This work was funded in part by grant P40RR17447 from the National Institute of Health and award RP150637 from the Cancer Prevention and Research Institute of Texas. We would like to thank Dr. Darwin J. Prockop for his support on the project.

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The authors declare they have no competing financial interests.

일부 연구 및 임상 응용에 사용하기위한 최적의 MSC는 그들의 높은 이득을 최대화하기 위해 작동하고, 우선적으로 이러한 FBS 배지와 같은 이종 성분의 잠재적 인 항원의 전달을 최소화하기 위하여 화학적 XF 조건 하에서 제조한다. 여기에 설명 된 프로토콜에서, 우리는 1) 방법을 도시 한 타원체를 형성하여 3D 배양에서 중간 엽 줄기 세포를 활성화 2) XF 조건에서 중간 엽 줄기 세포의 3D 활성화를 달성 3) 그들의 항에 관해서 타원체 엽 줄기 세포의 활성화 수준을 평가 염증, 면역 조절 성 및 항암 전위, 4) 마우스에 그대로 타원체로 활성화 된 중간 엽 줄기 세포를 제공한다. 중간 엽 줄기 세포는 골수, 지방 조직 등 다양한 성인 조직으로부터 플라스틱 접착을 통해 분리 할 수있다 다 능성 줄기 세포이다. 중간 엽 줄기 세포는 쉽게 표면 마커의 고유 한 집합을 표현 (~ 20 %) FBS 농도가 상대적으로 높은에서 조직 배양 플라스틱에 전파하고있다지방 세포, 골 세포, 연골 세포 계통 및 1, 16, 17, 18로 적어도 분화 될 수있다. 중간 엽 줄기 세포는 생체 내에서 투여 된 후 단지 일시적으로 유지 보여도 인간 질환의 여러 동물 모델에서 유리한 효과를 발휘하는 것으로 입증되었다. 중간 엽 줄기 세포의 효과는 따라서 &quot;뺑소니&quot;라고되어 종종 중간 엽 줄기 세포 (2)에 의해 분비 등 PGE2, TSG-6 및 indoleamine 2,3- 디옥 시게나 제 (IDO) 등의 항 염증 및 면역 분비 인자에 의해 매개되는 3, 11, 19, 20, 21. 그러나, 이러한 요인들을 생성하기 위해, 중간 엽 줄기 세포는 손상된 조직으로부터 신호를 통해 또는 면역 C에서 역시 활성화가 필요받는 사람의 ELL 학생. 이어서, 동물 또는 환자 (22)에 세포를 전달하기 전에 MSC 미리 활성화 프라이밍 또는 프로토콜을 개발하는 새로운 관심이 있었다. 또한, 표준 MSC 준비에 항원 FBS 구성 요소의 존재는 우려를 제기하고있다. 따라서, 연구가 MSC 배양을위한 최적의 화학적 XF 조건을 결정하기 위해 수행되었다. 우리의 최근 연구에서는 먼저 중간 엽 줄기 세포는 타원체를 형성하여 3D 활성화 될 수 있음을 보여 주었다하고 세포 활성화가 특정 조건 XF 8, 12, 13, 14에 따라 달성 될 수 있음을 발견했다. 3D 세포 배양 기술은 셀 기반 연구 정품 생리적 조건을 제공 할 목적으로 수십 년 동안 사용되어왔다. 2D에서 문화는 조직의 3D 특성을 무시하고, 따라서 항상 요점을 되풀이하지 않는다세포 - 대 - 세포 및 세포 신호 전달에서 중요한 세포 간 상호 작용 매트릭스. 많은 3D 배양 기술 그러나, 이러한 방법 많은 가장 큰 단점은 생성 된 회전 타원체의 크기 및 / 또는 특정 고가의 장비의 요구 사항의 이질성이다, 회전 용기, 스피너 플라스크, 또는 다양한 비 접착면을 사용합니다. 연구는 또한 본질적으로 중간 엽 줄기 세포를 장려 매달려 드롭 배양액을 사용하여 수행되었는지에 자발적으로 집합 한 구형 4, 5, 6, 7, 8, 9, 23로. 특히 매달려 드롭 배양 쉽게 세포 농도 및 / 또는 드롭 볼륨을 조절하여 세포 집합체의 크기를 조작 할 수 있다는 이점도 가진 비교적 균일 한 마이크로 조직 / 응집체의 조립을 지원한다. 또한, 매달려 D의 지배ROP 문화 기술은 광범위한 교육을 필요로하지 않습니다. 25-40 μL 방울을 용이하게 높은 세포 농도 μL 당 통상적으로 500 ~ 1,000 개의 세포와 중간 엽 줄기 세포를 제조 할 수있다. 보다 작은 20 μL 빨리 증발하는 경향이 그보다 큰 45 μL 종종 반전 중에 뚜껑 걸쳐 얼룩 떨어진다. 어떤 크기, 속도와 방향성의 방울을 포함하는 뚜껑을 틀지 때, 표면 장력 및 드롭 / 회전 타원체의 적절한 모양을 유지하기 위해 고려해야 할 중요한 매개 변수입니다. 인큐베이터에서 중단 문화와 적절한 공기 흐름 또한 각 드롭 내에서 하나의 영역으로 중간 엽 줄기 세포의 집계를 보장하기위한 중요하다. 