We would like to acknowledge Connecticut Children's Medical Center Strategic Research Funding for supporting this work.

동의가 소아 환자의 부모 / 보호자로부터 및 기관 검토위원회 (IRB # 13-094)에 따라 얻은 후 식도 생검을 얻었다. 1. 살균 악기 및 젤라틴 솔루션 <ol><li> 오토 클레이브 겸자 면도날 및 오염을 방지하기 위해 조직을 처리하기 전에 위. </li><li> 0.1 % 젤라틴 용액을 200 mL로, 젤라틴 0.2 g에 증류수 200 ㎖를 조합. 압력솥 멋진 사용하기 전에. </li></ol> 2. 코팅 조직 배양 플레이트 <ol><li> 종래 셀 분리하는데 약 2 시간이, 조직 배양 접시 (100mm)를 커버하고, 세포 배양 인큐베이터에서 37 ℃에서 배양한다 충분한 0.1 % 젤라틴을 추가한다. 참고 :이 접시도 미리 만들어 사용하기 전에 배양기에서 유지 될 수있다. </li></ol> 3. 해리에 대한 효소 솔루션을 만들기 <ol><li> 약 세포 분리에 앞서 30 분, 밖으로 무게유리 병에 밀리그램 농도 당 단위를 기준으로 균형에 디스 파제의 10 대. 37 ° C의 물을 욕조에 10 ㎖ 둘 베코의 수정 독수리 중간 (DMEM) 및 장소 15 ML 원뿔 튜브에 분말을 배치합니다. </li></ol> 4. 만들기 세포 배양 매체 <ol><li> F12의 35 ㎖ (햄의 중간), DMEM의 11.5 ㎖, L 글루타민 0.5 mL를 100 배 페니실린 / 스트렙토 마이신 0.5 ㎖, 2.5 ㎖의 : 멸균 원뿔 튜브에 다음 성분을 혼합, 조건부 재 프로그래밍 매체의 50 mL로한다 소 태아 혈청 (FBS), 인간 인슐린 250 μg의 인간 표피 성장 인자 (EGF)의 (500)의 NG. </li><li> , 3T3 매체의 500 mL로 FBS의 50 ㎖, 100 배 페니실린 / 스트렙토 마이신의 5 mL의 DMEM 500 mL를 L 글루타민 5 mL를 혼합합니다. </li><li> 각질 세포의 무 혈청 배지 500 mL로, EGF와 (미디어 제공) 소 뇌하수체 추출물 (BPE) 보조 식품을 해동. 기본 매체의 500 ㎖ 병에 보충제를 추가하고 10의 5 mL를 넣고0X 페니실린 / 스트렙토 마이신 </li></ol> 피더 소스로 5. 배양 및 조사 3T3 세포 <ol><li> DMEM, 10 % FBS, 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 2 mM L- 글루타민을 포함하고, 3T3 매체를 준비한다. </li><li> 문화 적어도 삼일 환자 샘플의 도착 전 조직 처리 T-75 플라스크에서 3T3 세포. <ol><li> 5 ㎖ 플라스크 당 0.25 % 트립신 - EDTA의 및 사용 3T3 세포가 5 분 동안 또는 가장 셀 때까지 37 ° C에서 부화 환자 샘플의 도착를 Trypsinize 직전이 떠있다 </li></ol></li><li> 반응을 정지 3T3 매체의 5 ML을 추가합니다. 세포 현탁액을 기음과 15 ML 원뿔 튜브에 전송할 수 있습니다. 300 X g에서 5 분 스핀. </li><li> 매체를 기음과 세포 계수를위한 트리 판 블루의 정의 된 볼륨 세포를 재현 탁. 죽은 세포를 제외 트리 판 블루 10 μL와 세포의 10 μL를 결합합니다. 세포 계수를위한 혈구에이 솔루션의 부하 10 μL. 참고 :이 프로토하십시오COL, 조사 3T3 세포 접종 밀도는 100mm 플레이트 당 600,000 세포와 동일한 cm 2 당 10,900 세포이다. </li><li> 한 50㎖ 원추형 튜브에 3T3 배지 25 mL에 환자 샘플 재현 탁 당 100mm 플레이트 접시 3000 래드로 조사하는데 필요한 세포의 수를 나누어지는. </li><li> 다음 조사, 아래로 100mm 플레이트 당 5 ㎖에서 조건부 재 프로그래밍 배지에서 5 300 XG에 분,에 resuspend에 대한 스핀 세포. </li><li> 환자 세포의 도금 프로토콜의 뒷부분에서 발생 때까지 옆으로 튜브를 설정 (단계 7.6 참조). </li></ol> 6. 소아 식도 생검을 보존하고 운반, 취득 <ol><li> 15 ML 원뿔 튜브에 100 μg의 / ML의 primocin 완료 각질 세포의 무 혈청 배지 5 mL를 추가하고 얼음에 의료 시설로 가져온다. 