트 면 실시, 분석, 실험을 설계 하 고 원고를 썼다. D.X. 및 C.P. 그림 준비에서 원조 하 고 실험을 실시. 이 작품은 NSFC (31320103906)에 의해 지원 되었다 결핵을 111 프로젝트 (B16013)

동물 동물 보호의 설립된 기준 및 뇌 과학 연구소 및 상태 키 실험실의 의학 신경 생물학의 복 단 대학, 상해, 중국의 절차에 따라 유지 되었다.
1. 솔루션 준비
주: 자료의 테이블을 참조 하십시오.
<ol>
	<li>조각화 버퍼 (수정된 Gey 솔루션) 준비: 92 m m NaCl, 2.5 m m KCl, 1.25 m m NaH2포4, 30 mM NaHCO3, 25 mM 포도 당, 20 mM HEPES, 3mm 나+-pyruvate, 10mm MgSO4및 0.5 m m CaCl2.</li>
	<li>Carbogenation 없이 1 M NaOH를 사용 하 여 7.6에 pH를 조정 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에 버퍼 저장 참고: 적정 흐린 액체를 명확히. osmolality 305-310 mOsm입니다. Carbogen21 5% 이산화탄소와 95% 산소를 포함합니다.</li>
	<li>실제의 최종 조성 주는 중 탄산염과 포도 당을 포함 하지 않는 실제의 재고 솔루션 x 10를 diluting 하 여 준비: 124 mM NaCl, 2.5 m m KCl, 2.5 m m CaCl2, 2 mM MgCl2및 1.25 m m KH2포4.</li>
	<li>중 탄산염 및 10 mM 포도 당 및 26 m m NaHCO3에 도달 하는 포도 추가 합니다.</li>
	<li>Carbogenate NaHCO3를 추가한 후 즉시 차단 엔드와 천공된 실리콘 튜브를 통해 실제.</li>
	<li>Carbogenating (pH 7.3-7.4) 동안 pH를 측정 합니다. 참고: 버퍼 용량 NaHCO3의 금액을 변경 하 여 약간 조정할 수 있습니다. 결과 pH 온도 의존 하는 때문에, 그것은 작동 온도 (예, 30 ° C)에서 carbogenating 동안 결과 pH를 확인 하는 데 필요한.</li>
</ol>
2입니다. 급성 Hippocampal 조각의 준비
주: 자료의 테이블을 참조 하십시오.
<ol>
	<li>급성 뇌 조각에 대 한 보육 챔버를 슬라이스 잡고 메쉬 장소, 실제, 및 carbogenate (4-6 L/h) 적어도 30 분22 28-30 ° c.에 대 한 챔버를 채우기</li>
	<li>2-4 ° c.까지 수술 도구 쿨</li>
	<li>감기와 carbogenated 버퍼 (2-4 ° C), 유지 하는 vibratome 근처 얼음/물 혼합물을 깔 끔 히 가득 유리 비 커를 놓습니다.</li>
	<li>각 막 반사 (30-50 s) 사라질 때까지 쥐 또는 쥐를 anesthetize 2 L 유리 용기 또는 50 mL 튜브에 12.5 µ L에 500 µ L를 취하여 isoflurane를 사용 하 여.</li>
	<li>설명 및 매 티 스 외 의 간행물에 자세히 시각화 방법을 사용 하 여 뇌를 분리 (2011 년) 23 , Yuanxiang 외. (2014) 24.</li>
	<li>2-4 ° c 뇌 소 뇌를 해 부하 고 반구를 분리 하기 전에 (적어도 2 분)에 대 한 차가운 조각화 버퍼에 멋진.</li>
	<li>차가운 수술 블레이드를 사용 하 여 그림 1C 는 복 부와 해 마의 중간 부분에서 가로 분할 영역을 각 반구25 의 등 쪽 가장자리를 따라 70 ° 각도로 지 피 조각 해 부 그리고 E.</li>
	<li>감기 치과 시멘트 주걱으로 짧게 만든된 표면 (1-2 s) 건조 필터 종이의 조각에 반구를 전송.</li>
	<li>갓 잘라 표면 두 반구 빠른 연기 접착제 접착제;를 사용 하 여 차가운 조각화 플랫폼에 탑재 반구 면 면도날 (그림 1D)의 꼬리 끝을 있다.</li>
	<li>vibratome의 냉각 챔버도 조각화 플랫폼을 놓고 조각화 버퍼 (2-4 ° C)와 그 챔버를 입력 합니다. Carbogenate 구멍된 실리콘 튜브를 사용 하 여입니다.</li>
	<li>적절 한 vibratome 설정을 사용 하 여 350 µ m 조각 잘라 (예를 들어, 블레이드 앞으로 속도: 1.2 m m/s, 블레이드 진폭: 1mm).</li>
	<li>분리는 subiculum를 사용 하 여 두 개의 주입 뉼 entorhinal 외피가 hippocampal 형성 (&#62; 28 G)가 위로.</li>
	<li>파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 이전 준비 보육 상공의 슬라이스 잡고 메쉬에서 거품을 제거 합니다.</li>
	<li>인큐베이션 챔버의 메쉬에 조각화 플랫폼에서 지층 pyramidale에서 몇 가지 투명도 있는 분할 영역을 전송 합니다. 모든 폴딩, 스트레칭, 중복, 및 큰 입 파스퇴르 피 펫으로 실제와 슬라이스를 발음에 의해 부동 하지 마십시오. 참고: 모든 절차 (단계 2.5-2.14) 5-10 분; 걸릴 수 있습니다. 따라서, 그것은 4 ° c.에 그것을 유지 하는 시간이 지남에 따라 버퍼 솔루션의 온도 확인 하는 것이 중요</li>
	<li>보육 실에서 적어도 1.5-2 h 30 ° C에서 슬라이스를 품 어 고 carbogen 4-6 L/h에서 제공 합니다. 참고: 버퍼는 인큐베이터에 순환 하지만 부동에서 슬라이스를 방지 carbogen의 유량을 조정 합니다.</li>
</ol>
3. 수정은 실제에 대 한 Carbogenation의 작은 저수지의 재활용
<ol>
	<li>재활용 시스템 (그림 2B)의 유출에 3 방향 튜브 커넥터를 추가 합니다.</li>
	<li>Carbogen 공급 튜브 3 방향 튜브 커넥터의 가운데 팔을 연결 하 고 공기 흐름 미터 (3-4 L/h,D 그림 2및 그림 4C) 유량을 조절.</li>
	<li>재활용 시스템의 유입에 두 번째 3-방향 튜브 커넥터를 추가 합니다. 중간 팔 (로우-패스 필터; 저수지에서 유입 튜브를 인라인 히터, 얇은 실리콘 튜브 (10 ㎝ 길이), 상 완 및 더 낮은 팔을 직면 하는 튜브를 연결 그림 4 C)입니다.</li>
	<li>얇은 실리콘 튜브 튜브 압착 기 장소 (OD: 2mm) 튜브 연동 펌프에 의해 생성 된 조각 챔버에 실제의 맥의 최소한은 한 위치에서. 참고: 유출-carbogenation (유출-수화물.) 수정 실제 저수지, 재활용 율, 실제의 볼륨을 carbogenation 레벨의 감도 감소 시키고 상대 튜브 작은 실제 저수지 내 위치 (&#60; 50 mL; 그림 3)입니다. 로우-패스 필터에 관한 얇은 실리콘 튜브에 공기의 일정 금액의 실제 흐름; 맥 동 감소 따라서, 튜브 공기도 주로 가득 한다.</li>