이 기술의 단점은 매달려 방울을 포함하는 판 어려운 환자 치료를위한 스케일 업을, 인큐베이터에 누적 또는 구를 조립하는 동안 이동하지해야한다는 것입니다. 또한, 드롭 문화를 걸려 매체를 변경하는 것은 매우 어려운이며, 따라서 장기적인 문화 유명해야한다oided. 또한, 매달려 떨어진다 낮은 매체 간 세포 비율은 결국 중요한 세포 기능 및 / 또는 세포 사멸의 손실로 이어지는 영양분 고갈과 폐기물의 축적을 일으킬 수있다. 그러나, 적절한 매달려 드롭 방식으로, 우리는 세포가 강력한 항 염증 분자 PGE2 및 TSG6뿐만 아니라 항암제 분자가 IL-24의 공장되어 있음으로 회전 타원체의 중간 엽 줄기 세포는 매우 활성 또는 프라이밍 될 것으로 입증 꼬리. 우리는 MSC의 타원체 실제로 항염증제 및 면역 것을 도시 배양 대식 세포, 비장 세포, 전립선 암 세포를 8, 12, 13, 14을 사용하여 다수의 기능 분석에서의 2 차원 단층 대응 우수한 항암 특성을 가지고있다. 또한, 우리는 투여시 MSC의 회전 타원체는 강력한 항 염증 효과를 발휘할 수 있다는 것을 보여 주었다복막염 8 마우스의 복강에. 특히, 약 400-500 ㎛의 직경의 큰 회전 타원체 (25,000-30,000 엽 줄기 세포 각각) 효율적 20G 바늘 / 카테터 조립체 및 표준 피펫을 사용 HBSS 작은 부피로 전달 될 수있는 것으로 나타났다. 유체의 흐름에 저항이 높은 결과이 기술 부적절한 카테터 위치로 쉽게 프로토콜에 기재된 바와 같이 제 HBSS / HSA 중 소량 주입함으로써 전송을 구형에 앞서 결정될 수있다. 적절하게 위치 된 카테터의 구 상체는 HBSS가 플라스틱 배관에 부착 구를 최소화 HSA로 보충되어 제공된 자유롭게 흐르고, 그리고 쉽게 가시화 될 수있다. 더욱이,이 기법은 주입을위한 표준 니들 / 주사기를 사용하여 발생할 수있는 셀에 전단 응력을 방지하고, 감염의 위험이 높은 운반 많은 기술적 도전 절개 수술에 대한 필요성을 회피한다. 하나의 주요 단점은 t이다카테터를 통해 구 전송에 대한 저항이 잘록한 부분이 높고으로 회전 타원체의 모자 다수는, 예컨대 복강 같은 넓은 체강 내로 주입 될 수있다. 우리는 또한 최근 타원체의 MSC 활성화 동일한 수준이 특정 시판 XF 매체를 사용함으로써 달성 될 수 있다는 것을 입증 XFM -1- 여기 불리는 것이면 재조합 기술을 통해 사람의 혈액에서 수득 또는 제조 HSA 보충되었을 14. 중간 엽 줄기 세포에 가장 XF 미디어가 처음 2D에서 세포의 최적의 확장을 공식화했다 아마도 때문에, MSC의 회전 타원체는 XF 미디어 (14)의 모든 종류의 PGE2와 TSG6의 높은 수준을 생성하지 않는 점에 유의하는 것이 중요합니다. HSA의 종류가 다양 역가 14주의하는 것이 중요하다. 또한, PGE2의 절대 레벨이 약간 다를 수 활성화 타원체의 CM 검출PGE2를 위해 사용 된 ELISA로 사라져 참으로 경쟁 분석이다. 따라서, 모든 PGE2 ELISA에 적절한 컨트롤을 포함하고, 서로 다른 시간에 분석 샘플 사이 또는 상이한 플레이트에 데이터를 직접 비교 피하기 위해 중요하다. 또한, 중간 엽 줄기 세포는 철저하게 이전에 매달려 준비에 XF 매체에 세척 따라서 잔류 CCM과, FBS 구성 요소의 제한 이월을 제거하기 위해 삭제해야합니다. 여기에 설명 된 프로토콜이 쉽게 구 형성 및 치료 유전자 발현의 다른 미디어 배합물을 평가하기 위해 채택 될 수있다. 중간 엽 줄기 세포는 3D에서 배양 할 때 분명히, 일반적으로 2D 중간 엽 줄기 세포에서 발생하지 않는 수많은 세포 신호 이벤트는 모션에서 설정됩니다. 세포 간 및 세포 - 기질 간 상호 작용 및 인테그린 cadherins 가이드 타원체 형성 및 다짐 24, 25, 26에 의해 매개 및 회전 타원체 치료 가능성이 매우 중요하다. 세포 집계와 공동으로마이너 아폽토시스 다수의 잠재적 치료 인자 4, 5의 제조 결과 MSC 활성화 과정에서 보조를 포함한 타원체 다양한 스트레스 신호로 MPACT. 우리는 이전에 MSC 활성화 및 PGE2 및 TSG6 (12)의 생산 분비 IL-1 신호 전달의 중요한 역할을 나타내었다. 많은 다양한 신호 전달 경로에 대해 MSC 활성화에 그 원조 알 수없는 남아 있지만, 매달려 드롭 문화 플랫폼은이 현상을 연구하고 MSC 기반 치료를 향상시킬 수있는 실용적인 방법을 제공한다. 전체적으로, 우리는 항 염증성, 면역 조절 및 항암 인자를 생성하기 위하여, 여기에서 프로토콜 화학적 정의 XF 조건 하에서 활성화 또는 3D 배양에서 중간 엽 줄기 세포의 프라이밍 방법에 대하여 설명 하였다. 이 그대로 MSC의 타원체가 생체 내에서 제공 할 수있는 방법을 우리는 또한 설명했다.

