8.2 각 형광 성 염료에 대 한 보상에서 사용 저장 셀. 
			참고: fluorophores 여기 및 라벨 염료의 방출 스펙트럼과 구슬 기반 보상을 사용 하 여 차선 보상 발생 합니다.</li>
			<li>사용 하 여 단계 2.2.2.1에서에서 저장 된 입력된 셀의 비율을 정확 하 게 결정 경우 하나 이상의 레이블이 인구 ( 그림 3)를 사용 하 여 차동 입력된 셀을 표시. 레이블이 없는 셀 ( 그림 4)에 표시 된 계산의 비율에 따라 조직 특정 마이그레이션.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+chemokine+receptors:+positioning+cells+for+host+defense+and+immunity.">Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity.</a> Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76 (2), 301-314 (1994).</li><li>Ponda, M. P., Breslow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+stimulation+of+CCR7+chemotaxis+due+to+coagulation+factor+XIIa-dependent+production+of+high-molecular-weight+kininogen+domain+5.">Serum stimulation of CCR7 chemotaxis due to coagulation factor XIIa-dependent production of high-molecular-weight kininogen domain 5.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (45), E7059-E7068 (2016).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J Exp Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boyden+chamber+assay.">Boyden chamber assay.</a> Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).</li><li>Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+(THP-1).">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li><li>Leonard, E. J., Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+monocyte+chemoattractant+protein-1+(MCP-1).">Human monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1).</a> Immunol Today. 11 (3), 97-101 (1990).</li><li>Crouch, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+fluorescence+based+assay+of+neurite+formation.">An automated fluorescence based assay of neurite formation.</a> J Neurosci Methods. 104 (1), 87-91 (2000).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Poot, M., Kavanagh, T. J., Kang, H. C., Haugland, R. P., Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+cell+cycle-dependent+changes+in+cell+thiol+level+by+combining+a+new+laser+dye+with+Hoechst+33342.">Flow cytometric analysis of cell cycle-dependent changes in cell thiol level by combining a new laser dye with Hoechst 33342.</a> Cytometry. 12 (2), 184-187 (1991).</li><li>West, C. A., He, C., Su, M., Swanson, S. J., Mentzer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+fixation+of+thiol-reactive+fluorescent+cytoplasmic+probes+for+tracking+cell+migration.">Aldehyde fixation of thiol-reactive fluorescent cytoplasmic probes for tracking cell migration.</a> J Histochem Cytochem. 49 (4), 511-518 (2001).</li><li>Kim, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+greater+chemotactic+network+for+lymphocyte+trafficking:+chemokines+and+beyond.">The greater chemotactic network for lymphocyte trafficking: chemokines and beyond.</a> Curr Opin Hematol. 12 (4), 298-304 (2005).</li></ol>

저자 공개할 게 없다

면역 세포 이동의 정량화는 간단한를 사용 하 여 수행할 수 있습니다 그리고 신속한 분석 실험 체 외에서 그리고 vivo에서모두. 혈 청에 의해 인간 monocytes MCP-1 그라디언트 및 확대에 대 한 응답에서의 chemotaxis 생체 외에서 설명합니다. Vivo에서, 기증자 murine splenocytes 차동 표시 했다 고 입양 전송 다음 받는 사람 동물에서 발견 했다.
몇 시간 포인트 샘?...

