우리는 제시된 작품의 중요한 논의 박사 알리샤 Mattiazzi 감사합니다. 이 작품은 NIH로부터 연구비 (R01 HL-084487) ALE에 지원되었다.

이 프로토콜은 모든 마우스 처리는 UC 머 시드 기관 동물 관리 및 사용위원회 (제 2008-201)에 의해 승인되었다. 앵무새와 실험 과학 연구에 대한 베네수엘라 연구소 (이 비치)의 과학위원회에 의해 설립 동물 사용의 일반적인 정책에 따라 1999 년에 실시 하였다. 1. 랑겐 돌프 세트까지 준비 <ol><li> 140의 NaCl, 5.4 KCl을,이 CaCl2를, 하나의 MgCl 2, 0.33 HPO 4, 10 글루코스, 10 HEPES 2 나트륨 : MM에서 다음과 용질 농도를 함유 타이로드 용액을 제조 하였다. NaOH로 7.4로 타이로드 용액의 pH를 조정 한 후 0.22 ㎛의 필터를 통해 용액을 필터. </li><li> 60 ML의 주사기에 타이로드 용액 (11), (12)는도 4에 도시 설정 수평 랑겐 돌프의 모든 튜브를 넣습니다. 모든 기포를 제거해야합니다. </li><li><stroNG&gt;도 4에 도시 된 바와 같이 침수 플라스틱 &quot;에어 스톤&quot;을 사용하여 100 % O 2 평형 타이로드 용액. <ol><li> 오 2 탱크에 플라스틱 튜브를 연결합니다. </li><li> 60 ML의 주사기에서 타이로드 용액에 5 &quot;튜브를 낮추기 위해 플라스틱 티 어댑터를 추가합니다. </li><li> 타이로드 솔루션으로이 뜻 거품 밖으로 O 있도록 5 &quot;튜브의 끝 부분에 플라스틱 공기 돌을 연결합니다. </li></ol></li><li> 캐 뉼러로 사용되는 바늘 주위에 비 흡수성 수술 용 봉합사를 놓습니다. 니들은 다른 솔루션 역 관류를 허용하는 매니 폴드 (도 4 참조)에 결합된다. 마지막으로, 심장의 대동맥은 바늘로 유관됩니다. </li></ol> 2. 동물 준비 및 심장 해부 <ol><li> 헤파린 마우스를 달아 주입 (예. 마우스 무게 20g의 20 단위 또는 200 μL로 주입) 자궁 전위에 의해 안락사 전에 15 분. 마취 잉꼬 따라 t오 동물을 사용하여 IACUC 프로토콜의 가이드 다음은 자궁 경부 전위를 진행합니다. 참고 : 8 주 오래 된 마우스 또는 20g의 앵무새를 사용합니다. </li><li> euthanization 후 흉강에서 마음을 제거합니다. 마우스에 대한 설명과 동일하게 잉꼬 마음의 압축을 풉니 다. <ol><li> 에탄올로 마우스의 가슴을 청소합니다. </li><li> 해부 가위를 사용하여 하복부에 절개를 한 후 목을 향해 측면을 잘라. </li><li> 절단 된 조직을 다시 당겨 아래로 핀. </li><li> 다이어프램을 잘라. 심장의 손상을 방지하기 위해 조리개를 절단 할 때주의해야합니다. </li><li> 폐와 주변 조직을 제거합니다. </li><li> 를 압박하지 않고 마음을 특종 핀셋을 사용합니다. 가능한 한 오랫동안 대동맥을 잘라. </li></ol></li><li> 약 1 mL의 타이로드 용액을 작은 무게 보트에 마음을 전송. </li><li> 비 흡수성 봉합사를 사용하여 수술하는 통해 수평 랑겐 돌프 장치 상 대동맥 넥타이바늘. 이 미세 핀셋의 도움으로 심장 대동맥을 묶어. 타이로드 용액을 함유하는 60 mL의 주사기에 직렬로 위치한 밸브를 개방하여 역 관류를 시작한다. </li><li> 심장이 10 분 동안 안정화 할 수 있습니다. 피와 염료를로드하기 전에 심장 주위의 지방 조직을 청소하는이 시간을 사용합니다. 핀셋으로 마음의베이스 근처의 지방 조직을 당겨 작은 해부 가위를 사용하여 잘라. 해부 현미경의 관점에서이 작업을 수행해야합니다. </li></ol> 3. 세포질 칼슘 측정 : 염료 루비로드 - 오전 2시 준비 <ol><li> 염료를 50㎍을 함유하는 염료 제조업체에서 제공하는 특수 패키징 플라스틱 바이알 DMSO의 20 % 플루 20 μL (비이 온성 계면 활성제)를 추가한다. </li><li> 거품을 피하고로 pipetting 아래로 섞는다. </li><li> 비이 온성 계면 활성제 및 투명한 유리 바이알에 특별한 포장 플라스틱 바이알에서 염료 혼합 DMSO 전송. 