저자는이 연구에 임상 자료를 공헌 한 자원 봉사자에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 모든 임상 자료의 수집을위한 보건 임상 의학, 의학 / 호흡기 의학 전공, 대학 병원, 우메 (Norrlands의 universitetssjukhus)의 부서의 직원들에게 감사하다. 이 작품은 스웨덴 연구 협의회, 스웨덴 심장 - 폐 재단, 전략적 연구를위한 스웨덴 재단과 카롤린스카 연구소에서 AS-S에 보조금에 의해 지원되었다.

참고 :이 연구는 우메 아, 스웨덴의 지역 윤리 심의위원회에 의해 승인되었다. 인간의 주제에서 샘플링 기관지 생검 1. 기관 지경 <ol><li> 모든 참가자의 동의를 얻습니다. </li><li> 경구 용 미다 졸람 (4-8 mg) 및 정맥 glycopyrronium (0.2-04 mg을)를 기관지 전에 30 분으로 주제를 취급합니다. 후두와 기관지에 리도카인으로 국소 마취를 적용합니다. 리도카인 4 % ~ 3 ㎖와 제목 양치질을하자 혀베이스와 후두 주사기를 통해 후두에 3 ㎖를 적용합니다. 리도카인 스프레이의 8-10 투여와 국소 마취를 최적화합니다. 제목 앉아이 단계를 수행합니다. </li><li> 앙와위에서 주제와 플라스틱 마우스 피스를 통해 입을 통해 유연한 비디오 기관 지경을 삽입합니다. 기관 지경을 통해 말단 기관 및 기관지의 국소 마취를 완료 할 목적으로 만든 스프레이 카테터를 사용합니다. 여기에, 약의 복용량을 사용리도카인 2 % ~ 10 mL로. </li><li> 6-9 주 카리나에서 기관지 점막 생검과 유창 집게를 사용하여 주 기관지 부문 (그림 1) 가져 가라. 기관지 내시경을 다음과 병원을 떠나기 전에, 2-4 시간 동안 주제 나머지를하자 가벼운 식사와 함께 그를 / 그녀를 제공합니다. </li></ol> 2. 글리콜 메틸 아크릴 레이트 (GMA) 수지의 생검을 포함하기 주 : GMA의 면역 프로토콜은 원래 사우 샘프 턴 대학, 조직 화학 연구 (17)에서 개발되었다. <ol><li> 고정 : 면역 조직 화학 법의 경우, 집게로부터 생검을 제거하고 (얼음 - 냉각 탈수 아세톤 및 프로테아제 저해제 3 ㎖을 함유하는 유리 병에 직접 페닐 메틸 술 포닐 플루오 라이드 (35 밀리그램 / 100 ml의 아세톤)을 넣고 요오도 아세트 아미드 (370 밀리그램 / 100 ml의 아세톤 )). -20 ° C (그림 2)에서 하룻밤 조직을 수정합니다. 참고 : 다음 단계를 PERFO한다적절한 니트릴 장갑 흄 후드에서 rmed. 매립 키트 과민, 자극, 및 / 또는 알레르기 성 피부 반응을 일으킬 수있는 구성 요소가 포함되어 있습니다. 모든 폐기물은 유해 폐기물로 폐기되어야합니다. </li><li> 탈수 : 억제제와 아세톤을 제거하고 실온에서 15 분 (RT)에 대한 (억제제)없이 신선한 탈수 아세톤으로 교체합니다. 아세톤을 제거하고 15 분 동안 메틸 벤조 에이트로 교체합니다. </li><li> 침투 : 글리콜 메타 크릴 레이트 단량체의 5 % 메틸 벤조 에이트 용액의 처리 액을 준비한다; 10 ㎖ 바이알 한 충분하다. 메틸 벤조 에이트 용액 오프 플라스틱 파스퇴르 피펫 흡입을 이용하여 처리 액 3ml를 교체. 생검 2 시간 동안 4 ° C에서 초과 처리 솔루션을 품어; 파스퇴르 피펫 용액 매립 포함한 모든 후속 용액 변화에 사용될 수있다. </li><li> 처리 액마다 2 시간 (3X 2 시간 인큐베이션)이므로 생체의 합계 함침 시간을주고처리 액에 psies 적어도 6 시간이다. 생검을 식별하기 위해 삽입 캡슐의 상단에 종이 라벨을 삽입합니다. </li><li> 글리콜 메타 크릴 레이트 단량체를 10 ml의 75 mg의 벤조일 퍼 옥사이드 매립 용액을 제조 하였다. 중합 반응을 시작하기 위해 매립 용액에 N, N -dimethylaniline 폴리 (에틸렌 옥사이드) 0.25 ㎖ (가속기)를 추가한다. 처리 액을 제거하고 집게를 사용하여 관련 매립 캡슐에 한 생검을 놓는다. </li><li> 천천히 솔루션을 포함로 가기 포함 캡슐을 채우고 뚜껑을 닫습니다. 생검을 방해하고 큰 공기 방울을 생성하지 마십시오. 수지가 완전히 중합 될 때까지 4 ℃에서 캡슐을 품어. </li><li> 실리카겔 약 5g을 함유하는 50 ㎖ 튜브에서 -20 ° C에 보관 매립 생검. </li></ol> GMA 내장 기관지 생검 3. 단면 <ol><li> 현미경 슬라이드 코팅 : A의 현미경 슬라이드를 씻으정상주기에 식기 세척기. 슬라이드를 덮고 건조 공기로 할 수 있습니다. </li><li> 증류수 10 % 폴리 -L- 리신 (PLL) 용액의 도포 액을 준비한다. 5 분 동안 코팅 용액의 슬라이드 잠수함, 다음 그들에게 자연 건조를 할 수 있습니다. 원래 상자에 건조 PLL 코팅 된 슬라이드를 저장합니다. </li><li> 증류수에 0.1 %의 트윈 20을 시트 유리 스트립을 씻으십시오. 종이 타월로 70 % 에탄올 건조와 유리를 씻어. 칼 메이커를 사용하여 유리 스트립 유리 블레이드를 잘라. 절삭 날이 손상되거나 흠집되지 않도록 이동을 방지 용기에 블레이드를 저장한다. </li><li> 생검 트리밍 : 캡슐 분배기의 생검 캡슐을 놓고 탄소 강철 단일 에지 블레이드를 사용하여 각면을 잘라. GMA 내장 조직 검사를 제거하고 그 단단히 놓습니다. 철강 블레이드를 사용하여 조직 검사 주위에서 초과 GMA을 낸다. </li><li> GMA의 단면. <ol><li> 증류수 0.05 % 암모니아 용액을 준비합니다. 일에서 유리 나이프와 조직 검사를 배치전자 마이크로톰. 조심스럽게 블레이드 블록의 표면에 대해 평평하게 걸쳐 지도록 나이프 홀더 생검 블록의 각도를 조절함으로써 블레이드 생검 블록 정렬. </li><li> 느린 절단 속도에 마이크로톰을 사용하여 2 μm의 두께 부분을 잘라 전송하고 암모니아수에 섹션을 떠 집게를 사용합니다. 부드러운 항원 검색을 허용하고 섹션의 전개, 45-90 초 동안 섹션을 플로트. </li><li> 현미경 슬라이드에 섹션을 선택합니다. 빨리 톨루이딘 블루 염색에 의해 생검 조직 검사를 확인합니다. </li><li> 50 ° C에 핫 플레이트 세트에 슬라이드를 건조 및 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 섹션을 여과 톨루이딘 블루 염색의 500 μl를 적용합니다. 녹색 링이 얼룩의 가장자리에 등장하기 시작할 때까지 뜨거운 접시에 절을 따뜻하게 한 다음 물로 씻어 내십시오. </li><li> 광학 현미경을 사용하여, 생검 조직 검사를 확인합니다. 면역 조직 화학 염색에 사용되는 섹션은 손상되지 않은 얇은 판의 좋은 부분을 포함해야적은 수의 분비 가능한 한 작은 평활근과 고유 층과는 상피. </li><li> 섹션 3.4.2에서와 같이, 좋은 조직학이 부분을 절단 및 면역 조직 화학 염색을위한 PLL 코팅 현미경 슬라이드로를 선택합니다. 분석을 위해 각 조직 검사에서 적어도 두 부분을 잘라. 적어도 1 시간 동안 건조 슬라이드. 건조 후, 절편 주석 호일로 래핑 할 수 있고, 최대 2 주 동안 -20 ℃에서 보관하거나 즉시 면역 염색 할 수있다. </li></ol></li></ol> GMA 내장 기관지 생검 4. 면역 조직 화학 염색 주 : 아 지드 화 나트륨은 독성이있다. 흄 후드 내의 0.1 % 나트륨 아 지드의 용액을 제조하고 산으로부터 멀리. 산에 접촉하면 유독 가스를 방출합니다. <ol><li> 다이아몬드로 만들어진 펜을 사용하여 섹션을 주위에 그려 염색 선반 위에 슬라이드를 정렬합니다. </li><li> 퍼 옥시 다제 블록을 수행합니다. 0.1 % 아 지드 화 나트륨 용액에 0.3 %의 과산화수소를 퍼 옥시 다제 블록 용액을 제조 하였다. 