이 논문에 제시된 연구 작업은 캐서린 샌드버그에 부여 R01 HL121456-01A1에 의해 지원되었다. 이 작품은 부분적으로 미국의 국립 보건원 (National Institutes of Health)에서 P30-CA051008에 의해 자금 지원 조지 타운 대학 의료 센터에서 현미경 및 이미지 공유 자원 (MISR)에 라이카 SP8 AOBS의 가용성에 의해 추가로 지원되었다. 우리는 기꺼이 라이카 SP8 영상 피터 존슨 안내, 칼 자이스 현미경 LLC의 알마 아놀드가 제공하는 영상 지원과 조지 타운 대학의 토마스 Coate, 생물학과의 실험실에서 자이스 혈구 LSM880의 사용을 인정합니다. 이 원고의 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다.

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	<li>Dale, L. B., Seachrist, J. L., Babwah, A. V., Ferguson, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+angiotensin+II+type+1A+receptor+intracellular+retention,+degradation,+and+recycling+by+Rab5,+Rab7,+and+Rab11+GTPases.">Regulation of angiotensin II type 1A receptor intracellular retention, degradation, and recycling by Rab5, Rab7, and Rab11 GTPases.</a> J Biol Chem. 279 (13), 13110-13118 (2004).</li><li>Hein, L., Meinel, L., Pratt, R. E., Dzau, V. J., Kobilka, B. 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저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