중간 엽 줄기 / 기질 세포 (중간 엽 줄기 세포는) 다양한 재생 의학 접근 방식에 대한 큰 잠재력을 보여 주었다. 중간 엽 줄기 세포는 초기 골수 간질 성분으로서 단리되었지만 사람의 지방 조직의 1, 2, 3을 포함하여 다수의 다른 성인 조직으로부터 수득 하였다. 흥미롭게도, 메인 분리 방법은 중간 엽 줄기 세포의 현저한 재산권 소 태아 혈청 (FBS)의 존재하에 조직 배양 플라스틱에 단단히 부착 품은. 전통적인 분리 기술은 2 차원 배양의 MSC 쉽고 신속한 팽창을 허용하는 동안, 그것은 오도 매우 인위적인 중요한 세포 특성이 (4)의 전위 손실로 이어지는 기본 3 차원 환경의 중요성을 무시 6. 따라서, 3D 문화에서 중간 엽 줄기 세포의 연구하는전통적인 2D 문화보다 더 생리있다 &quot;손실 / 감소&quot;MSC 특성에 대한 검색에 등장했다. 또한, 관심 임상 응용 프로그램에 대한 세포가 더 순종하게하여 MSC 문화 활성화를 위해 이종없는 (XF) 화학적으로 정의 된 조건을 식별하고 상승했다. 많은 연구는 생체 재료 및 구형 집합체 또는 회전 타원체로 모두 중간 엽 줄기 세포의 3 차원 배양을 보여주는 발표되었다. 중간 엽 줄기 세포의 타원체 배양 전임상 또는 임상 시험에서의 치료를위한 세포의 투여 후 생체 내에서 MSC 동작을 이해하는 방법으로 보였다 반면 생체 재료의 중간 엽 줄기 세포는 초기 셀 시드 지지체에 손상된 조직을 대체하는 조직 공학 방법을 위해 설계된 4, 5, 7. 흥미롭게도, 중간 엽 줄기 세포의 형태 타원체는 자발적으로 조직 배양 플라스틱에 부착이 허용되지 않는 경우8, 9, 10. 전통적으로, 세포 응집은 스피너 플라스크 방법 또는 액체 오버레이 기술, 종양 미세 환경을 모방하려고 노력 암 생물학에서 처음 사용 된 방법에 의해 촉진되었다. 최근 추가 방법은 배양 접시에서 세포 응집 세포 간 접착 수지 4, 5, 6을 방지하기 위해 특정 화학 물질로 미리 코팅 된 표면이 보여왔다. MSC의 타원체를 생성하는 가장 간단하고 경제적 인 방법 중 하나는 종종 배아 줄기 세포로부터 배아 체를 생성하기 위해 사용 된 기법에 매달려 방울 배양 그들이다. 드롭 배양 기술을 걸려, 조직 배양 플라스틱에 대한 세포 부착은 세포 aggreg을 용이하게하기 위해 중력을 조직 배양 접시 뚜껑의 밑면에 중간 방울에 세포를 현탁하고시킴으로써 방지드롭의 정점에 ATION. 회전 타원체 크기 용이 세포 농도 또는 액적 부피 변화를 제어하는 ​​것이 특히 용이 매달려 드롭 배양함으로써 조작 될 수있다. 중간 엽 줄기 세포의 3 차원 배양에 대한 초기 연구는 2D 대응 6, 8, 9에 비해 3 차원 셀의 특성 라디칼 차이를 보였다. 동시에, 보고서는 생체 내에서 중간 엽 줄기 세포의 유익한 효과는, 응답, 마이크로 환경 단서에 의해 활성화 될 항염증제 및 면역 11 요인을 생성하는 능력에 의존하고 있음을 보여 주었다. 흥미롭게도, 예컨대 프로스타글란딘 E2 (PGE2), 종양 괴사 인자 - 자극 된 유전자 6 (TSG6), 및 간세포 성장 인자 (HGF) 등이 요인의 많은위한 방법을 포장 전통적인 2D 엽 줄기 세포보다 MSC의 타원체에 의해 훨씬 더 많은 양으로 생산되었다 아이디어세포를 8, 12, 13를 활성화 차원 배양을 사용. 또한, 3D 배양에서 유전자 활성화는 마우스 (12)에 주입 한 후 세포 활성의 적어도 일부분 메커니즘 요점을 되풀이 나타났다. 생체 내에서 전통적인 MSC 효과는 종종 과도 지연 및 &quot;뺑소니&quot;로 설명 될 수있다 같은 실험들은 사용 전에 중간 엽 줄기 세포를 활성화시킴으로써, 세포의 장기간 효과는보다 두드러 수있다. 지난 몇 년 동안, MSC의 타원체를 사용하는 중요한 기능 연구는 염증 반응을 억제하며 타원체를 준비하는 중간 엽 줄기 세포 (2)의 매력적인 양식을 대 식세포, 수지상 세포, 호중구 및 T 세포와 같은 효과기 세포 영향에 의해 생체 내에서 면역성을 조절할 수 있음을 입증 3. 또한, int와 같은 항암 분자의 제조erleukin-24 (IL-24) 및 종양 괴사 인자 관련 세포 사멸 유도 리간드 (TRAIL)는, 중간 엽 줄기 세포를 단일 층에 중간 엽 줄기 세포의 상대 3D 문화에 표적 암 치료 8, 10, 14 악용 될 수있는 현상을 증가한다. 기존의 MSC 문화 조직 배양 플라스틱뿐만 아니라 FBS의 사용뿐만 아니라 필요에 따라 임상 극복 할 수 있었다위한 또 다른 장애물은 MSC의 회전 타원체보다 의무 확인합니다. 이 장애물을 해결하기 위해 최근에 특정 화학적 XF 조건 MSC의 구 상체의 형성을 보였다 얻어진 MSC의 구 상체는 FBS (14)의 조건에서 발생되는 회전 타원체와 같은 항염증제 및 항암 성 분자를 생성하기 위해 활성화되었는지 세웠다. 여기서, 이러한 결과는 XF를 이용하여 3 차원 배양에 미리 활성화 된 중간 엽 줄기 세포의 생성을 보여주는 몇 가지 상세한 프로토콜에 제시미디어. 또한, 프로토콜은 함께 마우스에 그대로 타원체를 전달하는 실제적인 방법으로 그들의 항 염증, 면역 조절 및 항암 효과에 관해서는 상기 중간 엽 줄기 세포의 활성화 수준을 평가하기위한 효과적인 방법을 설명이 제시된다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>MEM-&#945; (minimal essential medium alpha)</td>
			<td>ThermoFisher/Gibco</td>
			<td>12561049; 12561056; 12561072</td>
			<td>minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (fetal bovine serum), premium select</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11595; S11510; S11550; S11595-24</td>
			<td>component of complete culture media for all types of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>ThermoFisher/Gibco</td>
			<td>25030081; 25030149; 25030164</td>
			<td>component of complete culture media for all types of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher/Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td>component of complete culture media for all types of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilization Filter Units, 0.22 &#181;m PES membrane</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE</td>
			<td>media sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm cell culture dish</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>D8554&#160;SIGMA</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Model 3110</td>
			<td>incubation of cultured cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Early passage MCSs</td>
			<td>Center for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&#38;M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott &#38; White</td>
			<td>NA</td>
			<td>preparation of 2D and 3D cultures of MSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89501-468</td>
			<td>warming media to 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>492000904</td>
			<td>manual liquid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipete-Aid</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>4-000-300</td>
			<td>handling sereological pipetes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar sterile serological pipet (5, 10, 25 and 50 ml)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4487; 4101; 4251; 4490</td>