</ol>
4입니다.침수 슬라이스 챔버에 시 냅 스의 응답을 기록
주: 자료의 테이블을 참조 하십시오.
<ol>
	<li>미리 따뜻한 물 목욕 약 28-30 ° c (이것은 녹음 실에서 거품 형성 방지)에서 실제 솔루션.</li>
	<li>재활용 시스템 (4-5 mL/min)를 시작 하 고 적어도 1 시간을 위한 시스템을 equilibrate 하 인라인 히터를 활성화.</li>
	<li>렌즈 종이 나일론 메쉬 (그림 4) 몇 분 동안 침수 슬라이스 챔버에 U 자 모양의 백 금 철사에 고정을 청소의 작은 조각을 presoak합니다</li>
	<li>U 자 모양의 백 금 철사를 제거 합니다.</li>
	<li>재활용 전환 하 고 종이 청소 하는 렌즈에 슬라이스를 놓습니다.</li>
	<li>즉시 조각 위에 슬라이스 잡고 메쉬, 스위치는 펌프를 놓고 슬라이스는 실제 목적은 찍기에 없이 30 분 동안 equilibrate 하자.</li>
	<li>실제와 붕 micropipette (즉, 녹음 전극)를 작성 (저항 팁: 1-2 m ω, 1/3 실제 가득) 피 펫 홀더에 탑재.</li>
	<li>NaHCO3 솔루션으로 그것을 배치 하 여 금속 자극 전극의 절연 제를 확인 (&#62; 40 mM). DC 전압 발생기의 부정 극 전극 연결 (1-2 V, 긍정 극: 은색 또는 백 금 선), 해 부 현미경 아래 끝에 거품의 형성을 관찰 하 고 (&#62; 60 배 확대).</li>
	<li>조작 홀더에서 테스트 에폭시 절연 텅스텐 자극 전극을 놓고 슬라이스 챔버에 전선 참조.</li>
	<li>두 번째 참조 전극 챔버를 추가 하 고 기록 전극(그림 4)의 headstage의 참조 소켓에 연결.</li>
	<li>앰프 제어 소프트웨어에서 "제로 클램프 모드" 상자에서 클릭 하 고 "출력 이득 목록" 상자를 두 번 클릭 하 여 진행 합니다. 이득 선택 "100 년"의 "높은 통과 필터 목록 상자 (베셀)"를 두 번 클릭 "0.1 Hz,"를 선택 하 고 "3로"를 선택 하는 "낮은 패스 필터 목록 상자 (AC)"를 두 번 클릭</li>
	<li>클릭 기록 소프트웨어에는에 "취득 | 프로토콜을 엽니다. " 설정이 자동으로 에피소드 stimulations 고 50-100 ms에 대 한 10-20 kHz에서 증폭 된 잠재력의 디지털화에 대 한 허용 하는 프로토콜의 에피소드 녹화 시작 후 10 ms 자극 아이 솔 레이 터를 트리거를 선택 합니다.</li>
	<li>자극 및 기록 전극 선과 평행한 지층 pyramidale의 예 (그림 4B 및 그림 5)에 배치 합니다.</li>
	<li>클릭 "취득 | "프로토콜 편집 하 고 (팝업 창)에서"트리거"탭을 선택 합니다. 트리거 소스 "트리거 소스" 상자 및 선택 "스페이스 바" 클릭 합니다. "확인" 버튼을 클릭 합니다. 인수를 시작 하 고 트리거 버튼으로 팝업 창에 "기록" 버튼을 클릭 합니다.</li>
	<li>자극 아이 솔 레이 터 소프트웨어에서 "전압 제어" 상자를 클릭 하 고 "0" 입력 "다운로드" 버튼을 클릭 합니다. "소프트웨어"를 녹음 창에 클릭 하 고 스페이스바를 누릅니다. 입력 하 여 순차적으로 값 1에서 8, 예를 들어 "전압 제어" 상자에서 1 mV 단계에이 주기를 반복 합니다.</li>
	<li>FEPSP 경사 값 자극 강도 연관 하 고 최대 fEPSP 슬로프의 40%를 얻을 하는 데 필요한 자극 강도 결정 합니다. "전압 제어 상자"를 클릭 하 고 결정된 된 값을 입력 합니다. "다운로드" 버튼을 클릭 합니다. 참고: 자극 아이 솔 레이 터는 뇌 조직에 간단한 전압 또는 전류 펄스를 적용 하는 데 사용 됩니다. 복 형 펄스 위상 당 100 µs를 가질 수 있습니다.</li>
	<li>레코딩 소프트웨어에서 정지 버튼을 누른 다음 "취득" 메뉴를 클릭 합니다. "편집 프로토콜"에 클릭 하 고 팝업 창에서 "트리거" 탭을 선택 하십시오. 트리거 소스 트리거 소스 상자 및 선택 "내부 타이머" 클릭 합니다. "확인" 버튼을 클릭 합니다. 모든 30 필드 전위의 자동 녹음 시작 기록 단추를 클릭 예를 들면 s. 30-60 분 후 "정지" 버튼을 클릭 합니다.</li>
	<li>"취득" 메뉴에서 클릭, "개방형 프로토콜," 클릭 시 냅 스가 소성의 원하는 유도 프로토콜을 선택 하 고 "확인" 버튼을 클릭 합니다. 자동으로 활성화-고주파 자극 및 기록에 "기록" 버튼을 클릭 합니다. "정지" 버튼을 클릭 합니다. 참고: 경우 시 냅 스가 소성에 관한 연구, 적용 장기 potentiation 또는 장기간된 초기 녹음 후 장기 불황에 대 한 표준 유도 패러다임 중 하나. 시 냅 시스 전송의 결과 변조의 대표적인 예는 그림 7 과 그림 8에 묘사 된다.</li>
	<li>레코딩 소프트웨어에서 클릭 "취득 | 프로토콜 "열고 단계 4.12는 동일한 프로토콜을 선택 합니다. "확인" 버튼을 클릭 한 다음 "기록 합니다."를 클릭 자동으로 예를 들면 2-4 h에 대 한 필드 잠재적인 녹음을 실행 하십시오. 녹음을 종료 하려면 "stop" 버튼을 클릭 합니다.</li>
	<li>제약 연구 시 적용 화합물 직접는 실제 저수지 영구 복합 관리 경우 원하는 (그림 6).</li>
</ol>
5. 청소 설치 및 힌트
참고: 일반 팁에 대 한 아래 참조.
<ol>
	<li>더 이상 20 분, 이온 H2o. 세척 하 여 다음에 대 한 10% H2O2 를 재활용 하 여 매주 시스템 청소 참고: 에탄올 청소에 대 한 권장 하지 않습니다. 그것은 마찬가지로 바람직하지 몰입할 참조 전선 및 H2O2에 목표.</li>
	<li>렌즈 또는 0.1 N HCl와 다음 물 약 실 주변의 표면에 침전 된 소금을 제거 합니다.</li>
	<li>Carbogen bubbler 증류수 또는 0.1 N HCl을 씻어.</li>
	<li>담가 5 분 동안 10% H2O2 에 슬라이스 인큐베이션 챔버 일주일에 한 번 그리고 후 철저 하 게 린스 이온 H2o. 보육 실</li>
	<li>금속 자극 전극의 경우 각 실험 후 이온된 수로 자극 전극 팁을 린스 하 고 잔여 조직을 제거 하는 에탄올과 젖은 면봉으로 자극 전극 팁을 부드럽게 닦아 내십시오.</li>
	<li>샌드 페이퍼로 조심 슬쩍 통해 끝 단을 제거 하 여 상용 금속 자극 전극의 저항을 줄일 수 있습니다.</li>
	<li>소계 튜브 실리콘 튜브를 대체 하 여 튜브를 통해 재활용 하는 동안은 실제에서 carbogen 손실을 줄일.</li>
	<li>양식에 AgCl 와이어 표면에 표 백제 몇 일 동안 기록 전극 및 참조 전극은 전선 유지.</li>
</ol>