여기에 제시된 예비 실험은 24 분의 비교적 짧은 시간 과정 동안, 리소좀에 AT의 1A R-GFP의 전달에는 상당한 변화가 발생하지 않았 음을 보여줍니다. 일반적으로 리소좀에 내면화 수용체의 전달은 빠르면 15 ~ 20 분으로 발생할 수 있습니다. 이 실험은 1A의 R AT 내면화의 대부분이 큰, 핵 주변 엔도 좀을 대상으로 가설과 일치한다. R은 리소좀에 도착 1A AT 적어도 일부는 리 등에 의해 입증되었다 증거. , 중앙 II 처리 후 5 분 및 30 분에서 세포를 비교하여 30 AT 1A는 R과 램프 1 상당한 colocalization을 발견하지만 5 분 6 사람들. 이 논문은 세포 준비, 이미징 및 분석 단계에 대한 자세한 설명을 제공하고이 고급 이미징 기술에 많은 고유의 함정에 대해 설명합니다. 이 방법은 아래에서 설명 중요한 단계에 따라 달라집니다. 세포의 건강 모든 살아있는 세포 이미징 실험에 중요하기 때문에, 때문에 성장 속도 및 높은 통로에서 형질 전환 효율의 변화의 통로 (11)를 넘어 세포를 사용하지 않는 것이 중요하다. 리포좀 용액 증가 막에 blebbing 입증 세포에 독성이 있기 때문에 전체 실험 건강한 세포를 유지하기 위해 세포 형질 믹스 잠복기 5 시간을 초과하지 않아야한다. 온도, 습도 및 CO 2 제어 전뿐만 아니라 촬상시 중요하다. 촬영하는 동안 온도 드리프트는 상대적으로 주요 Z-섹션 감도와 초점면 안정성의 손실이 발생할 수 있습니다. 따라서 별도의주의 초점면 정확하게 유지되도록 이미징 동안 세포에 중앙 II의 첨가시 권장합니다. 영상 고정 된 세포를 사용하여 면역 세포를 통해 라이브 영상의 장점은생체 내 조건은 면밀히 조절 될 수 있고, 고정 세포와 관련된 이슈를 회피 할 수있다. 그러나, 라이브 세포 이미징은 수용체 내재화처럼, 매우 빠른있는 세포 과정을 최적화하기 어려울 수 있습니다. 악기 속도 한계를 연구 할 수있는 이벤트의 선택 photobleaching에 방지 할 필요가있다. 각 영상의 실험은 다른 사람의 일부 매개 변수와 타협에 만들어 질 어떤 선택을 요구할 수 있습니다; 예로는 분석 양질의 데이터를 얻는 동시에 오버 샘플링을 피하기 위해 화소 크기, 광고의 축적, 줌 배율 및 주사 속도의 선택. 이러한 요소의 중요한 결정 적절한 화소 개별 소체를 구별하는 크기와 발생하는 이벤트의 충분한 시간 해상도를 얻기위한 요구를 얻기위한 필요성의 균형에 의존한다. 따라서 약간의 절충은 세포가 GFP 표지 수용체를 내면화하기 시작 신속하게 정보를 획득하기 위해해야합니다. 우리의현대 촛점 소프트웨어 최적의 픽셀 크기를 제안 할 수 있지만 경우에, 실험은 나이 퀴 스트 수학 식 14에 따른 최적의 픽셀 크기보다 작은 값을 사용 하였다. 다른 실험에 대한 설정의 최적 선택은 더 큰 픽셀 크기가 더 광자를 수집하는 데 시간이 더 복셀 체류 시간과 무역을 허용하는 광자의 빠른 축적을 가능하게하기 때문에 세포가 얼마나 밝은에 따라 달라집니다. 분석이 성공하려면, 라이브 세포 이미징은 비판적으로 시간 경과 이미징 동안 정확한 초점 안정화가 필요합니다. 이미지에 초점 이동과 실패는 전체 세포 수용체 내재화의 정량에 따라 지대한 영향뿐만 아니라 전체 휴대 GFP 강도를 가질 수 있습니다. 중앙 II를 첨가 한 다음 영상의 빠른 시점 동안 초점의 이동이 문제의 해결책은 오토 포커스 용액의 형태로 촛점 제조업체가 제공되어있다 커버 슬립의 interferom자동 초점 제어 피드백과 함께 적외선 레이저 etry는 IR 반사에 의해 식별 된 커버 슬립 표면 대물로부터의 상대적인 거리를 유지하기 위해 사용된다 (예를 정한 포커스 또는 포커스 적응 제어). microscopist의 나머지 문제는 형상의 변화에도 불구하고, 전체 셀은 촬상 공간에 유지되도록 올바른 Z 범위를 식별 한 후이다. 온도 중앙 II의 첨가 후 초기 시점 동안 포커스 / Z 위치를 유지하는 또 다른 중요한 인자이다. 목적의 온도뿐만 아니라, 생균 촬상 챔버 실험 내내 37 ℃로 유지되어야한다. 영상의 또 다른 중요한 요소는 정량적으로 이미지를 획득한다. HYD 검출기가 광자 개수 모드에서 사용되는 경우 그 광자 연쇄 충돌이 발생하지 않도록, 촬상 파라미터를 설정해야한다. 의 PMT 및 기타 감지기를 들어, 이미지가 포화 픽셀 (복셀)를 포함 할 수 없습니다. 두 경우 모두에서, SPE룩업 테이블 (LUT)은 그들이 존재하는 경우 포화 화소 물론 존재를 가시화하는 데 사용될 수 cialized 상기 microscopist 레이저 강도 및 / 또는 이득을 감소시켜야한다. 분석 여기서 설명하는 접근법은 AT 1A는 R 수용체 리소좀과의 colocalization을 적용하고 있지만, 다양한 형광 태그로 표지 된 세포 내 구획에서 수용체의 상대적인 양이 질문에 인 실험에 적용 할 수있다. 목표는 다음 소기관 마커로 피어슨 colocalization을 계수를 이용하여 상기 소기관으로 여부 수용체 움직임을 측정하는 경우에 문제가된다. 계수들 중 하나는 항상 100 %에 가까운 것되도록 소기관 식별되는 모든 픽셀 마커의 많은 양을 가질 것이다. 따라서, colocalization을 측정 오해의 소지가있을 수 있습니다. 한편, 에르 총량 대 소기관에 수용체의 비율을 측정토르는 훨씬 더 유익하고 해석 명확하다. 단백질 colocalization을 가장 피어슨의 상관 계수를 이용하여 설명 될 수있는 경우에, 그 상호 작용을 더 정교한 colocalization을 방식, 즉 FLIM / FRET (6)이라도보고되었다 (1A)의 R 수용체 LAMP1 AT 것이다. 3D 영상의 사용으로 인해 시간 경과 (라이브 영상이 동영상) 중에 불가피 셀룰러 이동의 2 차원 분석 세포의 대표적인 슬라이스를 사용하는 것보다 더 정확하다. 