우리 박사 R. 하 워드 베 르 그, 도널드 댄 포트 식물 과학 센터, 그의 지도에 통합 현미경 시설의 감독 감사 하 고 도움이 confocal 현미경 검사 법. 저자는 선언에 충돌의 관심 있다.

1. 라벨 Defensins Fluorophores와의
<ol>
	<li>살아있는 세포 내부에 항균 성 속성으로 이해 및 지역화 defensin의 최소 효과가 fluorophore를 선택 합니다. 참고: 최적의 fluorophore 선택 특정 실험 목적에 따라 달라 집니다. 스펙트럼 및 화학 속성, photostability, 크기와는 fluorophore의 충전도 고려해 야 합니다.</li>
	<li>라벨 라벨 키트 상업용 공급 업체에서 제공 하는 적절 한 펩 티 드를 사용 하 여 선택한 fluorophore와 defensin. 또는, 화학적 fluorophore 표시 defensins 음성 합성. 이 연구에서는 DyLight550와 MtDef5 defensin 라벨 상업 라벨을 사용 하 여 제조 업체의 프로토콜 및 tetramethyl rhodamine (TAMRA)에 따르면 키트-화학적으로 상업적으로 합성 되었다 레이블 MtDef4 defensin. 참고: 것이 좋습니다는 fluorophore에 최소 효과 보장 하기 위해 펩 티 드의 N 또는 C 맨끝 잔류물을 연결할 수 있기 때문에 화학적 합성된 fluorophore 태그 펩 티 드 (특히에 대 한 짧은 펩 티 드 아미노산 50 이하로) 사용할 수는 항균 성 활동입니다. 3 개 이상의 이황화 채권 긴 펩 티 드의 종합 도전 이다. 이 경우에 펩 티 드 적합 한 상용 펩 티 드 라벨 키트를 사용 하 여 최적의 fluorophore와 함께 표시 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>레이블이 defensin의 생체 외에서 항균 성 활동을 테스트 하 고 조사를 곰 팡이 대 한 최소 억제 농도 (MIC)을 결정. 참고:이 연구에서 DyLight550 MtDef5 및 TMR MtDef4 마이크 Neurospora crassa Fusarium graminearum에 대 한 결정 되었다.</li>
</ol>
2. 곰 팡이 문화 및 성장 매체
<ol>
	<li>경사 관 보 글의 한 천 매체21 를 포함 하 고 5 일 동안 빛에서 실 온에서 품 어 N. crassa 주식 문화에서 conidia를 전송 합니다.</li>
	<li>5 일에 대 한 완벽 한 중간 (CM)22 28 º C에서를 포함 하는 접시에 F. graminearum PH-1 변형 문화. Conidia의 생산에 대 한 접종 F. graminearum PH 1의 5 일 오래 된 문화 4 (10 m m 직경) 플러그 carboxymethyl 셀 루 로스 (CMC) 매체 (15 g carboxymethyl 셀 루 로스, 효 모 추출 물, 0.5 g MgSO4.7 H2O, 1 g NH 1g의 50 mL에 4 아니3, 고 1 g KH2포4) 180 rpm 회전 통에 28 º C에서 4-7 일에 대 한 문화.</li>
</ol>
3. 준비의 Conidial 서 스 펜 션
<ol>
	<li>F. graminearum conidial 서 스 펜 션
	<ol>
		<li>소용돌이 F. graminearum 액체 문화 및 수집 conidia 2 mL microcentrifuge 관으로 여과 재료 (예: Miracloth)의 2 개의 층을 통해 1.5 mL 곰 팡이 문화를 필터링 하 여. 2 분 동안 microcentrifuge에 g 속도 x 13,226에서 conidial 정지 원심</li>
		<li>상쾌한, 삭제 하 고 펠 릿을 세척 살 균 물의 1 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>원심 2 분 삭제에 대 한 microcentrifuge에 g 속도 x 13,226에서 conidial 정지는 상쾌한 고 2 X SFM (합성 균 미디어)23의 1 mL에 펠 릿을 resuspend.</li>
		<li>Conidia는 가벼운 현미경 hemocytometer를 사용 하 여 계산 합니다.</li>
		<li>2 X SFM 함께 105 conidia/ml conidial 서 스 펜 션을 조정 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>N. crassa conidial 서 스 펜 션
	<ol>
		<li>적은 양의 성장 문화 (5 일 이전) N. crassa 보 글의 액체 매체의 2 개 mL를 포함 하는 microcentrifuge 관을 접종 루프를 사용 하 여 전송 합니다.</li>
		<li>소용돌이 conidial 정지 하 고 새로운 microcentrifuge 관으로 여과 소재를 통해 필터.</li>