주 : 매체의이 튜브는 최대 2 개월 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> TI의에서 약 8 식도 조직 검사를 구합니다나에게 다음과 같이 내시경의 분리 : <ol><li> 젖은 얼음에 100 μg의 / ML의 primocin 및 장소 완전한 각질 세포의 무 혈청 배지를 포함하는 15 ML 원뿔 여섯 조직 검사를 놓습니다. </li><li> 젖은 얼음에 완충 포르말린과 장소의 5 mL에 하나의 조직 검사를 놓습니다. </li><li> 최적의 절단 온도 화합물 cryomold 작은 생검 한 조직 검사를 놓습니다. <ol><li> 즉시 액체 질소에 배치 이소 펜탄의 비커에 넣고,이 금형을 놓습니다. 일단 냉동, 견본 가방에 cryomold을 배치하고, 스티로폼 용기에 드라이 아이스에 저장합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 밀봉 가방 안에 다음 젖은 얼음을 포함하는 배송 상자에 중간 또는 포르말린에서 조직 검사를 포함하는 튜브를 놓습니다. 인감 및 생물 학적 레이블 상자에 레이블과 실험실로 운반 할 것. 참고 : 드라이 아이스가 들어 컨테이너 및 냉동 조직 검사는 밀봉 생물 학적 레이블과 레이블이 붙어 있습니다. </li></ol> 7. 처리다운 스트림 문화 분석을위한 환자 조직 <ol><li> 실험실에 도착하면, 하류 단면 또는 RNA 추출을 위해 C의 냉동고 ° -80에 드라이 아이스에 냉동 생검을 전송합니다. 포르말린의 샘플을 놓습니다. 4 ° C 냉장고에 보관 하룻밤 해결 할 수 있습니다. </li><li> 300 XG에 남아있는 조직 검사를 스핀 다운, 그리고 매체를 대기음. 원추형 튜브 시일 디스 파제 용액 10 mL를 첨가하고 15 분 동안 수욕에서 37 ℃에서 배양 할 수 있습니다. </li><li> 배양 후, 300 × g으로의 조직 검사를 스핀 다운. 0.05 % 트립신 EDTA 5ml에 재현 탁하고 배지를 흡인 생검. </li><li> 100mm의 멸균 판에 조직 검사를 포함하는 트립신 EDTA의 5 mL를 전송하고 2 멸균 면도날 가능한 벌금을 사용하여 조직 검사를 말하다. </li><li> 새로운 15 ML 원뿔에 다진 조직 검사를 포함하는 트립신 EDTA의 5 mL를 전송합니다. 0.05 % 트립신 - EDTA의 추가 5 mL로 두 번 접시를 씻어 원추형에 추가튜브. 37 ° C의 물을 욕조에 10 분 동안 튜브를 품어. </li><li> 배양 후, 5 분 300 XG (1.4 RPM)에서 조직 검사를 스핀 다운 및 매체를 대기음. 원추형 튜브뿐만 아니라 조사 피더 세포를 포함하는 조건부 프로그래밍 매체의 5 ㎖ 조건부 프로그래밍 배지 5 ㎖를 추가한다 (단계 5.7 참조). </li><li> 조직 배양 접시에서 젤라틴을 흡입 한 후 세포 현탁액과 판의 10 ㎖에 ROCK 저해제 (1 μL / mL로)를 추가합니다. 37 ° C에서 품어. </li></ol> 8. 배양 및 확장 셀 <ol><li> 문화의 약 5 일 후, 다진-생검 조각을 포함하는 초기 매체를 대기음 5 mL의 멸균 PBS와 함께 접시에 2-3 번 헹군다. 10 μM에서 ROCK 저해제를 포함하는 판에 새로운 매체를 추가합니다. </li><li> 70 % 포화 상태에 도달하면, 세포를 확장. 접시에 0.05 % 트립신 - EDTA의 5 ㎖를 추가하고 37 ° C 배양기에서 일을 제거 이하 2.5 분을 품어전자 피더 세포. 그 배양 한 후, 트립신 EDTA를 기음과 PBS 5 mL로 접시를 씻어. </li><li> PBS를 대기음하고 판에 0.25 % 트립신 - EDTA 5 mL를 추가하고 5 ~ 10 분 동안이나 세포가 접시에서 느슨한 때까지 배양한다. 반응을 중지하고 50 ML 원뿔 관에 유체를 모두 전송하고 5 분 동안 300 XG에 스핀 다운 판에 매체의 동일한 금액을 추가합니다. </li><li> 조건부 프로그래밍 매체의 정의 부피 재현 탁 세포는 트리 판 블루 10 μL로 현탁액 10 μL를 혼합한다. 총 세포 수를 결정하는 혈구의 개수. </li><li> 세포를 확장 120 만 15 mL의 총 부피에 3T3 세포를 조사와 함께 150mm 판에 1 백만 인간의 식도 세포를 추가합니다. 10μM에서 신선한 ROCK 억제제를 추가하고 젤라틴 코팅 150mm 접시에 세포 현탁액을 추가합니다. </li></ol> 9. 동결 및 저장 인간의 식도 상피 세포 <ol><li> 매체를 동결하려면 10 % 추가조건부 프로그래밍 매체 DMSO. trypsinizing 및 계산 한 후, 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 고정하고 5 분 동안 300 XG에 스핀 다운 세포 나누어지는. </li><li> 매체를 기음과 cryovial 당 2 mL의 부피에 매체를 동결 추가합니다. 세포 현탁액을 균질되면, 미리 라벨링 cyrovials 10 6 세포 분취. 장기 액체 질소 저장에 튜브를 이동하기 전에 최소 24 시간 동안 -80 ° C에서 냉동 컨테이너의 장소. </li></ol>