강력한 면역에는 부상, 감염에 적절 하 게 응답 하 고 생성 하는 self-tolerance 세포 유형의 수많은 복잡 한 시간적 및 공간 조정을 필요 합니다. 여러 다스 chemokine 수용 체와 그들의 해당 ligands 발견 되었습니다 하 고 특정 셀에 의해 특징이 제공 분자 기계 장치는 특정 시간에 특정 조직으로 지시 될 수 있다. 따라서, 공부 chemotaxis 및 마이그레이션 면역학 연구의 필수적인 구성 요소 이다. 실제로, 설명 체 외에서 분석 결과 가속 C C 19와 21 발산3으로 T-세포의 chemotaxis 혈 공동 인자를 식별 하기 위해 심사 도구로 사용 최근 했다. 여기에 설명 된 방법의 목적은 면역 세포 chemotaxis에서 생체 외에서 그리고 vivo에서의 정량적 평가 허용 하는.
Boyden (셀 이동과 침략) 챔버 분석 결과 셀 마이그레이션4,5을 평가 하기 위한, 재현, 저렴 하 고 빠른 방법입니다. 표준 분석 결과에서 상단 챔버 셀, 시드 고 낮은 챔버로 셀 이동에서 다공성 삽입으로 구분 됩니다. 원하는 시간에 셀 삽입의 밑면 마이그레이션한 고정 고 가벼운 현미경 검사 법에 의해 정량에 대 한 스테인드 될 수 있습니다. 그러나, 이러한 측정 동적 데이터 수집 하는 걸로 단일 끝점으로 데이터 수집을 제한 하 고 분석을 위한 최적의 시간 점을 결정 광범위 한 최적화를 요구할 수 있습니다. 여기, 여러 적응 chemotaxis에서 생체 외에서의 실시간, 양적 및 다중화 측정을 허용 하는 설명 합니다.
Vivo에서 학문에 대 한 기능 끝점 사용 됩니다, 즉 주어진된 조직에 세포의 특정 축적. 사전 분류 기증자 세포 입양 전송을 통해 받는 사람 동물에 소개 된다. 이러한 기증자 세포 이후에 받는 조직 수확 후 cytometry로 식별할 수 있습니다. 또한 다른 종류의 세포는 단일 받는 사람 동물 내에서 인신 매매의 결정에 대 한 수 있도록 공동 상표 전략이 이다. 이 방법은 셀 주입, 및 생리 간 동물 다양성에 대 한 계정에서 동물 간 편차를 제거합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C1430</td>
			<td>Excitation: 485nm, Emission: 520nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>1007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroblok Fibronectin Insert</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB354597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9998S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant MCP-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adult bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS with calcium and magnesium; no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M2e plate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein animal health</td>
			<td>11695-6776-2</td>
			<td>Isofluorane anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40um nylon</td>
			<td>Falcon Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>118-156-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Orange CMTMR Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C2927</td>
			<td>Excitation: 541nm, Emission: 565nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C2925</td>
			<td>Excitation: 485nm, Emission: 520nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml TB syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100228</td>
			<td>Excitation: 405nm, Emission: 421nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115540</td>
			<td>Excitation: 405nm, Emission: 603nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRII</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying human monocyte chemotaxis in vitro and murine lymphocyte trafficking in vivo

Chemotaxis는 특정 화학 그라데이션1따라 마이그레이션. 발산은 해부학과 시간적 특이성2세포질 매매 홍보 혈 cytokines. Chemotaxis는 세포의 중요 한 기능 그리고 양이 많게 될 수 있는 다른 면역 세포에 생체 외평가. 이 원고 chemotaxis의 평가 허용 하는 방법에 설명 합니다 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo에서, 셀 라인 및 기본 셀을 포함 하 여 다양 한 셀 형식에 대 한. 생체 외에서플레이트 기반 포맷 허용 몇 가지 조건 동시에 비교 실시간, 1-4 헤 체 외에서 분석 결과 조건 주 작동 근 그리고 길 항 근, 소개를 조작할 수 있습니다 내에서 완료 될 수 있습니다 그리고 뿐만 아니라 chemokinesis에서 chemotaxis 차별화는 임의 운동. Vivo에서 인신 매매 평가, 대 한 면역 세포는 여러 형광 염료로 표시 고 입양 전송에 사용 될 수 있습니다. 셀의 차동 라벨 혼합된 셀 인구 함으로써 분산 감소 하 고 적절 하 게 구동된 실험에 필요한 동물의 수를 줄이고 동일한 동물에 소개 될 수 있습니다. 1 시간 만큼 적게 발생 하는 림프 조직으로 마이그레이션 하 고 여러 조직 구획을 샘플링할 수 있다. Cytometry 조직 수확에 따라 여러 종류의 세포 철새 패턴의 급속 한 양적 분석 할 수 있습니다.