			<td>liquid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher/Gibco</td>
			<td>10010023; 10010072; 10010031; 10010049</td>
			<td>cell culture processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin/EDTA solution</td>
			<td>ThermoFisher/Gibco</td>
			<td>25200056; 25200072; 25200114</td>
			<td>lifting adherent cells and dispersing cell aggregates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tube</td>
			<td>Corning/BD Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td>cell centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tube</td>
			<td>Corning/BD Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td>cell centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendor refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf/Fisher Scientific</td>
			<td>Model 5810R</td>
			<td>cell centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26716</td>
			<td>cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypan blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154 SIGMA</td>
			<td>dead cell exclusion during cell counting in hemacytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1)</td>
			<td>ThermoFisher/Gibco</td>
			<td>A1067501</td>
			<td>Xeno-free media specifically formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5420</td>
			<td>Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSA (Human serum albumin)</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>800-120</td>
			<td>Component of xeno-free MSC media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rHSA (recombinant Human serum albumin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9731&#160;SIGMA</td>
			<td>Component of xeno-free MSC media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-channel pipette, 10&#8239;&#8211;&#8239;100&#8239;&#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022453904</td>
			<td>preparation of hanging drops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total RNA isolation Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>Total RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiashredder</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>Sample homogenization prior to total RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse-free DNase Set&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>On-column DNA elimination during total RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250&#160;ALDRICH</td>
			<td>inhibition of RNAses in RLT buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-562</td>
			<td>mixing sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>NA</td>
			<td>RNA concentration and quality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>ThermoFisher/Applied Biosystems</td>
			<td>4368814</td>
			<td>transcription of total RNA into cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Expression Assays</td>
			<td>ThermoFisher/Applied Biosystems</td>
			<td>varies</td>
			<td>primer/probe combination for real-time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Universal PCR Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher/Applied Biosystems</td>
			<td>4352042; 4364103; 4366073; 4367846</td>
			<td>master mix for real-time PCR reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR system (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System)</td>
			<td>ABI Prizm</td>
			<td>NA</td>
			<td>real-time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml centrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22364111</td>
			<td>cell centrifugation, sample collection and storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(-80&#176;C) freezer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Model Thermo Forma 8695</td>
			<td>sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>KGE004B</td>
			<td>estimation of cytokine concentration in the sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium)</td>
			<td>ThermoFisher/Gibco</td>
			<td>10566-016; 10566-024;10566-032</td>
			<td>macrophage culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J774 mouse macrophages</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-67</td>
			<td>mouse macrophage cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td>in-vitro macrophage stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS (lipopolysaccharide)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>L4130</td>