타이로드의 SOLU 1 mL를 넣고투명한 유리 병에 기. </li><li> 목욕 초음파기에서 15 ~ 20 분 동안 초음파 처리. </li><li> 실온에서 30 분 동안 연동 펌프를 사용하여 염료를 관류. <ol><li> 염료 실에 염료를 놓습니다. </li><li> 매니 폴드에 연결된 모든 다른 배관 라인을 압축하는 기계적 클램프를 사용한다. 클램프는 매니 폴드 위에 배치됩니다. 이를 60 mL의 주사기에 연결된 배관에 역류하는 것을 방지한다. </li><li> 염료를 순환 시작 관류 연동 펌프를 켭니다. 즉시 60 ml 주사기 아래의 3 방향 밸브를 닫는다. </li><li> 심장에 관류 된 염료를 재순환하는 마음 옆에 흡입 연동 펌프에 연결된 작은 튜브를 놓습니다. </li></ol></li></ol> 4. 내부-SR 칼슘 2 + 측정 : 염료 매기 - Fluo4AM 준비 <ol><li> 루비로드 - 오전 2시와 동일한 방식으로 매기 - Fluo4AM를 준비합니다. 단계별 지침은 3 장을 참조하십시오. </li><li> Afte염료 로딩 R, 역 관류를 시작 타이로드 용액을 함유하는 60 mL의 주사기에 직렬로있는 밸브를 연다. 매니 폴드 위의 클램프를 제거해야합니다. </li><li> 수평 챔버에 타이로드 솔루션을 추가하고 37 ° C로 예열. </li><li> 45 분 동안 타이로드 솔루션 레트로 관류는 세포질 염료를 제거합니다. </li></ol> 5. 멤브레인 잠재적 인 측정 : 염료 디 - 8 - ANEPPS 준비 <ol><li> 염료 5 ㎎을 포함하는 염료 바이알에 99 % 에탄올 5 mL를 추가한다. </li><li> 나누어지는 리피터 피펫을 사용하여 500 개인 1 ML의 플라스틱 튜브에 10 μL. </li><li> -20 ° C에서 고속 진공 건조하는 저장소. </li><li> 건조 된 염료의 10 μg의와 플라스틱 병에 20 20 %의 μL 플루 DMSO에 추가합니다. </li><li> 거품을 피하고로 pipetting 아래로 섞는다. </li><li> 플라스틱 병에서 눈금 실린더 (10 ㎖)에 플루와 염료로 DMSO를 포함 믹스를 전송합니다. 최종 VO에 타이로드 솔루션을 추가5 ㎖의 LUME. </li><li> 목욕 초음파기에서 20 ~ 25 분 동안 초음파 처리. </li><li> 연동 펌프를 사용하여 30 분 동안 심장 내로 관류. 3.5 절에서 단계별 지침을 참조하십시오. </li></ol> 6. 심 외막 신호를 기록 <ol><li> 염료를로드 한 후, 매니 폴드 위의 클램프를 제거하여 타이로드 용액과 마음을 복고 - 관류. 타이로드 용액을 함유하는 60 mL의 주사기에 직렬로있는 밸브를 연다. 10 분 동안 레트로 관류의 타이로드 솔루션은 마음을 안정. </li><li> 타이로드 솔루션 가로 실을 작성하고 37 ° C로 목욕 온도를 가지고 펠티에 장치의 전원을 켭니다. </li><li> 마음의 표면에 광섬유를 배치합니다. <ol><li> 2 mL를 피펫 내부의 광섬유를 배치 한 다음 미세 조작기에 피펫을 첨부합니다. </li><li> 약간 LV의 표면에 광섬유를 눌러 미세 조작기를 사용합니다. </li></ol></li><li> 외부 난방 조절이파형 발생기에 의해 제어되는 자극과 실온. <ol><li> 1 ms의 폭의 사각형 펄스를 제공하는 파형 생성기 프로그램. </li><li> 외부 적으로 동기화 될 수있는 자극을 설정하고 파동 발생기에 외부 입력을 연결한다. </li><li> 자극기의 각 출력에, 마지막에 납땜 침술 바늘로 와이어를 연결합니다. </li><li> 약 3mm 떨어져 서로 마음의 정점에 모두 침을 놓습니다. </li><li> 바늘이 조직에 배치됩니다 만 후 전기 충격을 방지하기 위해 자극기의 출력을 켭니다. </li></ol></li><li> 인수 소프트웨어에서, 10 kHz로 획득 주파수를 조정합니다. </li></ol> 7. 심 내막 신호를 기록 <ol><li> 염료를로드 한 후 마음을 안정시키기 위해 6.1 및 6.2 단계를 참조하십시오. </li><li> 광섬유의 크기를 급격히 23Ga 점을 이용하여, 격벽에 가까운 LV 심장의 표면에 작은 구멍을 만든다. </li> &lt;리&gt;은 미세 조작기를 이용하여 내막에 처음으로 광섬유의 위치에 도움이되도록 유리체 강내 수술 공막 어댑터를 놓습니다. </li><li> 외부 마음을 조절이. 6.4 단계를 참조하십시오. </li><li> 수집 소프트웨어에서, 10 kHz로 획득 주파수를 조정합니다. </li></ol>