		<li>원심 2 분 삭제에 대 한 microcentrifuge에서 최대 속도로 conidial 정지는 상쾌한 고 보 글의 액체 매체의 1 mL에 conidial 펠 릿 resuspend.</li>
		<li>Conidia는 가벼운 현미경 hemocytometer를 사용 하 여 계산 합니다.</li>
		<li>보 글의 액체 매체와 105 conidia/ml conidial 서 스 펜 션을 조정 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 샘플 준비와 Confocal 현미경 검사 법
<ol>
	<li>MtDef4 곰 팡이 세포로 defensin의 subcellular 지 방화
	<ol>
		<li>각 conidial 서 스 펜 션 (105 conidia/mL)의 50 µ L 35 m m 유리 하단 microwell 요리 10 m m microwell에 플라스틱. Conidia의 관찰, 직접 다음 단계로 또는 germlings 준비, N. crassa F. graminearum 의 피 펫 50 µ L 35mm 문화 요리에 conidia 진행이 고 실 온에서 3-6 h에 대 한 발 아 하 게.</li>
		<li>각 microwell 접시를 마이크에 붙일 레이블 defensin의 50 µ L을 추가 하 고 2.5 h에 대 한 품 어. 마이크는 fluorophore 표시 defensins 여기 사용 (1.3 단계)의 N. crassa 및 F. graminearum 3 µ M 이며 N. crassa 및 F. graminearum TMR-MtDef4의 마이크는 1 µ M 및 12 µ M, 각각.</li>
		<li>막 선택의 2 µ L 염색 FM4-64를 추가 (최종 농도: 5 µ M) 문화에 요리 하 고 30 분 동안 품 어 이미징 confocal 현미경에 즉시 탑재.</li>
		<li>화이트 빛 레이저 (WLL)을 선택 합니다. 두 개의 레이저 소스 488 nm을 사용 하 여 550 nm 각각 TMR MtDef4 그리고 FM4-64 염료를 흥분 시키기 위해. 580-700 nm에서 TMR MtDef4의 형광을 검출 하 고 690-800 nm FM4-64 염료 검출. 참고: 어두운 방에 있는 confocal 현미경 검사 법을 수행 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MtDef5 defensin의 국제화의 시간 경과 영상
	<ol>
		<li>N. crassa F. graminearum conidial 정지 (105 conidia/mL)의 50 µ L 35 m m 유리 하단 microwell 요리 10 m m microwell로 플라스틱. 10 m m microwell 코팅 이며 하단에 제 1.5 커버 유리를 있다. Conidia의 관찰에 대 한 직접 다음 단계로 진행 합니다. Germlings의 관찰, 현미경 검사 법으로 진행 하기 전에 실 온에서 3-6 h conidia를 품 어.</li>
		<li>WLL을 켭니다. 550 레이저 라인 선택 fluorophore 표시 defensins 여기 사용 (1.3 단계) 그리고 FM4-64 1.00% 강도의 자극을 활성화 하 고 해당 감지기 nm. fluorophore 표시 defensins 여기 사용 (1.3 단계) 560-600 nm에서 검색 되었습니다 그리고 FM4-64dye 690-800 nm에서 검색 되었습니다. 참고: 높은 레이저 강도 라이브 곰 팡이 세포에 손상을 일으킬 수 있습니다 라이브 셀 이미징에 대 한 낮은 레이저 강도 사용 합니다.</li>
		<li>현미경에 microwell 접시를 탑재 합니다. 100 x로 전환 후 처음 10 x 목표를 사용 하 여 셀 찾기 / 1.44 높은 확대에 대 한 석유 목표. 참고: 스캔 모드를 설정 합니다 xyzt (Z-스택 및 시간 경과 모드의 조합), Z 위치, 줌, 이미지 캡처, 등의 주파수.</li></ol></li></ol>전에 다음 단계로 하는 절차
		<li>각 microwell 접시, 3 µ M의 마이크와 선택적 막 염료 FM4-64 (최종 농도 5 µ M)의 2 µ L에는 fluorophore 표시 defensins 여기 사용 (1.3 단계)의 50 µ L을 추가 하 고 시간 경과 영상 시작. 증발을 방지 하기 위해 microwell 요리에 젖은 필터 종이의 작은 조각을 놓으십시오. 이미지 캡처의 주파수는 3 분 30 s 그리고 총 기간 2 h 30 분 이었다. 참고: 추가 defensin 고 fluorophore 현미경에 장착 microwell 요리 관심 영역 defocus 수 있습니다 후. 따라서, 추가 defensin fluorophore는 microwell를, 후 관심 영역 필요가 refocused 수 이미지 수집 시간이 지연 될 수 있습니다.</li>
		<li>모든 confocal 이미징 confocal 현미경을 사용 하 고 어두운 방에 실 온에서 현미경을 수행.</li>