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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+inflammation+on+the+proliferation+of+human+gingival+epithelial+cells+in+vitro.">Effect of inflammation on the proliferation of human gingival epithelial cells in vitro.</a> J Periodontol. 68 (11), 1070-1075 (1997).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

환자로부터 생검 식도 상피 세포를 분리하고 확장하기 위해 가장 중요한 단계가있다 : 1) 적절히 최소 세포사와 생검 조직 해리; 2) 보장 ROCK 억제제마다 변화 매체에서 세포 배양 배지에 첨가되고; 3) 권장보다 더 피더 세포를 사용하지 마십시오 4) 깨끗한 무균 문화를 유지; 5) 합류에 도달하기 직전 통로 세포. 조건부 인해 프로그래밍 얻어 생검 표본에서 환자 - 관련 차이로는 성장 동역학, 표현형 여러 통로로 확장하는 능력의 차이를 예상하는 것이 합리적이다. 일반적으로, 4 식도 생검 세포 격리 각 환자로부터 얻을 수있다. 일단 해리, 우리는이 평균 통로 (3)에 의해 만 10 세포로 확장 일 0에서 약 300,000-600,000 세포를 그물. 상피 세포 라인에 대한 설명 조약돌 형태를 유사하게 나타납니다 형성 식민지의 형태 &lt;SUP 클래스 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 25 (그림 2). 문화에 세포의 샘플은 유동 세포 계측법 및 상피 마커에 대한 면역이 확장 인구가 원점에서 실제로 상피 (그림 3)입니다 보장하기 위해 QRT-PCR을 통해 분석해야한다. 세포가 상피 마커 (E-cadherin의,는 EpCAM, TJP1)을 표현 안, 셀 라인은 종료 및 폐기해야합니다. 그들이 유래 상피 경우 본 셀보다 90 %는 EpCAM 긍정적 인 것으로 예상된다. 배양 표현형을 변경하거나 상피 발현 면역지는 경우 평가하거나 계측법 상피 마커 (E-cadherin의) 선조 표현 (P63), 및 상피 밀착 연접 단백질 (TJP1)를 평가하기 위해 이용되어야 흐르게하기 위하여. 세포는 표현형이 변화하지 않도록 기대된다 계대으로 증식이 감소 안되며, 이들 세포는 상피 발현뿐만 아니라 전구 표현 (도 4를 표시해야 </strong&gt;). 또한, 해리 조건부 프로그래밍 문화에 도금 정상적인 식도 조직은 약 36-40 시간 (그림 5)의 인구가 두 배로 시간이 나타납니다. 5 일 이상 두 번하지 않는 발견되는 세포는 노화 될 가능성이 폐기해야합니다. 그러한 삼킴 같이 본 염증 반응, 환자로부터 분리 된 세포는 감소 된 증식 속도가 상피 세포를 가지고 있다고 설명 하였다 (도 3 (26) 및 28 명) 및 아폽토시스 (26)의 높은 비율의 E-cadherin의 발현을 감소시켰다. 따라서,이 방법을 사용하여 심한 어려움 병 환자로부터 세포 배양을 위해 불합리한 아니다. 이 세포는 몇 통로 또는 단지 초기 통로 견디는 것이 가능하다. 이것은 여전히 ​​원래 격리 된 이상 세포의 큰 번호와 연구자를 제공해야합니다. 그러나이 숫자는 적절하지 않을 수 있습니다모든 제안 된 연구. 이들 세포는 궁극적으로 식도 질환 연구 또는 식도 여분을 구성하는 데 사용되지 않기 때문에, 이들 세포가 점막 재생 만 책임이 기억하는 것이 중요하다. 이러한 섬유 아세포, 신경 세포, 평활근 세포 및 혈관과 같은 다른 세포 유형 또한 식도 질환의 연구 및 조직 공학 어플리케이션에 마찬가지로 중요하다. 이 기술은 질병의 발병 기전을 연구뿐만 아니라 식도 조직 공학 응용 프로그램에 대한 환자 맞춤형 세포의 잠재적 인 저수지 역할을하는 매우 중요한 도구 인 환자 맞춤형 세포 소스를 제공합니다. 수술 주입을위한 생체 물질을 뿌리기 위해 이용 세포는 유전 적 이상, 바이러스 성 시퀀스의 자유와 기형 종을 형성하지 않아야합니다. 줄기 세포 (다 능성 또는 다 능성)의 사용은 differen받지 않은 경우에는 그 중 일부는 기형 종을 형성 할 수있는 분화 다음 너무 많은 원치 않는 세포 유형을 생성tiation. 또한,이 셀 소스 표현형이 일치하고 정제하거나 원하지 않는 세포의 제거를 필요로하지 않는다. 이상적인 셀 소스가 설계되고 동일한 해부학 적 위치에서 발견되는 세포 수 있습니다. 이 방식에서, 이들 식도 상피 세포는 식도의 점막 지지체를 다시 채우기 위해 사용된다. 추가의 세포 유형은 식도 재생에 필요한; 이 누설, 협착 및 천공으로 이어질 수 있지만,이 기술의 초점이 완전하지 점막이 시드 된 보장하기 위해이었다. 식도 새로운 수술 옵션 공학에 대한 이러한 세포를 이용하는 이외에, 이들 세포는 이들 질환을 치료하기위한 새로운 치료 방법에 대한 식도 질환 과정뿐만 아니라 화면을 연구하는데 사용될 수있다. 호산 구성 식도염 (삼킴)은 아직 완전하게 설명하는 정확한 메커니즘과 발병 기전과, 식도의 알레르기 질환으로 설명되어 있습니다. 현재 치료 등록iments는 제거식이 요법, 경구 용 스테로이드 및 여러 내시경을 포함한다. 어떤 분석은 ​​&quot;추측을하고&quot;사용 길고 환자에게 종종 실망 접근 할 의사를 리드 각 환자에 대한 염증 반응을 유발 무엇을 평가하기 위해 존재하지 않는다. 환자 특정 세포 팽창이 방법은 렌티 바이러스 형질 도입 또는 유전자 조작을 이용하지 않기 때문에, 프로그래밍 과정에서 세포의 유전자형에 대한 영구 변화의 가능성이 최소화된다. 이것은 세포가 이론적으로 생체 내 환경에서 변하지 의미한다. 체외에서 환자의 세포를 테스트 할 수있는 능력은 트리거 에이전트가 새로운 것 파악하고 궁극적으로 이러한 소아 환자를위한 새로운 진단 또는 치료제의 개발로 이어질 수있다.