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저자는 공개 아무것도 없어.

이 문서는 심장 근세포 생체의 기능을 평가하기 위해 국소 체 형광 기술을 설명하기에 중심. 결합 된 환경에서 이러한 세포의 연구뿐만 아니라 더 많은 생리적 인뿐만 아니라 장기 레벨 병리학을 평가하기위한 매우 적합하다. 여기 수축 커플 링 (ECC)를 기본 셀룰러 이벤트 세포 내 칼슘 역학을 모니터링 분자 프로브의 사용과 전체 기관 수준에서 (루비로드 2 세포질 칼슘을 매기-Fluo4 SR 칼슘) 평가 될 수 있으며, 전기 활동 (디 -8- ANEPPs). 여기, 우리는 모두 흥분과 광섬유를 이용하여 형광 지표에서 방출을 수집 세 LFFM의 표면 형광 기법을 제시 하였다. 이들은 사용 된 광원과 광 변조의 유형에 따라 다르다. LEDFM도 PLEDFM에 펄스 수의 LED를 사용하는 반면 PLFFM는, 빛, CLFFM 연속 레이저 빛을 사용하여 펄스 레이저를 사용합니다. 이 모든한 세트로서도 1에 제시되지만, 세 개의 표면 형광 배열의 하나로 구성 될 수있다. 또한, 상기 검출 된 광은 다양한 방법으로 처리 될 수있다. 예를 들어,도 2는 광전류가 통합 또는 직접 전류 전압 변환기에 의해 전압으로 변환 될 수있는 두 가지 경우를 예시한다. 도 3와 같이 일반적 LFFM 방식은 동시에 다수의 해부학 적 위치를 측정하는데 사용될 수있다. 본래 기관 수준에서 심근 특성을 평가하기 위해 여기에 제시된 방법은 셀들 사이의 커플 링은 상기 조직의 행동을 정의하는 중요한 문제를 연구하는 것이 더 적절하다. 다른 AP를 생산할 수있는 심장의 극한 이질성 특정 조직에 기초하여, 22 21, 13 파형하는 CE로부터LLS 유래. 따라서, 전체 장기 연구는 다른 해부학 적 구조의 셀의 로컬 생리 기능을 평가하는 기회를 제공한다. 또한, 우리는 불꽃과 파도 같은 세포 내 이벤트가 그대로 기관 (15)보다 해리 세포에서 다른 동력학을 가지고 보았다. 랑겐 돌프 세트 업 (그림 4)는 생체에 가까운 상황에서 마음을 유지하는 것이 중요합니다. 또한, 여러 가지 생리 학적 변수의 측정을 허용 다중 약물 및 다양한 형광 분자 프로브 retroperfusion 있습니다. 서로 다른 광원을 사용하는 외인성 형광 프로브 변경 광섬유의 크기를 증가 또는 선택 극적 기술의 응용을 변경할 수있다. 또한, 수평 챔버 아래 펠티에 유닛은 다양한 온도에서 칼슘 역학에 대한 연구를 촉진 할 수있다. 액세서리를 추가빔 스플리터가 그대로 마음에 다른 지역에서 기록하는 데 사용 광섬유의 수를 증가시킬 수 등 LFFM합니다. 이 지역의 차이는 병적 인 시나리오에서 발생할 경우 테스트하는 매우 유용한 적응이다. 그림 3은 내막을 보여주고 심장 외막 동시에 평가된다. 또한, 다른 효능과 마음을 관류하는 것은 우리가 심실 벽에서 서로 다른 영역을 조절하는 방법을 이해 할 수 있습니다. 전기 신호 (그림 5)과 칼슘 2 + 운동 (그림 6)은 이질성은 심장 외막과 내막에 비교 될 수있다. 또한, 상이한 여기 파장 및 방출 필터를 다수의 염료가 사용될 수있다. 예를 들어 크기 - FLUO-4를 사용함으로써, SR의 루멘의 칼슘 이온 농도는 (도 7)에 기록 될 수있다. 광섬유의 크기를 변경하는 것도 LAR에서 형광 촬영을 허용함으로써 이러한 방법의 용량을 확장 할 수있다게르 영역입니다. 이 논문은 또한 별도로 고가의 레이저에서, LED는 우리의 기술에서는 여기 광원으로서 사용할 수 있음을 보여준다. 도 8은 광원이 저렴 유형 ratiometrically AP를 측정 할 수 있음을 보여준다. 도 8에 도시 된 비율 적 측정은 이동에 의한 아티팩트를 포함한 실험없이 최종 기록 생산에 유리하다. 마지막으로, 심지어 칼슘 과도 AP 광학적 다중화 상이한 파장과 동일한 발광 스펙트럼과 염료를 사용하여, 동시에 기록 될 수있다. 도 9에 설명 된 신호 처리는 염료의 발광 스펙트럼의 중첩에 의해 생성 된 내부의 오염을 제거하는데 중요하다. 칼슘을 2 + 과도 및 AP를 동시에하지만, 두 개의 독립적 인 출력 신호를 기록하는 ECC 및 칼슘 유도 된 칼슘을 공부에 도움이됩니다 2+ </suP&gt;이 두 변수는 매우 서로 연결되어 프로세스가 릴리스 (CICR). LFFM 그대로 조직의 세포 생리학의 여러 응용 프로그램과의 기술이다. 그러나, 하나의 중요한 한계는 녹음 된 형광 광파이버가 조직과 접촉되는 로컬 영역 내의 기본 형광 표시기에서의 평균 발광 점이다. 두 개의 광섬유를 사용하는 경우에도, LFFM은 측정 된 신호의 세포 내 공간 분포를 제공하지 않는다. 광학 매핑 같은 AP, 칼슘 과도 전파로서 공간과 시간의 변화 생리 학적 변수를 모니터링하는 좋은 방법이며, alternans 23, 24, 25. LFFM는 공 초점 현미경 및 기타 광학 매핑 기술과 같은 구조의 영상을 제공 할 수 없습니다. 그럼에도 불구하고, 광섬유의 사용은 R에이 실용적심 내막 또는 공 초점 현미경으로 온전한 마음에 접근이 어렵거나 불가능한 다른 지역에서 지역 형광 신호를 ecording. 그대로 마음에서 얻은 생리 학적 변수들 사이에 고립 된 심근 세포 실험에서 비교는 어렵습니다. 절연 심장 근세포를 이용하는 가장 큰 이점은 패치 클램프 조건 하에서 세포의 생물 리 학적 특성을 평가할 수있는 유일한 기회이다. 반면, LFFM보다 네이티브 환경에서 생리와 병리 현상의 연구를 할 수 있습니다. 예를 들어, 그대로 마음에 우리는 분리 된 세포에서 달성 할 수없는 전층 생리의 차이 (15), AP와 칼슘의 심장 박동 의존성 2+ 범위 (13)을 평가할 수 있습니다. 또, 본래의 중심 구 (10)의 기능에 허혈의 효과를 연구 할 수있다. 항목의 심장 전위한 실험은 또한 우리가 다른 유형의 세포 및 근육 세포 (11) 사이의 상호 작용을 평가하기 위해 허용한다. LFFM는 세포 생리 학적 커플 링이있는 그대로 심장 수준에서 세포 신호 시각화 할 수 있습니다. 세포가 손상 기관에서 여전히 동안 LFFM은 세포 활동의 연구를 할 수 있습니다. 칼슘 역학과 전기 활동 : 형광 염료 및 epiluminescence와 함께, LFFM 두 가지 주요 심장 속성을 모니터링 할 수 있습니다. 마지막으로, 여기에 제시된 방법은 ECC의 연구에서 여러 응용 프로그램을 사용할 수 있습니다. 이 같은 부정맥 (16)과 허혈 9, 15으로 병적 인 상황에 영향을받는 방법 초분자 신호를 나타낼 수있는 도구입니다. 이 기술들이 단지 그대로 기관 수준에서 잘 이해 될 수 있기 때문에 이러한 병리를 연구하기 위해 필요한 것이다.