			<td>in vitro macrophage stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse TNF-a ELISA kit</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MTA00B</td>
			<td>estimation of cytokine concentration in the sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kit</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>M1000B</td>
			<td>estimation of cytokine concentration in the sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>ThermoFisher/Gibco</td>
			<td>11875-085</td>
			<td>splenocyte culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>651</td>
			<td>in vivo spheroid delivery; splenocyte preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>145-2C11</td>
			<td>In vitro splenocyte stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m strainer&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td>Splenocyte preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood cell lysis solution (1x)</td>
			<td>Affymetrix eBioscience</td>
			<td>00-4333</td>
			<td>removal of red blood cells during splenocyte isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IFN-y (interferon gamma) ELISA kit</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MIF 00</td>
			<td>estimation of cytokine concentration in the sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LNCaP prostate cancer cells&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1740</td>
			<td>study the effect of 3D MSCs on cancer cell lines in vitro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-based cell proliferation assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C7026</td>
			<td>cell number measurement based on DNA content</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5150</td>
			<td>component of lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>FERR1021</td>
			<td>calcium chelator, component of lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td>RNA degradation for measurement of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter-based multi-mode microplate reader</td>
			<td>BMG Technology</td>
			<td>NA</td>
			<td>Microplate assays (ELISA, cell quantification, e.t.c.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (Hanks balanced salt solution), no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher/Gibco</td>
			<td>14175079</td>
			<td>resupsension of MSC spheroids prior to in vivo injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>MWI Vet Supply</td>
			<td>502017</td>
			<td>Anesthesia for in vivo injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen, compressed gas</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>NA</td>
			<td>For use with isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Forma BSL-2 cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Model 1385</td>
			<td>Sterile cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety I.V. catheter/needle stiletto, 20G, 1 inch</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SR*FNP2025</td>
			<td>Delivery of shperoids into peritoneal cavity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile micropipette tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>varies</td>
			<td>liquid/cells handling</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production and administration of therapeutic mesenchymal stem/stromal cell (msc) spheroids primed in 3-d cultures under xeno-free conditions

중간 엽 줄기 / 간질 세포 (중간 엽 줄기 세포)는 생명 공학 및 재생 의학에 큰 약속을 개최합니다. 중간 엽 줄기 세포는 조직 배양 플라스틱에 강한 접착을 통해 다수의 성인 조직으로부터 분리 한 후, 추가 가장 일반적으로 소 태아 혈청 (FBS)을 사용하여, 시험 관내에서 확장 될 수있다. FBS는 중간 엽 줄기 세포는 면역 원성가 발생할 수 있기 때문에, MSC 문화에서의 존재는 세포의 모두 임상 및 실험 응용 프로그램을 제한합니다. MSC 문화에 대한 따라서 연구는 화학적으로 채용하는 이종없는 (XF) 미디어는 매우 가치가있다. 중간 엽 줄기 세포의 많은 이로운 효과는 종양 괴사 인자 - 자극 된 유전자 6 (TSG6) 및 프로스타글란딘 E2 (PGE2)로 주로 면역 인자의 분비를 통해 염증 및 면역 조절 능력에 기인하고있다. 그러나, 중간 엽 줄기 세포는 이러한 요소를 생성하도록 활성화를 요구하고 중간 엽 줄기 세포의 효과는 종종 일시적이므로, 큰 관심은 세포 프리 오 미리 활성화시키는 방법을 발견하는 등장자신의 사용에 대한 연구, 따라서 생체 내에서 활성화에 대한 지연 시간을 제거. 여기에서 우리는 3 차원 (3D) 문화에서 효율적으로 작동하는 프로토콜이나 주요 중간 엽 줄기 세포를 제시 화학적으로 XF 조건 및 생체 내에서 이러한 사전 활성화 된 중간 엽 줄기 세포를 관리하는. 특히, 우리는 먼저 XF 매체를 이용하여 구형 MSC 마이크로 조직이나 매달려 방울의 &#39;타원체&#39;를 생성하고 분야와 에어컨 매체 (CM)는 다양한 애플리케이션에 수확 할 수있는 방법을 보여주기 위해 방법을 설명합니다. 둘째, 유전자 발현 화면 설명 및 시험 관내 기능 분석을 신속하게 세포의 항 염증 및 항암 가능성을 강조 타원체 MSC의 활성화 수준을 평가. 셋째, 생체 내 효능을 시험하기위한 마우스 복강 내로 그대로 MSC의 구 상체를 분사하기위한 신규 한 방법을 설명한다. 전반적으로, 프로토콜은 여기에 화학적으로 XF 콘에서 미리 활성화 된 중간 엽 줄기 세포를 얻는 주요 문제를 극복ditions 및 치료에 대한 MSC의 타원체를 관리 할 수있는 유연한 시스템을 제공합니다.