식도 조직 공학 및 호산 구성 식도염 (삼킴)는 지난 10 년간 많은 실험실에서 연구의 초점이되고있다. 이러한 식도 폐쇄증과 같은 선천성 결함, 1 먹을 수 없다는 선도 식도의 불완전 개발 결과 약 1 4,000에서 출산에 볼 수 있습니다. 호산구 식도염의 발생률과 유병률은 1993 년 질병 엔티티의 식별이 호산구 식도염의 빈도는 10 인 - 연간 / 100,000 0.7에서 변화와 유병률은 43 / 10 만 2 0.2에서 원거리 이후로 증가하고있다. 롱갭 식도 폐쇄증의 치료에 대한 새로운 매력적인 접근법 수술은 환자 자신의 세포를 이용하여 이식을위한 조직 구조를 생성하는 것으로 이루어진다. 합성 비계와 함께이 세포들은 면역 억제를 필요로하지 않는자가 구조를 생성합니다. 일부 그룹은 이미 우리를 조사하기 시작했다7 - 식도 조직 공학 (3)뿐만 아니라 고유의 식도 상피 세포의 사용과 같은 줄기 세포의 예는 점막 4를 다시 채울. 소아 환자의 식도에 존재하는 질병은 종종 진단이나 간섭없이 공부하기 어렵다. 또한, 사용 동물 모델 또는 시험 관내에서 정확한 질병의 발병 또는 환자 별 차이 (8)을 포함하지 않는 호산구 식도염 등 소아 질환 세포주 모델을 불멸. 따라서, 위해 체외에서 환자의 질병 과정을 연구 할 수있는 기능은 특정 질병 유발 항원을 식별하는 기본 메커니즘을 평가하고 새로운 일 및 환자 치료에 도움이되는 정보와 임상의를 제공 할 것이다 약물 치료를 조사합니다. tissu에서 사용하기 위해 제안 된 많은 환자는자가 또는 특정 세포 유형이 있었다전자 공학 및 인간 질병의 발병 기전을 연구. 그러나, 이들 세포 유형의 일부 큰 지지체 시드 또는 시험 관내 연구에서 높은 처리량을 수행 할 특정 표현형의 충분한 세포를 생성하는 그들의 능력에 제한된다. 다 능성 또는 다 능성 줄기 세포의 사용은 많은 연구의 논의의 주제왔다 그러나, 이들 세포를 사용 제한 및 단점도 9를 설명 하였다. 인간 배아 줄기 세포의 사용은 매우 많은 논쟁 윤리적 문제를 제시한다. 가장 중요한 것은, 이러한 세포는 그들의 능성 상태 사전 거실 호스트 (10)로 전달을 구별하지 않는 경우, 종양과 유사한 기형 종을 형성한다. 또, 배아 줄기 세포의 사용은 환자의 특정되지 않을 것 및 동종 면역 반응 억제 (10)의 필요성을 유도 할 수있다. 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)는 그 수있는 만능 세포이다환자 자신의 세포로부터 유도 될 수있다. 피부 세포 등의 체세포, 통합 및 비 통합하는 다양한 기술을 사용하여 다 능성 상태로 유도 할 수있다. 이 세포는 조직 공학 또는 질병 연구를위한 환자 맞춤형 세포 소스 역할을합니다. 이들 세포에 원하지 않는 유전 물질의 통합은 여러 설명하고 서열하더라도 완전히 제거 iPSCs들이 11 유도되었던 세포 유형 향해 후생 유전 학적 &quot;메모리&quot;보존 나타날 우려이다. 이식 11 일 전에 분화되지 않는 경우 상기 세포는 생체 내에서 기형 종을 형성한다. 많은 분화 프로토콜 그러나, 분화의 끝에서 생성 된 세포 유형이 균일 및 O 아니라는 것을주의하는 것이 중요 상피 계통 (12, 13), (14)에 집중 조사되었다할수 있답니다 관심의 세포 유형의 일부를 소유한다. 이것은 낮은 수율 및 목적하는 세포 유형을 정제 할 필요성을 초래한다. iPSCs 잠재적 환자 별 셀 소스이지만, 처리는 조직 공학 또는 질병 조사 중 하나에 대한 관심의 세포 유형은 매우 비효율적이다 얻었다. 폐 15 유 16 17 소장, 결장 (18), 방광 (19) 및 식도 (20) : 인간 상피 세포가 성공적 포함한 인체에 질병 및 비 병변 조직 모두 다양한 분리되었다. 이는 일차 인간 세포 표현형 (21), (22)이 유지되는 통로 유한 수있는 것이 중요하다. 불행하게도,이 즉, 질병 조사 또는 설계 발판을 시드에 필요한 세포의 수주입 달성되지 않을 수 있습니다. 따라서, 새로운 기술은 여전히 ​​상피 표현형을 유지하면서 환자의 세포를 확대 할 필요가있다. 피더 세포와 ROCK 저해제를 이용하여 정상 및 암 상피 세포의 조건부 재 프로그래밍은 리우 등에 의해 2012 년에 설명했다. 2 3. 이 기술은 조사 된 피더 세포, 암 억제제 및 조건부 프로그래밍 매체를 이용하여 전립선 및 유방암의 생검에서 얻은 암성 상피 세포를 확장하는 데에 이용 하였다. 목표는 약물 검사 등의 체외 분석을위한 충분한 세포를 생성하는 것이 었습니다. 이 기술은 높은 증식하는 줄기 또는 선조 같은 상태를 &quot;리 프로그래밍&quot;이 무기한 세포 상피 세포를 확대 할 수있다. 이들 세포가 아닌 종양이며 기형 종 (23), (24)을 형성하는 능력을 갖고 있지 않는 것이 입증되었다. 또한, 아니염색체 이상 또는 유전자 조작이 기술 23, 24을 사용 문화에 이러한 세포를 계대 후 참석했다. 가장 중요한 것은, 이들 세포는 주목 원시 세포 유형으로 분화 할 수있다. 따라서,이 기술은 불멸화 없이도 질환 조사 또는 조직 공학을위한 환자 별 상피 세포의 큰 저장 용기를 제공한다. 질병 과정을 연구하기 위해 특정 기관의 상피 조직을 얻기 때문에, 환자의 위험을 가능 종종 한정되지 항상. 식도 질환 또는 결함을 앓고있는 환자의 경우, 내시경 생검 검색이 해리 조건이 환자의 식도 점막 고유 부정 셀 소스를 제공하기 위해 재 프로그램 될 수있는 상피 조직을 얻기위한 최소 침습적 방법이다. 이것은 다음 체외 연구 허용상피 세포의 잠재적 치료제에 대한 질병 프로세스와 화면을 평가합니다. 크게 이러한 접근법으로부터 이익을 얻을 수 한 질병 과정 식도 (8)의 알레르기 질환과 같은 설명했지만 호산구 식도염이다. 알레르기 시험뿐만 아니라 치료 방법은 환자 자신의 상피 세포를 사용하여 시험 관내에서 평가 될 수 있고,이 데이터는 개별 치료 계획을 수립하기 위해 치료 의사에 전달 될 수있다. 소아 환자에서 내시경 생검을 얻기과 함께 조건부 프로그래밍의 기술은 모든 환자에서 무기한 정상 식도 상피 세포를 확장 할 수있는 기능을 제공합니다. 이 셀 소스 따라서 결함, 질병이나 외상에 대한 환자 맞춤형 수술 옵션을 제공하는 천연 또는 합성 비계와 함께 협력 할 수있다. 무기한 세포 수를 갖는 것은 완전히 시드 가지고 식도 구조 엔지니어링 도움이 될 것이다위해 식도 상피 세포와 루멘하면 나머지 세포 유형의 재생을 촉진하는 데 도움.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="843">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">Primocin</td>
			<td style="width:172px;">InVivogen</td>
			<td style="width:119px;">ant-pm2</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">Isopentane</td>