Calcein 오전 염료를 사용 하는 경우 셀의 시각적 검사 레이블 통풍 관 (그림 1)를 확인 합니다. 자동화 된 형광 판독 시간이 지남에 삽입의 아래쪽에 셀 교통으로 마이그레이션을 추적 합니다. 이러한 데이터는 명확 하 게 혈 청 (그림 2A)에 의해이 응답의 확대 뿐만 아니라 MCP-1으로 셀 이동의 유도 표시. 철새 자극의 강도 따라, 신?...

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Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

인간 Monocyte Chemotaxis에서 생체 외에서 그리고 Vivo에서 인신 매매 Murine 림프 구 측정

림프 구 chemotaxis 및 마이그레이션에 대 한 양적 평가 대 한 프로토콜은 면역학 연구를 위한 중요 한 도구입니다. 여기, 생체 외에서 프로토콜 허용 실시간, 다중화 세포 이동의 평가 뿐만 아니라 상호 보완적인 vivo에서 기술 활성화 추적 기본 셀의 비장에 설명 되어 있습니다.

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

7.1K 조회수.  The Rockefeller University. 림프 구 chemotaxis 및 마이그레이션에 대 한 양적 평가 대 한 프로토콜은 면역학 연구를 위한 중요 한 도구입니다. 여기, 생체 외에서 프로토콜 허용 실시간, 다중화 세포 이동의 평가 뿐만 아니라 상호 보완적인 vivo에서 기술 활성화 추적 기본 셀의 비장에 설명 되어 있습니다.

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Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

마이 그 레이션의 인간 T 림프구 분리, 문화 및 분석 체외에서</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

연구

면역학 및 감염병학

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

<em&gt; 체외에서</em공부하기&gt; 공동 감염 모델<em&gt; Plasmodium falciparum</em인간의 기본 단핵구 파생 면역 세포에서&gt; - HIV-1 상호 작용

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

정량<em&gt; 체외</em정적 조건에서 활성화 된 기본 인간의 미세 혈관 내피 세포에 호중구 부착을 측정하는&gt; 분석

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

표현형 분석 및 대한 인간의 피부에서 림프구 분리<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 세포 배양

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots ("H" and "F") of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.

The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.

인간의 혈액에서 측정 과립구와 단핵구 식균 작용 및 산화 버스트 활동

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte cell culture and 64Cu-antibody receptor targeting of the cells. In vitro evaluation of the radiolabel and non-invasive in vivo cell tracking in an animal model of an airway delayed-type hypersensitivity reaction (DTHR) by PET/CT are described.
In detail, the conjugation of a mAb with the chelator 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) is shown. Following the production of radioactive 64Cu, radiolabeling of the DOTA-conjugated mAb is described. Next, the expansion of chicken ovalbumin (cOVA)-specific CD4+ interferon (IFN)-&#947;-producing T helper cells (cOVA-TH1) and the subsequent radiolabeling of the cOVA-TH1 cells are depicted. Various in vitro techniques are presented to evaluate the effects of 64Cu-radiolabeling on the cells, such as the determination of cell viability by trypan blue exclusion, the staining for apoptosis with Annexin V for flow cytometry, and the assessment of functionality by IFN-&#947; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Furthermore, the determination of the radioactive uptake into the cells and the labeling stability are described in detail. This protocol further describes how to perform cell tracking studies in an animal model for an airway DTHR and, therefore, the induction of cOVA-induced acute airway DHTR in BALB/c mice is included. Finally, a robust PET/CT workflow including image acquisition, reconstruction, and analysis is presented.
The 64Cu-antibody receptor targeting approach with subsequent receptor internalization provides high specificity and stability, reduced cellular toxicity, and low efflux rates compared to common PET-tracers for cell labeling, e.g.64Cu-pyruvaldehyde bis(N4-methylthiosemicarbazone) (64Cu-PTSM). Finally, our approach enables non-invasive in vivo cell tracking by PET/CT with an optimal signal-to-background ratio for 48 h. This experimental approach can be transferred to different animal models and cell types with membrane-bound receptors that are internalized.