출원Y 1 부에 퍼 옥시다아제 블록 ㎖를 30 분 동안 배양한다. </li><li> 0.05 M 트리스 완충 식염수 (TBS), 산도 7.6의 세척 용액을 준비합니다. , TBS에서 3 배 5 분 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> DMEM의 1 % BSA 블록 솔루션을 준비합니다. 사전에 큰 볼륨, 나누어지는에서이 작업을 수행하고 필요한 때까지 동결. 슬라이드 드레인 비특이적 결합 된 항체를 차단하는 블록을 30 분 동안 용액 중에서 섹션을 배양한다. 비특이적 결합은 여전히 ​​발생하면, 이차 항체와 같은 종으로부터의 5 % 혈청 블록과 함께 30 분간 배양 단계를 포함한다. </li><li> (:; 따라 CD1a 1로 희석 1,000 : 1,00 1 희석 CD45) 및 슬라이드에 적용하여 원하는 농도로 TBS에서 차 항체 (CD45 또는 따라 CD1a)를 희석. 섹션을 커버 슬립과 RT에서 밤새 품어. </li><li> TBS에서 세 번 슬라이드를 씻으십시오. (TBS에서 원하는 농도 (2)이 경우, 토끼 항 마우스 F (AB &#39;에서 일차 항체 숙주 종에 대해 유도) 1:30 비오틴 차 항체 희석0 희석)과 슬라이드에 적용됩니다. 실온에서 2 시간 동안 품어. </li><li> 사용하기 전에 스트렙 타비 딘 비오틴 - 퍼 옥시 다제 복잡한 적어도 30 분을 준비합니다. 모든 슬라이드를 커버하기에 충분 있는지 확인하십시오. TBS에서 세 번 슬라이드를 씻으십시오. 슬라이드에 대한 해결책을 적용하고 실온에서 2 시간 동안 품어. </li><li> TBS에서 세 번 슬라이드를 씻으십시오. 3- 아미노 9 에틸 카바 졸 (제조업체의 지침에 따라 제조) (AEC) 퍼 옥시 다제 기질 용액을 준비합니다. 슬라이드에 적용하고 20 ~ 30 분 동안 또는 원하는 얼룩 강도가 개발 될 때까지 배양한다. </li><li> 5 분 동안 수돗물을 실행에 슬라이드를 씻어. 2 분 동안 여과 마이어의 헤 마톡 솔루션 섹션을 Counterstain과. 5 분 동안 수돗물을 실행에 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 슬라이드를 배출하고 영구적 인 수성 장착 매체와 섹션을 커버한다. 건조 오븐에서 80 ℃에서 슬라이드를 건조. 슬라이드 냉각 한 다음 DPX로 장착하고 커버 슬립을 배치 할 수 있습니다. </li></ol> 5. 세인트aining 분석 <ol><li> 컴퓨터에 연결 탑재 된 카메라로 광학 현미경을 사용하여 40X 배율 섹션을 분석합니다. 참고 : 세포 분석을 위해 적극적으로 부드러운 근육, 동맥, 큰 혈관과 일치하지 않는 또는 손상된 조직의 영역을 제외하고, 기관지 점막 고유 그대로 상피 세포 내 핵 세포를 염색 카운트. </li><li> 세포 수를 평균 고유 층의 면적 및 상피의 길이에 대한 평균 세포 수를 수정한다. 고유 판 및 상피의 길이의 영역은, 화상 해석 프로그램을 사용하여 계산 될 수있다. </li></ol> 기관지 생검 6. 효소 소화 <ol><li> 세탁기 생검 : 행크 완충 식염수 용액 (HBSS) (도 3) 10 ㎖를 함유하는 15 ml의 원추형 튜브에 무균 핀셋 장소 생검 그대로 사용. 30 rpm에서 락을 플랫폼에서 RT에서 5 분 동안 품어. 멸균 D에 조직 검사로 이동HBSS로 15ml의 튜브의 함유량을 경사하여 틱. </li><li> DTT와 점액을 중단 : 5 mM의 1,4- 디티 오 트레이 톨 (DTT)를 포함 HBSS 10 ㎖로 튜브의 HBSS를 교체합니다. 멸균 집게를 사용하여 15 ML 튜브에 다시 조직 검사를 전송합니다. 30 rpm에서 락 플랫폼에서 실온에서 15 분 동안 품어. </li><li> 15 초 동안 부드럽게 튜브를 소용돌이. HBSS DTT와 함께 15 ml의 튜브의 함유량을 경사 분리하여 멸균 접시 상 생검을 전송. </li><li> 문화 매체에 조직 검사를 전송 : RPMI 1640 배지 10 ㎖로 튜브의 HBSS과 DTT를 교체합니다. 멸균 집게를 사용하여 15 ML 튜브에 다시 조직 검사를 전송합니다. 30 rpm에서 락 플랫폼에서 실온에서 10 분 동안 품어. </li><li> 콜라게나 제와 DNase의와 생검을 소화. <ol><li> 1 M HEPES 용액을 함유하는 예비 가온 RPMI에서 콜라게나 제 II (0.25 ㎎ / ㎖)과의 DNase (0.2 ㎎ / ㎖)의 분해 용액을 제조 하였다. 48 웰 조직 숭배에 500 μL 잘 당 소화 용액 추가URE 판. </li><li> 소화 용액 아니라 당 조직 검사를 놓습니다. 220 rpm에서 37 ° C에서 60 분 동안 진탕 플랫폼에서 접시를 품어. 피펫 30 분의 생검을 재 분산 한 후 아래로, 그리고 60 분 후가 완전히 조직들을 분해한다. </li></ol></li><li> 단일 세포 현탁액을 준비. <ol><li> 함께 수영장 40 μm의 셀 스트레이너를 통과하여 50 ㎖ 튜브에 우물에서 소화 생검. 얼음처럼 차가운 FACS 완충액 (인산염 완충 식염수 (PBS)를 함유하는 2 % 소 태아 혈청)으로 웰을 세척하여 잔여 세포를 수집한다. </li><li> 주사기의 플런저의 뒷면을 사용하여 세포 여과기에 남아있는 조직을 짠다. 4 ℃에서 5 분 동안 400 XG에서 소화 세포를 원심 분리기. 조심스럽게 상층 액을 제거하고 얼음 - 냉각 된 FACS 완충액 5 ㎖에 펠렛을 재현 탁. 수동으로 세포의 생존력을 평가하기 혈구 및 트립 판 블루 염색을 이용하여 세포 수를 계산. </li></ol></li></ol><ol><li> FACS 완충액 200㎕를 약 1 × 106 세포의 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 죽은 세포 배제에 대한 세포 생존 염료를 추가합니다. </li><li> 의 FcR 차단 시약의 5 ​​μl를 추가하고 4 ℃에서 5 분 동안 품어. </li><li> , CD16 (0.5 μL), HLA-DR (3 μL)의 CD11c (5 μL), CD123, CD45 (2 μL), 계보 (2 ㎕를 각 CD3, CD20, CD56, CD66abce 및 CD14)에 대한 세포 표면 항체 추가 (5 μL), CD1c (3 μL), 및 CD103 (2 μL), 4 ℃에서 15 분 동안 품어. 항체에 대한 세부 사항은 방법 섹션에서 찾을 수 있지만, 사용 사이토 정확한 흐름에 항체를 적정하고 최적화 할 수 있습니다. 400 X g에서 5 분 동안 PBS로 여분의 항체를 씻으십시오. 사이토의 흐름에 신선한 샘플을 취득 이상 acquisit 이전에 1 % 파라 포름 알데히드의 세포를 고정이온. </li><li> 분석 (18) (그림 4) 세포 계측법 흐름을 사용하여 폐 조직 검사에서 인간의 수지상 세포를 식별합니다. 주 : 분석 소프트웨어 유세포를 사용하여, 면역 세포가 CD45에 게이팅하여 다른 폐 세포로부터 구별된다. 죽은 세포는 LIVE / DEAD 염료에 대한 긍정적 인 세포로 제외 할 수 있습니다. 모든 살아있는 CD45 + 세포 계통 세포 (B 세포, T 세포, NK 세포, 호중구 및 단핵 세포)의 한 채널에서 CD20, CD3, CD56, CD66abce, CD14 및 CD16에 대한 항체의 칵테일을 사용하여 배제 할 수있다. , HLA-DR + 세포가 인간의 모든 DC가의 식별을 허용 할 것을 다음과 같습니다. 이 중 CD11c MDC에 발현하는 CD11c 또는 각각의 부재에 기초하여 올라가고 구별 될 수있다. MDC에 더 CD1c + MDC에 또는 CD141 +로 나눌 수 있습니다. </li></ol>