<ol>
	<li>Jones, J. D. G., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plant+immune+system.">The plant immune system.</a> Nature. 444 (7117), 323-329 (2006).</li><li>Tavormina, P., De Coninck, B., Nikonorova, N., De Smet, I., Cammue, B. P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Plant+Peptidome:+An+expanding+repertoire+of+structural+features+and+biological+functions.">The Plant Peptidome: An expanding repertoire of structural features and biological functions.</a> Plant cell. 27 (8), 2095-2118 (2015).</li><li>Van Der Weerden, N. L., Bleackley, M. R., Anderson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+and+mechanisms+of+action+of+naturally+occurring+antifungal+peptides.">Properties and mechanisms of action of naturally occurring antifungal peptides.</a> Cell. and Mol. Life Sci. 70 (19), 3545-3570 (2013).</li><li>Van der Weerden, N. L., Anderson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+defensins:+Common+fold,+multiple+functions.">Plant defensins: Common fold, multiple functions.</a> Fungal Biol Rev. 26 (4), 121-131 (2013).</li><li>De Coninck, B., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modes+of+antifungal+action+and+in+planta+functions+of+plant+defensins+and+defensin-like+peptides.">Modes of antifungal action and in planta functions of plant defensins and defensin-like peptides.</a> Fungal Biol Rev. 26 (4), 109-120 (2013).</li><li>Kaur, J., Sagaram, U. S., Shah, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+plant+defensins+be+used+to+engineer+durable+commercially+useful+fungal+resistance+in+crop+plants?.">Can plant defensins be used to engineer durable commercially useful fungal resistance in crop plants?.</a> Fungal Biol. Rev. 25 (3), 128-135 (2011).</li><li>Vriens, K., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+plant+defensins:+Mechanisms+of+action+and+production.">Antifungal plant defensins: Mechanisms of action and production.</a> Molecules. 19 (8), 12280-12303 (2014).</li><li>Sagaram, U. S., Kaur, J., Shah, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+plant+defensins:+Structure-activity+relationships,+modes+of+action,+and+biotech+applications.">Antifungal plant defensins: Structure-activity relationships, modes of action, and biotech applications.</a> ACS Symp. Ser. 1095, 317-336 (2012).</li><li>Thevissen, K., Francois, I. E. J. A., Aerts, A. M., Cammue, B. P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+sphingolipids+as+targets+for+the+development+of+selective+antifungal+therapeutics.">Fungal sphingolipids as targets for the development of selective antifungal therapeutics.</a> Curr. Drug Targets. 6 (8), 923-928 (2005).</li><li>Thevissen, K., Kristensen, H. H., Thomma, B. P. H. J., Cammue, B. P. A., Francois, I. E. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+antifungal+plant+and+insect+defensins.">Therapeutic potential of antifungal plant and insect defensins.</a> Drug Discov. Today. 12 (21-22), 966-971 (2007).</li><li>Aerts, A. M., Fran&#231;ois, I. E. J. A., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mode+of+antifungal+action+of+plant,+insect+and+human+defensins.">The mode of antifungal action of plant, insect and human defensins.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65 (13), 2069-2079 (2008).</li><li>Van Der Weerden, N. L., Lay, F. T., Anderson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plant+defensin,+NaD1,+enters+the+cytoplasm+of+Fusarium+oxysporum+hyphae.">The plant defensin, NaD1, enters the cytoplasm of Fusarium oxysporum hyphae.</a> J. Biol. Chem. 283 (21), 14445-14452 (2008).</li><li>Lobo, D. S., Pereira, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+Pisum+sativum+Defensin+1+Interacts+with+Neurospora+crassa+Cyclin+F+Related+to+the+Cell+Cycle.">Antifungal Pisum sativum Defensin 1 Interacts with Neurospora crassa Cyclin F Related to the Cell Cycle.</a> Biochemistry. 46 (4), 987-996 (2007).</li><li>El-Mounadi, K., Islam, K. T., Hernandez-Ortiz, P., Read, N. D., Shah, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+mechanisms+of+a+plant+defensin+MtDef4+are+not+conserved+between+the+ascomycete+fungi+Neurospora+crassa+and+Fusarium+graminearum.">Antifungal mechanisms of a plant defensin MtDef4 are not conserved between the ascomycete fungi Neurospora crassa and Fusarium graminearum.</a> Mol. Microbiol. 100 (3), 542-559 (2016).</li><li>Baxter, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tomato+Defensin+TPP3+Binds+Phosphatidylinositol+(4,5)-Bisphosphate+via+a+Conserved+Dimeric+Cationic+Grip+Conformation+To+Mediate+Cell+Lysis.">The Tomato Defensin TPP3 Binds Phosphatidylinositol (4,5)-Bisphosphate via a Conserved Dimeric Cationic Grip Conformation To Mediate Cell Lysis.</a> Mol. and Cell. Biol. 35 (11), 1964-1978 (2015).</li><li>Kvansakul, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+phosphatidic+acid+by+NsD7+mediates+the+formation+of+helical+defensin-lipid+oligomeric+assemblies+and+membrane+permeabilization.">Binding of phosphatidic acid by NsD7 mediates the formation of helical defensin-lipid oligomeric assemblies and membrane permeabilization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 113, 11202-11207 (2016).