이도에 도시 된 라이브 셀 이미지로부터 명백한 3 수용체는 주로 그 막 작은 밝은 장소에 편재 중앙 II 노출 몇 분 이내에, 그러나, 세포막에서 지역화 4b 및도 5A 막에 인접, 아마 코팅 피트 초기 엔도 좀 (도 4B를 소포 </strong&gt;, 4C). 시간이 계속 진행으로, 소포는 (5A, 1도, MVEs) multivesicular 엔도 좀 설명 된 핵에 인접한 큰 소포에 3, 15 축적 셀을 통해 이동합니다. 슬라이스가 초기 시간에 세포 표면, 나중에 시간에 MVEs 포함되지 않은 경우 특히 국제화 과정을 왜곡하고 진정한 사건을 잘못 할 시간이 지남에 따라 세포를 통해 한 조각. 이 연구에서, 이미지 분석을위한 방법은 두 가지 정량적 결과에 GFP의 광표백뿐만 아니라 형광 염료의 효과를 최소화 할 수있다. 셀 (제한된 범위이기는하지만) photobleach 같이, 셀 전체 강도에 대하여 내재화 소포의 상대 휘도 광표백 가정하면 균일하게 발생하게 유지된다. 형광 염료 긍정적 인 소포는 쉽게 표준 deviatio을 선택하여 식별밝은 내면화 소포를 임계 화에 대한 평균 형광 강도 옵션 없음. 이 경우에도 형광 감소의 전체 수준과 같은 배경에서 그들을 구별한다. 따라서, 우리의 측정은 겸손 광표백의 영향에 민감하지 않았다. 그러나 시간이 지남에 따라 세포 강도의 강한 광표백과 같은 50 %의 손실을 정량적 결과에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 대안 적으로, 광표백 효과는 대조 실험은 AT의 1A R-GFP의 경우에 형광 염료의 경우는 인접하는 형질 감염되지 않은 세포에서 중앙 II 무채색 독립적으로 측정 될 수있다. 광표백의 효과는 분석 과정에서 고려 될 수있다. 추가 우려 최근, 세포 생물 학자들은 단백질 무관 무관 형광 단백질 자체에 의해 생성 된 아티팩트를 피하기 위해 세포에서 막 인신 매매 모니터링을위한 형광 단백질의 중요한 평가 및 수정을 실시했다g는 태그. 각종 형광 단백질 로컬 미세 단백질 침전 선도 또는 pKa가 년대 아미노산 시스테인의 존재 하에서 각각 16 계 가교제와의 상호 작용에 취약하다. 이러한 상호 작용의 또 다른 결과는 형광 (16)의 손실을 포함 할 수있다. 이 유물은 모두 인신 매매의 정량적 측정에 영향을 미친다. Constantini 등은. 잠재적 인 아티팩트 (16)를 제거하기 위해 시스테인이 결여 이미징 단량체 형광 단백질을 생성했다. 따라서, 모노머에 (아닌 모노머)로부터 EGFP 스위칭 이미징 실험의 목표에 따라 시스테인이없는 형태의 산성 및 / 또는 환원 소포 미세 환경의 연구에 유리할 것이다. 또 다른 예는 FRAP에 대한 자신의 향상 유틸리티이거나 멀티 머화 및 가교 단백질 확산 및 단백질 - 단백질 상호 작용에 영향을 미칠 것이다 실험을 FRET 것이다. <p클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; 추가주의해야 할 점은 EGFP 라벨이 수용체의 정상적인 동작을 수정할지 여부를 테스트하는 것이 중요하다는 것이다. 이 가능성을 테스트하는 한 방법은 야생형 또는 EGFP 표지 된 수용체로 형질 감염 세포에 대한 방사성 리간드 결합 분석을 실시하여 수용체 친 화성 (Kd를)과 최대 수용체 수가 최대 결합 (Bmax)에서 어떤 차이가 있는지를 결정하는 것이다. 또 다른 잠재적 인 이슈는 GFP 융합 단백질과 함께 LysoTracker 레드를 사용하여 리소좀 이미징 때 LysoTracker 레드 그린 (17)에 광 변환 할 수있는 것으로 나타났다 것입니다 고려. 저자는 표면 형광 조명의 사용을 최소화하는 것이,이 이슈의 발생을 논의하고,이 시약을 사용하여 colocalization을 성공적으로 인스턴스를 참조하시기 바랍니다. 또한, 리소좀 다른 마커 colocalization을 같은 결과를 검증하기 위하여 이용 될 수있다, 예를 들어, 6 LAMP1 태그. 미래에,이 분석의 민감도 및 특이도는 18 저하하지만 축적 7을 차단 bafilomycin 사용 리소좀 산성화를 저해함으로써 수용체 소낭 수송 및 / 또는 융합 억제제를 사용하여 리소좀뿐만 아니라 다른 세포 내 구획 대상을 조사 할 수있다 결과적 같은 리소좀 (2)에 표시된 중앙 II의 타겟팅을 양성 대조군으로 사용하여, 리소좀 2, 5, 6, 7, 18 수용체 공동 지역화 차단 리소좀과 융합을 차단하는 클로로퀸을 사용하여, 그리고 서로에 비교하여 잘 이러한 트랜스페린 또는 표피 성장 인자 수용체와 그들의 동족 3과 -described 수용체 리간드 시스템. 흥미로운 양성 대조군하는lbeit artefactual, 우리의 실험에서 1A의 R-GFP 음성 세포 AT, 형질 감염되지 않은 인접한 관찰 한 결과였다. 이 세포는 분명히 형질 감염된 세포에서 방출 GFP를했다 및 형광 염료와 colocalization을 아주 눈에 띄는했다 리소좀에 대상 (도시하지 않음). 예상대로이 colocalization을하지만, 중앙 II에 민감하지 않았다. 결론적으로 여기에 제시된 형질 이미징 및 이미지 분석을위한 방법은 여러 가지 세포 내 구획 수용체 내재화 정량적 시간 동안 살아있는 세포 내에서 추적 될 수있는 수단을 제공한다. 다른 수용체 또는 선택적으로 돌연변이 수용체 사이의 상대 비교는 특정 구획에 대한 반응 속도에 관해서 및 세포 내 현지화로 가능하다. 가능한 어려움이 기술과 관련된 이슈가 논의된다. 그럼에도 불구하고, 이미지 분석과 함께 3 차원 고속 실시간 이미징 수용체 흡수 신속한 측정하는데 사용될 수있다세포질을 통해 전환은 정의 구획을 분자합니다. 이 수용체 작용제 또는 길항제, 및 억제제의 적용 돌연변이로 인한 차이를 측정하는 단계를 설정한다.