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<li>Saeys, Y., Gassen, S. V., Lambrecht, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+flow+cytometry%3A+helping+to+make+sense+of+high-dimensional+immunology+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Computational flow cytometry: helping to make sense of high-dimensional immunology data.</a> Nat Rev Immunol. 16 (7), 449-462 (2016).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

이 논문은 면역 조직 화학 염색을 이용하여 건강한 인간의 폐 조직 상주 수지상의 상세한 공간 및 표현형 특성을 생성하고 기관지 동안 수집 된 기관지 점막 생검에 유동 세포 계측법하는 방법에 대해 설명합니다. 다음 단락에서 프로토콜의 중요한 단계를 자세히 설명합니다. 프로토콜과 중요한 단계 단면 및 면역 : 그것은 그들이 (단계 2.5)를 사용하지 않는 경우 -20 ℃에서 생검 블록을 유지하는 것이 중요하다. 따뜻한 블록 때로는 부드러운 될 수 있습니다 및 섹션도하지 않습니다. 또한, -20 ° C에서 블록을 유지하는 항원 부위를 보존하고 면역 조직 화학 염색을 사용하여 더 초래할 것이다. 단면 및 면역 조직 화학 다음 GMA 내장 조직 검사를 절편 때,에 섹션을 떠 할 수 암모니아수 3-4 용기가 편리합니다. 섹션이 포착되고, 엄마신선한 섹션 (단계 3.4)로 교체해야 애. 이것은 그 부분을 다시 처리 시간으로,이 항원 제시 및 후속 면역 조직 화학 에이즈 시간의 약 올바른 길이 (45-90 초)에 대한 암모니아 물에 떠있는 한 것이라고 보장합니다. 이러한 방식으로 2 ㎛의 섹션을 절단하는 것도 동일한 셀 잠재적으로 다른 세포 표면 또는 세포 마커로 염색 될 수 있다는 것을 의미 연속 절편, 허용한다. 이 때 절편이 쉽게 손상 될 때, 유리 블레이드의 절삭 에지를 건드리지 않는 것이 중요하다. 제거해야 블레이드로부터 이물질이있는 경우, 항상 얻어 절삭 에지로부터 브러시. 효소 분해 및 유동 세포 계측법 : 면역 세포가 드물다 조직 샘플에서 처음 추가로 식별 DC가 또는 관심의 다른 면역 세포 전에 (소수) 백혈구를 식별하는 흐름 염색 패널에서 CD45을 포함하는 것이 중요합니다. 또한, &quot;Fluorescence 뺀 &quot;또는 이소 컨트롤은 소음을 통해 진정한 신호 드문 이벤트를 확인하는 데 사용되는 항체 패널의 유효성을 검사하는 동안 포함 중요하다. 수정 및 문제 해결 단면 및 면역 : 면역 세포에 의해 발현 대부분 세포 마커, 편도 조직 좋은 양성 대조군으로 사용할 수 있으며, 한정 기관지 생검 재료 (4 단계)를 낭비하지 않도록하기 위하여 면역 조직 화학에 대한 항체를 적정하기. 수지상 돌기 과정을 시각화, 조직보다는 수직으로 점막 (21)을 통해보다 상피 평행하게 절단 할 수있다. 사용자가 다른 바탕색 필요한 경우 기타 퍼 옥시 다제 기질, 예컨대 DAB 등 AEC에 더하여 사용될 수있다. 아비딘 / 바이오틴, 효소 복합체는 알칼리 포스 파타 아제, 예를 들면, 치환 될 수있다. 효소 분해 및 유동 세포 계측법 : 결국 있지만obronchial 생검 조직 상주 세포는 유세포 분석을 위해 단일 세포 현탁액으로 효소 소화 처리 후에도, (도 3) 작다. 그러나, 항체 패널 유동 세포 계측법에 사용되는 얼룩의 효소의 잠재적 인 영향을 평가하는 것이 중요하다. 효소 소화 프로토콜 절단 오프, 변형하거나, 또는 항체 염색을 방해, 말초 혈액 단핵 세포와 유사한 마커를 발현보다 쉽게 ​​접근 세포, 소화 효소 (단계 6)의 여부를 처리 할 수 ​​있는지 여부를 테스트하고하려면 이후에 의한 형광 표지 항체로 염색 및 유동 세포 계측법 (7 단계)로 분석 할 수 있습니다. 콜라게나 제와 DNase의이 항원의 가용성을 방해하지 않는 경우, 또는 효소로 세포의 치료없이 얼룩은 유사합니다. 또한,이 인터넷 (유세포 모두 사용하여 확인뿐만 아니라, 조직 절편하고 면역 조직 화학을 그대로 수gures 2-3) 19. 기술의 한계 기관지 대부분의 건강한 사람 잘 기관지를 허용하고, 일상적으로 여기 (단계 1)에 기술 된 바와 같이 검사 및 기관지 점막 생검을 수집 포함한 폐를 샘플링하기 위해 사용하는 방법이다. 그러나, 기관지은 종종 불쾌한 것으로 인식되어 있기 때문에, 길이 방향의 샘플링을 수행하는 일반적으로 적합한 방법이 아니며, 이는 또한 시간 및 자원을 요구하는 과정이다. 따라서 기관지 생검는 주어진 시간 점막 폐 조직에 존재하는 면역 세포의 스냅보다는 역학 또는 역학 변화 장기 연구를 제공한다. 기존 / 대체 방법에 대하여 기술의 중요성 단면 및 면역 조직 화학 : 장점을 오히려 파라핀보다 또는 냉동 보존에 의해 GMA에 포함의17를 얻을 수있다 얇은 부분으로 인한 형태학 및 항원 및 소 생검에서 섹션보다 많은 수의 우수한 보존된다. 효소 소화 유동 세포 계측법합니다. 작은 생검으로부터 단일 세포를 획득함으로써, 훨씬 더 많은 정보는 유세포 다색 의해 달성 될 수있다. 이 기술을 마스터 한 후 미래의 응용 프로그램 또는 방향 이 프로토콜은 면역 조직 화학 법을 조합하고 유세포 작은 기관지 조직 검사로부터 얻어 질 수있는 정보를 극대화하기 위해 두 개의 병렬 방법을 설명했다. 이러한 수지상 희귀 면역 세포의 공간적 분포의 특징을, 생검 유사한 마커 다른 면역 세포에서 수지상 세포를 구별 할 수있는 반면, 면역 얇은 섹션을 얻었다 GMA에 내장 될 수 있으며, 생검의 효소 소화 다중 색 유세포 허용 체육 될 수 있습니다rformed. 염증 질환 중 수지상의 신규 한 특성의 바이어스 식별을 가능하게하기 위해, 유세포 자동화 된 데이터 분석은 피쳐 추출 알고리즘 (22)을 적용하여 수행 될 수있다. 미래의 애플리케이션은 RNA 서열 또는 transcriptomic 프로파일에 사용될 수있는 특정 세포 집단을 수집 정렬 셀이 단일 셀을 사용하여 포함한다. 폐에 존재하는 수지상 세포의 식별은 건강과 질병 중 면역 풍경의 변화를 이해하는 데 중요 할 수있다.