<ol>
	<li>McIlwain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+response+in+vitro+to+electrical+stimulation+of+sections+of+mammalian+brain.">Metabolic response in vitro to electrical stimulation of sections of mammalian brain.</a> Biochem J. 48 (4), (1951).</li><li>McIlwain, H., Richards, C. D., Somerville, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+in+vitro+from+the+piriform+cortex+of+the+rat,+and+their+susceptibility+to+centrally-acting+drugs.">Responses in vitro from the piriform cortex of the rat, and their susceptibility to centrally-acting drugs.</a> J Neurochem. 14 (9), 937-938 (1967).</li><li>Yamamoto, C., McIlwain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+activities+in+thin+sections+from+the+mammalian+brain+maintained+in+chemically-defined+media+in+vitro.">Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro.</a> J Neurochem. 13 (12), 1333-1343 (1966).</li><li>Andersen, P., Bliss, T. V., Lomo, T., Olsen, L. I., Skrede, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamellar+organization+of+hippocampal+excitatory+pathways.">Lamellar organization of hippocampal excitatory pathways.</a> Acta Physiol Scand. 76 (1), 4-5 (1969).</li><li>Skrede, K. K., Westgaard, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transverse+hippocampal+slice:+a+well-defined+cortical+structure+maintained+in+vitro.">The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro.</a> Brain Res. 35 (2), 589-593 (1971).</li><li>Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slices+have+more+synapses+than+perfusion-fixed+hippocampus+from+both+young+and+mature+rats.">Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats.</a> J Neurosci. 19 (8), 2876-2886 (1999).</li><li>Schwartzkroin, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+CA1+neurons+recorded+intracellularly+in+the+hippocampal+in+vitro+slice+preparation.">Characteristics of CA1 neurons recorded intracellularly in the hippocampal in vitro slice preparation.</a> Brain Res. 85 (3), 423-436 (1975).</li><li>Schwartzkroin, P. A., Wester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+facilitation+of+a+synaptic+potential+following+tetanization+in+the+in+vitro+hippocampal+slice.">Long-lasting facilitation of a synaptic potential following tetanization in the in vitro hippocampal slice.</a> Brain Res. 89 (1), 107-119 (1975).</li><li>Reymann, K. G., Frey, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+late+maintenance+of+hippocampal+LTP:+requirements,+phases,+'synaptic+tagging',+'late-associativity'+and+implications.">The late maintenance of hippocampal LTP: requirements, phases, 'synaptic tagging', 'late-associativity' and implications.</a> Neuropharm. 52 (1), 24-40 (2007).</li><li>Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+in+health+and+disease:+introduction+and+overview.">Synaptic plasticity in health and disease: introduction and overview.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1633), 20130129 (2014).</li><li>Bliss, T. V., Gardner-Medwin, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+potentiation+of+synaptic+transmission+in+the+dentate+area+of+the+unanaestetized+rabbit+following+stimulation+of+the+perforant+path.">Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the unanaestetized rabbit following stimulation of the perforant path.</a> J Physiol. 232 (2), 357-374 (1973).</li><li>Reid, K. H., Edmonds, H. L., Schurr, A., Tseng, M. T., West, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pitfalls+in+the+Use+of+Brain-Slices.">Pitfalls in the Use of Brain-Slices.</a> Prog Neurobiol. 31 (1), 1-18 (1988).</li><li>Rambani, K., Vukasinovic, J., Glezer, A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+thick+brain+slices:+an+interstitial+3D+microperfusion+system+for+enhanced+viability.">Culturing thick brain slices: an interstitial 3D microperfusion system for enhanced viability.</a> J Neurosci Methods. 180 (2), 243-254 (2009).</li><li>Hajos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+network+activity+in+submerged+hippocampal+slices:+importance+of+oxygen+supply.">Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply.</a> Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).</li><li>Redondo, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+tagging+and+capture:+differential+role+of+distinct+calcium/calmodulin+kinases+in+protein+synthesis-dependent+long-term+potentiation.">Synaptic tagging and capture: differential role of distinct calcium/calmodulin kinases in protein synthesis-dependent long-term potentiation.</a> J Neurosci. 30 (14), 4981-4989 (2010).</li><li>Stopps, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+application+of+a+novel+brain+slice+system+that+permits+independent+electrophysiological+recordings+from+multiple+slices.">Design and application of a novel brain slice system that permits independent electrophysiological recordings from multiple slices.</a> J Neurosci Methods. 132 (2), 137-148 (2004).</li><li>Behnisch, T., Matsushita, S., Knopfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+gene+expression+during+long-term+potentiation.">Imaging of gene expression during long-term potentiation.</a> Neuroreport. 15 (13), 2039-2043 (2004).</li><li>Karpova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encoding+and+transducing+the+synaptic+or+extrasynaptic+origin+of+NMDA+receptor+signals+to+the+nucleus.">Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus.</a> Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).</li><li>Karpova, A., Mikhaylova, M., Thomas, U., Knopfel, T., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+protein+synthesis+and+degradation+in+long-term+potentiation+of+Schaffer+collateral+CA1+synapses.">Involvement of protein synthesis and degradation in long-term potentiation of Schaffer collateral CA1 synapses.</a> J Neurosci. 26 (18), 4949-4955 (2006).</li><li>Weng, W., Chen, Y., Wang, M., Zhuang, Y., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiation+of+Schaffer-Collateral+CA1+Synaptic+Transmission+by+eEF2K+and+p38+MAPK+Mediated+Mechanisms.">Potentiation of Schaffer-Collateral CA1 Synaptic Transmission by eEF2K and p38 MAPK Mediated Mechanisms.</a> Front Cell Neurosci. 10 (247), (2016).</li><li>Meduna, L. J., Jackman, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+dioxide+inhalation+therapy.">Carbon dioxide inhalation therapy.</a> Res Publ Assoc Res Nerv Ment Dis. 31, 280-286 (1953).</li><li>Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thin+slice+preparation+for+patch+clamp+recordings+from+neurones+of+the+mammalian+central+nervous+system.">A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system.</a> Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).</li><li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid+pathology.">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li><li>Yuanxiang, P., Bera, S., Karpova, A., Kreutz, M. R., Mikhaylova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CA1+nuclear+enriched+fractions+from+hippocampal+slices+to+study+activity-dependent+nuclear+import+of+synapto-nuclear+messenger+proteins.">Isolation of CA1 nuclear enriched fractions from hippocampal slices to study activity-dependent nuclear import of synapto-nuclear messenger proteins.</a> J Vis Exp. (90), e51310 (2014).</li><li>Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTP+in+cultured+hippocampal-entorhinal+cortex+slices+from+young+adult+(P25-30)+rats.">LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats.</a> J Neurosci Meth. 130 (1), 19-32 (2003).</li><li>Kloosterman, F., Peloquin, P., Leung, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+and+basal+orthodromic+population+spikes+in+hippocampal+CA1+in+vivo+show+different+origins+and+patterns+of+propagation.">Apical and basal orthodromic population spikes in hippocampal CA1 in vivo show different origins and patterns of propagation.</a> J Neurophysiol. 86 (5), 2435-2444 (2001).</li><li>Thiemann, W., Malisch, R., Reymann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+microcirculation+chamber+for+inexpensive+long-term+investigations+of+nervous+tissue+in+vitro.">A new microcirculation chamber for inexpensive long-term investigations of nervous tissue in vitro.</a> Brain Res Bull. 17 (1), 1-4 (1986).</li><li>Shetty, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+Synaptic+Tagging/Capture+and+Cross-capture+using+Acute+Hippocampal+Slices+from+Rodents.">Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents.</a> J Vis Exp. (103), (2015).</li><li>Du, H., Lin, J., Zuercher, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+efficiency+of+CO2+injection+into+seawater+by+a+venturi+than+a+conventional+diffuser+system.">Higher efficiency of CO2 injection into seawater by a venturi than a conventional diffuser system.</a> Bioresour Technol. 107, 131-134 (2012).</li><li>Weinman, J., Mahler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Analysis+of+Electrical+Properties+of+Metal+Electrodes.">An Analysis of Electrical Properties of Metal Electrodes.</a> Med Electron Biol Eng. 2, 299-310 (1964).</li><li>Fanselow, M. S., Dong, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+the+dorsal+and+ventral+hippocampus+functionally+distinct+structures.">Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures.</a> Neuron. 65 (1), 7-19 (2010).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+BDNF-gene+transcripts+with+short+3'+UTR+in+hippocampal+CA1+neurons+improves+memory+formation+and+enhances+synaptic+plasticity-relevant+signaling+pathways.">Translation of BDNF-gene transcripts with short 3' UTR in hippocampal CA1 neurons improves memory formation and enhances synaptic plasticity-relevant signaling pathways.</a> Neurobiol Learn Mem. , (2016).</li></ol>

저자는 연구 잠재적인 상충으로 해석 될 수 있는 어떤 상업적 또는 금융 관계의 부재에서 실시 되었다 선언 합니다.