전반적인 목표는 수용체 작용제 치료 후 시간과 특정 세포 내 소기관과 수용체의 colocalization을의 공간에서 정량적 증거를 획득하는 것입니다. 따라서, 여기에 즉시 목표 경과 촛점 리소좀의 이미지와 인간 배아 신장 세포에서 수용체 (HEK) 정량적으로 수용체의 전달을 측정하기 위하여 3 차원의 화상 데이터를 형질 다음이어서 조립 분석 걸친 트랜스를 캡처하는 리소좀. 횡단 수용체가 생리 학적 및 병태 생리 학적 조건에 의해 규제되는 방법을 결정하는 데 도움이 수용체 리간드에 의해 활성화되면 세포 내 이입 동안 리소좀 또는 다른 세포 소기관이있는 횡단 수용체의 동시 인신 매매를 조사. 1A AT R 주로 HEK293 촬영 한 대부분 있지만, 모델 전지 시스템의 중앙 II로 처리 다음 리소좀 저하 될 것으로 추정된다리간드, 앙 II의 대량 리소좀 2, 3, 4, 5의 열화 상태 eptors 주로 세포막 나중에 재활용 multivesicular 재활용 엔도 좀에 편재되어있다. 최근 리튬 등. 포스터 공명 에너지 전이 (FRET) 및 형광 수명 이미징 현미경 (FLIM) 기술을 이용하여 증명하는 AT 1A는 R의 colocalizes LAMP1으로 (~ 10 nm의 척도), 리셉터의 적어도 일부에 타겟팅 및 열화되는 것을 제안 리소좀 막 단백질 리소좀 (6)에 의해. 이 저자는 리소좀 억제제 클로로퀸은 클로로퀸의 효과가 리소좀 늦은 엔도 좀 또는 autophagosomes의 융합을 차단하는 것을 제안 이전 보고서와 일치 1A R-램프 1 협회에서 차단 지적했다. 기타 간접 접근 (1A)의 R 리터 AT 결정리소좀에서 ocalization는 리소좀 3, 4, 5, 6, 7, 8 (1A)의 R의 앞에서 추론 리소좀 억제제 bafilomycin 이용했다. 라이브 셀 이미징은 세포 부피 및 GFP-키메라 수용체의 손실 / 디밍 / 재배포에 고정의 잠재적 영향을 방지 할 수 있습니다. 이전 연구 colocalization을하거나 또는 리포좀 등의 수용체 - 결합 대용 표지 생균 사용에 수용체의 동시 발생을 결정 고정 세포 의존 한 β-아레스 1, 2, 3, 4, 5, 6. 회전 디스크 공 촛점 또는 레이저 포인트 스캐닝의 conf를 사용하여 다른 된 GPCR의 라이브 셀 이미징하나로 이루어질 수 또는 HYD 탐지기가 장착 OCAL 현미경은 30 초 간격으로 9, 10 Z-스택에 몇 군데 개별 세포 수용체의 내면화와 인신 매매를 관찰하는 연구자 수있었습니다. 라이브 세포 Z - 스택이 빠르게 수집 그러나 경우에도, 분석은 2D (10)에 즉 각 스택 내에서 단일 평면 선택 후 발생할 수 있습니다. 이 문제의 내재화 GPCR 또는 티로신 키나제 수용체 공부 충분할 수도 있지만, AT 1A는 루피는 시간의 크기와 위치를 변화함으로써 본질적으로 적절하게 각 시점에서 대표적인 단일 슬라이스를 이용하여 시료에 더 어렵 소체에 축적한다. 철저히 셀 통해 크기 및 위치에 다른 소포 각 모집단을 검출하는 1A의 R AT 분류의 경로를 결정하기 위해, 3 차원 영상 및 3 차원 분석을위한 방법은 이러한 변화를 추적하고되도록 고안<html> 이러한 리소좀 등 다양한 세포 내 구획의 표시와 함께 사용. 수사관들은 직접 셀과 중앙 II 자극 다음 세포 내 구획에 그 이전에 AT 1A는 R의 움직임을 시각화하는 라이브 세포 이미징에 대해이 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 세포 내 구획 형광 단백질 키메라 또는 다른 형광 마커 태그. 이 프로토콜은 또한 야생형 수용체 대 비교하는 돌연변이 또는 약물 치료를 다음과 같이 변경을 검출하기 위해 200 nm의 최소 해상도 세포 내 소기관의 수용체를 지역화하는 첫 번째 방법으로 사용될 수있다. 이 라이브 셀 이미징 구비하는 공 초점 현미경에 대해 수행 될 수 있기 때문에이 기술은 액세스. 이 방법의 상대적인 용이성이 증가 전문성과 상호 작용 분자 (6)을 검출 FRET / FLIM / BRET 기술을 수행하는 데 필요한 장비와 대조&quot;외부 참조&quot;&gt; 11. 이러한 측정은 높은 해상도 (~ 10 ㎚)과 세포 내 소기관 내 위치 파악이 유추됩니다에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 정의합니다. 이러한 고급 기술은 후속 또한 분자 관심 작용보다는 세포 내 구획을 통해 수용체 통로를 정의하는 데 사용되며, 이들은 직접 셀 (11) 내에서 특정 시간과 장소에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 보여준다. 화상 취득이 느리기 때문에 FLIM, 억 셉터 농도에 독립적 인 FRET 기술은 주로 고정 된 샘플들에 수행된다. 대조적으로, 비 FRET 빠른 영상과 상호 작용하는 단백질의 고해상도 colocalization을을 제공한다. 비 FRET의 단점은 이미징 위드 에피 형광 이미징 속도를 얻기 위해 감소 해상도 및 세포 기관 (12)의 대조 결과 전체 셀을 포함를 활용한다. 생물 발광 공명 에너지 전달 (BRET)는 다른 인시간 (11)를 통해 분자 근접의 인수를 측정하기 된 GPCR에 적용된 고급 기술. 이 기술에서, 단백질 형광 분자는 분할되고, 각 반 당해 두 단백질 중 하나에 연결. 되면 관심 바인드 두 단백질 서로 키메라 태그의 부분은 형광 시간 동안 정량 증가 형광 취득 조립 재. 여기서 우리는 중앙 II 자극과 중앙 II 자극을 다음과 리소좀에 1A의 R AT 내면화 전달의 전위 변화에 따라 셀에 AT 1A는 R의 인신 매매를 연구하는 이미지 정량화와 결합 라이브 세포 이미징을위한 간단한 방법을 제시한다. 이 기술의 궁극적 인 사용은 야생형과 돌연변이 수용체를 비교 막 인신 매매의 차이를 특성화하는 것입니다. 이러한 차이는 AT 1A는 R leadi는을의 생리 활성 메커니즘 (들)에 영향을 파악하는 데 도움이 될 것입니다혈압 조절 ng 내지.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Angiotensin II (Ang II)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9525&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle medium (DMEM 1X)</td>
			<td>Gibco -ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11960-044</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin (Pen Strep)</td>
			<td>Gibco -ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200mM (100X)</td>
			<td>Gibco (life technologies)</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Embryonic Kidney (HEK)-293 cells</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)&#160;</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td>Passage number 5 -12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Lab-Tek II chambered 1.5 German Coverglass System</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>155409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Store at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM, Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco- ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X&#160;</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP3994</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle medium (DMEM 1X)&#160;</td>
			<td>Gibco -ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31053-028</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red DND-99</td>
			<td>molecular probes -ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L7528</td>
			<td>Store aliquotes in dark at -20 &#176;C .&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity Ver. 6.3 Image Analysis software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Visualization and Quantitation Modules</td>
			<td>For 3D image analysis of image stacks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 AOBS</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>laser scanning confocal microscope</td>
			<td>For image collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 880</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>laser scanning confocal microscope</td>
			<td>For image collection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live cell imaging and 3d analysis of angiotensin receptor type 1a trafficking in transfected human embryonic kidney cells using confocal microscopy