폐는 외부 환경과 연속적인 접촉이 높은 질환을 유발하는 능력 모두에 무해 입자와 미생물에 노출된다. 따라서, 침입 병원균에 대한 강력한 면역 반응을 탑재 면역계에 중요하지만, 질병의 원인이없는 흡입 항원에 대한 내성을 유지하는 것도 중요하다. 강력한 면역 감시를 제공하기 위해 호흡기는 수지상 세포를 포함하여 면역 세포의 네트워크 늘어서있다. 수지상 나이브 T 세포를 활성화 할 수있는 독특한 능력을 가진 전문적인 항원 제시 세포이다. 인간 폐, 상주 수지상 항원 다음 프로세스가 발생하여 T 세포를 1, 2, 3으로 표시 및 활성화에 대한 폐 림프절로 전송. 인간 면역계 DCS는 디스탱으로 여러 서브 세트들로 분할 될 수있다CT하지만 중복 기능 : CD1c +와 CD141 + 골수성 수지상 세포 (MDC에) 및 CD123 + 형질 DC가 (올라가고) 4, 5. 인간 수지상 가장 상세한 기술은 혈액 유래 연구 동안, 인간의 폐는 T 세포 자극 용량 6, 7, 8, 9 DC 서브 세트 드문 인구 항구 것이 이제 명백하다. 그러나, 누적 데이터는 수지상 세포를 포함하는 면역 세포가 자신의 해부학 적 위치 (10)에 따라 빈도, 표현형 및 기능에 차이가 있음을 보여준다. 따라서, 로컬 면역 관용에 대한 그들의 기여를 이해하기 위해 관련 조직에서 면역 세포를 연구하는 것이 중요하다. 함께 찍은,이 혈액 DC가 더 쉽게 사용 가능하고 접근에도 불구하고, 폐 질환을 해결하면 폐 상주 수지상 세포를 연구 할 필요성을 강조<html> 인간한다. 인간 폐 상주 수지상 조사 제의 연구는 주로 면역 11, 12, 13을 이용하여 조직 절편에서 형태 및 HLA-DR의 CD11c와 같은 하나의 마커의 발현에 의존했다. 대조적으로, 통상적으로 유세포에 의존 더 최근의 연구는 다양한 면역 세포 서브 세트를 연구 분석한다. 그 고유 특정 DC 서브 세트를 식별하는 하나의 세포 표면 마커를 찾는 것은 어렵다 때문에, 연구의 전위 한계는 단지 4 색은 유세포인가하는 수지상 세포와 유사한 표현형 마커와 세포 집단 등의 위험이있다. 예를 들어, 중 CD11c 모든 골수성 수지상 세포와 단핵 세포의 대부분에 표현된다. 한편, 연구 고급 유동 세포 계측법 패널을 적용하여 환자의 수술 적 절제로부터 비 암성 폐 조직은 통상적으로 사용 된외부 참조 &quot;&gt; 10, 14, 15, 16은, 이들 희소 인구 건강한 피험자의 DCS 본 진정 대표 불분명 않는다. 전체적으로 연구 인해 수술 제거 또는 전부를 인간 폐 조직이 부족하다는 사실에 크게 제한된다. 이러한 한계들을 극복하기 위해,이 작품은 공간 분포와 기관지 내시경을 받아야 건강한 지원자에서 얻은 점막 기관지 생검에서 수지상 세포의 표현형 식별에 대한 자세한 분석을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 여러 작은 생검 각에서 수집 될 수 있고,이어서 절편 분석 고급 유세포 분석을위한 분해 효소를 사용하여 면역 조직 화학 또는 임베디드 될 수있다. bronchoscopies 얻은 기관지 생검 형태의 폐 조직을 사용하는 것은 가능 명세서를 수행 할 수있게하는 장점을 부여udy는 건강한 지원자에서, 폐의 개복 수술과는 달리 분명한 이유, 흉부 수술이 필요한 환자에게 제한되어있다. 또한, 건강한 지원자에서 기관지 중 샘플링되는 조직은 폐 질환을 가진 환자의 폐 조직의 영향을받지 않는 영역에 대조적으로, 생리 학적으로 정상인. 한편, 생검 작은 여러 생검 풀링에도 검색된 셀의 수는 수행 될 수있는 분석의 유형을 제한한다. 본 연구는 수지상 세포에 초점을 맞추고 있지만, 직접 확장 할 수 있습니다 설명하는 방법은 인간의 점막 폐 조직에있는 관심의 다른 (면역) 세포를 포함합니다. 또한, 프로토콜은 기관지 같은 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 유육종증, 폐 암으로 진단을 확립의 일부 폐 질환을 앓고있는 환자로부터 얻은 샘플에 직접 적용 할 수있다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Bronchoscopy&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Bronchoscope BF1T160</td><td>Olympus</td><td>BF1T160</td><td></td></tr><tr><td>Light source&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>Exera CV-160</td><td></td></tr><tr><td>Fenestrated forceps</td><td>Olympus</td><td>FB21C</td><td>Used to take biopsies</td></tr><tr><td>Bite Block</td><td>Conmed</td><td>1429</td><td>20 mm x 27 mm</td></tr><tr><td>Glucose 25%&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>500 ml intravenous</td></tr><tr><td>Glycopyrronium bromide 0.2 mg/ml</td><td></td><td></td><td>Intravenous. Prevents mucus/saliva secretion</td></tr><tr><td>Mixt. Midazolam 1 mg/ml p.o</td><td></td><td></td><td>Can be used for extra relaxation</td></tr><tr><td>Lidocaine, 40 mg/ml</td><td></td><td></td><td>Mouth and throat administration / Gargled</td></tr><tr><td>Lidocaine 100 mg/ml spray</td><td></td><td></td><td>Administered to back of throat</td></tr><tr><td>Lidocaine 20 mg/ml spray</td><td></td><td></td><td>Administered via bronchoscope to airways</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;GMA processing and embedding&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Glass vials</td><td></td><td></td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32201-1L</td><td></td></tr><tr><td>Molecular sieves, 4 &amp;#197;</td><td>Alfa Aesar</td><td>88120</td><td>3-4 mm diameter pellets</td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-7626</td><td>0.035 g/100 ml acetone</td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-6125</td><td>0.37 g/100 ml acetone</td></tr><tr><td>Polythene-flat&amp;nbsp; TAAB embedding capsules</td><td>TAAB laboratories</td><td>C094</td><td>500x 8 mm diameter, polythene, flat-bottom capsules</td></tr><tr><td>Capsule holder</td><td>TAAB laboratories</td><td>C054</td><td>Holds 25 8 mm capsules</td></tr><tr><td>JB-4 GMA embedding kit</td><td>Polysciences</td><td>00226</td><td>Contains JB-4 Solution A (0026A-800), JB-4 solution B (0026B-3.8), benzoyl peroxide (02618-12)</td></tr><tr><td>Methyl benzoate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27614-1L</td><td></td></tr><tr><td>Silica gel with humidity indicator</td><td>Scharlau</td><td>GE0043</td><td>2.5-6 mm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;GMA sectioning&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Glass microscope slides</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10143562CEF</td><td>Cut edges, frosted end</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920-500mL</td><td>1:10 for working solution</td></tr><tr><td>Sheet glass strips for ultramicrotomy</td><td>Alkar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td>Wash solution (0.1% Tween20)</td></tr><tr><td>LKB 7800B Knifemaker</td><td>LKB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capsule splitter</td><td>TAAB laboratories</td><td>C065</td><td></td></tr><tr><td>Carbon steel single edge blades</td><td>TAAB laboratories</td><td>B054</td><td></td></tr><tr><td>Vice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ammonia, 25%</td><td>VWR</td><td>1133.1000</td><td>2 ml in 1 L, 1:500 (0.05%)</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td></td><td>Leica RM 2165</td></tr><tr><td>Light source</td><td>Leica</td><td></td><td>Leica CLS 150 XE</td></tr><tr><td>Microscope with swing arm stand</td><td>Leica</td><td></td><td>Leica MZ6</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;GMA Immunohistochemistry&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Diamond tipped pen</td><td>Histolab</td><td>5218</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide 30% solution</td><td>AnalaR Normapur</td><td>23619.264</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Roche</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>VWR chemicals</td><td>27810.295</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Millipore</td><td>82-045-2</td><td>Probumin BSA diagnostic grade</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s modified eagle medium (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5546</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human CD45 antibody</td><td>BioLegend</td><td>304002</td><td>Mouse monoclonal, clone HI30, isotype IgG1k. Working concentration of 500 ng/ml</td></tr><tr><td>Anti-human CD1a antibody</td><td>AbD Serotech</td><td>MCA80GA</td><td>Mouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Working concentration of 10 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal IgG1 isotype control</td><td>Abcam</td><td>ab27479</td><td></td></tr><tr><td>Mouse monoclonal IgG2a isotype control</td><td>Dako</td><td>X094301-2</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain ABC Elite standard kit</td><td>Vector Labs</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kite</td><td>Vector Labs</td><td>SK-4200</td><td></td></tr><tr><td>Mayers haematoxylin</td><td>HistoLab</td><td>01820</td><td></td></tr><tr><td>Permanent Aqueous Mounting Medium</td><td>AbD Serotech</td><td>BUF058C</td><td></td></tr><tr><td>Drying oven</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPX permanent mounting solution&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>360292F</td><td></td></tr><tr><td>Light microscope</td><td>Leica</td><td></td><td>Leica DMLB</td></tr><tr><td>Microscope camera</td><td>Leica</td><td></td><td>Leica DFC 320</td></tr><tr><td>Analysis software</td><td>Leica</td><td></td><td>Leica Qwin V3</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Enzymatic digestion&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Hank&#039;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>55021C</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10104159001&amp;nbsp;ROCHE</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platform rocker</td><td>Grant instruments</td><td>PMR-30</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conical tubes</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Flow cytometry&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit</td><td>Life Technologies</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>CD45</td><td>BD</td><td>555485</td><td></td></tr><tr><td>CD3</td><td>BD</td><td>557757</td><td></td></tr><tr><td>CD20</td><td>BD</td><td>335829</td><td></td></tr><tr><td>CD56</td><td>Biolegend</td><td>318332</td><td></td></tr><tr><td>CD66abce</td><td>Miltenyi</td><td>130-101-132</td><td></td></tr><tr><td>HLA-DR</td><td>BD</td><td>555813</td><td></td></tr><tr><td>CD14</td><td>BD</td><td>557831</td><td></td></tr><tr><td>CD16</td><td>Biolegend</td><td>302026</td><td></td></tr><tr><td>CD11c</td><td>BD</td><td>560369</td><td></td></tr><tr><td>CD1c</td><td>Miltenyi</td><td>130-098-009</td><td></td></tr><tr><td>CD141</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-514</td><td></td></tr><tr><td>CD103</td><td>Biolegend</td><td>350212</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>LSR II Flow cytometer</td><td>BD</td><td></td><td>Flow cytometer</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo</td><td></td><td>Software for analysis</td></tr></tbody></table>