인터페이스 슬라이스 챔버 더 강력한 시 냅 스 응답25,26,,2728전시, 침수 챔버 패치 클램프 기록 및 형광에 대 한 추가 편의 제공 이미지입니다. 따라서, 우리 신경17,18, 형광 프로브의 이미지를 쉽게 확장할 수 있는 상업 잠수 슬라이스 챔버를 사용 하 여 급성 hippocampal 조각에서 필드 잠재적인 녹음의 여러 측면을 설명 했습니다. 19. 조각 준비25, 외 많은 시간 후에 녹음 실에서 지속적인 carbogen 레벨의 유지 보수 장애물의 하나를 나타냅니다. Carbogen 수준 실제 저수지의 초기 포화에 의해 제어만 때문에, 차이 실제에 산소 수준에서 쉽게 얻을 수 있습니다 일상적인 실험에. 따라서, 산소 미터는 것이 좋습니다 문제 해결 가속화 하 고 적어도 28 mg/L 도달 조건 (예: 온도, carbogen 유량, carbogenation 도구 및 실제 재활용 비율) 조정 안정에서 실제 저수지에서 산소 수준입니다. 또한, 약물 응용 프로그램에 대 한 실제 컨테이너의 크기를 변경 하는 일반적인 연습 그들의 carbogen 레벨 차이로 인해 필드 전위에 효과 유도할 수 있다.
작은 재활용 버퍼 볼륨의 유출 carbogenation를 사용 하 여 시 냅 스가 소성 실험의 결과 향상. 향상 된 액체에서 산소의 용 해 액체의 접촉 영역 사이의 carbogen 큰 비율을 기반으로 합니다. 또한, 유출 carbogenation 실제 저수지에서 carbogen 고갈 실제의 공급을 감소 시킨다. carbogenation의 안정성 상용 제품29의 원칙에 따라 구체적으로 설계 된 venturi에 의해 더 향상 될 수 있습니다.
함께 최고의 슬라이스 준비 및 설치 조건, 그것은 종종 피할 수 절연된 금속 자극 전극을 사용 하는 경우 필드 전위를 유도 될 수 없습니다. 종종, 이유는 단 열 절곡 또는 청소 손상 되었습니다. 우리는 방법에 표시 된 있다, 낮은 DC 전압에서 거품 형성을 확인 하는 간단한 방법이입니다. 또한,이 단계는 팁을 청소 하 고 자극 전극의 임피던스를 줄일 수 있습니다. 자극에 대 한 유리 펫의 사용 일반적 이며 섬유 자극의 좁은 분야를 제공 하는 이점이 있다. 종종, 유리 피 펫 자극 사용 하는 경우 최대 fEPSP 슬로프를 찾을 수 아니다. FEPSP 감퇴 단계에서 인구 스파이크의 포지티브 원본 컴포넌트의 외관 다음 자극 강도23조정 사용할 수 있습니다.
다른 신호 경로 적용된 유도 프로토콜에 의존의 참여는 사용할 수 있는10고 활동-종속 시 냅 스가 소성의 유도 관한 게시 수 있습니다. 그러나, 방법론의 관점에서 높은-주파수 자극 시 냅 스가 소성의 성공적인 유도 막을 수 있는 뚜렷한 유물을 발생할 수 있습니다. 반복된 100/1의 자극 자극 전극의 전기 화학 반응30, afferents (예를 들어 그림 8 참조)에 손상을 인해 시 냅 시스 전송의 우울증에 따른 양극 화가 될 수 있습니다. 전기 화학 프로세스를 최소화 하기 위해 초기 기록에 대 한 복 형 자극 펄스와 자극 전원 2 V 보다 더 많은 것 아닙니다의 사용을 권장 합니다.
요약 하자면, 유출-carbogenation 약물 실험의 비용 효율성을 강화 하는 작은 버퍼 저수지의 재활용에 의존 하는 실험에서 산소 수준 안정화에 도움이 됩니다.

1951 년에 처음 보고 급성 뇌 조각 실험 실시1했다. Piriform 피2,3 , hippocampal 신경 해 마4, 중 septotemporal 축 transversely 상호는 발견에서 성공적인 생체 외에서 녹음 후 1971 년에는 첫 체 외에 녹음 hippocampal 신경 활동의 달성된5이었다. Vivo에서 그리고 생체 외에서 조건 하에서 뉴런의 신경 생리학 또는 neurostructural 매개 변수의 유사성은 여전히6의 일부 토론 주제 하지만 1975 년에, Schwartzkroin7 표시는 기저 뉴런의 속성은 체 외에서 고 hippocampal 형성에 afferents의 그 높은-주파수 자극 (즉, tetanization)의 시 냅 스 전위8오랫동안 촉진 유도. 신경 활동의 기록 electrophysiological 생체 외에서 크게 확장 활동-종속 시 냅 스가 소성9,10, 블 리스에 의해 1973 년에 발견 했다 세포 메커니즘의 연구 외. 11 vivo에서 토끼로 실험.
신호 경로 뇌 조각, 그리고 급성 hippocampal 조각, 특히 신경 활동의 연구는 이제 표준 도구입니다. 그러나, 의외로, 실험 체 외에 는 아직 표준화 될 준비 및 급성 hippocampal 조각의 유지 보수에 대 한 여전히 존재 하는 여러 방법에 의해 입증. 리드 외. (1988) 12 조각 챔버의 다른 유형과 매체, pH, 온도 및 산소 레벨 목욕의 선택에 급성 뇌 조각의 유지 보수에 대 한 방법론 문제 검토. 이러한 매개 변수는 여전히 조각-녹음 설정 생체 외에서 의 맞춤 요소 때문 녹음 실에서 제어 하기 어렵다. 게시는 설명할 수 있습니다. 극복 하는 데 도움이 방법론 도전과 그의 일부 침수 슬라이스 챔버, 중간 3D microperfusion 시스템13, 향상 된 층 류 및 산소 챔버의 새로운 유형을 찾을 수 있습니다. 14, 컴퓨터 온도 제어15, 시스템 및 다중 챔버 녹음 시스템16공급 한다. 이러한 챔버 구축 하기 쉬운 이므로, 대부분의 과학자 들은 상업적으로 사용 가능한 슬라이스 챔버에 의존 합니다. 이 챔버는 전기 생리학 및 형광 이미징17,,1819의 조합에 대 한 되므로 현미경 시스템에 장착할 수 있습니다. 이 약 실은 뇌 조각 인공 척수 (실제)에 빠져들 계속, 버퍼 솔루션의 높은 유량 필요 유지, 약물 응용 프로그램의 비용을 증가 합니다. 이 위해, 우리는 유출-carbogenation 침수 슬라이스 챔버는 상대적으로 작은 실제 볼륨을 사용 하 여 필드 전위의 장기 기록에 대 한 충분 한 안정성을 제공 하는 재활용 관류 시스템을 통합 했습니다. 또한, 우리는이 실험 carbogenation/관류 시스템의 사용 활동-종속 시 냅 스가 소성10 의 결과 미치는 영향 및 진 핵 신장 요인 2 키 니 아 제 (eEF2K)의 억제 시 냅 스 변조 방법 요약 전송20.