라이브 셀 이미징 동시에 안지오텐신 II (중앙 II) 자극 다음 형질 전환 된 인간 배아 신장 293 (HEK) 세포에서 안지오텐신 1a 형의 (1A의 R AT) 수용체 및 세포 내 구획의 시간 경과 이미지를 캡처하는 데 사용됩니다. HEK 세포를 일시적으로 플라스미드 DNA 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 태그 (1A)의 R AT 함유 형질. 리소좀은 빨간색 형광 염료로 식별됩니다. 라이브 셀 이미지는 중앙 II 자극 후 레이저 스캐닝 공 초점 현미경에 포착 시간이 지남에 따라 세 가지 차원 (3D, 복셀)에서 소프트웨어로 분석된다. 라이브 세포 이미징 수용체 피킹으로 조사 할 수 있으며 정착과 관련된 교란을 방지하고, 특히, EGFP 태그가 막 수용체의 손실 또는 artefactual 변위. 각 셀은 시간을 추적 같이 따라서, 수용체의 세포 내 지역화 묘화하고 측정 할 수있다. 이미지는 sufficientl을 취득해야합니다Y는 빠른 속도로 빠른 소포의 움직임을 촬영합니다. 그러나, 빠른 속도로 영상을 수집 된 광자의 수는 감소된다. 절충안은 이미징 속도를 얻기 위해 같은 복셀 사이즈 촬상 파라미터의 선택에서 이루어져야한다. 라이브 세포 이미징의 중요한 응용 프로그램 이름하지만 몇 가지로 단백질 인신 매매, 이동, 증식, 세포주기, 세포 사멸, 자식 작용 및 단백질 - 단백질 상호 작용과 역학을 공부한다.