			<td style="width:172px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">277258-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">Gelatin From Porcine Skin</td>
			<td style="width:172px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G1890-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">DMEM</td>
			<td style="width:172px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">Cryomold</td>
			<td style="width:172px;">TissueTek</td>
			<td style="width:119px;">4565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">Cryomatrix OCT</td>
			<td style="width:172px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">6769006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">15ml Conical Tubes</td>
			<td style="width:172px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C1017-p</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">Complete Keratinocyte Serum Free Medium</td>
			<td style="width:172px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10724011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td style="width:172px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">Glutamax</td>
			<td style="width:172px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">Insulin Solution</td>
			<td style="width:172px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I9278-5ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">Human Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td style="width:172px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">ROCK Inhibitor (Y-27632)</td>
			<td style="width:172px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">125410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">F-12 Medium&#160;</td>
			<td style="width:172px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:172px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">Dispase</td>
			<td style="width:172px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:172px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:172px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">100mm Dishes</td>
			<td style="width:172px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:119px;">T1110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">150mm Dishes</td>
			<td style="width:172px;">Denville Scientific</td>
			<td>T1115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">50ml Conicals</td>
			<td style="width:172px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:119px;">&#160; C1062-9&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">Phosphate Buffered Saline Tablets</td>
			<td style="width:172px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP2944-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">5ml Pipettes</td>
			<td style="width:172px;">Fisher Scientific</td>
			<td>1367811D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">10ml Pipettes</td>
			<td style="width:172px;">Fisher Scientific</td>
			<td>1367811E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">25ml Pipettes</td>
			<td style="width:172px;">Fisher Scientific</td>
			<td>1367811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">9&#34; Pasteur Pipettes</td>
			<td style="width:172px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:385px;">NIH 3T3 Cells</td>
			<td style="width:172px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL1658</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