핵심은 심장 혈관 시스템의 중심 기관이다. 심장의 수축은 세포 내에서 증가 [칼슘 2 +]에 의해 시작된다. 세포 내 칼슘 방출의 전기적 흥분성 변화 사이의 관계는 역사적으로 효소 적 세포 해리 (1, 2)에서 연구되고있다. 그러나, 심근 세포 대사되어 전기적 및 기계적 4 3 결합된다. 격리되면, 근육 세포가 물리적으로 결합되지 없지만, 상이한 계층에서 심근 세포를 해리 5 동안 혼합한다. 또한, 전압 클램프 조건 하에서 분리 된 세포 연구로부터 나왔다 막대한 장점, 6, 7, 8의 전기 syncytium ALWA 같은 심장의 본질 불구YS는 조직 3에 존재하는 것과 세포를 분해하는 방법을 기능적으로 다른 질문을 제기. 이 논문에서는 본래 심장 로컬 필드 형광 현미경 (LFFM) 기술을 사용하여 심장 생리학의 기술에서 얻어진 발전을 설명한다. LFFM는 세포질 칼슘, 내 근질 세망 (SR) 칼슘과 막 잠재력 등 여러 생리적 변수를 측정하는 형광 표시를 사용합니다. 이러한 측정은 심실 압력 9, 10, 9 심전도, 전기 활동 전위 (APS), 이온 전류 및 기록 갇힌 화합물 (4)의 플래시 광분해, (11)과 함께 동시에 얻을 수있다. 또한, 이들 측정은 가까운 높은 주파수에서 그대로 심장 페이싱에 의해 얻을 수있다생리 요금에 연구. 여러 문서 있지만 9, 11, 12, 13, 14 LFFM 기술을 이용하여 우리 그룹에 의해 출판 된, 이러한 기술과 관련된 기술적 인 복잡성의 추정은 심장 및 다른 기관에 생체 생리 현상 공부의 다량 사용을 방지하고있다. LFFM 기술 (도 1)이 조직과 접촉하는 멀티 모드 광파이버를 사용하여 얻어진 표면 형광 측정에 기초한다. 접촉 형광 영상 법처럼, 광학 해상도는 직경, 섬유의 개구 수 (NA)에 따라 달라진다. 광섬유의 NA보다 작은 직경 측정의 공간 해상도를 증가시킬 것이다. NAS 및 섬유 직경은 각각 0.22에서 mm 0.66과 μm의 1 (50)에 이르기까지 다양 할 수 있습니다. 에서개구를 주름은 큰 입체각에서 도착 광자를 받아들임으로써 잡음비 (S / N)에 신호를 개선한다. 표면 형광 장치로서 작용하기 위해서는, 광 빔은 비구면 렌즈 표면 형광 또는 목적을 가진 광섬유에 집중되는 경우, 렌즈의 NA와 광 매치. 이 검색은 여기 및 형광 물질에 의해 방출되는 광자를 다시 수집하는 에너지 전달을 최대화한다. 조직에 들어 외인성 형광 표시기를 자극하기 위해, 다른 광원, 조명 모드가 이용 될 수있다. 펄스 지역 필드 형광 현미경 (3), 12 (PLFFM)를 사용하여 우리의 선구적인 연구는 저가의 피코 초 레이저 (그림 1a, PLFFM)를 사용. 광원이 유형의 실질적으로 인한 색소 표백 않고 조명 영역 하에서 형광 분자의 흥미로운 큰 분획의 큰 장점을 갖는다짧은 펄스 (12) 기간. 게다가 초단 펄스의 사용은 염료 (12)의 형광 수명의 평가를 허용했다. 형광 수명은 칼슘 결합 염료 분자의 비율을 정량하는 데 사용될 수있는 특성이다. 불행히도, 펄스 간에서 진폭 펄스 및 변화의 시간적 터링 색소에 결합하는 리간드에 의해 생성 된 형광의 변화가 큰 경우에,이 실험 전략의 적용을 제한한다. 연속파 (CW) 레이저는 일반적 LFFM (도 1b, CLFFM)의 메인 조명 원으로 사용된다. 레이저 빔은 연속 조직을 조명하거나 ferroelectrically 변조 될 수있다. 빔의 강유전체 변조 마이크로 광 펄스를 생성 할 수있다. 이 변조는 외부의 하드웨어에 의해 제어 될 수있다. 이 절차는뿐만 아니라 극적으로 t을 감소그는 광 펄스의 시간적 지터하지만, 또한 서로 다른 파장의 광선을 혼합 할 수 있습니다. 보의 혼합은 다른 레이저에서 다중 광선에 의해 수행된다. 결과적으로, 상이한 스펙트럼 특성을 가지는 다수의 염료는, 예를 들면, 생리 학적 변수의 다양한 측정을 수행하도록 기대 될 수 루비로드 -2- 세포질 칼슘 들면 MagFluo4 인트라 SR 칼슘 및 디 -8- ANEPPS 대한 대 막 잠재력. LFFM의 광원으로서 레이저가 본 다양한 장점 있지만, 광원의 다른 유형의 발광 다이오드 (LED)를 포함하여 사용할 수있다. 이 경우, 상기 여기 광원은 InGaN으로 LED (도 1C, PLEDFM)로 구성되었다. 전도대의 전자가 가전 자대의 정공과 재결합 할 때의 LED에서 광자 자발적 방출된다. 고체 레이저와의 차이는 발광 다른 광자에 의해 자극되지 않는다는 것이다. 이것은 비 - 간섭 성 빔의 결과LED의 넓은 스펙트럼 방사. 하이 파워 LED의 종류가 사용될 수있다. 디 -8- ANEPPS 및 CA에 대해를 사용하여 AP의 레코딩을위한 2+ 과도 FLUO-4 또는 크기 - FLUO-4, 우리는 485 나노 미터 (블루), 20 nm의 절반 폭의 전형적인 피크 방출을 갖는 LED를 사용하여 기록 (그림 1D). 루비로드-2로 기록 칼슘 과도를 들어, LED는 540 nm의 (녹색), 35 nm의 (도 1D)의 절반 폭 일반적인 발광 피크를 가지고 있었다. LED는 밴드 파장에서 방출하기 때문에 자신의 스펙트럼 방사를 좁힐 필터를 필요로한다. 또, 펄스 광은 20 μs의 지속 시간 1.6 kHz의 속도로 생성 될 수있다. LED는 빠르고 전력 MOSFET 전계 효과 트랜지스터로 펄스 하였다. 다른 지표 동시 녹화 시간 다중화 LED에 의해 수행 될 수있다. 불행히도, LED에 의해 방출 된 광은 레이저 광과 비교하여 광섬유에 초점을 더 어렵다. 따라서, 우리의 주요 단점LED를 보내고 그들의 방출 프로파일 메인 축으로부터의 각도 변위 (± 15 °)를 가지며, 보조 광학 그것을 보정하기 위해 사용되어야한다는 것이다. 전술 한 광학 모든 구성에서, 여기 광은 다이크로 익 미러의 ​​도움으로 반사된다. 빔이어서 조직에 위치하는 다중 모드 광섬유 상에 비구면 렌즈는 현미경 대물 렌즈에 의해 집광된다. 모든 표면 형광 장치에서와 같이, 다이크로 익 미러는 출사 된 광으로부터 음원을 분리하는 역할을한다. 방출 된 빛의 스펙트럼은 반영 여기를 제거하기 위해 다시 차단 필터를 통해 이동한다. 마지막으로, 출사 광은 광 검출기 (도 1) 상에 목적으로 집중된다. 전류 빛의 전달은 실리콘 애벌 런치 포토 다이오드에 의해 수행된다. 이 다이오드는 빠른 응답 및 낮은 광 검출을 허용하는 높은 감도를 가지고있다. 그만큼애벌랜치 포토 다이오드에 의해 생성 된 광전류는 두 가지 방식으로 증폭 될 수있다 : 트랜스 임피던스 증폭기의 전압 (도 1F)로 전류 변환하는 저항성 피드백 요소 (도 1E)을 갖는 또는 적분기로. 첫 번째 방법을 사용하여, 출력 전압과 광전류 피드백 저항에 비례한다. 피코 초 레이저 펄스의 저항 검출의 전형적인 예는도 2a, 2b 및 2c에 도시되어있다. 패널 2a는 트랜스 임피던스 증폭기의 출력을 도시하고 패널 (2B)은 별표 (*)로 표시된 구간의 시간 전개를 보여준다. 피크 추적 알고리즘은 형광 응답 (12)의 피크 (적색)과베이스 (녹색)을 검출하도록 실시 하였다. 기본 형광 측정은 주변 조명기구에 의해 도입 된 애벌랜치 포토 다이오드의 암전류와 간섭 양자의 정보를 제공한다HT 및 전자기 커플 링. 피크 염기의 표현은도 2c에 도시된다. 이 그림은 박동 잉꼬 심장의 심장주기 동안 2 + 칼슘 결합 염료 (루비로드-2)에 의해 방출되는 형광을 보여줍니다. 두 번째 방법에있어서, 상기 적분기의 출력 전압 및 전류 피드백 용량의 함수이다 (도 2D, 2E 및 2F). 어떤 외부 조명과 제 1 및 펄스 LED로부터인가 된 광 펄스와 두 번째 그림 2 층은 두 개의 연속적인 통합주기를 보여줍니다. 자세한 설명은도 2g과 2 시간에 제시되어있다. 이 접근법은 더 힘든 있지만 의한 피드백 커패시터의 열 잡음의 부재로 큰 S / N을 제공한다. 기기는 여기 광을 모두 제어 다중화를 생성하고 headstage 통합 및 입술 명령하는 타이밍 단을 포함등 기간. 이것은 일반적으로도 데이터의 온라인 회귀 계산으로 통합 된 출력 신호의 디지털 미분을 행하는 디지털 신호 처리 회로가 수행된다. 저항 피드백을 사용하는 경우에는, 어느 A / D 수집 보드를 사용할 수있다. 마지막으로, 우리 LFFM 기법 다용도이며 하나 이상의 영역으로부터 기록하도록 구성 될 수있다. 빛의 경로에 빔 스플리터를 추가하면 우리는 두 개의 광섬유로 빛을 분할 할 수 있습니다. 각 광섬유는 그 외인성 형광 프로브로부터 독립적으로 여기시키기 조직 기록 방출 서로 다른 영역에 배치 될 수있다. 이 수정은 생리 학적 변수에 영향을 미치는 방법을 해부학 적 지역적 차이 평가하기 위해 우리를 허용합니다. 도 3은 두 개의 광 화이버는 전층 전기 또는 세포를 측정하기 위해 사용되는 CW 여기 광을 분할하기 위해 사용되는 빔 스플리터를 도시한다 [칼슘] 레벨 재치시간 마이너 침입. 전층 신호는 하나의 내막의 섬유 심실 벽의 외막 층의 다른 배치하여 기록 할 수있다. 따라서, LFFM 기술은 상이한 영역에서 셀룰러 신호의 시간 경과를 측정하는 기능이 지역 변경 병리학 적 상황에서 발생하는지 테스트하는데 사용될 수있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7786-30-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hyrdoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2um nylon membrane filter</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>7402-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manifold MPP</td>
			<td>Warner</td>
			<td>64-0216&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21G1.5 Precision glide needle</td>
			<td>B-D</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture)</td>
			<td>AllMech Tech</td>
			<td>LOOK-SP105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium injection 1000USP/mL</td>
			<td>AllMech Tech</td>
			<td>NDC63323-540-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO D8779</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>856925-71-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127 20% solution</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>59004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materflex C/L peristaltic pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>77122-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isostim stimulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>A320RC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waveform generator</td>
			<td>Teledyne Lecroy</td>