현재 작업에 매달려 드롭 문화는 소형 구형 마이크로 조직 또는 XF 조건에서 활성화 된 중간 엽 줄기 세포의 &#39;타원체&#39;을 생성하기 위해 사용되었다. 그림 1의 임상 로드맵은 중간 엽 줄기 세포는 자기 조립에 권장되는 타원체, 또는 CM은 구 유래의 치료 요인로드 한 후 72 시간에 대한 방울 매달려에 현탁 때 타원체로 수집 될 수 있으며, 잠재적으로 모두 사용되는 것으로 묘사 연구 및 임상 응용 프로그램. 구 생산에 필요한 세포의 다수 cm 2 당 일반적으로 저밀도 100-200 세포를 중간 엽 줄기 세포를 시딩하고 약 80 % 합류 (도 2까지 6-7일 위해 세포를 확대하여 일주일 이내에 취득 할 수있다 ). 세포 성장 동역학은 매일 생존 세포를 계수함으로써 결정 강력한 확장 단계 (3-7 일) 1~2일 간략한 유도기 (도 2c를 &lt;다음 지적/ STRONG&gt;). 통로 (2) 또는 제 3 엽 줄기 세포는 통상적 CCM에서 배양 된 세포를 냉동 보존 1,000,000 단일 바이알로부터 50-100000000 세포를 수득 하였다. 확장 및 수확 후, 중간 엽 줄기 세포는 타원체, μL 당 일반적으로 500 ~ 1,000 세포를 생성하는 높은 세포 농도로 일시 중단됩니다. 매달려 드롭 배양 이후에 (도 3) 대칭 적절 접시의 바닥에 위치되는 조직 배양 접시 뚜껑의 밑면 상에 중간 엽 줄기 세포를 함유하는 배지 25-40 ㎕의 액 적을 이송에 의해 제조된다. μL 당 714 세포에서 CCM의 35 μl의 방울에 현탁 경우 (예 : 드롭 당 25,000 세포), 중간 엽 줄기 세포는 먼저 결국 드롭 (그림 3C)의 정점에서 72 시간에 하나의 컴팩트 한 영역을 생성하기 위해 병합 작은 집합체로 조립한다. 회전 타원체는 MSC 확장에 최적화 된 시판 XF 미디어의 여러 종류에 72 시간에 걸쳐 형성여기 XFM-1 및 XFM-2라고도합니다. 그러나 XFM-1 단일 컴팩트 분야의 형성은 13 ㎎ / ㎖ 인간 혈청 알부민 (HSA), CCM의 추정 된 총 단백질 함량 (도 3d)를 반영하는 농도의 보충을 필요로한다. 단일 소형 구체 쉽게 HSA없이 또는 단백질 무료 αMEM (그림 3D)에서 기본 XFM-1에서 형성하지 않습니다. 적절한 화학적으로 정의 된 XF 매체 (예 XFM-1 + HSA)에서 구 조립, MSC 표현형의 변화 근본적으로 (그림 4), 때, PGE2 및 TSG6 (그림 4C)을 포함하여 상향 조절하는 다수의 항 염증 인자의 발현 중. 그러나 TSG6 및 PGE2의 생산은 현저하게 HSA (그림 4C)없이 XFM-2 또는 XFM-1의 분야로 배양 된 중간 엽 줄기 세포의 증강되지 않습니다. 특히 이러한 항 염증 인자뿐만 아니라, 항암 요인 TRAIL 및 IL-24가 높은 경우 t, 중간 엽 줄기 세포를 단일 층하는 구형 엽 줄기 세포에 비해 상향 조절 된그는 인간의 혈액 (그림 4D)에서 준비 중 재조합 HSA (RHSA) 또는 임상 등급 HSA (CHSA) 보충 XFM-1에서 배양 한 분야입니다. 다양한 미디어 제형으로 제조 MSC 분야의 치료 가능성을 평가하기 위해, 여러 가지 실제 테스트는 (그림 5) 수행됩니다. 타원체의 면역 조절 성 특성은 첫째 LPS 자극 식세포 및 CD3 자극 된 비장 세포 / 림프구 (그림 5)에 의해 생성 된 사이토 카인의 수준에 구 CM의 효과를 측정하여 시험 관내에서 결정된다. MSC에서 CM은 CCM 식세포 TNFα 및 IFNγ의 비장 XFM-1 / HSA 현저히 억제 생산 분야에서 배양하면서 동시에 항 염증 사이토 카인 수준이 증진 IL-10 (도 5a 및도 5b). 분야의 항암 특성은 구 형상 (O)의 영향을 측정함으로써 평가되고N 성장 된 LNCaP 전립선 암세포의 형태. XF 매체 XFM-1 / HSA 효과적으로 FBS 함유 CCM (도 5C 및 5D)과 유사한 된 LNCaP 증식을 감소시켰다. 중요한 것은, 그대로 MSC 스피어 (도 6) 생체 내에서 세포의 항 염증 활성을 테스트하기 위해 마우스의 복강 내로 투여 될 수있다. 이 실험을 위해,이 분야 XF 상태를 유지하면서 플라스틱 배관에 그 접착력을 최소화 HSA의 낮은 농도를 함유하는 HBSS로 주입을 위해 준비된다. 이어서, 구체 쉽게 적절한 표준 복강 내 주사를 위해 배치 된 니들 / 카테터 조립체 (도 6c과도 6d)를 통하여 피펫 (도 6b)을 이용하여 포집 관 (도 6a)에서 전송 한 후 주입 될 수있다. 이 방법을 이용하여, MSC의 타원체 규칙적 일 수무결성 (그림 6 세대 6H)을 방해하지 않고 효율이 90 % 이상 (그림 6E 및 6F)에서 전송. 복강 내에 카테터 팁의 부적절한 위치는 가난한 구 납품 및 높은 유지 (그림 6 층)에 연결됩니다. 