<table width="982">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:311px;height:21px;">Reagents required</td>
			<td style="width:244px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="width:311px;height:27px;">NaCl</td>
			<td style="width:244px;">Sinopharm Chemical Reagent, China</td>
			<td style="width:179px;">10019318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="width:311px;height:27px;">KCl</td>
			<td style="width:244px;">Sinopharm Chemical Reagent, China</td>
			<td style="width:179px;">10016318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="width:311px;height:27px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:244px;">Sinopharm Chemical Reagent, China</td>
			<td style="width:179px;">10017618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="width:311px;height:27px;">MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td style="width:244px;">Sinopharm Chemical Reagent, China</td>
			<td style="width:179px;">10012818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="width:311px;height:27px;">CaCl2</td>
			<td style="width:244px;">Sinopharm Chemical Reagent, China</td>
			<td style="width:179px;">10005861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="width:311px;height:27px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:244px;">Sinopharm Chemical Reagent, China</td>
			<td style="width:179px;">10018960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="width:311px;height:27px;">Glucose</td>
			<td style="width:244px;">Sinopharm Chemical Reagent, China</td>
			<td style="width:179px;">10010518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="width:311px;height:27px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:244px;">Sinopharm Chemical Reagent, China</td>
			<td style="width:179px;">20040718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="width:311px;height:27px;">HEPES</td>
			<td style="width:244px;">Sigma</td>
			<td style="width:179px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="width:311px;height:27px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:244px;">Sigma</td>
			<td style="width:179px;">A4043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="width:311px;height:27px;">MgSO4</td>
			<td style="width:244px;">Sinopharm Chemical Reagent, China</td>
			<td style="width:179px;">20025118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="width:311px;height:27px;">NaOH</td>
			<td style="width:244px;">Sinopharm Chemical Reagent, China</td>
			<td style="width:179px;">10019718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:311px;height:21px;"></td>
			<td style="width:244px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:311px;height:21px;">Tools and materials for dissection</td>
			<td style="width:244px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:311px;height:21px;">Decapitators</td>
			<td style="width:244px;">Harvard apparatus</td>
			<td style="width:179px;">55-0012</td>
			<td>for rat decapitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:311px;height:21px;">Bandage Scissors</td>
			<td style="width:244px;">SCHREIBER</td>
			<td style="width:179px;">12-4227</td>
			<td>for mouse decapitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:311px;height:21px;">double-edge blade</td>
			<td style="width:244px;">Flying Eagle, China</td>
			<td style="width:179px;">74-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:311px;height:21px;">IRIS Scissors</td>
			<td style="width:244px;">RWD, China</td>
			<td style="width:179px;">S12003-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:311px;height:21px;">Bone Rongeurs</td>
			<td style="width:244px;">RWD, China</td>
			<td style="width:179px;">S22002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:311px;height:21px;">Spoon</td>
			<td style="width:244px;">Hammacher&#160;</td>
			<td style="width:179px;">HSN 152-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:311px;height:21px;">dental cement spatula</td>
			<td style="width:244px;">Hammacher&#160;</td>
			<td style="width:179px;">HSN 016-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:311px;height:21px;">dental double end excavator</td>
			<td style="width:244px;">Blacksmith Surgical, USA</td>
			<td style="width:179px;">BS-415-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:311px;height:21px;">Vibrating Microtome</td>
			<td style="width:244px;">Leica, Germany</td>
			<td style="width:179px;">VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:311px;height:21px;">surgical blade&#160;</td>
			<td style="width:244px;">RWD, China</td>
			<td style="width:179px;">S31023-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:311px;height:21px;">surgical holder</td>
			<td style="width:244px;">RWD, China</td>
			<td style="width:179px;">S32007-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:311px;height:21px;"></td>
			<td style="width:244px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:311px;height:42px;">Electrophysiology equipment and materials</td>
			<td style="width:244px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:311px;height:21px;">Vertical Pipette Puller</td>
			<td style="width:244px;">Narishige, Japan</td>
			<td style="width:179px;">PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:311px;height:21px;">Vibration isolation table</td>
			<td style="width:244px;">Meirits, Japan</td>
			<td style="width:179px;">ADZ-A0806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:311px;height:21px;">submerged type recording chamber</td>
			<td style="width:244px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:179px;">RC-26GLP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:311px;height:21px;">thermostatic water bath</td>
			<td style="width:244px;">Zhongcheng Yiqi&#65292;China</td>
			<td style="width:179px;">HH-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:311px;height:21px;">4 Axis Micromanipulator</td>
			<td style="width:244px;">Sutter, USA</td>
			<td style="width:179px;">MP-285, MP-225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:311px;height:21px;">Platinum Wire</td>
			<td style="width:244px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:179px;">PTP406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:311px;height:21px;">Amplifier</td>
			<td style="width:244px;">Molecular Devices, USA</td>
			<td style="width:179px;">Multiclamp 700B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:311px;height:21px;">Data Acquisition System</td>
			<td style="width:244px;">Molecular Devices, USA</td>
			<td style="width:179px;">Digidata 1440A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:311px;height:21px;">Anaysis software</td>
			<td style="width:244px;">Molecular Devices, USA</td>
			<td style="width:179px;">Clampex 10.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:311px;height:21px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:244px;">Nikon, Japan</td>
			<td style="width:179px;">FN1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:311px;height:21px;">LED light source</td>
			<td style="width:244px;">Lumen Dynamics Group, Canada</td>
			<td style="width:179px;">X-cite 120LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:311px;height:21px;">micropipettes</td>
			<td style="width:244px;">Harvard apparatus</td>
			<td style="width:179px;">GC150TF</td>
			<td>extracelluar recording</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:311px;height:21px;">borosilicate micropipettes</td>
			<td style="width:244px;">Sutter, USA</td>
			<td style="width:179px;">BF150-86</td>
			<td>patch clamp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:311px;height:21px;">tungsten electrode</td>
			<td style="width:244px;">A-M Systems, USA</td>
			<td style="width:179px;">575500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:311px;height:21px;">peristaltic pump</td>
			<td style="width:244px;">Longer, China</td>
			<td style="width:179px;">BT00-300T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:311px;height:21px;">tubes for peristaltic pump</td>
			<td style="width:244px;">ISMATEC, Wertheim, Germany</td>
			<td style="width:179px;">SC0309</td>
			<td>1x inflow, ID: 1.02mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:311px;height:21px;">tubes for peristaltic pump</td>
			<td style="width:244px;">ISMATEC, Wertheim, Germany</td>
			<td style="width:179px;">SC0319</td>
			<td>2x tubes for outflow, ID: 2.79 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:311px;height:21px;">CCD camera</td>
			<td style="width:244px;">PCO, Germany</td>
			<td style="width:179px;">pco.edge sCMOS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:311px;height:21px;">lens cleaning paper</td>
			<td style="width:244px;">Kodak</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:311px;height:21px;">50 ml conical centrifuge tube</td>
			<td style="width:244px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:179px;">339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:311px;height:21px;">Prechamber</td>
			<td style="width:244px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:179px;">BSC-PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:311px;height:21px;">Inline heater</td>
			<td style="width:244px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:179px;">SF-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:311px;height:21px;">Temperature Controller</td>
			<td style="width:244px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:179px;">TC-324B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

recording synaptic plasticity in acute hippocampal slices maintained in a small-volume recycling-, perfusion-, and submersion-type chamber system

비록 뇌 조각에 실험 1951 년부터 사용 되었습니다, 문제는 필드 잠재적인 또는 세포내 녹음을 수행할 때 시 냅 시스 전송의 조음의 안정적이 고 성공적인 분석을 달성의 가능성을 감소 시키는 남아 있다. 이 원고는 상용 침수 챔버에 필드 흥분 성의 postsynaptic 잠재력 기록에 대 한 급성 뇌 조각의 유지 보수에 대 한 실험 조건 개선에 도움이 될 수 있는 방법론 기능을 설명 합니다. 와 유출 carbogenation 단위. 유출 carbogenation 약물 실험의 비용 효율성을 향상 시키기 위해 작은 버퍼 저수지의 재활용에 의존 하는 실험에서 산소 수준 안정화에 도움이 됩니다. 또한, 원고는 시 냅 시스 전송의 활동-종속 시 냅 스가 소성에 다른 carbogenation 모드와 자극 패러다임의 효과 검사 하는 대표적인 실험을 선물 한다.