human lung dendritic cells: spatial distribution and phenotypic identification in endobronchial biopsies using immunohistochemistry and flow cytometry

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In order to maintain tolerance or to induce an immune response, the immune system must appropriately handle inhaled antigens. Lung dendritic cells (DCs) are essential in maintaining a delicate balance to initiate immunity when required without causing collateral damage to the lungs due to an exaggerated inflammatory response. While there is a detailed understanding of the phenotype and function of immune cells such as DCs in human blood, the knowledge of these cells in less accessible tissues, such as the lungs, is much more limited, since studies of human lung tissue samples, especially from healthy individuals, are scarce. This work presents a strategy to generate detailed spatial and phenotypic characterization of lung tissue resident DCs in healthy humans that undergo a bronchoscopy for the sampling of endobronchial biopsies. Several small biopsies can be collected from each individual and can be subsequently embedded for ultrafine sectioning or enzymatically digested for advanced flow cytometric analysis. The outlined protocols have been optimized to yield maximum information from small tissue samples that, under steady-state conditions, contain only a low frequency of DCs. While the present work focuses on DCs, the methods described can directly be expanded to include other (immune) cells of interest found in mucosal lung tissue. Furthermore, the protocols are also directly applicable to samples obtained from patients suffering from pulmonary diseases where bronchoscopy is part of establishing the diagnosis, such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), sarcoidosis, or lung cancer.