중요한 것은, 피펫 / 카테터 내의 구 보존 레벨 질적 육안 검사로 결정되거나, 정량적 / 수집 잔류 구체 용균 시판 DNA 기반 셀 정량 시약 / 키트 (도 6F)로 세포 수를 측정함으로써. 포스트 분사 구 보존 분석 실험 중에 포함 / 제외 기준을 만들 수 있습니다. 특히, TSG6 및 PGE2의 높은 수준을 분비하는 CCM 및 XFM-1 / HSA 회전 타원체의 능력은 드롭 문화 (그림 6I)에 걸려에서 구체의 전송 후 최소 6 시간을 유지됩니다. 자신의 체외 EF 유사fects는 XFM-1 / HSA 분야는 염증성 TNFα (그림 6J)을 감소시키면서 즉시 복막에 정맥 LPS의 관리, 강화 된 PGE2 및 IL-10 수준으로 전신 염증의 유도에 따라, 마우스의 복강에 주입. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55126/55126fig1.jpg" /> 그림 1 : XF 조건에서 구형 마이크로 조직으로 준비하는 중간 엽 줄기 세포의 secretome를 활용하기 위해 개발 플랫폼의 도식 표현. 단층 문화 (1) 등의 확장에 따라, 중간 엽 줄기 세포는 프라임 / 세포를 활성화 높은 세포 농도로 배양 접시 (2)의 뚜껑에서 방울을 걸려에서 일시 중단됩니다. 72 시간 후, (3) 조정 배지 (CM) 및 (4) 본래 타원체가 소적에서 수확 다양한 하류 어플리케이션에서 이용 될 수있는 두. 형상은 면역 조절 인자뿐만 아니라 다른 치료 COMPON 풍부엔트. 매달려 방울 형성 컴팩트 타원체 쉽게 도관 (6)을 통해 생체 내 투여 효과적으로 피펫 (5)를 사용하여 전송 될 수있다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55126/55126fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55126/55126fig2.jpg" /> 도 2 단층 배양 골수 유래 중간 엽 줄기 세포의 성장 특성. 통로 (2)의 중간 엽 줄기 세포는 15cm 접시 (접시 당 15,000 세포)와 CCM 7 일간 배양 낮은 밀도 (cm 2 당 100 셀)을 접종 하였다. 보통 하루 5 ~ 6 (수확하기 전에 24 ~ 48 시간)에 다시 3 일에 변경 하였다. 세포를 플레이 팅 후 MSC들 삼일 (A) 7 일간 (B)의 대표적인 위상차 현미경 사진. 스케일 바 = 200 μm의. 중간 엽 줄기 세포의 (C) 성장 동역학3 기증자로부터 얻은 날 (7)에 일이 매일 가능한 부착 세포의 수를 계산하여 결정 하였다 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55126/55126fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55126/55126fig3.jpg" /> 그림 3 : XF 매체에 MSC의 타원체를 프라이밍에 대한 드롭 문화를 걸려 제조. 기술을 묘사 (A) 사진이 빠르게 조직 배양 접시 뚜껑의 아래쪽에 방울을 걸려 층합니다. (B) 사진 교수형을 설명하면 요리의 기초 위에 반전과 뚜껑의 위치 후 삭제합니다. (C) 위상차 현미경으로 시각으로 매달려 드롭 25,000 엽 줄기 세포의 집계에 시간에 따른 변화를. 목적은 드롭의 정점에 집중했다. 스케일 바 = 500 μm의. (D) 난 ...MSC 분야의 GES가와 FBS (예 : CCM)없이 αMEM, XFM-1 및 HSA없이, 그리고 XFM-2와 HSA없이 등 다양한 미디어 제제를 사용하여 드롭 문화를 걸려 3 일 후에 형성했다. 스케일 바 = 200 μm의. 패널 D의 데이터는 게시자 (14)의 허가 원래 기사에서 얻었다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55126/55126fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55126/55126fig4.jpg" /> 그림 4 : 3-D XF의 문화 MSC 활성화의 평가. (A) 분야 / CM은 / 반전 접시 뚜껑을 기울 셀 리프터를 이용하여 에지 방울 강요 72 시간 후에 수확한다. 25,000 세포로부터 조립 분야를 쉽게 수집 중에 가시화 될 수있다. (B) approxi의 사진많은 조직 배양 접시의 뚜껑에서 수집 한 500 구를, 후면부. 분야는 빠른 속도로 원심 분리하지 않고 튜브의 바닥에 내려. 72 시간을 ELISA로 측정 한 후, PGE2의 (C) 단계는 MSC 분야에서 분비. 실시간 RT-PCR은 TSG6 수준을 측정 하였다. TSG6 및 PGE2 모두 타원체에서 MSC 활성화를 선별하기위한 중요한 지표이다. XF 매체 XFM-1 + HSA는 PGE2와 TSG6 생산 (빨간색 상자)의 높은 수준을 보였다. 