			<td>WaveStation 2012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner FS20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1533530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing ID:1/32&#34; OD:3/32&#34; Wall 1/32&#34;</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>TET-031A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing ID:3/32&#34; OD:5/32&#34; Wall 1/32&#34;</td>
			<td>Component Supply</td>
			<td>TET-094A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter luer lock to 3-way valve</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-31200-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tee adapters and plastic fittings</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>6365-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic clamp</td>
			<td>WaterZoo</td>
			<td>2465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>TE-127-2.0-2.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod-2AM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R1245MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-8-ANEPPS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D3167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mag-Fluo-4AM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>M14206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acupunture needles</td>
			<td>LHASA</td>
			<td>TC1.20x13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mL BD syringe with luer-lok</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-820-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabView</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed vacuum Eppendorf Vagufuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-748-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital signal processing circuit DSP TMS 320</td>
			<td>Texas Instrument</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Longpass Dichroic mirror 567nm</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>DMLP567L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>Stock# 33-437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>Stock# 33-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Longpass colored glass filter 590 nm&#160;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>FGL590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green Nd-YAG laser 532nm, 500mW</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator for laser</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>MX130R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode fiber optic 200&#181;m NA 0.39</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>FT200UMT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEDs blue</td>
			<td>Lumileds</td>
			<td colspan="2">L135-B475003500000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEDs green</td>
			<td>Lumileds</td>
			<td colspan="2">L135-G525003500000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cube beam splitter, non-polarizing</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>BS007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36&#34; Length, Dovetail Optical Rail</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>54-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5&#34; Width, Dovetail Carrier</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>54-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.75&#34; Travel, micrometer stage</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>37-983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dovetail optical rail 3&#34;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>RLA075/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dovetail rail carrier 1&#34;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>RC1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avalanche photodiode Helix 902</td>
			<td>Digi-Key</td>
			<td>HELIX-902-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective holder XY Translator&#160;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>ST1XY-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum breadboard 6&#34;x6&#34;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>MB6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexus otpical table 4&#39;x6&#39;</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>T46HK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel cap screws</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>HW-KIT5/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic&#160; sheet</td>
			<td>Home Depot/Lowes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard Silicone elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy gel&#160;</td>
			<td>Walmart/Home Depot</td>
			<td>2-part 5 min clr 1oz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21G1.5 Precision glide needle</td>
			<td>B-D</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23G Precision glide needle</td>
			<td>B-D</td>
			<td>305145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting base, 25mmx75mmx10mm</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>BA1/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire shelve posts 36&#34;</td>
			<td>Alera</td>
			<td>AALESW59PO36SR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire shelves</td>
			<td>Alera</td>
			<td>ALESW582424SR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post and angle clamp</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>SWC/M-P5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe for dye chamber</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>W851020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber stopper</td>
			<td>Home Science Tools</td>
			<td>CE-STOP01C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