</li><li>Poon, I. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositide-mediated+oligomerization+of+a+defensin+induces+cell+lysis.">Phosphoinositide-mediated oligomerization of a defensin induces cell lysis.</a> eLife. 3, e01808 (2014).</li><li>Mu&#241;oz, A., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+and+analysis+shed+light+on+the+complexity+and+dynamics+of+antimicrobial+Peptide+action.">Live-cell imaging and analysis shed light on the complexity and dynamics of antimicrobial Peptide action.</a> Front. Immunol. 3, 248 (2012).</li><li>Hayes, B. M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+mechanism+of+action+of+the+plant+defensin+NaD1+as+a+new+member+of+the+antifungal+drug+arsenal+against+candida+albicans.">Identification and mechanism of action of the plant defensin NaD1 as a new member of the antifungal drug arsenal against candida albicans.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 57 (8), 3667-3675 (2013).</li><li>Mu&#241;oz, A., Marcos, J. F., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration-dependent+mechanisms+of+cell+penetration+and+killing+by+the+de+novo+designed+antifungal+hexapeptide+PAF26.">Concentration-dependent mechanisms of cell penetration and killing by the de novo designed antifungal hexapeptide PAF26.</a> Mol. Microbiol. 85 (1), 89-106 (2012).</li><li>Eaton, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+guanine+nucleotide+exchange+factor+RIC8+regulates+conidial+germination+through+G&#945;+proteins+in+Neurospora+crassa.">The guanine nucleotide exchange factor RIC8 regulates conidial germination through G&#945; proteins in Neurospora crassa.</a> PLoS One. 7 (10), e48026 (2012).</li><li>Leslie, J. F., Summerell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Fusarium. laboratory manual. , (2006).</li><li>Broekaert, W. F., Terras, F. R. G., Cammue, B. P. A., Vanderleyden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+quantitative+assay+for+fungal+growth+inhibition.">An automated quantitative assay for fungal growth inhibition.</a> FEMS Microbiol.Lett. 69 (1-2), 55-59 (1990).</li><li>Sagaram, U. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+studies+of+a+phosphatidic+acid-binding+antifungal+plant+defensin+MtDef4:+Identification+of+an+RGFRRR+motif+governing+fungal+cell+entry.">Structural and functional studies of a phosphatidic acid-binding antifungal plant defensin MtDef4: Identification of an RGFRRR motif governing fungal cell entry.</a> PLoS One. 8 (12), 1-22 (2013).</li><li>Uchida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+X-ray+tomography+of+phenotypic+switching+and+the+cellular+response+to+antifungal+peptoids+in+Candida+albicans.">Soft X-ray tomography of phenotypic switching and the cellular response to antifungal peptoids in Candida albicans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (46), 19375-19380 (2009).</li><li>Nair, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Better+prediction+of+sub-cellular+localization+by+combining+evolutionary+and+structural+information.">Better prediction of sub-cellular localization by combining evolutionary and structural information.</a> Proteins Struct. Funct. Bioinform. 53 (4), 917-930 (2003).</li><li>Scott, M. S., Calafell, S. J., Thomas, D. Y., Hallett, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refining+protein+subcellular+localization.">Refining protein subcellular localization.</a> PLoS Comput. Biol. 1 (6), e66 (2005).</li><li>Shagaghi, N., Bhave, M., Palombo, E., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+sequence+of+interactions+of+PuroA+peptide+with+Candida+albicans+cells+by+live-cell+imaging.">Revealing the sequence of interactions of PuroA peptide with Candida albicans cells by live-cell imaging.</a> Sci. Rep. 7, 43542 (2017).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 연구에 붙일 레이블된 항진균 defensins 사용 하 여 신뢰할 수 있는 라이브 셀 이미징 방법론 곰 팡이 세포에 이러한 펩 티이 드의 국제화의 속도 론을 공부 하 고 그들의 subcellular 목표를 결정 하는 설명 했다. 이 방법은 일시적으로 그리고 공간 defensins와 곰 팡이 세포 사이 상호 작용의 역동성을 시각화 하는 강력한 도구입니다.
다양 한 방법은 국제화 식물 defensins 곰 팡이 세포에서의 세포내 지역화를 공부 하 고 사용 되었습니다. 이러한 방법에서 defensin 취급 세포는 일반적으로 고정 하 고 immunolocalization, 전자 현미경, 또는 x 선 단층 촬영15,,2425에 대 한 처리. 또한, 이러한 기술의 대부분 특정 시간에 보다 실시간으로 같은 살아있는 세포의 시간 경과 영상 모니터를 사용 하는 동적 변화 defensin 도전 하 응답 세포 이미징 제한 되었습니다. 시각화, 분석 및 비교 defensins의 항진균 작업 하는 동안 실시간으로 곰 팡이 세포에서 일어나는 동적 이벤트의 수는이 기술을 효과적이 고 흥미로운. 또한, 그것은 펩 티 드의 동적 세포내 지역화 시간 개별 곰 팡이 세포의 morphogenesis에 미치는 영향의 더 나은 이해를 제공 합니다.
이 방법의 중요 한 측면 중 하나는 중요 한 형광 염료 (예: FM4-64; 함께 붙일 레이블된 펩 티 드를 사용 하 여 subcellular 대상 결정 SG)입니다. Subcellular 지 방화에 있는 펩 티 드 운영, 그리고 그것의 상호 작용 협동자, 기능 및 세포 기계26,27에서 잠재적인 역할 elucidating 향해 중요 한 단계를 나타냅니다 환경을 결정 합니다.
이 기술은 작은 한계 형광 펩타이드 종종 레이블이 펩 티 드에 비해 감소 항진균 활동 전시입니다. 펩 티 드 상용 펩 티 드 라벨 키트를 사용 하 여 표시 됩니다 나타나고 항진균 성 활동의 완전 한 손실, 화학적 합성된 펩 티 드 작은 fluorophore에서 그것의 N-또는 C-말단 이라고 것이 좋습니다.
요약, 라이브 셀에서 이미징 defensin fluorophore 태그와 함께 도전 하는 곰 팡이 세포의 항진균 defensin의 MOA의 직접, 높은 spatio 시간적 해상도 제공할 수 있는 효과적인 도구입니다. 더 정확한 MOA 연구를 위해이 기술은 결합 될 수 있다 형광 일생 현미경 이미징 펩 티 드 또는 다른 레이블이 분자 나 휴대 다른 펩 티 드와의 상호 작용 활동을 측정 하는 것을 허용할 것 이다 (FLIM)28 실시간으로의 성분 이 항균 성 펩 티 드 작동 함으로써 농업과 의학에 사용 하기 위해 항진균 성 대리인으로 그들의 개발을 가속화 하는 방법에 대 한 우리의 이해를 풍부 하 게 됩니다.