프로토콜 섹션에서 우리는 조각의 급성 hippocampal hippocampal 형성 (그림 1)의 복 부와 중간 부분에서 남성 C57BL/6 마우스 및 남성 Wistar 쥐 (5-8 주)의 준비를 설명. 슬라이서 플랫폼에 반구의 위치 그들을 안정적으로 유지 하는 데 도움이 하 고 안정화 한 천 또는 agarose의 필요를 제거 합니다. 관류 시스템 자체 운영 하는 액체의 필요한 유량을 주고 높은 회전에 연동 펌프를 기반으로 합니다. 따라서, 펌프 내에서 표준 튜브의 급속 한 노후화 만든 우리 비 실리콘 튜브를 사용 하 여 극복 하는 상당한 문제 (ID: 1.02 m m). 유출에 대 한 부정적인 압력 2.79 m m 내부 직경 두 병렬 연결 된 관에 의해 만들어집니다. 이 두 관 액체(그림 4)의 열망에 대 한 수 있도록 녹음 실에서 정 맥에 연결 됩니다. 저수지에서 실제의 carbogenation 속도 작은 구멍으로 환기 돌 또는 튜브를 사용 하 여 달성 하기 어려울 수 있습니다 많은 시간 동안 안정 해야 합니다. 이후 유출-carbogenation 작은 구멍, (그림 2) 시간이 남아 안정 이상의 carbogen 흐름 속도에 의존 하지 않습니다. 실험은 작은 실제 저수지와 함께 실시, 유출-carbogenation 용 존된 산소 (그림 3)의 균형을 달성 하기 위해 수 있습니다. 또한, 변경 된 유입/유출 튜브 위치, carbogen 버블 튜브와 액체 재활용 비율에서 활성 숨 구멍의 수에 따라 실험 사이 산소 레벨의 변화를 최소화 합니다.
조각(그림 4)까지 일부 액체 교환 수 있도록 렌즈 종이에 배치 됩니다. 때문에 슬라이스 챔버 40 X 목표를 갖춘 직 립 현미경에 거치 될 수 있다, 잘 제어 (B 그림 4및 그림 5)는 전극의 위치 될 수 있습니다. 이 더 일상 업무에 실험의 가변성을 감소 시킨다.
잠재적인 자극 강도 따라 필드 잠재적인 크기의 종속성은 다른 자극 강점 (그림 5에서 fEPSPs를 기록 하 여 결정 되어야 합니다 필드의 초기 기록에 필요한 자극 강도 확인 하려면 ). 입력-출력 특성의 측정 높은 자극 힘에 조각에 몇 가지 스트레스를 만듭니다. 따라서, 다른 방법은 그냥 fEPSP-감퇴 (검은 화살표 그림5에서)26에 긍정적인 인구 스파이크 구성 요소 끝 자극 강도 대 한 검색입니다.
적어도 30 분 동안 안정 기준선을 기록한 후 약국 시작할 수 있습니다. 여기, 우리는 시 냅 스 전송에 eEF2K 억제제의 효과의 예 제시. eEF2K의 억제 시 냅 스 전송 (그림 6A), p38 MAPK (그림 6B)20의 억제에 의해 감쇠는 그 효과 촉진 합니다.
활동-종속 시 냅 스가 소성 자극 패러다임10의 다양 한에 의해 유도 될 수 있다. 100 Hz에서 자극의 연속 시퀀스와 1 hz 15 분 이상 반복된 stimulations에 여기, 우리는 시 냅 스가 소성의 대표적인 실험 제시. 시 냅 시스 전송의 결과 변조 그림 7 과 그림 8에 묘사 되어 있다. 또한, 그것은 표시 그림 7 과 그림 8 에 유출-carbogenation (흰 동그라미, 그림 3에서 24-40 분 상대 산소 수준)에 의해 작은 버퍼 저수지의 산소 수준의 안정화는 LTP 개선 그리고 (회색 서클, 산소 수준 7-24 분) 저수지-carbogenation만 실험에 비해 LTD 유도. 우리 우리 낮고 간단 carbogen 사용 실험 시스템을 만들기에 관심이 있기 때문에 유출-carbogenation와 저수지-carbogenation (7-24 분)의 결합을 테스트 하지 않았다. 없이 저수지 carbogenation 실제 저수지에서 산소의 기준선 수준을 나타냅니다 재활용 (최대 7 분).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55936/55936fig1.jpg"> 
그림 1: 는 vibratome를 사용 하 여 해 마의 가로 슬라이스를 두뇌 반구를 위치. (A) hippocampal 형성 복원된 마우스 뇌 모델 내에서 녹색 오른쪽 뇌의 측면 보기에 표시 됩니다. (B) A hippocampal 형성의 복 부 전망. (C) rostral-꼬리 보기 hippocampal 형성 수평 평면에 오른쪽 뇌에 대 한 복 부와 중간 부분의 섹션을 보여 줍니다. 해 마의 septotemporal 축 다른 지역 신경 분포와 기능31,의 다른 학위를가지고 있기 때문에32, 다른 절단 각도 필요 해 마 등의 가로 분할 영역 예를 들어. 눈금 막대 = 3 mm (가로 흰색 라인). (D) 사진은 vibratome 플랫폼에 붙어 쥐 뇌의 반구. 눈금 막대 = 6 m m. (E) 스케치 분리 오른쪽 반구 (점선된 검은 선) 및 조각화 플랫폼에서 만든된 표면에 뇌를 접착제로 회전 (빨간색 화살표)의 외피 (위 스키마)의 등 쪽 가장자리를 트리밍에 대 한 각도 보여준다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55936/55936fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55936/55936fig2.jpg"> 
그림 2 : 50 mL 아래 실제 저수지에 대 한 carbogenation 시스템의 요소. (A) 표준 carbogenation 시스템 (a) 구멍이 튜브를 사용 하 여 carbogen 거품 장치; 튜브는 250 µ m 직경 스테인리스 와이어 여러 구멍에서 구멍 했다. (B) 유출-carbogenation (b) 3 방향 튜브 커넥터 (내경: 2mm) 또는 소수 성 필터와 액체의 역류를 방지 하는 (C)는 환기 단위.3-방향 튜브 커넥터의 가운데 팔 한 차압 후 carbogen 탱크에 연결 되어 (가스 압력: &#60; 1 atm) 및 유량 계. 나머지 무기는 실제 유출 튜브 내에서 연결 됩니다. (D)는 carbogen 유량 흐름 미터에 의해 제어 됩니다. 실험을 하는 동안 실제 저수지는 28-30 ° c.에 유지 됩니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55936/55936fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55936/55936fig3.jpg"> 
그림 3: 서로 다른 조건에서 실제의 40 mL의 산소 수준. 저수지-carbogenation 동안 산소 수준 (res.-수화물.) 지속적으로 감소 실제 재활용 (회색 가득 동그라미, n = 3). 그러나, 유출-carbogenation (유출-수화물.) 실제 중 산소 수준, 평형 기준선 수준에 도달의 드롭 감소 재활용 (화이트 가득 동그라미, n = 3). 초기 레벨 res. 탄수화물으로 측정 되었다. 없이 실제 재활용. 수직 점선된 회색 줄 다른 carbogenation 프로토콜에 스위치를 나타냅니다. 재활용 (7-24 분)와 함께 res. 수화물 및 유출 수화물의 효과. LTP와 LTD의 유도에 (흰 동그라미, 24-40 분)를 재활용으로 그림 7 과 그림 8에 묘사 된다. 데이터 평균 ± SEM.로 표시 됩니다 <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55936/55936fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55936/55936fig4.jpg"> 