local field fluorescence microscopy: imaging cellular signals in intact hearts

심장에서 분자 신호 전달 연구는 일반적으로 고립 된 근육 세포에서 수행된다. 그러나, 허혈 및 부정맥과 같은 많은 병리학 적 상황은 완전히 전체 기관 수준에서 잘 이해 될 수있다. 여기서는 본래 심장 세포 신호를 측정 할 수 있도록 로컬 필드 형광 현미경 (LFFM) 분광 기법을 제시한다. 이 기술은 랑겐 돌프 관류 심장 및 형광 신호를 기록하는 광 화이버의 결합에 기초한다. LFFM 정상 및 병적 상태에서 마음을 연구하는 심장 혈관 생리학의 분야에서 다양한 응용 프로그램이 있습니다. 다중 심장 변수는 상이한 형광 표시기를 사용하여 모니터링 할 수있다. 다음은 세포질 [칼슘 2 +] 내 근질 세망 [칼슘 2 +]와 막 전위를 포함한다. 외인성 형광 프로브 흥분 방출 된 형광 LFFM의 표면 형광 기법의 세 가지 다른 배열 검출이 논문에서 제시 s의. 이러한 기술들 중 중앙의 차이는 여기하고 상기 여기 광을 변조 방식에 사용되는 광원의 종류이다. 연속파 LFFM (CLFFM)는 연속 여기 레이저 광을 사용하는 반면 펄스 LFFM (PLFFM)의 레이저 광 펄스를 사용한다. 마지막으로, 발광 다이오드 (LED)는 제 3 광원으로 사용했다. 이 비 간섭 장치는 펄스 형 LED 형광 현미경 (PLEDFM)라고한다.

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Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts

중심부에 위치한 분자 이벤트는 기관의 전기 및 수축 기능을 조정. 여기에 제시된 지역 필드 형광 현미경 기술의 집합은 그대로 마음에 휴대 변수의 기록을 할 수 있습니다. 심장 기능을 정의하는 메커니즘을 확인하면 마음이 병적 인 상황에서 어떻게 작동하는지 이해에 중요하다.

지역 필드 형광 현미경 : 본래 마음의 세포 신호 이미징

In the heart, molecular signaling studies are usually performed in isolated myocytes. However, many pathological situations such as ischemia and ...

local-field-fluorescence-microscopy-imaging-cellular-signals-intact

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.2K 조회수.  University of California, Merced.  중심부에 위치한 분자 이벤트는 기관의 전기 및 수축 기능을 조정. 여기에 제시된 지역 필드 형광 현미경 기술의 집합은 그대로 마음에 휴대 변수의 기록을 할 수 있습니다. 심장 기능을 정의하는 메커니즘을 확인하면 마음이 병적 인 상황에서 어떻게 작동하는지 이해에 중요하다. 