식물 미생물 식물 병원 체1에 대 한 방어에 대 한 정교한 타고 난 면역 체계를 진화 했다. 그들은 수많은 유전자 인코딩 호스트 방어 펩 putative 항균 활동2익스프레스. 실제로, 많은 이러한 펩 티이 드의 항균 활동 생체 외에서3표시합니다. Defensins 식물 왕국4호스트 방어 펩 티 드의 가장 큰 그룹 중 구성 됩니다. 이 시스테인-부자, 양이온 펩 티 드 곰 팡이 대 한 강력한 성장 억제 활동 전시 및 micromolar 농도 및 이러한 병원 균5,6에 대 한 방어의 첫 번째 라인 중 하나에서 oomycete 병원 체. 그들의 강력한 항진균 활동 때문에 defensins agribiotechnological 저항 하는 질병 작물을 생성 하기 위해 응용 프로그램에 악용 될 수 있습니다. 여러 식물 defensins의 제정 overexpression 유전자 변형 작물6온실 및 필드 테스트에 질병 저항을 향상 시키기 위해 표시 되었습니다. 그것은 완전히 작물 보호를 위한 효과적인 도구로 서 자신의 잠재력을 활용 하기 위해서는 이러한 항진균 펩 티 드의 행동 (MOA)의 메커니즘을 해명 하는 것이 중요. 그러나, 이러한 식물 defensins MOA 제대로 이해 하 고. 현재 증거 그들이 다른 MOA5,6,,78전시 제안 합니다. 일부 defensins extracellularly 버섯에 행동 하 고 특정 세포 벽/플라즈마 막 주민 sphingolipids 대상, 막 무결성 고 세포 독성 경로9,,1011활성화 됩니다. 그러나 최근에,, 곰 팡이 세포로 이동 하는 항진균 defensins 발견된12,,1314있다. 일부 이러한 defensins 바인딩할 막 상주 생리 인지질, oligomeric 단지를 형성 하 고 플라즈마 막15,,1617permeabilize. 따라서, 식물 defensins의 MOA의 몇 가지 측면 해명 되어 있다. 그러나, 식물 defensins 가능성이의 MOA 아직 식별 및 포괄적인 모델에 통합 이벤트의 복잡 한 세트를 포함 한다. 특히, 이러한 펩 티이 드의 셀룰러 목표의 우리의 이해에 큰 간격이 남아 있습니다.
진보와 함께 최근 현미경 검사 법 기술 및 새로운 형광 프로브 개발, 라이브 세포 이미징 기술은 지금 자주 사용 된다 항균 성 펩 티 드 (암페어)의 모아 공부 하. 이러한 기술을 보완 형태에 항진균 펩타이드의 효과 분석 하는 주로 고용 immunolocalization, 전자 현미경, 원자 힘 현미경 또는 x 선 단층 촬영18등 널리 사용 되는 방법 및 세포 벽 무결성, 원형질 막 permeabilization로 셀 성장/분기 패턴 변경의 연구를 포함 하 여 고 죽이 곰 팡이 세포의 성장. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 연구는 특정 시간 시점에서 셀 defensin 도전 하 응답 그들의 동적 변화를 모니터링 하는 같은 셀에 이미징 시간 경과 수행 하는 대신 펩 티 드와 치료 후 이미징에 국한 되었습니다. 최근 몇 년 동안, 라이브 셀 이미징 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 함께에서 붙일 레이블된 펩 티 드의 사용은 앰프-미생물 상호 작용의 역동성의 실시간 시각화를 활성화 하 고. 둘 다 자연스럽 게 정화 하 고 화학적으로 합성된 항진균 펩 티 드 형광 라벨 태그 될 수 있습니다 (예를 들어, DyLight, rhodamine, BODIPY, 또는 알 렉 사 Fluor 기반 염료) 직접 세포와의 상호 작용 하는 동안 시간 경과 의해 관찰 하 고 라이브 셀 이미지입니다. 이러한 펩 티 드를 표시의 사용은 크게 모드 항목, subcellular 지 방화, 세포내 매매, 및 살아있는 곰 팡이 세포 내 항진균 작업의 사이트를 포함 하 여 그들의 MOA의 다양 한 측면의 우리의 이해를 증가 18.
최근, 여러 연구 공장 defensins 포함 하는 다양 한 항진균 펩 티 드는 살고 곰 팡이 세포12,14,,1920내 면 나타났습니다. 이러한 defensins 가능성이의 MOA 세포내 목표와 상호 작용을 포함 한다. 우리 최근 두 ascomycete 버섯, Neurospora crassa 과 Fusarium graminearum에 MtDef4 defensin 식물의 항진균 액션을 보고 있다. MtDef4 곰 팡이 셀 항목 및이 균14subcellular 지 방화에 대 한 다른 경로 사용 하 여 표시 했다. 화학적으로 사용이 연구 합성 tetramethyl rhodamine (TAMRA)-중요 한 형광 염료 (막 선택적 염료, FM4-64; 막 permeant 염료, SYTOX 그린 셀 죽음 기자 염료, 요오드 화물 propidium)와 함께에서 MtDef4를 표시 하 고 신진 대사 억제제입니다. 이러한 분석의 MtDef4, 세포내 수송의 그것의 기계 장치 및 그것의 subcellular 대상14의 국제화 활동을 보여주었다.
여기, confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 라이브 셀 이미징에 대 한 프로토콜 제공 됩니다. 프로토콜 공장 defensin 곰 팡이 상호 작용, 특히 공부를 중요 한 형광 염료, 전 좌의 경로와 defensins 곰 팡이 세포에서의 세포내 표적 조합에 붙일 레이블된 펩 티 드를 이용 한다.