그림 4 : 침수 슬라이스 챔버에 실험에 대 한 유출-carbogenation의 구성 요소. (A) 침수 슬라이스 챔버의 프리젠테이션. 들고 hippocampal 슬라이스 나일론 섬유와 U 자 모양의 백 금 철사 그려져 있습니다. 실버 와이어 실버 와이어 결말의 영역을 증가 하려면 코일을 만드는 작은 정을 감싸 했다. 자극 참조 와이어 유출 챔버에 배치 했다 그리고 기록 참조 메인 챔버. 서로 다른 액체 수준에서 안정, 기록 참조 와이어 버퍼에 노출 하는 와이어의 "수 중" 부분만 떠나 플라스틱 튜브로 절연 수 있습니다 잠재적인 참조 전극 유지. (B) 밝은 필드 이미지는 대표적인 급성 hippocampal 조각과 전극 보여 줍니다. CA1, CA3: 뿔 Ammonis 1, 3; DG:가 이랑; 하위: subiculum; EC: entorhinal 외피입니다. (C) 회로도 carbogen 및 연동 펌프 유량의 표시 없이 유출-carbogenation의 주요 구성 요소를 강조 표시합니다. 로우 패스 필터를 실제 흐름의 맥 동을 줄이기 위해 인라인 히터 앞 놓일 수 있다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55936/55936fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55936/55936fig5.jpg"> 
그림 5 : 자극 강도 및 전극의 위치에 잠재적인 모양 필드의 종속성. (A) 지층 pyramidale (pyr str.), 그리고 자극 장점에서 다른 거리에 갖는 잠재력 묘사 된다 분야의 대표적인 예. 수평 검은 화살표는 필드 잠재적인 붕괴에 인구 스파이크의 포지티브 원본 구성 요소를 나타냅니다. 인구 스파이크의 포지티브 원본 구성 요소는 약 초기 fEPSP 상승 단계에서 모든 테스트 "인라인" 전극 위치 셀 바디 레이어 (e)에 가까운 매우 하나 제외 하 고의 중간에 남아 있었다. 인구 스파이크의 구성 요소 (B)의 포지티브 원본 위치 자극 및 기록 전극의 부정합으로 인해 크게 다양합니다. 락입니다.: 지층 lacunosum moleculare; Rad.: 지층 radiatum; Pyr입니다.: 지층 pyramidale; 레크 리에이: 기록 전극; Stim입니다.: 자극 전극입니다. 눈금 막대 = 100 µ m. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55936/55936fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55936/55936fig6.jpg"> 
그림 6 : 유출-carbogenation를 사용 하 여 작은 실제 저수지20 의 재활용으로 hippocampal 시 냅 스 전송에 eEF2K 억제제의 효과의 대표적인 예 . 20 분 동안 1 분 간격 fEPSPs를 기록한 후 eEF2K 억제 물 A-484954는 직접 실제 저수지 (수평 라인)에 추가 되었습니다. 시 냅 시스 전송의 급속 한 증가 감지 (화이트-채워진 원) 이었다. 약은 적용 되지 fEPSP 사면 녹화 (회색 가득 원)의 시간 동안 안정 유지. P38 MAPK 억제제 (회색 가로 선) 응용 프로그램 (B) eEF2K inhibito-유도 증진 분야 잠재력의 방지. 데이터 평균 ± SEM.로 표시 됩니다 <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55936/55936fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55936/55936fig7.jpg"> 
그림 7: 유출-carbogenation를 사용 하 여 시 냅 시스 전송의 활동-종속 potentiation의 대표 녹음 (유출-수화물.; 흰 동그라미)와 저수지-carbogenation (해상도-수화물.; 검은 서클), 작은 실제의 재활용과 저수지. 후 시간 포인트 0에 의해 3 시간 100 Hz/s 기차는 potentiation 유도 되었다 (Tet.: tetanization, 높은-주파수 자극). 데이터 평균 ± SEM. 브라켓으로 제공 됩니다: 시간 포인트; 당 그룹의 통계 비교 짝이 없는 T-테스트, 일관 된 표준 편차를 가정 하지. * p &#60; 0.05.<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55936/55936fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55936/55936fig8.jpg"> 
그림 8 : 자극 강도 및 carbogenation 시 냅 시스 전송의 활동-종속 우울증의 종속성. (A) 저수지-carbogenation를 사용 하 여 (res.-수화물.) 큰 실제 볼륨의 재활용으로 최대한 fEPSP 슬로프의 80%에서 15 분 동안 1 자극 시 냅 시스 전송 (흰색 원)의 강한 우울증 갖는. 그러나, 대표 fEPSP (검은 추적) 하기 전에 추적 그리고 후 (빨간 추적 110일 분) LTD 유도 표시, 연 접 섬유 발리 (수직 검은 화살표) 크게 감소 했다. 이 자극 전극에서 전기 화학적 인 과정 회사 관련 메커니즘에 부분적으로 의존 하지 않는 우울증을 일으키는 afferents 해 수를 나타내는 예입니다. 더 낮은 정도에 시 냅 시스 전송의 우울증 유발 자극 강도 fEPSP 사면 최대 50% 감소 하지만 변경 하지 않고 연 접 섬유 발리 (회색 가득 원). FEPSP-슬로프 저수지-carbogenation와 실험에서의 지속적인 우울증과 작은 실제 저수지의 재활용 (B) LTD 유도 연상 하지 않았다 (res.-수화물.; 회색 채워진 사각형). (C) 유출-carbogenation 작은 실제 저수지의 재활용 향상 LTD 유도의 결과. 삽입 (검은 추적) 하기 전에 대표 fEPSPs 제시 (110일 분, 붉은 흔적) 후 LTD 유도. 대표 fEPSPs에 대 한 수직 눈금 막대 표시 1 mV, 그리고 2 양 데이터 1에 2 개월 된 C57/BL 6 쥐의 급성 hippocampal 조각 (350 µ m)에서 가져온 고 평균 ± SEM. 괄호로 표시 됩니다에 해당 하는 가로 비율 바 : 시간 포인트; 당 그룹의 통계 비교 짝이 없는 T-테스트, 일관 된 표준 편차를 가정 하지. * p &#60; 0.05, ns: 비-중요 한. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55936/55936fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System at JoVE.com