비디오: Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Actually what I'm gonna do, mount it in here first and then swap out You. So now I'm gonna aspirate try and be as gentle as possible.Okay. A few seconds just holding.Okay.Alright.So the important features of our lifestyle imaging grid are that, so it's an inverted scope, which means the objective, the samples here in the objective is underneath. So the objective is pointing up and the whole scope, or practically the whole, practically the whole scope, including the objectives and the sample are at 37 degrees. So everything in this plastic box is at 37 degrees.And right on top of the stage we have an air and CO2 mix. That is 5%CO2. So the idea is that the sample is actually in a cell, it's like a cell incubator.And so we have, this is our mixer for the air and the CO2 and, and it gets humidified and heated and then piped onto the, the sample on the stage.Okay. And today we're just gonna be doing fluorescence one channel GFP fluorescence. This is the hose that the CO2 and 5%CO2 goes in and it just fits into the stage holder.That's important. And then we can close these, take these down, and then we go to our first position. And what I'm gonna do is go to the first field, which is my control sample, and I'll pick positions based on what I see on the screen.So I just make sure I actually look into the microscope in each new, well, because the focal plane for each of the wells is different, the, the dish is not perfectly flat on the bottom. So you will need to make fine adjustments when you move from well to the well. So right now I'm on the first, well, what I'll do is I'll focus, so I just hit, I just told, I just turned on the light, the transmitted light for the microscope.And I have make sure all the light is going to the eye pieces. And so I just look in, make sure I get a nice clean field. And then what I'll do is turn that light off, turn the fluorescence light on, make sure the cells that I'm looking at look healthy and they're not apoptotic.And, and I turn that off. And what I do next is send, so now I'm gonna start picking positions, which means I have to te send the light path to the camera. This is the camera right here.So I tell the microscope to send all the camera, they don't see anything in the eye pieces. What I'll do is in the software controlling the microscope, I'll choose the right filter set, which for our purposes is psy. And then set an exposure time.And I know these cells very well and I know that they take a 0.2 second exposure time. So I tell, that's what I tell the software to do. And what I'll do is hit focus.This is, and it's basically just alive. The, A light will turn on and you can, oh, I don't know if you can see cells, but the reason this is a good field is because there's, all the cells are, even in terms of their fluorescence, There are no apoptotic cells. Apoptotic cells tend to be very bright and there's no dirt or schmutz in the field.And you can see that they're actually, this is a metaphase cell and that's a metaphase cell, that's a cell that's probably just exited mitosis. And I can just tell that because it looks like those are, those two sets of chromatin are very nicely oriented to each other. Like they just exited an face.So that's a good field. So, and now that I know that the exposure time and the filter set is correct, and this is gonna be software specific, I'll go and I'll take positions and now the software has memorized the X, Y, Z position of that field. And then when I do pick another field, it's, and I'll, so when I'm picking, when I'm picking new fields, but in the same, well, I'll use the, I'll move the i'll, I'll turn the shutter, I'll open the shutter and I'll look to see what I see on the screen and I'll pick fields based on that versus looking in the field.So I don't see any of my tonics in there. But again, even nicely centered, these cells will go through my PS I continue, here's a good example. Here's a good example of what I would avoid that, see how bright that is?That's very bright. That's probably remnants of an apoptotic cell. And the reason I would avoid that is because since it's so bright, when the software auto focuses, it will autofocus just on that and it won't be in the same plane as all these other cells.And so I won't get any information from that field. That looks nice. There's a, this is a pro metaphase right here, That's A metaphase.So, and I'm gonna take three positions per well. So that was three positions and now I'm going to go to my next Well, so you can, so what I will probably do is take images every 10 minutes. So it's a compromise.Lifestyle imaging is always a compromise, right? You have to image, you have to keep the cells healthy, especially if you're interested in mitosis. So you have to minimize their exposure to the fluorescent line.And, but you wanna get information. So you have to take images, you have to, so you have to compromise, you have to make a choice about what you want to capture, what kind of information you wanna capture. For our purposes, mitosis tends to take about an hour.So if we're taking 10 minute intervals, that's pretty good. We see prophase, we see metaphase, we see anaphase, and we can, we can see when there are, there are treatments or drugs or siRNAs that affect those specific cell cycle stages. So for our purposes, that's enough, but we always want more.We always want more positions or finer time and interval or something like that. So it's a compromise. So, and then I'll hit start.And so our software, it does an autofocusing pass on the first pass. So once I hit start, it should start auto autofocusing and you'll see the shutter open, open and close between auto focusing. So I'll hit start.So that's the shutter opening and closing. The Z motor is engaging and it's actually trying to find the plane with the most contrast, which will be the most in focus. You can actually see on the screen going in and out of finding the best plane of focus that might be worrisome.So what it does is it, it drives the Z motor to find the best, the most in focus plane focus, well the most in image. And then it acquires picture there and then it learns that Z position. And then we'll use that Z position for the next 12 passes.And then we'll do the auto focusing pass again. What Kind of experiments do they do? Okay, so our lab is mostly interested in understanding what regulates mitic progression, or at least I'm most interested in understanding that.So with live cell imaging and especially our multi position, long-term imaging scope, you can take, you can film cells for two or three days entering anding mitosis, and you can image multiple rounds of mitosis so you can understand. And then you can put drugs or RNAs or any kind of perturbations on the cells that you would like to study. So you can understand how, how those drugs or, or genes are, are important in regulating mitotic progression.Because it's not fixed cell work and live cell work, you can understand what, when you need to have a perturbation to affect mitosis or what stage of mitosis is affected. So it's really powerful in that respect. What, what are the main technical elements of this experiments?What are the possible problems? Well, the biggest problem besides getting the rig set up, getting the rig set up is not trivial. A lot of people have the rig, but just making sure it works well for your application.The financial element is not, you know, is not small. So there's the setting up of the apparatus and then, and then once you gather the data, there's a real data analysis issue. It takes these movie, if, so, if you're gathering 40 movies each with 30 cells, so you have 40 in 40 fields that you just filmed and each of those fields has 30 cells, then you have to sit down with each one of those movies and look at each one of those cells in that movie.So it takes a really long time to do data analysis. And that's, so it takes a week to analyze data that it took you two days to collect. So there's a, that's a very big obstacle in terms of gathering lots of data.So it's not, while it's high throughput data collection, it's not high throughput analysis. So what would you make to make this experiment really high throughput? So our lab is in the process of developing a program that does the data analysis automatically.And it's a pretty decent program. It's not perfect. The human eye is always better, but it's getting there.So What are the interesting application of this experiment? Maybe other fields you can mention? Besides cell division?You mean for the, oh, for the live cell imaging? Yes.Well, you can do cell motility assays. You can, depending on the, the microscopy that's involved, you can, you know, look at how cells, you could look at tumor development if you really wanted to.But there, you, you're, if as long as you have the right imaging set up, you can, you're pretty much not limited in terms of anything. Our scope happens to be just a wide field and we use 20 by 20 x objective. So it's a pretty low resolution set up, but that's sufficient for what we need to see.So there are, but there definitely aren't, you wouldn't be limited. Anything that has any dynamic kind of experiment, which is biology, it would be, would really benefit from lifestyle imaging. So calcium imaging, although you couldn't do it on our apparatus, that's a live cell.You definitely need live cell imaging for that. Like I said, patient assays, motility assays, those kinds of things would really benefit from live cell imaging. Would you like to tell a few words about your previous experience?How long do you work on these techniques? What do you you work on before? Wow.So in my PhD I didn't work.I did a lot of confocal microscopy, but no lifestyle imaging. And so during my postdoc I was, I helped Dr.King get this apparatus that, that we just used to set up these fragment, get that up and running. And, and so during my postdoc, I had a lot of experience with both widefield with TimeLapse imaging on our scope, which is the widefield and also TimeLapse imaging with confocal microscopy.And I would say that it's really powerful. You get a lot of information, but it's not easy to get working perfectly. So it really requires a lot of attention and a lot of attention to details at every little step of the process.And, and then you still have problems. So it's a tough application, but you can really get, if, if it's what you need to have to, to study your problem, your scientific problem, then it, it's invaluable in that respect, but it's tough. So find someone who knows what they're doing and use them.That's my advice. So good.