<table><tbody><tr><td>FM4-64 Dye</td><td>Life Technologies</td><td>T13320</td><td></td></tr><tr><td>DyLight 550 Antibody Labeling Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>84530</td><td></td></tr><tr><td>Glass Bottom Microwell Dishes</td><td>Mat TeK</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Mira cloth</td><td>EMD Millipore Corp</td><td>475855-1R</td><td></td></tr><tr><td>SP8-X confocal microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>FiJi</td><td></td><td>For Image analysis</td></tr><tr><td>Imaris software</td><td>Bitplane</td><td></td><td>For Image analysis</td></tr></tbody></table>

live-cell imaging of fungal cells to investigate modes of entry and subcellular localization of antifungal plant defensins

작은 시스테인-부자 defensins 모든 식물에 호스트 방어 펩 티 드의 가장 큰 그룹 중 하나입니다. 많은 식물 defensins 곰 팡이 병원 균의 넓 스펙트럼에 대 한 강력한 생체 외에서 항진균 성 활동을 전시 하 고 따라서 유전자 변형 작물에 항진균 성 대리인으로 사용 될 가능성이 있다. 질병 제어를 위한 식물 defensins의 잠재력을 활용 하기 위해 그들의 행동 (MOA)의 메커니즘을 명료 하 게 결정적 이다. 고급 현미경 검사 법 기술의 도래와 함께 라이브 셀 이미징 식물 defensins의 항진균 MOA의 역학을 이해 하기 위한 강력한 도구가 되고있다. 여기, confocal 현미경 검사 법 기반 라이브 세포 이미징 방법 중요 한 형광 염료와 함께에서 두 붙일 레이블된 공장 defensins (MtDef4 및 MtDef5)를 사용 하 여 설명 합니다. 이 기술은 실시간 시각화 및 곰 팡이 세포에 MtDef4 및 MtDef5 국제화의 동적 이벤트의 분석을 수 있습니다. 중요 한 것은,이 분석 결과 다양 한 국제화 활동, 항목의 모드와 이러한 펩 티이 드의 subcellular 지 방화를 포함 하 여 정보를 생성 합니다. 다른 셀 생물 학적 도구를 이러한 방법 역학과 이러한 펩 티이 드의 MOA의 복잡성에 대 한 중요 한 통찰력 제공. 이러한 도구는 또한 다른 버섯에 대 한 이러한 펩 티이 드의 MOA 비교 하 사용할 수 있습니다.

라이브 셀 이미징 추적 하 고 국제화 및 두 defensins, MtDef4 및 MtDef5, 개자리속 truncatula;에서 subcellular 지 방화 비교 실시 되었다 버섯 모양 세포. TMR MtDef4 MtDef5 Dylight550으로 표시 했습니다 동안 합성 화학적으로 되었다 (Dylight550-MtDef5). Conidia 막 선택적 염료 FM4-64와 함께에서 어느 defensin 함께 알을 품을 했다. 그림 1 TMR MtDef4가 다른 밀매 경로 N. crassa F. graminearum에 비해 보여줍니다. N. crassa, FM4-64는 defensin와 공동 지역화 하지 않습니다 하지만 오히려 얼룩는 defensin 압수 하는 그들의 세포 막. F. graminearum, 다른 한편으로, TMR-MtDef4 어떤 특정 막 바인딩된 세포 내에서 지역화 되지 하지만 (그림 1) 세포질에서 확산.
N. crassa 셀 fluorophore 표시 defensins 여기 사용 (1.3 단계) 및 FM4-64 쇼는 defensin 치료 (그림 2)의 30 ~ 40 분 이내 곰 팡이 세포를 입력할 수는 표시의 시간 경과 이미지입니다. 셀에는 항목, 시는 fluorophore 표시 defensins 여기 사용 (1.3 단계) 어떤 특정 세포 기관이 내를 지역화 하지 않습니다 하지만 쉽게 세포질으로 확산. 이것은 TMR-MtDef4 N. crassa 세포를 입력 하 고 기공을 몸 안에 갇혀 3hrs 치료 (그림 1)의 후에 남아 있는 대조적 이다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55995/55995fig1.jpg"> 
그림 1: N. crassa 에 MtDef4는 다른 성매매 경로 및 F. graminearum. TMR-MtDef4 N. crassa (A)에 기공을 시체로 localizes 하지만 F. graminearum (B)의 세포질으로 확산. N. crassa 및 F. graminearum conidia 1 µ M와 12 µ M 공동 분류 했다 TMR-MtDef4 (빨강), 각각, 그리고 FM4-64 (녹색). 이미지 처리의 3 h 후 찍은 사진. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55995/55995fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55995/55995fig2.jpg"> 
그림 2: MtDef5 N. crassa 에 의해 내 면화 하 고 셀 내부 확산. DyLight550-MtDef5 N. crassa 세포로 내 면 및 세포질에 확산 한다. DyLight550-MtDef5 (빨강) 및 FM4-64 (녹색) N. crassa 셀 했다 공동 3 µ M으로 표시 됩니다. 비디오 2 h 30 분 기록 했다. MtDef5의 추가 및 이미지 수집 시작 사이 지연 했다 5 분 규모 바 = 4 µ m. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55995/Fig2_ Ncr_germlings.mov" target="_blank">하시기 바랍니다 여기를 클릭 하십시오가이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Live-cell Imaging of Fungal Cells to Investigate Modes of Entry and Subcellular Localization of Antifungal Plant Defensins at JoVE.com

Live-cell Imaging of Fungal Cells to Investigate Modes of Entry and Subcellular Localization of Antifungal Plant Defensins

식물 defensins 병원 균에 대 한 식물 방어에 중요 한 역할을 재생. 대 한 항진균 요원, 액션 (MOA)의 그들의 모드를 이해로 이러한 항진균 펩 티 드의 효과적인 사용이 중요 합니다. 여기, 라이브 세포 이미징 방법 공부 이러한 펩 티이 드의 MOA의 중요 한 측면을 설명 합니다.