이 실험의 대표 세트에, HEK 세포를 N2 및 pEGFP-13 플라스미드로 클로닝 (1A R-GFP AT) 안지오텐신 계 1A 수용체 구성 (E1,2,3-AT 1A는 R)로 형질 감염시켰다. HEK의 시간 경과 이미지 획득 및 동영상 (라이브 셀 이미징 1 라이브 셀 이미징이 동영상 참조)로 연주 하였다. 영화와 스틸 리간드 자극 후 1A AT R-EGFPs는 세포막에 주로 국부 것을 보여 주지만, 중앙 II 첨가 밝은 소체를 형성하는 2.5 분 내에 내부화 될 이들 수용체와 나중에 시간이 크다 소체에 클러스터링 핵 주변 영역 (도 4B, 5, 6A, 라이브 셀 이미징 2). 그림 5 페이지에있는 셀에 대한 총 세포 GFP 강도와 총 소포 GFP 강도의 정량화중앙 II는 파동 운동을 유도하고 세포 모양 변경 사항이 즉시 자극 다음과 같은 경우에 내재 된 합병증의 그림 rovide (그림 5A, 0 분 후 중앙 II에서 화살표를, 상단 행, 오렌지 역치 개체를 나타냅니다). 나중에 시간에서, 핵 주변 클러스터의 GFP 함유 소포의 현지화도 (29.5 분에서도 5a, 빨간색 화살표)을 방해한다. 모든 개체는 전체 셀 GFP 강도 측정에 포함되어야 비록 그들이 1A R-GFP AT 세포막을 나타내는 바와 같이, 주름이 소포 측정에서 제외한다. 반면, 클러스터 된 핵 주변 소포는 (, 후자는도 5a에서 빨간색 원에 포함 된 셀의 영역에서 볼 수 있습니다 29.5 분에서 후 중앙 II, 아래 줄을 화살표) 소포 측정에서 제외되어서는 안된다. 크기 필터링하여이 작업을 수행하기 위해 시도가 주름 및 클러스터 절 차별하지 수 있기 때문에 유용하지 않았다 (이상 또는 이하 7 μm의 3 이상)esicles (도 5a 및도 5b는, 필터&gt; 7 비교할 &lt;7 필터 및 필터 없음). 가능한 대안은 세포의 세포질 부분을 포괄하지만 셀의 파동 운동 가장자리 둘레를 제외 관심 (ROI)의 영역을 그릴 것입니다. GFP 존재하는 픽셀이 포화 되었기 때문에 결국,이 셀은 정량적 결과에 포함되지 않는다. 두 번째 대표적인 예는 오토 포커스 기능을 사용하지 않는 한에서 시간 경과를 나타내는도 6a에 도시되어있다. 내재화 GFP는 %의 총 세포 GFP (그림 6B)로 표시됩니다. 이전의 3 분의 빨간 화살표의 시점은 상기 셀의 일부로서 만 오해되는 것은 촬상 공간으로했지만 중앙 II를 첨가 한 후 3 분은 초점면이 다시 안정. 세포 내 총 GFP이 셀 (도 6c 시간 동안 상당히 photobleach하지 않았 음을 보여<html> ). 소포의 다음 증가 수준 오프 (그림 6B)에서, %의 GFP 강도 3 년 사이 약 12 분. 이어서, 형광 색소로 식별 리소좀는 GFP 강도 (도 6D)의 합계에 대한 정량화 된 형질 감염된 세포 내에서의 ROI를 식별하기 위해 사용되었다. 3 분 후에, 빨간색 확인 된 리소좀에서 AT의 1A R-GFP의 강도는 시간이 지남에 따라 (그림 3D, N = 5, 평균의 ± 표준 오차를 의미) 변화하지 않습니다. 따라서 중앙 II 투여 후 최대 24 분 동안 리소좀에 AT의 1A R-GFPs의 전달에는 검출 증가는 없다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55177/55177fig1.jpg" /> 그림 1 : 조회 테이블 (LUT)에서 확인 된 포화 픽셀. 빨간색 화살표가 파란색으로 표시 포화 픽셀을 나타냅니다.t = &quot;_ 빈&quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55177/55177fig2.jpg" /> 그림 2 : 이미지의 정량화 소프트웨어의 개요. 주요 항목은 숫자로 표시 및 방법 텍스트 내에서 논의된다. 1) 작업 항목, 2) 선택된 이미지, 3) 자유 손 ROI 툴, 4) 측정 탭, 5) 개체 찾기, 6) 인구 1 찾기 개체 대화 상자 7) 화살표가 활성화 시간 경과 영화, 8) 측정 항목, 9) 두 번째 찾기는 필터 인구 명령을 포함하는 대화 상자 개체. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55177/55177fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55177/55177fig3.jpg" /> 그림 3 : 색상 등록 수정. 보정과 이미지수정 화소 등록은 1A의 R-GFP AT 포함하는 여러 colocalizing 소포의 세트와 함께 표시됩니다. 적색 픽셀은 보정되지 않은 화상의 XY 평면 내의 좌측으로 한 픽셀 시프트된다. 세트는 높은 배율에서 박스 영역을 보여줍니다. 스케일 바 = 3.3 μm의, 복셀 크기 = 0.138 X 0.138 × 1 μm의 3. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55177/55177fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55177/55177fig4.jpg" /> 그림 4 : 임계 화의 그림 GFP- 및 형광 염료 함유 소포 및 GFP-전체 세포를 식별합니다. (A) (1A)의 R-GFP (GFP, 맨 윗줄) AT 사용하여 전체 세포의 식별 및 전체 셀 (ID 전지, 아래 행) 0에 표시 2.5 분 중앙 II 첨가 후 있습니다에 대한 GFP를 임계 된. 