conditional reprogramming of pediatric human esophageal epithelial cells for use in tissue engineering and disease investigation

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing various types of stem cells to derive cell types of interest is often costly, time consuming and highly inefficient. Furthermore, undesired cell types must be removed prior to using this cell source, which requires another step in the process. In order to obtain enough esophageal epithelial cells to engineer the lumen of an esophageal construct or to screen therapeutic approaches for treating esophageal disease, native esophageal epithelial cells must be expanded without altering their gene expression or phenotype. Conditional reprogramming of esophageal epithelial tissue offers a promising approach to expanding patient-specific esophageal epithelial cells. Furthermore, these cells do not need to be sorted or purified and will return to a mature epithelial state after removing them from conditional reprogramming culture. This technique has been described in many cancer screening studies and allows for indefinite expansion of these cells over multiple passages. The ability to perform esophageal screening assays would help revolutionize the treatment of pediatric esophageal diseases like eosinophilic esophagitis by identifying the trigger mechanism causing the patient's symptoms. For those patients who suffer from congenital defect, disease or injury of the esophagus, this cell source could be used as a means to seed a synthetic construct for implantation to repair or replace the affected region.

환자로부터 생검 식도 상피 세포를 단리의 주요 단계의 요약은도 1에 요약 하였다. 상피 세포의 콜로니는 약 4-5일에 형성되고 섬유 아세포의 피더 세포 (그림 2A)에 의해 포위됩니다. 이러한 식민지가 확장됨에 따라 그들은 더 큰 식민지 (그림 2B)를 형성하기 위해 다른 식민지로 병합합니다. 문화가 70 % 합류하게되면, 그들은 (그림 2C)를 확장 할 필요가있다. 섬유 아세포 전에 상피 세포를 제거하기 판에서 제거되는 것을 보장하기 위해, 0.05 % 트립신 EDTA는 피더를 제거하기 위해 최대 2.5 분 동안 사용됩니다. 피더의 부재는 2D 그림과 유사하게 나타납니다. 자기편 상피 세포를 0.25 % 트립신 - EDTA와 트립신 새로운 조사 피더 세포 (그림 2E)에 플레이 팅된다. <p class="jove_content" fo:keep-together.wi초기 생검 샘플에 비해 여전히 E 헤린 및 TJP1 표현을 유지하면서 얇은 페이지 = &quot;1&quot;&gt; QRT-PCR을 통한이 세포의 표현형 특성은 P63, 통로 (1)의 끝에서 전구 세포의 마커의 상향 조절을 입증 . 이것은 세포가 아닌 재 프로그래밍 세포에 비해 증식되어 더 전구 / 줄기 같은 상태로 &quot;재 프로그램&quot;되었음을 나타냅니다. 이들 세포는 조건부 프로그래밍 조건에서 촬영하고 정상 조직 배양 플레이트에 플레이 팅 될 때, P63 감소하고 TJP1 및 E-cadherin의 발현 (CDH1)는 (도 3a보다 분화 된 상피 세포에 전구 세포의 표현형의 변화를 보여주는 증대 ). 이러한 세포는 유동 세포 계측법 통해 상피 마커 통로 1 분석 하였다 세 환자에 존재하는 세포의 90 % 이상이는 EpCAM (도 3b)에 대해 양성이었다. 셀은 또한 통로 (1) 및 3에 면역을 통해 분석 하였다<html> 그 3 통로를 통해 표현형이 변경되지 않았습니다 확인합니다. 염색은 상피 마커 E-cadherin의의 지속성을 보여줍니다 (그림 4A-D), 전구 마커 P63 (그림 4E-H), 증식 마커 KI-67 (그림 4I-L)와 상피 꽉 접합 단백질 TJP1 (그림 4M-P ). 마지막으로, 성장 곡선 조건부 프로그래밍 배양이 세포의 배가 시간을 평가하는 비 질환 환자의 세포주를 플롯 하였다. 세포는 일 0시 10 세포에서 도금하고, 하루 4 (그림 5)에서 단지 약간 500,000 셀 것으로 밝혀졌다. 배수 시간은 약 36 ~ 40 시간으로 계산되었다. 병든 세포 그러나, 모든 환자는 개인차 고려하여 개별적으로 평가되어야 느린 배가 시간을 가질 것으로 예상된다. 1 &quot;&gt; <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55243/55243fig1.jpg" /> 그림 1 : 소아 생검에서 분리 및 배양 인간의 식도 상피 세포의 개요. 생검 동의 후 소아로부터 수득하고 실험실 각화 세포의 무 혈청 배지에서 전송된다. 이러한 생검 후 멸균 면도날로 조직을 잘게 썰고 최종적으로 0.05 % 트립신 EDTA로 처리 하였다 디스 파제 1 U / ㎖로 처리된다. 세포 현탁액을 조건부 프로그래밍 매체에 조사 피더 세포에 첨가한다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55243/55243fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55243/55243fig2.jpg" /> 그림 2 : 배양과 인간의 식도 상피 세포를 확장. 조건부 리 프로그램 5 일 후밍 매체는 식도 상피 세포는 결국 큰 콜로니 (B)를 형성하도록 수렴 작은 조약돌 콜로니 (A)를 형성하기 시작한다. 조직 배양 접시 (C) 70 % 컨 플루 언스에 도달하면, 플레이트 여전히 상피 세포 (D)의 밀착성을 유지하면서, 피더 세포를 제거하기 위해 0.05 % 트립신 EDTA으로 아주 짧은 시간 동안 처리한다. 상피 세포를 0.25 % 트립신 -EDTA를 제거하고 새로운 피더 세포로 플레이 팅한다. 이 세포들이 새로운 식민지를 형성하고 확산 계속 (E)를 분리 한 후 불과 24 시간. 배율은 100 배입니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55243/55243fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55243/55243fig3.jpg" /> 그림 3 : 유동 세포 계측법 및 QRT-P문화에 확장 된 세포의 CR 분석. (A) 조건부 프로그래밍 통과 한 배양 한 세포의 대표적인 유전자 발현 P63 식 6 배 증가, 전구 세포의 마커뿐만 아니라 생검 유전자 발현에 비해 상피 마커 CDH1 및 TJP1의 감소를 보였다. 이 세포 집단이 더욱 전구와 같은 상태에 있고, 따라서 더 높은 증식이다 나타낸다. (피더 세포와 ROCK 억제제의 제거 후) 유전자의 발현을 24 시간 후 - 프로그래밍은 CDH1 및 TJP1 발현하지만 P63 발현의 감소를 증가 보여준다. (B) 1 통로에서 얻어진 여러 환자로부터 세포 계측법 분석 플로우는 EpCAM을 발현하는 세포의 90 % 이상을 보여준다. 환자 (26, 28)가 삼킴 환자 세포 동안 환자 (27)는 비 삼킴 환자의 세포를 나타낸다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55243/55243fig3large.jpg" target="_blank">t 여기를 클릭하십시오</a>오이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55243/55243fig4.jpg" /> 도 4 : 조사 피더 세포 리 프로그래밍 조건 배지에서 배양 한 구절에서 셀 및 3. 세포의 면역 형광 염색 익스프레스 E-cadherin의 (A - D)뿐만 아니라 전구 마커 P63 (E - H). 이 세포는 여전히 통로 (3) (- L I)에서 증식한다. 마지막으로,이 세포는 상피 표현형 (- P M)과 일치 꽉 접합 단백질 1 (TJP1)을 표현한다. 핵은 DAPI (파란색)으로 대조되는 항체는 알렉사 형석 546 항체 (오렌지)를 사용하여 검출된다. 2 차 항체 (AB) 제어는 조직 (Q, R)에 대한 이차 항체의 비특이적 결합을 나타낸다. 스케일 바 = 50μm의. 배율은 200X이다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55243/55243fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/55243/55243fig5.jpg" /> 그림 5 : 조건부 재 프로그래밍에서 세포의 성장 곡선. 비 질환 환자로부터 조건부 프로그래밍 매체 세포 정해진 밀도로 시딩 세 4 일 동안 매일 집계 하였다 복제 하였다. 성장 곡선은 약 4 주 0 주 및 이들 세포의 배가 시간으로 얻어진 수치에 기초하여 산출 한 시간을 36 ~ 40 시간이되는 세포 수를 사용 배가 생성되었다. 오차 막대는 표준 오류를 나타냅니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55243/55243fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Conditional Reprogramming of Pediatric Human Esophageal Epithelial Cells for Use in Tissue Engineering and Disease Investigation