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

급성 Hippocampal 조각에 작은 볼륨 재활용-, 관류-침수 형 챔버 시스템 유지에 시 냅 스가 소성을 기록

이 프로토콜 산소 수준 재활용된 버퍼의 작은 볼륨과 침수 급성 hippocampal 조각 활동 종속 시 냅 스가 소성 녹음의 방법 론 적 측면에서의 안정화를 설명 합니다.

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

recording-synaptic-plasticity-acute-hippocampal-slices-maintained

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.5K 조회수.  Fudan University. 이 프로토콜 산소 수준 재활용된 버퍼의 작은 볼륨과 침수 급성 hippocampal 조각 활동 종속 시 냅 스가 소성 녹음의 방법 론 적 측면에서의 안정화를 설명 합니다.

비디오: Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

β - 아밀로이드 Oligomeric의 준비 1-42</subHippocampal 조각에 시냅틱 소성 장애의>와 유도

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

연구

신경과학

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The hippocampus can be extracted quickly and easily from rats and mice and slices remain viable for hours in oxygenated artificial cerebrospinal fluid. Moreover, basic electrophysisologic techniques are easily applied to the investigation of synaptic function in hippocampal slices and have provided some of the best biomarkers for cognitive impairments. The hippocampal slice is especially popular for the study of synaptic plasticity mechanisms involved in learning and memory. Changes in the induction of long-term potentiation and depression (LTP and LTD) of synaptic efficacy in hippocampal slices (or lack thereof) are frequently used to describe the neurologic phenotype of cognitively-impaired animals and/or to evaluate the mechanism of action of nootropic compounds. This article outlines the procedures we use for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and Alzheimer's disease (AD)1-3. Use of aged rats and AD model mice can present a unique set of challenges to researchers accustomed to using younger rats and/or mice in their research. Aged rats have thicker skulls and tougher connective tissue than younger rats and mice, which can delay brain extraction and/or dissection and consequently negate or exaggerate real age-differences in synaptic function and plasticity. Aging and amyloid pathology may also exacerbate hippocampal damage sustained during the dissection procedure, again complicating any inferences drawn from physiologic assessment. Here, we discuss the steps taken during the dissection procedure to minimize these problems. Examples of synaptic responses acquired in "healthy" and "unhealthy" slices from rats and mice are provided, as well as representative synaptic plasticity experiments. The possible impact of other methodological factors on synaptic function in these animal models (e.g. recording solution components, stimulation parameters) are also discussed. While the focus of this article is on the use of aged rats and transgenic mice, novices to slice physiology should find enough detail here to get started on their own studies, using a variety of rodent models.

This article outlines procedures for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and age-related neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease.

노화와 아밀로이드 병리 동안 시냅틱 얼터 레이션의 연구에 대한 고양이와 트렌스 제닉 마우스의 급성 Hippocampal 조각의 준비

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

교양 뉴런의 막 단백질의 측면 보급과 Exocytosis은 형광 복구 및 형광 손실 Photobleaching를 사용하여 평가

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

신경 발사 환율의 조작에 의해 성상 세포 수용체의 가소성을 유도

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity is achieved in neurons within a specific time frame. These long-term plasticity-related processes are the leading candidate models to study the basis of memory formation and persistence at the cellular level. Both STC and cross-tagging involve two serial processes: (1) setting of the synaptic tag as triggered by a specific pattern of stimulation, and (2) synaptic capture, whereby the synaptic tag interacts with newly synthesized plasticity-related proteins (PRPs). Much of the understanding about the concepts of STC and cross-tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the laboratories are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging. This video article describes the experimental procedures to study long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.

This video article describes experimental procedures to study long-term plasticity and its associative processes such as synaptic tagging, capture and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using acute hippocampal slices from rodents.

설치류에서 급성 해마 조각을 사용하여 시냅스 태그 / 캡처 및 크로스 캡처 조사

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.

교양된 Hippocampal 신경에 시 냅 스 소포 Endocytosis를 측정

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high dose, whereas sequential injections of a subconvulsive dose have been used for the development of chemical kindling, an epilepsy model. A single low-dose injection of PTZ induces a mild seizure without convulsion. However, repetitive low-dose injections of PTZ decrease the threshold to evoke a convulsive seizure. Finally, continuous low-dose administration of PTZ induces a severe tonic-clonic seizure. This method is simple and widely applicable to investigate the pathophysiology of epilepsy, which is defined as a chronic disease that involves repetitive seizures. This chemical kindling protocol causes repetitive seizures in animals. With this method, vulnerability to PTZ-mediated seizures or the degree of aggravation of epileptic seizures was estimated. These advantages have led to the use of this method for screening anti-epileptic drugs and epilepsy-related genes. In addition, this method has been used to investigate neuronal damage after epileptic seizures because the histological changes observed in the brains of epileptic patients also appear in the brains of chemical-kindled animals. Thus, this protocol is useful for conveniently producing animal models of epilepsy.

This protocol describes a method of chemical kindling with pentylenetetrazole and provides a mouse model of epilepsy. This protocol can also be used to investigate vulnerability to seizure induction and pathogenesis after epileptic seizures in mice.

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

Investigating Long-term Synaptic Plasticity in Interlamellar Hippocampus CA1 by Electrophysiological Field Recording

The study of synaptic plasticity in the hippocampus has focused on the use of the CA3-CA1 lamellar network. Less attention has been given to the longitudinal interlamellar CA1-CA1 network. Recently however, an associational connection between CA1-CA1 pyramidal neurons has been shown. Therefore, there is the need to investigate whether the longitudinal interlamellar CA1-CA1 network of the hippocampus supports synaptic plasticity.
We designed a protocol to investigate the presence or absence of long-term synaptic plasticity in the interlamellar hippocampal CA1 network using electrophysiological field recordings both in vivo and in vitro. For in vivo extracellular field recordings, the recording and stimulation electrodes were placed in a septal-temporal axis of the dorsal hippocampus at a longitudinal angle, to evoke field excitatory postsynaptic potentials. For in vitro extracellular field recordings, hippocampal longitudinal slices were cut parallel to the septal-temporal plane. Recording and stimulation electrodes were placed in the stratum oriens (S.O) and the stratum radiatum (S.R) of the hippocampus along the longitudinal axis. This enabled us to investigate the directional and layer specificity of evoked excitatory postsynaptic potentials. Already established protocols were used to induce long-term potentiation (LTP) and long-term depression (LTD) both in vivo and in vitro. Our results demonstrated that the longitudinal interlamellar CA1 network supports N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor-dependent long-term potentiation (LTP) with no directional or layer specificity. The interlamellar network, however, in contrast to the transverse lamellar network, did not present with any significant long-term depression (LTD).

We used recording and stimulation electrodes in longitudinal hippocampal brain slices and longitudinally positioned recording and stimulation electrodes in the dorsal hippocampus in vivo to evoke extracellular postsynaptic potentials and demonstrate long-term synaptic plasticity along the longitudinal interlamellar CA1.

전기 생리학 필드 기록에 의하여 인터라멜라 해마 CA1에 있는 장기 시냅스 가소성 조사

The study of synaptic plasticity in the hippocampus has focused on the use of the CA3-CA1 lamellar network. Less attention has been given to the ...

Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other neurodegenerative disorders, this independence might be compromised due to insufficient glutamate clearance and the resulting spill-in and spill-out effects. Altered astrocytic coverage of the presynaptic terminals and/or dendritic spines as well as a reduced size of glutamate transporter clusters at glutamate release sites have been implicated in the pathogenesis of diseases resulting in symptoms of dys-/hyperkinesia. However, the mechanisms leading to the dysfunction of glutamatergic synapses in HD are not well understood. Improving and applying synapse imaging we have obtained data shedding new light on the mechanisms impeding the initiation of movements. Here, we describe the principle elements of a relatively inexpensive approach to achieve single synapse resolution by using the new genetically encoded ultrafast glutamate sensor iGluu, wide-field optics, a scientific CMOS (sCMOS) camera, a 473 nm laser and a laser positioning system to evaluate the state of corticostriatal synapses in acute slices from age appropriate healthy or diseased mice. Glutamate transients were constructed from single or multiple pixels to obtain estimates of i) glutamate release based on the maximal elevation of the glutamate concentration [Glu] next to the active zone and ii) glutamate uptake as reflected in the time constant of decay (TauD) of the perisynaptic [Glu]. Differences in the resting bouton size and contrasting patterns of short-term plasticity served as criteria for the identification of corticostriatal terminals as belonging to the intratelencephalic (IT) or the pyramidal tract (PT) pathway. Using these methods, we discovered that in symptomatic HD mice ~40% of PT-type corticostriatal synapses exhibited insufficient glutamate clearance, suggesting that these synapses might be at risk to excitotoxic damage. The results underline the usefulness of TauD as a biomarker of dysfunctional synapses in Huntington mice with a hypokinetic phenotype.

We present a protocol to evaluate the balance between glutamate release and clearance at single corticostriatal glutamatergic synapses in acute slices from adult mice. This protocol uses the fluorescent sensor iGluu for glutamate detection, a sCMOS camera for signal acquisition and a device for focal laser illumination.