화이트 박스 기능을 표시(B) 및 (C)에 도시 외 영역. 1A R-GFPs AT (B)는 단일 컬러 이미지의 중앙 II 추가 (맨 윗줄) 후 0, 2, 5 분에 비교된다. 임계 값에 의해 식별 소포는 맨 아래 행 (ID 보이는 군, 보라색)에 표시됩니다. (C) (1A의 R-GFP / 형광 염료 AT) 2 색 이미지는 0과 2.5 분 후 중앙 II뿐만 아니라에 표시됩니다. 임계 값에 의해 식별 리소좀은 빨간색 윤곽선으로 표시됩니다. 스케일 바 = 7.0 μm의, 복셀 크기 = 0.114 X 0.114 X 1.4 μm의 3. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55177/55177fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/55177/55177fig5.jpg" /> 그림 5 : 내면화 GFP 수용체의 측정에 프릴과 클러스터 된 소포의 효과의 그림입니다. (A)<html> 중앙 II에서 T 1A는 R-GFP 0 (맨 윗줄) 2.5 분 (아랫 줄)을에, 첫 번째 열에 필터보다 큰 7 μm의 3 만 선택 객체에 적용된 세 가지 필터링 실험에 도시에서 세포 치료 선택 두 번째 열은 7 μm의 3 이하 개체, 세 번째 열에서 어떤 필터는 사용되지 않았다. 임계 수준은 세 가지 일정이었다. 화살표는 원 이후 시점에서 핵 주위 소포를 포함하는 세포질 영역을 나타내는 큰 역치 개체를 나타낸다. 역치 지역은 오렌지입니다. 소포에서 GFP 총 강도 (B) 정량 또는 (A의 행에 의해)이 시점에서 (A에 열을 기준으로) 크기 필터링없이 역치 영역에 대한 표시됩니다. 복셀의 크기는 X 0.138 × 1 μm의 3 0.138이었다. 스케일 바 = 5.6 μm의. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55177/55177fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> ntent &quot;FO : 유지-together.within 페이지 =&quot;1 &quot;&gt; <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/55177/55177fig6.jpg" /> 그림 6 : 리소좀에서 AT1 R-GFP 국제화 및 잠재적 인 현지화를 추적. (A) LysoTracker 빨강 AT의 1A R-GFP 다섯 선택된 시점 0, 3, 6, 9, 12 분 후 중앙 II에 첨부 된 영화 (생균 촬영 한 동영상)에서 도시된다. 그리드 6.56 μm의 3의 단위 크기를 나타내고, 복셀의 크기는 0.297 X 0.297 X 1.2 ㎛의 (3) 및, Z = 1.2 μm의 단계였다. (B) 시간이 지남에 소포의 퍼센트 총 GFP의 줄거리는 AT의 1A R-GFP의 급속한 국제화를 보여줍니다. (C) 시간에 따라 셀의 전체 GFP의 플롯은 비교적 작은 광표백 이미징 24 분 동안 발생한 것을 나타낸다. (D) 리소좀은 LysoTracker 레드 양성 소포를 식별하여 확인되었다. 플로리다에서 총 GFP 강도uorescent 색소 양 소포의 ROI는 (독립적으로 측정되지 광표백 없음 보상 제 시점 정규화) 각각의 시점에서 측정했다. (C - D) 화살표에 앞서, 측정 포커스 시프트 때문에 유효하지 않다. N = 5, 평균의 표준 오차 ± 평균. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55177/55177fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="영화 1" src="/files/ftp_upload/55177/55177mov1.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55177/Live_Cell_Movie_1.MOV">영화 1 : 라이브 셀 이미징 1 : (오른쪽 다운로드 클릭)</a> 100 nm의 중앙 II의 추가 후 24 분 (25 프레임)마다 1 분을 이미지화 된 AT의 1A R-GFP로 형질 HEK 세포를. 영화는 계획-Apochrom와 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하여 인수 한63X / 1.4 NA 오일 목적에서, 0.279 X 0.279 X 1.2 μm의 3의 복셀 크기; 및 3.20 μS / 픽셀에서 몇 군데 4.794 μm의 두께 총 5 조각. 동영상 속도는 2 프레임 / 초이다. 단위 = 6.56 μm의. <img alt="영화 2" src="/files/ftp_upload/55177/55177mov2.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55177/Live_Cell_Movie_2.mp4">영화 2 : 라이브 셀 이미징 2 : (오른쪽 다운로드 클릭)</a> 100 nm의 중앙 II의 추가 후 25 분 (51 프레임)마다 30 초를 이미지화 한 AT의 1A R-GFP로 형질 HEK 세포를. 영화는 계획 - 고차 색지움 40X / 1.4 NA 오일 목적으로 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하여 획득 하였다. 복셀의 크기는 X 0.11 X 1.4 μm의 3 0.11이었다. 8.4 μm의 두께 총 7 조각은 3.72 S / 프레임에 몇 군데 있었다. 동영상 속도는 3 프레임 / 초이다. 스케일 바 = 7 μm의.