조건부 재 프로그래밍을 이용하여 인간의 소아 식도 상피 세포의 확장 결함이나 부상을 치료 및 치료 심사 분석을위한 저수지 역할을하는자가 이식을 위해 식도 구조 엔지니어링에 이용 될 수있는 셀의 환자 별 인구와 수사관을 제공합니다.

조직 공학 및 질병 조사에있는 사용을위한 소아 인간의 식도 상피 세포의 조건부 재 프로그래밍

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing ...

conditional-reprogramming-pediatric-human-esophageal-epithelial-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.9K 조회수.  UConn Health.  조건부 재 프로그래밍을 이용하여 인간의 소아 식도 상피 세포의 확장 결함이나 부상을 치료 및 치료 심사 분석을위한 저수지 역할을하는자가 이식을 위해 식도 구조 엔지니어링에 이용 될 수있는 셀의 환자 별 인구와 수사관을 제공합니다. 

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Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own body. The ability to grow bone de novo using a patient's own cells would allow bony defects to be filled with adequate tissue without the morbidity of harvesting native bone. There is interest in the use of adipose-derived stromal cells (ASCs) as a source for tissue engineering because these are obtained from an abundant source: the patient's own adipose tissue. However, ASCs are a heterogeneous population and some subpopulations may be more effective in this application than others. Isolation of the most osteogenic population of ASCs could improve the efficiency and effectiveness of a bone engineering process. In this protocol, ASCs are obtained from subcutaneous fat tissue from a human donor. The subpopulation of ASCs expressing the marker BMPR-IB is isolated using FACS. These cells are then applied to an in vivo calvarial defect healing assay and are found to have improved osteogenic regenerative potential compared with unsorted cells.

Adipose-derived stromal cells may be useful for engineering new tissue from a patient's own cells. We present a protocol for the isolation of a subpopulation of human adipose-derived stromal cells (ASCs) with increased osteogenic potential, followed by application of the cells in an in vivo calvarial healing assay.

BMPR-IB +의 신속한 격리 두개골 결함 치유 모델에서 사용을위한 기질 세포를 지방이는 유래

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own ...

연구

발생학

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Mouse Secondary Palate Fusion의 라이브 이미징

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

수평 한 전체적인 거치 : 피부의 두껍고, 3 차원 조직 단면도를위한 비발 한 가공 그리고 화상 진찰 의정서

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and pathological processes, such as cancer and ageing. Recently, senescence has also been implicated in tissue repair and regeneration. Therefore, it has become increasingly critical to identify senescent cells in vivo. Senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) assay is the most widely used assay to detect senescent cells both in culture and in vivo. This assay is based on the increased lysosomal contents in the senescent cells, which allows the histochemical detection of lysosomal &#946;-galactosidase activity at suboptimum pH (6 or 5.5). In comparison with other assays, such as flow cytometry, this allows the identification of senescent cells in their resident environment, which offers valuable information such as the location relating to the tissue architecture, the morphology, and the possibility of coupling with other markers via immunohistochemistry&#160;(IHC). The major limitation of the SA-&#946;-Gal assay is the requirement of fresh or frozen samples.
Here, we present a detailed protocol to understand how cellular senescence promotes cellular plasticity and tissue regeneration in vivo. We use SA-&#946;-Gal to detect senescent cells in the skeletal muscle upon injury, which is a well-established system to study tissue regeneration. Moreover, we use&#160;IHC to detect Nanog, a marker of pluripotent stem cells, in a transgenic mouse model. This protocol enables us to examine and quantify cellular senescence in the context of induced cellular plasticity and in vivo reprogramming.

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Here we present a detailed protocol to detect both senescent and pluripotent stem cells in the skeletal muscle upon injury while inducing in vivo reprogramming. This method is suitable for evaluating the role of cellular senescence during tissue regeneration and reprogramming in vivo.

부상-유도 노화 및 골격 근육에서 프로그래밍을 Vivo에서 의 평가

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted in sophisticated in vitro models of the intestinal mucosa. Leveraging these emerging model systems will require adaptation of tools and techniques developed for 2D culture systems and animals. Here, we describe a technique for measuring epithelial barrier permeability in human intestinal organoids in real-time. This is accomplished by microinjection of fluorescently-labeled dextran and imaging on an inverted microscope fitted with epifluorescent filters. Real-time measurement of the barrier permeability in intestinal organoids facilitates the generation of high-resolution temporal data in human intestinal epithelial tissue, although this technique can also be applied to fixed timepoint imaging approaches. This protocol is readily adaptable for the measurement of epithelial barrier permeability following exposure to pharmacologic agents, bacterial products or toxins, or live microorganisms. With minor modifications, this protocol can also serve as a general primer on microinjection of intestinal organoids and users may choose to supplement this protocol with additional or alternative downstream applications following microinjection.