조사 항목의 모드와 항진균 공장 Defensins의 Subcellular 지 방화 하는 곰 팡이 세포의 라이브 셀 이미징

Small cysteine-rich defensins are one of the largest groups of host defense peptides present in all plants. Many plant defensins exhibit potent in vitro ...

live-cell-imaging-fungal-cells-to-investigate-modes-entry-subcellular

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

6.6K 조회수.  Donald Danforth Plant Science Center. 식물 defensins 병원 균에 대 한 식물 방어에 중요 한 역할을 재생. 대 한 항진균 요원, 액션 (MOA)의 그들의 모드를 이해로 이러한 항진균 펩 티 드의 효과적인 사용이 중요 합니다. 여기, 라이브 세포 이미징 방법 공부 이러한 펩 티이 드의 MOA의 중요 한 측면을 설명 합니다.

비디오: Live-cell Imaging of Fungal Cells to Investigate Modes of Entry and Subcellular Localization of Antifungal Plant Defensins

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

곰팡이 병원체 Phagocytosis의 라이브 셀 비디오 현미경

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

연구

면역학 및 감염병학

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

라이브 셀 이미징 및 배아 상피 세포의 정량 분석 Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

생물학

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research investigating immunological responses against A. fumigatus has been limited by the lack of consistent and reliable assays for measuring the antifungal activity of specific immune cells in vitro. A new method is described to assess the antifungal activity of primary monocytes and neutrophils from human donors against A. fumigatus using FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia. These conidia contain a genetically encoded dsRed reporter, which is constitutively expressed by live FLARE conidia, and are externally labeled with Alexa Fluor 633, which is resistant to degradation within the phagolysosome, thus allowing a distinction between live and dead A. fumigatus conidia. Video microscopy and flow cytometry are subsequently used to visualize the interaction between conidia and innate immune cells, assessing fungicidal activity whilst also providing a wealth of information on phagocyte migration, phagocytosis and the inhibition of fungal growth. This novel technique has already provided exciting new insights into the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus. It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.
It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Here, we describe a protocol to assess antifungal activity of primary human immune cells in real-time using fluorescent Aspergillus reporter conidia in conjunction with live-cell video microscopy and flow cytometry. Generated data provide insight into host cell-Aspergillus interactions such as fungicidal activity, phagocytosis, cell migration and inhibition of fungal growth.

에 대한 응답으로 인간의 기본 호중구와 단핵구에 의해 항진균 활성의 라이브 영상<em&gt;를했다. 투스</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.

DNA의 손상 응답 단백질의 2와 3 차원 라이브 셀 이미징

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic matter, as well as regulation of nutrient levels. There they also find numerous opportunities to interact with a variety of other microbes such as bacteria or other fungi. Studying fungal interactions at the cellular level, however, can be challenging owing to the black box-like nature of soil. New microfluidic tools are being developed for the study of fungal interactions; two platforms designed to study bacterial-fungal and fungal-fungal interactions are highlighted. Within these microchannels, fungal-microbial interactions can be monitored in controlled physico-chemical environments at higher temporal and spatial resolution than previously possible. Application of these tools have yielded numerous novel biological insights, such as the observation of bacterial polar attachment to hyphae or revealing uncharacterised fungal-fungal antagonisms. A key feature of these methodologies regards the ease of use of this tool by non-experts, yielding highly translatable technologies for use in microbiology labs.

Owing to the opacity of soil, interactions between its constituent microbes cannot easily be visualised with cellular resolution. Here, two microfluidic tools are presented, which offer new opportunities for investigating fungal-microbial interactions. The devices are versatile and simple to use, enabling high spatiotemporal control and high-resolution imaging at the cellular level.

세포 수준에서 곰팡이 - 미생물 상호 작용을 조사하기위한 미세 유체 도구

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic ...

생체공학

Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the plant immune system. During infection cytoplasmic effectors are delivered to the host cytosol via a type III secretion system (T3SS). After delivery into the plant cell, the effector(s) targets the specific compartment(s) to modulate host cell processes for survival and replication of the pathogen. Although there has been some research on the subcellular localization of effector proteins in the host cells to understand their function in pathogenicity by using fluorescent proteins, investigation of the dynamics of effectors directly injected from bacteria has been challenging due to the incompatibility between the T3SS and fluorescent proteins.
Here, we describe our recent method of an optimized split superfolder green fluorescent protein system (sfGFPOPT) to visualize the localization of effectors delivered via the bacterial T3SS in the host cell. The sfGFP11 (11th &#946;-strand of sfGFP)-tagged effector secreted through the T3SS can be assembled with a specific organelle targeted sfGFP1-10OPT (1-10th &#946;-strand of sfGFP) leading to fluorescence emission at the site. This protocol provides a procedure to visualize the reconstituted sfGFP fluorescence signal with an effector protein from Pseudomonas syringae in a particular organelle in the Arabidopsis and Nicotiana benthamiana plants.