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Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy

여기에서 우리는 안지오텐신 II 치료에 의해 시작 엔도 시토 시스 동안 녹색 형광 단백질 태그 안지오텐신 형 1A 수용체를 발현하는 이미지 세포에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 기술은 시간이 지남에 따라 입체적 수용체 리소좀의 공동 현지화를 분석하는 소프트웨어를 이용하여 다음 라벨링 제 형광 마커 리소좀 등을 포함한다.

공 초점 현미경을 사용하여 트랜 인간 배아 신장 세포의 라이브 셀 이미징 및 3D 분석 안지오텐신 수용체의 유형 (1A)의 인신 매매

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in ...

live-cell-imaging-3d-analysis-angiotensin-receptor-type-1a

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

9.6K 조회수.  Georgetown University Medical Center.  여기에서 우리는 안지오텐신 II 치료에 의해 시작 엔도 시토 시스 동안 녹색 형광 단백질 태그 안지오텐신 형 1A 수용체를 발현하는 이미지 세포에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 기술은 시간이 지남에 따라 입체적 수용체 리소좀의 공동 현지화를 분석하는 소프트웨어를 이용하여 다음 라벨링 제 형광 마커 리소좀 등을 포함한다. 

비디오: Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

공촛점 현미경으로 Zebrafish 배아 뇌 영상 라이브

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

연구

생물학

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

비디오 생물 정보학 인간의 배아 줄기 세포 콜로니 성장 분석

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

라이브 셀 이미징 및 배아 상피 세포의 정량 분석 Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

형광 단백질을 표현 라이브 마우스의 이미징 세포 이하의 구조물의 intravital 현미경

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

4D 공 초점 현미경을 사용하여 제브라 피쉬의 두개 안면 형태 형성 분석

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

정량적 RT-PCR에 의해 개별 인간 배아 줄기 세포를 프로파일 링

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single procedure. Due to advances in microscope technology it is relatively easy to capture live cell images for the purpose of investigating cellular events in real time with minimal concern regarding phototoxicity to the cells. This protocol describes how to take live cell timelapse images of primary rat neonatal cardiomyocytes using a confocal spinning disk microscope following lentiviral and adenoviral transduction to modulate properties of the cell. The application of two different types of viruses makes it easier to achieve an appropriate transduction rate and expression levels for two different genes. Well focused live cell images can be obtained using the microscope&#8217;s autofocus system, which maintains stable focus for long time periods. Applying this method, the functions of exogenously engineered proteins expressed in cultured primary cells can be analyzed. Additionally, this system can be used to examine the functions of genes through the use of siRNAs as well as of chemical modulators.

This protocol describes a method of live cell imaging using primary rat neonatal cardiomyocytes following lentiviral and adenoviral transduction using confocal spinning disk microscopy. This enables detailed observations of cellular processes in living cardiomyocytes.

차 쥐 신생아 심근 라이브 셀 이미징은 아데노 바이러스 다음과 렌티 바이러스 형질 도입은 공 초점 현미경 디스크를 회전시키는 사용

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused throughout tissues made of diverse cell types, such as enteroendocrine cells of the intestinal epithelium. These gastrointestinal sensors of food and bacteria have been difficult to study because they are dispersed among other epithelial cells at a ratio of 1:1,000. Recently, transgenic reporter mice have been generated to identify enteroendocrine cells by means of fluorescence. One of those is the peptide YY-GFP mouse. Using this mouse, we developed a method to correlate confocal and serial block-face scanning electron microscopy. We named the method cocem3D and applied it to identify a specific enteroendocrine cell in tissue and unveil the cell&#8217;s ultrastructure in 3D. The resolution of cocem3D is sufficient to identify organelles as small as secretory vesicles and to distinguish cell membranes for volume rendering. Cocem3D can be easily adapted to study the 3D ultrastructure of other specific cell types in their native tissue.

Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy.

특정 감각 세포의 상호 공 초점 및 3D 전자 현미경

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...