This protocol describes the measurement of epithelial barrier permeability in real-time following pharmacologic treatment in human intestinal organoids using fluorescent microscopy and live cell microscopy.

인간의 장 Organoids에 상피 장벽 침투성의 실시간 측정

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

성인 피부 조직에서 기본 인간의 Keratinocytes를 분리 하는 단순 하 고 효율적인 방법

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Na&#239;ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Na&#239;ve human pluripotent stem cells (N-hPSC) with improved functionality may have a wide impact in regenerative medicine. The goal of this protocol is to efficiently revert lineage-primed, conventional human pluripotent stem cells (hPSC) maintained on either feeder-free or feeder-dependent conditions to a na&#239;ve-like pluripotency with improved functionality. This chemical na&#239;ve reversion method employs the classical leukemia inhibitory factor (LIF), GSK3&#946;, and MEK/ERK inhibition cocktail (LIF-2i), supplemented with only a tankyrase inhibitor XAV939 (LIF-3i). LIF-3i reverts conventional hPSC to a stable pluripotent state adopting biochemical, transcriptional, and epigenetic features of the human pre-implantation epiblast. This LIF-3i method requires minimal cell culture manipulation and is highly reproducible in a broad repertoire of human embryonic stem cell (hESC) and transgene-free human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. The LIF-3i method does not require a re-priming step prior to the differentiation; N-hPSC can be differentiated directly with extremely high efficiencies and maintain karyotypic and epigenomic stabilities (including at imprinted loci). To increase the universality of the method, conventional hPSC are first cultured in the LIF-3i cocktail supplemented with two additional small molecules that potentiate protein kinase A (forskolin) and sonic hedgehog (sHH) (purmorphamine) signaling (LIF-5i). This brief LIF-5i adaptation step significantly enhances the initial clonal expansion of conventional hPSC and permits them to be subsequently na&#239;ve-reverted with LIF-3i alone in bulk quantities, thus obviating the need for picking/subcloning rare N-hPSC colonies later. LIF-5i-stabilized hPSCs are subsequently maintained in LIF-3i alone without the need of anti-apoptotic molecules. Most importantly, LIF-3i reversion markedly improves the functional pluripotency of a broad repertoire of conventional hPSC by decreasing their lineage-primed gene expression and erasing the interline variability of directed differentiation commonly observed amongst independent hPSC lines. Representative characterizations of LIF-3i-reverted N-hPSC are provided, and experimental strategies for functional comparisons of isogenic hPSC in lineage-primed vs. na&#239;ve-like states are outlined.

We present a protocol for efficient, bulk, and rapid chemical reversion of conventional lineage-primed human pluripotent stem cells (hPSC) into an epigenomically-stable na&#239;ve preimplantation epiblast-like pluripotent state. This method results in decreased lineage-primed gene expression and marked improvement in directed multilineage differentiation across a broad repertoire of conventional hPSC lines.

향상 된 Multilineage 차별화 힘으로 순진한 같은 상태로 기존의 인간의 Pluripotent 줄기 세포의 화학 귀선

Na&#239;ve human pluripotent stem cells (N-hPSC) with improved functionality may have a wide impact in regenerative medicine. The goal of this protocol is ...

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms of retinitis pigmentosa (RP) and age-related macular degeneration (AMD). Cell therapy is one of the most promising therapeutic strategies proposed to cure these diseases, with already encouraging preliminary results in humans. However, the method of preparation of the graft has a significant impact on its functional outcomes in vivo. Indeed, RPE cells grafted as a cell suspension are less functional than the same cells transplanted as a retinal tissue. Herein, we describe a simple and reproducible method to engineer RPE tissue and its preparation for an in vivo implantation. RPE cells derived from human pluripotent stem cells are seeded on a biological support, the human amniotic membrane (hAM). Compared to artificial scaffolds, this support has the advantage of having a basement membrane that is close to the Bruch&#39;s membrane where endogenous RPE cells are attached. However, its manipulation is not easy, and we developed several strategies for its proper culturing and preparation for grafting in vivo.

We describe a method to engineer a retinal tissue composed of retinal pigment epithelial cells derived from human pluripotent stem cells cultured on top of human amniotic membranes and its preparation for grafting in animal models.

인간 배아 줄기 세포에서 파생 된 이식 적합 한 망막 색소 상피 조직 공학

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative therapeutic requires a safe, robust, and expedient reprogramming protocol. Here, we present a clinically relevant, step-by-step protocol for the extremely high-efficiency reprogramming of human dermal fibroblasts into iPSCs using a non-integrating approach. The core of the protocol consists of expressing pluripotency factors (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, NANOG, OCT4-MyoD fusion) from in vitro transcribed messenger RNAs synthesized with modified nucleotides (modified mRNAs). The reprogramming modified mRNAs are transfected into primary fibroblasts every 48 h together with mature embryonic stem cell-specific microRNA-367/302 mimics for two weeks. The resulting iPSC colonies can then be isolated and directly expanded in feeder-free conditions. To maximize efficiency and consistency of our reprogramming protocol across fibroblast samples, we have optimized various parameters including the RNA transfection regimen, timing of transfections, culture conditions, and seeding densities. Importantly, our method generates high-quality iPSCs from most fibroblast sources, including difficult-to-reprogram diseased, aged, and/or senescent samples.

Here we describe a clinically relevant, high-efficiency, feeder-free method to reprogram human primary fibroblasts into induced pluripotent stem cells using modified mRNAs encoding reprogramming factors and mature microRNA-367/302 mimics. Also included are methods to assess reprogramming efficiency, expand clonal iPSC colonies, and confirm expression of the pluripotency marker TRA-1-60.

인간의 기본 섬유 아 세포의 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍 RNA 기반

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...