Fluorescent protein-based approaches to monitor effectors secreted by bacteria into host cells are challenging. This is due to the incompatibility between fluorescent proteins and the type-III secretion system. Here, an optimized split superfolder GFP system is used for visualization of effectors secreted by bacteria into the host plant cell.

녹색 형광 단백질 박테리아에서 감염 하는 동안 전달 하는 이펙터를 시각화 하기 위해 시스템을 분하시오

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the ...

Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two decades ago and since then continues to contribute greatly to our understanding of the filamentous fungal lifestyle. This paper provides a practical guide for the utilization of the two membrane dyes FM 1-43 and FM 4-64 and the four cell wall stains Calcofluor White M2R, Solophenyl Flavine 7GFE 500, Pontamine Fast Scarlet 48 and Congo Red. The focus is on their low-dose application to ascertain artefact-free staining, their co-imaging properties, and their quantitative evaluation. The presented methods are applicable to all filamentous fungal samples that can be prepared in the described ways. The fundamental staining approaches can serve as starting points for adaptations to species that might require different cultivation conditions. First, biophysical and biochemical properties are reviewed as their understanding is essential for using these dyes as truly vital fluorescent stains. Secondly, step-by-step protocols are presented that detail the preparation of various fungal sample types for fluorescent live-cell imaging. Finally, example experiments illustrate different approaches to: (1) identify defects in the spatio-temporal organization of endocytosis in genetic mutants, (2) comparatively characterize shared and distinct co-localization of GFP-labeled target proteins in the endocytic pathway, (3) identify morphogenetic cell wall defects in a genetic mutant, and (4) monitor cell wall biogenesis in real time.

Vital fluorescent dyes are essential tools for live-cell imaging analyses in modern fungal cell biology. This paper details the application of established and lesser-known fluorescent dyes for tracking plasma membrane dynamics, endo-/exocytosis and cell wall morphogenesis in filamentous fungi.

필라멘트 곰팡이의 살아있는 세포 이미징을 위한 막 및 세포벽 선택적 형광 염료의 적용

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...

옥수수 껍질과 균류 사이의 세포 상호 작용의 시각화

Detached Maize Sheaths for Live-Cell Imaging of Infection by Fungal Foliar Maize Pathogens

We have optimized a protocol to inoculate maize leaf sheaths with hemibiotrophic and necrotrophic foliar pathogenic fungi. The method is modified from one originally applied to rice leaf sheaths and allows direct microscopic observation of fungal growth and development in living plant cells. Leaf sheaths collected from maize seedlings with two fully emerged leaf collars are inoculated with 20 &#181;L drops of 5 x 105 spores/mL fungal spore suspensions and incubated in humidity chambers at 23 &#176;C under continuous fluorescent light. After 24-72 h, excess tissue is removed with a razor blade to leave a single layer of epidermal cells, an optically clear sample that can be imaged directly without the necessity for chemical fixation or clearing. Plant and fungal cells remain alive for the duration of the experiment and interactions can be visualized in real-time. Sheaths can be stained or subjected to plasmolysis to study the developmental cytology and viability of host and pathogen cells during infection and colonization. Fungal strains transformed to express fluorescent proteins can be inoculated or co-inoculated on the sheaths for increased resolution and to facilitate the evaluation of competitive or synergistic interactions. Fungal strains expressing fluorescent fusion proteins can be used to track and quantify the production and targeting of these individual proteins in planta. Inoculated sheath tissues can be extracted to characterize nucleic acids, proteins, or metabolites. The use of these sheath assays has greatly advanced the detailed studies of the mechanisms of fungal pathogenicity in maize and also of fungal protein effectors and secondary metabolites contributing to pathogenicity.

저자 스포트라이트: Investigating Fungal Pathogenicity Mechanisms in Maize 

This manuscript details an optimized inoculation protocol that uses detached maize leaf sheaths for reproducible cytological, physiological, and molecular studies of maize interactions with fungal plant pathogens. The leaf sheaths facilitate real-time observation of cellular interactions between the living plant and fungus in unfixed tissues.

곰팡이 잎 옥수수 병원체에 의한 감염의 살아있는 세포 이미징을 위한 분리된 옥수수 덮개

We have optimized a protocol to inoculate maize leaf sheaths with hemibiotrophic and necrotrophic foliar pathogenic fungi. The method is modified from one ...

조사 항목의 모드와 항진균 공장 Defensins의 Subcellular 지 방화 하는 곰 팡이 세포의 라이브 셀 이미징

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

곰팡이 병원체 Phagocytosis의 라이브 셀 비디오 현미경

라이브 셀 이미징 및 배아 상피 세포의 정량 분석 Xenopus laevis

에 대한 응답으로 인간의 기본 호중구와 단핵구에 의해 항진균 활성의 라이브 영상

라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에

DNA의 손상 응답 단백질의 2와 3 차원 라이브 셀 이미징

세포 수준에서 곰팡이 - 미생물 상호 작용을 조사하기위한 미세 유체 도구

녹색 형광 단백질 박테리아에서 감염 하는 동안 전달 하는 이펙터를 시각화 하기 위해 시스템을 분하시오

필라멘트 곰팡이의 살아있는 세포 이미징을 위한 막 및 세포벽 선택적 형광 염료의 적용

곰팡이 잎 옥수수 병원체에 의한 감염의 살아있는 세포 이미징을 위한 분리된 옥수수 덮개

곰팡이 잎 옥수수 병원체에 의한 감염의 살아있는 세포 이미징을 위한 분리된 옥수수 덮개