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Following the preparation of a 64Cu-modified monoclonal antibody binding to a transgenic murine T cell receptor, T cells are radiolabeled in vivo, analyzed for viability, functionality, labeling stability and apoptosis, and adoptively transferred into mice with an airway delayed-type hypersensitivity reaction for non-invasive imaging by positron emission tomography/computed tomography (PET/CT).

에 의해 쥐 림프구 라벨링<sup&gt; (64)</sup&gt; CU-항체 수용체는 대한 타겟팅<em&gt; 생체</em&gt; PET / CT에 의한 세포 트래 피킹

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

를 사용하여 림프구 혈관 외로 유출 분석<em&gt; 체외</em&gt; 인간의 혈액 - 뇌 장벽의 모델

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development and autoimmune diseases. This is facilitated through a process of capture from free flow onto the luminal surface of activated endothelial cells, followed by their adhesion and transendothelial migration (transmigration) into the underlying affected tissue. However, the mechanisms that support the preferential and context-dependent recruitment of monocyte subpopulations are still not fully understood. Therefore, we have developed a method that allows the recruitment of different monocyte subpopulations to be simultaneously visualized and measured under flow. This method, based on time-lapse confocal imaging, allows for the unambiguous distinction between adherent and transmigrated monocytes. Here, we describe how this method can be used to simultaneously study the recruitment cascade of pro-angiogenic and non-angiogenic monocytes in vitro. Furthermore, this method can be extended to study the different steps of recruitment of up to three monocyte populations.

Here, we present an integrated protocol that measures monocyte subpopulation trafficking under flow in vitro by use of specific surface markers and confocal fluorescence microscopy. This protocol can be used to explore sequential recruitment steps as well as to profile other leukocyte subtypes using other specific surface markers.

생체 외에서 흐름 아래 Monocyte 모집단의 채용의 동시 연구

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of monocyte-derived macrophages can impair wound healing. We showed that high fat and high sugar diets promote monocyte priming and dysfunction, converting healthy blood monocytes into a hyper chemotactic phenotype poised to differentiate into macrophages with dysregulated activation profiles and impaired phenotypic plasticity. The over-recruitment of monocyte-derived macrophages and recruitment of macrophages with dysregulated activation profiles is believed to be a major contributor to the development of chronic inflammatory diseases associated with metabolic disorders, including atherosclerosis and obesity. The goal of this protocol is to quantify the chemotactic activity of blood monocytes as a biomarker for monocyte priming and dysfunction and to characterize the macrophage phenotype blood monocytes are poised to differentiate into in these mouse models. Using single cell Western blot analysis, we show that after 24 h 33%of cells recruited into MCP-1-loaded basement membrane-derived gel plugs injected into mice are monocytes and macrophages; 58% after day 3. However, on day 5, monocyte and macrophage numbers were significantly decreased. Finally, we show that this assays also allows for the isolation of live macrophages from the surgically retrieved basement membrane-derived gel plugs, which can then be subjected to subsequent characterization by single cell Western blot analysis.

Here we present a protocol to quantify the chemotactic activity of blood monocytes in mouse models, to assess the effects of nutritional, pharmacological and genetic interventions on blood monocyte and to characterize the blood monocytes derived macrophages in mouse models using monocyte-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-loaded basement membrane-derived gel plugs.