DC를 비롯한 인간 호흡기 조직 상주 면역 세포를 특성화 연구는 주로 수술로 인해 제거되거나 전체 인간 폐 조직이 부족하다는 사실을 한정한다. 여기서, 면역 세포 계측법을 사용하여 조직의 면역 세포를 분석하거나, 유동 건강한 지원자 및 개발 프로토콜 기관지 생검 (EBB)로부터 폐 조직을 얻는 덜 침습적 방법이 설명된다. 이전 19 20 설명 된대로 건강한 자원 봉사자, 기관지 내시경을 시행 하였다. 6 ~ 9 1-2mm 3 기관지 점막 생검은 주 카리나와 유창 집게를 (그림 1A)를 사용하여 각 과목의 주요 기관지 부서에서 촬영되었다. 두 생검 GMA 내장이어서 공간 정보를 제공하기 위하여 면역 조직 화학에 사용 하였다. 나머지 biopsiES는 효소 적으로 분해하여, 단일 세포 현탁액 희귀 세포 서브 세트 (도 1b)의주의 특성을 허용하는 유동 세포 계측법 멀티 컬러를 사용하여 분석 하였다. 작은 조직편으로부터 가능한 한 많은 공간 정보를 얻기 위해, 생검 μm의 얇은 부분 (도 2A-B)을 허용 GMA에 삽입 하였다. 예상 한 바와 같이 면역 조직 화학 (도 2c)에 의해 평가 된 바와 같이, CD45을 발현하는 면역 세포가 비교적 희귀에 평균 2 mm 당 125 CD45 + 세포가 정상 상태 동안 점막 폐 조직에 존재 하였다. 의 IgG1 아이소 타입 컨트롤 차 항체의 특이성을 나타내는 아니오 양성 염색 결과. 폐 상피 세포 및 기저 점막 고유 층에서 모두 양성 세포의 수 정량과 CD45 + 세포를 면역 라 더 풍부한 것으로 나타났다했다상피 (그림 2D)에 비해 미나 고유 층. 또한, 따라 CD1a 발현 세포를 식별 열거, 그들은 대부분의 DC (그림 2E)을 표현 하였다. 평균적으로, mm 2 당 미만 하나 따라 CD1a + 세포는 정상 상태에서 폐 점막 고유 층 (그림 2 층)에서 확인되었다. 면역 그대로 조직 세포의 해부학 적 분포에 대한 정보를 제공하지만, 일반적으로 다수의 세포 표면 마커를 이용하여 세포를 정의 할 수있는 능력이 제한된다. 멀티 컬러는 기기에 따라 유동 세포 계측법 셀당 더 많은 정보를 제공하는 장점을 가지며, 이는 작은 샘플을 사용할 수있다. 최대 9 폐 점막 생검 모으고 세척하고, 점액을 방해 배양 하였다. 각 조직 검사 후 F (단일 세포 현탁액의 결과로 48 잘 플레이트의 각 우물에 콜라겐과 DNase의 소화했다igures 3A - 3B). 평균적으로, 피사체 1.5 × 106 기관지 세포를 수득하고, 세포 수율과 생존 사이의 양의 상관 관계 (도 3c)이 관찰되었다. 낮은 세포 수를 관찰 감소 세포 생존 잠재적 전지 최적이었다 셀당 높은 효소 농도에 의해 설명 될 수있다. 이 생검 일부 생검은 다른 사람보다 표면 점막의 이상을 샘플링하여, 크기 및 세포 밀도에 모두 변화와 도전이다. 예상대로, 단일 세포 현탁액의 세포 계측 분석을 정상 상태 조건에서 폐 점막 조직 세포의 대부분은 면역 세포 (도 3d하지 동안 평균적으로 세포의 12 %가 CD45 + 백혈구이었다 밝혀 흘러 ). 평행 한 두 가지 기술을 채용하는 힘을 강조 대응 지어진 유세포와 IHC 데이터. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page= &quot;1&quot;&gt; 효소 소화 프로토콜을 이용하여, 기관지 조직 검사에서 세포 현탁액은 형광 표지 된 항체 패널로 염색 하였다. 폐 조직과 같은 피사체에서 기관지 폐포 세척액 또는 말초 혈액 세포에 비해 CD103의 발현이 다른 DC 서브 세트의 주파수 분석 하였다. 골수 세포는 HLA-DR을 표현하지만, 혈통 마커 CD3, CD20, CD56, CD66abce, CD14 및 CD16 (그림 4A)에 대한 음성이었다 라이브 CD45 + 백혈구에 게이트를 이용하여 확인 하였다. 세포의이 작은 집단에서, 형질 수지상 세포 (올라가고은)의 CD11c 표현의 부족과 CD123 및 HLA-DR (청록색)의 높은 발현을 기준으로 확인되었다. 의 CD11c의 + HLA-DR + 계보 음성 세포 중에서 골수 DC가 확인되었다 CD1c + (산호) 및 CD141 + (적갈색) (그림 4A) 모두. 또한, CD10 인테그린의 발현을 이들 셀 집합을 특성화<html> 조직 고정 중요한 E-cadherin의, 결합도 3에서, 평가 하였다. 모든 DC 서브 세트뿐만 아니라, T 세포가 말초 혈액에서 순환하는 동안, CD103에 대한 낮거나 음의 있었다 동일인의 폐에서 발견 된 수지상 세포 및 T 세포의 구별 CD103 비율을 나타냈다. 이 기관지 세척뿐만 아니라 폐 조직 (그림 4B) 모두에서 발견 세포의 사실이었다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55222/55222fig1.jpg" /> 그림 1 : 인간의 폐 점막 조직의 샘플링. (A) Bronchoscopies 하나 폐 사용 포셉의 주요 기관지 부문에서 기관지 생검을 얻기 위해 주제에 수행 하였다. (B) 생검이 중 유동 세포 계측법 (핑크 다이어그램)에 대한 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 소화 효소 조직 절편 및 면역 조직 화학 (파란색도)에 대해 GMA 내장이나되었다.m / 파일 / ftp_upload / 55222 / 55222fig1large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55222/55222fig2.jpg" /> 그림 2 : GMA 수지의 생검을 포함하기. (A) bronchoscopies 찍은 생검은 즉시 빙냉 탈수 아세톤 (왼쪽 패널)을 함유하는 유리 병에 옮겼다. 밤새 고정 후, 생검 메틸 벤조 에이트 용액에 함침 하였다. 조직 검사는 중합 (중간 패널)를 시작 솔루션을 포함 가득 캡슐을 포함에 넣었다. 임베디드 생검 -20 ° C에서 저장 될 수 있거나 또는 면역 조직 화학 염색 (오른쪽 패널)에 대한 구분 될 수있다. (B)을 사용하여 GMA 매립 생검 과정에서 개략적 하이라이트 주요 단계. CD45의 존재를 보여주는 단면 생검의 대표 이미지 + </sup&gt; 셀 (C) 또는 셀에 CD1a + (E)은 각각의 아이소 타입 컨트롤 (오른쪽 판넬)과 비교하여 도시된다. 특정 얼룩은 빨간색으로 표시하고, 헤 마톡 실린으로 대조 세포 핵은 파란색으로되어있다. 스케일 바는 50 μm의 =. 막대 그래프는 CD45 + (D) 또는 따라 CD1a + (F) 상피 또는 점막 고유 층 (N = 20)의 mm 2 당 세포의 사 분위 범위 ± 중간을 보여줍니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55222/55222fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55222/55222fig3.jpg" /> 그림 3 : 유동 세포 계측법에 대한 생검의 효소 소화. (A) 페트리 접시에서 기관지 내시경에서 찍은 기관지 생검. 생검이 점액을 제거하기 위해 DTT 처리, HBSS에서 세척유세포 분석을 위해 단 전지의 수집 전에 콜라겐과의 DNase로 분해 거라고. (B) 회로도는 유동 세포 계측법에 대한 생검을 소화하기위한 기본 절차를 요약 한 것입니다. 수동 계산 및 트리 판 블루 배제 (N = 20)에 의해 평가로 (C)의 그래프는, 세포 수율과 생존의 상관 관계를 보여줍니다. (D) 소화 조직 검사에서 단일 세포 현탁액은 유동 세포 계측법에 의해 분석과 생존 및 CD45의 발현 (백혈구 공통 항원)에 대한 평가 하였다. 플롯 세포 계측법 흐름은 20 건강한 피험자 중 하나의 대표 기증자를 보여줍니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55222/55222fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55222/55222fig4.jpg" /> 그림 4 : 소화 나 폐 수지상 세포 하위 집합의 식별iopsies. 폐 점막 조직에서 CD1c +와 CD141 + 골수성 수지상 세포 (MDC에) 및 형질 DC가 (올라가고)의 식별 (A) 게이팅 전략. 하나의 대표 주제에서 플롯 세포 계측법 흐름이 표시됩니다. (B) 도트 플롯은 폐 생검 (왼쪽 패널), 기관지 세척 (중간 패널)에서 수지상의 집단에 인테그린 CD103의 발현 및 말초 혈액 (오른쪽 패널)를 보여줍니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55222/55222fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Human Lung Dendritic Cells: Spatial Distribution and Phenotypic Identification in Endobronchial Biopsies Using Immunohistochemistry and Flow Cytometry