와이드 필드 현미경을 사용하여 장기 이미징 포유 동물 세포

연구

생물학

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective imaging of fluorescent molecules that are closest to a high refractive index substance such as glass1. In this article, we apply this technique to image exocytosis of synaptic vesicles in retinal bipolar cells isolated from the goldfish retina. These neurons are very suitable for this kind of study due to their large axon terminals. By simultaneously patch clamping the bipolar cells, it is possible to investigate the relationship between pre-synaptic voltage and synaptic release2,3. Synaptic vesicles inside the bipolar cell terminals are loaded with a fluorescent dye (FM 1-43&reg;) by co-puffing the dye and a ringer solution containing a high K+ concentration onto the synaptic terminals. This depolarizes the cells and stimulates endocytosis and consequent dye uptake into the glutamatergic vesicles. After washing the excess dye away for around 30 minutes, cells are ready for being patch clamped and imaged simultaneously with a 488 nm laser. The patch pipette solution contains a rhodamine-based peptide that binds selectively to the synaptic ribbon protein RIBEYE4, thereby labeling ribbons specifically when terminals are imaged with a 561 nm laser. This allows the precise localization of active zones and the separation of synaptic from extra-synaptic events.

In this video, we demonstrate how to label and visualize single synaptic vesicle exocytosis and trafficking in goldfish retinal bipolar cells using total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy.

TIRF 현미경과 망막 바이폴라 세포 이미징 Exocytosis

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

서브 세포 해상도 손상 Drosophila의 애벌레의 생체내 이미징에서

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

신속한 분석 및 형광 현미경 이미지의 탐사

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, because of laborious and time-consuming protocols that also demand experience in preparation of artifact-free samples, TEM is not considered a user-friendly technique. Traditional sample preparation for TEM used chemical fixatives to preserve cellular structures. High-pressure freezing is the cryofixation of biological samples under high pressures to produce very fast cooling rates, thereby restricting ice formation, which is detrimental to the integrity of cellular ultrastructure. High-pressure freezing and freeze substitution are currently the methods of choice for producing the highest quality morphology in resin sections for TEM. These methods minimize the artifacts normally associated with conventional processing for TEM of thin sections. After cryofixation the frozen water in the sample is replaced with liquid organic solvent at low temperatures, a process called freeze substitution. Freeze substitution is typically carried out over several days in dedicated, costly equipment. A recent innovation allows the process to be completed in three hours, instead of the usual two days. This is typically followed by several more days of sample preparation that includes infiltration and embedding in epoxy resins before sectioning. Here we present a protocol combining high-pressure freezing and quick freeze substitution that enables plant sample fixation to be accomplished within hours. The protocol can readily be adapted for working with other tissues or organisms. Plant tissues are of special concern because of the presence of aerated spaces and water-filled vacuoles that impede ice-free freezing of water. In addition, the process of chemical fixation is especially long in plants due to cell walls impeding the penetration of the chemicals to deep within the tissues. Plant tissues are therefore particularly challenging, but this protocol is reliable and produces samples of the highest quality.

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

탠덤 고압 냉동 및 투과 전자 현미경을위한 식물 조직의 빠른 동결 교체

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

이미징 로컬 CA<sup&gt; 2 +</sup&gt; 배양 된 포유 동물 세포에서 신호

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, excessive ROS levels induce a state of oxidative stress, which is accompanied by irreversible oxidative damage to DNA, lipids and proteins. Thus, quantification of ROS provides a direct proxy for cellular health condition. Since mitochondria are among the major cellular sources and targets of ROS, joint analysis of mitochondrial function and ROS production in the same cells is crucial for better understanding the interconnection in pathophysiological conditions. Therefore, a high-content microscopy-based strategy was developed for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, mitochondrial membrane potential (&#916;&#936;m) and mitochondrial morphology. It is based on automated widefield fluorescence microscopy and image analysis of living adherent cells, grown in multi-well plates, and stained with the cell-permeable fluorescent reporter molecules CM-H2DCFDA (ROS) and TMRM (&#916;&#936;m and mitochondrial morphology). In contrast with fluorimetry or flow-cytometry, this strategy allows quantification of subcellular parameters at the level of the individual cell with high spatiotemporal resolution, both before and after experimental stimulation. Importantly, the image-based nature of the method allows extracting morphological parameters in addition to signal intensities. The combined feature set is used for explorative and statistical multivariate data analysis to detect differences between subpopulations, cell types and/or treatments. Here, a detailed description of the assay is provided, along with an example experiment that proves its potential for unambiguous discrimination between cellular states after chemical perturbation.

This paper presents a high-content microscopy workflow for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, as well as mitochondrial membrane potential and morphology &#8211; jointly referred to as mitochondrial morphofunction &#8211; in living adherent cells using the cell-permeant fluorescent reporter molecules 5-(and-6)-chloromethyl-2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester (CM-H2DCFDA) and tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

고감도 현미경을 이용한 세포 산화 환원 프로파일 링

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to understand where and when transcription is taking place within nuclear space and to visualize the relationship between episomes infected within the same cell's nucleus. Here, both immunofluorescence (IFA) and RNA-FISH have been combinedto identify actively transcribing Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) episomes. By staining KSHV latency-associated nuclear antigen (LANA), it is possible to locate where viral episomes exist within the nucleus. In addition, by designing RNA-FISH probes to target the intron region of a viral gene, which is expressed only during productive infection, nascent RNA transcripts can be located. Using this combination of molecular probes, it is possible to visualize the assembly of large viral transcription factories and analyze the spatial regulation of viral gene expression during KSHV reactivation. By including anti-RNA polymerase II antibody staining, one can also visualize the association between RNA polymerase II (RNAPII) aggregation and KSHV transcription during reactivation.

Viral transcriptional factories are discrete structures that are enriched with cellular RNA polymerase II to increase viral gene transcription during reactivation. Here, a method to locate sites of actively transcribing viral chromatin in 3D nuclear space by a combination of immunofluorescence staining and in situ RNA hybridization is described.

기능 이미징 3D 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 바이러스 성 녹음 방송 공장

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...