Lung-resident immune cells, including dendritic cells (DCs) in humans, are critical for defense against inhaled pathogens and allergens. However, due to the scarcity of human lung tissue, studies are limited. This work presents protocols to process human mucosal endobronchial biopsies for studying lung DCs using immunohistochemistry and flow cytometry.

면역 및 유동 세포 계측법을 사용하여 기관지 생검의 공간 분포 및 표현형 확인 : 인간의 폐 수지상 세포

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.3K 조회수.  Karolinska Institutet. Lung-resident immune cells, including dendritic cells (DCs) in humans, are critical for defense against inhaled pathogens and allergens. However, due to the scarcity of human lung tissue, studies are limited. This work presents protocols to process human mucosal endobronchial biopsies for studying lung DCs using immunohistochemistry and flow cytometry. 

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Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

마우스 폐에 돌기 세포의 분리

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

연구

면역학 및 감염병학

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in peripheral tissues in steady state; however in response to antigen stimulation, DCs take up the antigen and rapidly migrate to the draining lymph nodes where they initiate T cell response against the antigen1,2. Additionally, DCs also play a key role in initiating autoimmune as well as allergic immune response3.
DCs play an essential role in both initiation of immune response and induction of tolerance in the setting of lung environment4. Lung environment is largely tolerogenic, owing to the exposure to vast array of environmental antigens5. However, in some individuals there is a break in tolerance, which leads to induction of allergy and asthma. In this study, we describe a strategy, which can be used to monitor airway DC maturation and migration in response to the antigen used for sensitization. The measurement of airway DC maturation and migration allows for assessment of the kinetics of immune response during airway allergic inflammation and also assists in understanding the magnitude of the subsequent immune response along with the underlying mechanisms.
Our strategy is based on the use of ovalbumin as a sensitizing agent. Ovalbumin-induced allergic asthma is a widely used model to reproduce the airway eosinophilia, pulmonary inflammation and elevated IgE levels found during asthma6,7. After sensitization, mice are challenged by intranasal delivery of FITC labeled ovalbumin, which allows for specific labeling of airway DCs which uptake ovalbumin. Next, using several DC specific markers, we can assess the maturation of these DCs and can also assess their migration to the draining lymph nodes by employing flow cytometry.

We describe a strategy to monitor maturation and migration of pulmonary dendritic cells in response to ovalbumin in the setting of ovalbumin induced allergic airway inflammation. This strategy can be modified to assess migration of pulmonary dendritic cells in settings of infection.

알레르기기도 염증 동안 폐 돌기 세포 성숙과 마이 그 레이션 분석

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for quantitative analysis of cell surface proteins on immune cells, but it provides no information on the localization and migration patterns of these cells within the lung. Similarly,&#160;chemotaxis assays can be performed to study the potential of cells to respond to chemotactic factors in vitro, but these assays do not reproduce the complex environment of the intact lung. In contrast to these aforementioned techniques, the location of individual cell types within the lung can be readily visualized by generating Precision-cut Lung Slices (PCLS), staining them with commercially available, fluorescently tagged antibodies, and visualizing the sections by confocal microscopy. PCLS can be used for both live and fixed lung tissue, and the slices can encompass areas as large as a cross section of an entire lobe. We have used this protocol to successfully visualize the location of a wide variety of cell types in the lung, including distinct types of dendritic cells, macrophages, neutrophils, T cells and B cells, as well as structural cells such as lymphatic, endothelial, and epithelial cells. The ability to visualize cellular interactions, such as those between dendritic cells and T cells, in live, three-dimensional lung tissue, can reveal how cells move within the lung and interact with one another at steady state and during inflammation. Thus, when used in combination with other procedures, such as flow cytometry and quantitative PCR, PCLS can contribute to a comprehensive understanding of cellular events that underlie allergic and inflammatory diseases of the lung.

We describe a method for generating Precision-cut Lung Slices (PCLS) and immunostaining them to visualize the localization of various immune cell types in the lung. Our protocol can be extended to visualize the location and function of many different cell types under a variety of conditions.

정밀 절단 라이브 폐 수지상 세포를 시각화하기 위해 마우스 폐 슬라이스

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low numbers of DCs present per tissue. Yet, as the phenotype and function of DCs is modified by the tissue environment, it is necessary to analyze tissue resident DC populations, since blood derived DCs incompletely reflect the complexities of DCs in tissues. Here we present a protocol to isolate DCs from the human female reproductive tract (FRT) using hysterectomy specimens that allows both phenotypical and functional analyses. The protocol consists of tissue digestion to generate a single cell mixed cell suspension, followed by positive magnetic bead selection. Our tissue digestion protocol does not cleave surface markers, which allows phenotypical and functional analysis of DCs in the steady state, without overnight incubation or cell activation. This protocol can be adapted for the isolation of other immune cell types or isolation of DCs from other tissues.

We describe here a method to isolate and purify dendritic cells from different anatomical compartments in the human female reproductive tract for the evaluation of their phenotypical and functional characteristics. This method can be adapted to isolate other immune cells or dendritic cells from other mucosal tissues.

Phenotypical 및 기능 연구에 대 한 인간의 여성 생식 관에서 수지상 세포의 고립

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...

Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

Haemophilus influenzae (Hi) is a prevalent bacterium found in a range of respiratory conditions. A variety of different assays/techniques may be used to assess the respiratory immune/inflammatory response to this bacterium. Flow cytometry and confocal microscopy are fluorescence-based technologies that allow detailed characterization of biological responses.&#160;Different forms of Hi antigen can be used, including cell wall components, killed/inactivated preparations, and live bacteria. Hi is a fastidious bacterium that requires enriched media but is generally easy to grow in standard laboratory settings. Tissue samples for stimulation with Hi may be obtained from peripheral blood, bronchoscopy, or resected lung (e.g., in patients undergoing surgery for the treatment of lung cancer). Macrophage and neutrophil function may be comprehensively assessed using flow cytometry with a variety of parameters measured, including phagocytosis, reactive oxygen species, and intracellular cytokine production. Lymphocyte function (e.g., T cell and NK cell function) may be specifically assessed using flow cytometry, principally for intracellular cytokine production. Hi infection is a potent inducer of extracellular trap production, both by neutrophils (NETs) and macrophages (METs). Confocal microscopy is arguably the most optimal way to assess NET and MET expression, which may also be used to assess protease activity. Lung immunity to Haemophilus influenzae can be assessed using flow cytometry and confocal microscopy.

Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

Haemophilus influenzae induces inflammation in the respiratory tract. This article will focus on the use of flow cytometry and confocal microscopy to define immune responses by phagocytes and lymphocytes in response to this bacterium.

헤모필루스 인플루엔자에 대한 호흡기 면역 반응 평가

Haemophilus influenzae (Hi) is a prevalent bacterium found in a range of respiratory conditions. A variety of different assays/techniques may be used to ...

Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an attractive therapeutic target in the clinical management of affected patients. In order to further optimize strategies aiming at therapeutic regulation of pathologically imbalanced tissue infiltration of pro-inflammatory immune cells, it will be of particular importance to achieve improved insights into disease- and organ-specific homing properties of peripheral lymphocytes. The here described experimental protocol allows to monitor lung accumulation of fluorescently labeled and adoptively transferred human lymphocytes in the context of papain-induced pulmonary inflammation. In contrast to standard in vitro assays frequently used for the analysis of immune cell migration and chemotaxis, the now introduced in vivo setting takes into account lung-specific aspects of tissue organization and the influence of the complex inflammatory scenario taking place in the living murine organism. Moreover, three-dimensional cross-sectional light-sheet fluorescence microscopic imaging does not only provide quantitative data on infiltrating immune cells, but also depicts the pattern of immune cell localization within the inflamed lung. Overall, we are able to introduce an innovative technique of high value for immunological research in the field of chronic inflammatory lung diseases, which can be easily applied by following the provided step-by-step protocol.

The here introduced protocol allows characterization of the lung homing capacity of primary human lymphocytes under in vivo inflammatory conditions. Pulmonary infiltration of adoptively transferred human immune cells in a mouse model of allergic inflammation can be imaged and quantified by light-sheet fluorescence microscopy of chemically cleared lung tissue.

고급 폐 유도 빛 시트 현미경 검사 법에 따라 알레르기 염증의 Vivo 모델에서 실험에서 인간 림프 톨의 이미징

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an ...

의학

Flow Cytometric Analysis for Identification of the Innate and Adaptive Immune Cells of Murine Lung

The respiratory tract is in direct contact with the outside environment and requires a precisely regulated immune system to provide protection while suppressing unwanted reactions to environmental antigens. Lungs host several populations of innate and adaptive immune cells that provide immune surveillance but also mediate protective immune responses. These cells, which keep the healthy pulmonary immune system in balance, also participate in several pathological conditions such as asthma, infections, autoimmune diseases, and cancer. Selective expression of surface and intracellular proteins provides unique immunophenotypic properties to the immune cells of the lung. Consequently, flow cytometry has an instrumental role in the identification of such cell populations during steady-state and pathological conditions. This paper presents a protocol that describes a consistent and reproducible method to identify the immune cells that reside in the lungs of healthy mice under steady-state conditions. However, this protocol can also be used to identify changes in these cell populations in various disease models to help identify disease-specific changes in the lung immune landscape.

In this study, we present an effective and reproducible protocol to isolate the immune populations of the murine respiratory system. We also provide a method for the identification of all innate and adaptive immune cells that reside in the lungs of healthy mice, using a 9-color-based flow cytometry panel.

뮤린 폐의 선천적 및 적응성 면역 세포의 확인을 위한 유세포 분석

The respiratory tract is in direct contact with the outside environment and requires a precisely regulated immune system to provide protection while ...

Agarose-embedded vibratome section을 사용한 혁신적인 폐 이미징

Automated Vibratome Sectioning of Agarose-Embedded Lung Tissue for Multiplex Fluorescence Imaging

Due to its inherent structural fragility, the lung is regarded as one of the more difficult tissues to process for microscopic readouts. To add structural support for sectioning, pieces of lung tissue are commonly embedded in paraffin or OCT compound and cut with a microtome or cryostat, respectively. A more recent technique, known as precision-cut lung slices, adds structural support to fresh lung tissue through agarose infiltration and provides a platform to maintain primary lung tissue in culture. However, due to epitope masking and tissue distortion, none of these techniques adequately lend themselves to the development of reproducible advanced light imaging readouts that would be compatible across multiple antibodies and species. 
To this end, we have developed a tissue-processing pipeline, which utilizes agarose embedding of fixed lung tissue, coupled to automated vibratome sectioning. This facilitated the generation of lung sections from 200 &#181;m to 70 &#181;m thick, in mouse, pig, and human lungs, which require no antigen retrieval, and represent the least "processed" version of the native isolated tissue. Using these slices, we reveal a multiplex imaging readout capable of generating high-resolution images whose spatial protein expression can be used to quantify and better understand the mechanisms underlying lung injury and regeneration.

저자 스포트라이트: Agarose Embedded Lung Tissue Section을 사용한 공간 단백질 발현 연구 

We have developed a tissue-processing technique utilizing a vibratome and agarose-embedded lung tissue to generate lung sections, thereby permitting the acquisition of high-resolution images of lung architecture. We employed immunofluorescence staining to observe spatial protein expression using specific lung structural markers.

다중 형광 이미징을 위한 Agarose-Embedded 폐 조직의 자동 진동 절편

Due to its inherent structural fragility, the lung is regarded as one of the more difficult tissues to process for microscopic readouts. To add structural ...

면역 및 유동 세포 계측법을 사용하여 기관지 생검의 공간 분포 및 표현형 확인 : 인간의 폐 수지상 세포

요약

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헤모필루스 인플루엔자에 대한 호흡기 면역 반응 평가

고급 폐 유도 빛 시트 현미경 검사 법에 따라 알레르기 염증의 Vivo 모델에서 실험에서 인간 림프 톨의 이미징

뮤린 폐의 선천적 및 적응성 면역 세포의 확인을 위한 유세포 분석

다중 형광 이미징을 위한 Agarose-Embedded 폐 조직의 자동 진동 절편

다중 형광 이미징을 위한 Agarose-Embedded 폐 조직의 자동 진동 절편

다중 형광 이미징을 위한 Agarose-Embedded 폐 조직의 자동 진동 절편