데이터는 평균 ± SD로 표시하고 (*** p &lt;0.001, αMEM 샘플에 비해) 학생의 t-test를 분석 하였다. (D) PGE2 ELISA 및 실시간 RT-PCR CCM, 13 ㎎ / ㎖ 재조합 HSA (RHSA) 특별히 보충 XFM-1에서 제조 분야에 대한 분석, 또는 인간의 정맥 혈액으로부터 제조 된 임상 등급 HSA (CHSA). 접어 변화가 부착 된 단층 중간 엽 줄기 세포 (RQ = 1)에서 측정 하였다. 데이터는 평균 ± SD로 표시되고 (** p &lt;0.01, *** p &lt;0.001 비교 스튜던트 t 검정에 의해 분석 된단층 중간 엽 줄기 세포). 패널 C와 D의 일부 데이터는 게시자 (14)의 허가 원래 기사에서 얻었다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55126/55126fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/55126/55126fig5.jpg" /> 그림 5 : 생체 기능 분석에서 드롭 문화를 걸려에서 수집 MSC-CM의 항 염증 및 항암 특성을 평가. (A) LPS 자극 된 마우스 대 식세포 (MQ)를 기준으로 TNFα 및 IL-10 생산에 구 CM (CCM 및 XFM-1 / HSA)의 효과를 나타내는 ELISA를 대표 결과. (B) 항 CD3 항체로 자극 된 마우스의 비장 세포 (SPL)에 의해 IFNγ 생산에 구 CM (CCM 및 XFM-1 / HSA)의 영향을 보여주는 ELISA 결과를 대표.<html> CCM 및 XFM-1 / HSA 제조 MSC 분야에서 기본적인 CCM 및 XFM-1 / HSA 또는 조정 배지 (CM)로 처리 된 LNCaP 전립선 암세포의 (C) 위상차 현미경 사진. 된 LNCaP 세포를 RPMI 배지 (대조군)에서 배양 하였다. 스케일 바는 200 μm의입니다. 된 LNCaP 전립선 암세포의 성장 (D) 양적 변화는 시판되는 DNA 기반 셀 정량 시약 / 키트로 측정 하였다. 점선은 잘 5,000 세포의 파종 밀도를 나타냅니다. 모든 패널의 데이터는 평균 ± SD로 표시되고, 스튜던트 t 검정 (** p &lt;0.001)로 분석 하였다. 모든 패널의 일부 데이터는 게시자 (14)의 허가 원래 기사에서 얻었다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55126/55126fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 로드 / 55126 / 55126fig6.jpg &quot;/&gt; 도 6 : 20G 정맥 바늘 / 도관 시스템을 사용 XF 조건 하에서 제조 된 중간 엽 줄기 세포의 손상 타원체, 효율적인 전송. (A) 0.2 % HSA가 포함 된 HBSS에 주입을 준비 XFM-1 / HSA MSC의 분야와 15 ML 원뿔 튜브의 대표 사진. (B) 200 μL 피펫 팁에 흡인 후 MSC 분야의 대표적인 사진. (C) 마우스에 그대로 MSC의 타원체를 관리하는 데 사용되는 20 G 바늘 / 카테터 어셈블리의 이미지. 폴리 우레탄 카테터 어댑터 내로 피펫 팁의 적절한 위치 설정을 보여주는 (D) 이미지. 즉시 배양 접시에 카테터를 통해 통과 후 MSC 분야의 (E) 이미지. 약 100 중 95 구를 옮겼다. 마우스의 복강 내로 구 전달 (F)의 효율은 유지 / 용균 분야를 수집하여 측정 하였다용해 분야의 총형로부터 얻은 세포의 수에 대하여 상용 DNA 기반 세포 분석을 통해 정량 피펫 / 카테터 측정 셀 번호. 빨간색 점선은 90 %의 전송 효율을 나타낸다. 불량 구 전달 (71 %)은 하나의 주입 (화살표)으로 관찰 하였다. (G) 패널 E의 분야의 위상차 현미경 (보기 확대). 스케일 바 = 200 μm의. (H) 조직 배양 접시 상에 전송 후 XFM-1 / HSA 구 16 시간의 위상차 현미경 사진. 중간 엽 줄기 세포의 섬유 아세포, 스핀들 형상의 형태가 구형에서 이전 셀에서 유지된다. 스케일 바 = 200 μm의. TSG6 및 PGE2는 CM 수행 된 소염 인자 (I) ELISA 분석법을 2 ml의 αMEM / 2 % FBS를 포함하는 6 웰 플레이트로 분야의 전사 후 6 시간을 모았다. XF 매체 XFM-1에서 제조 분야는 / HSA는 TSG6 및 PGE2 분비 (빨간색 상자)의 가장 높은 수준을 보였다. 데이터는 평균으로 표현± SD가, 학생의 t-test를 분석 하였다 (*** p &lt;0.001, αMEM 샘플에 비해). 일부 데이터는 게시자 (14)의 허가 원래 기사에서 얻었다. (J) 독소의 정맥 내 주사 (LPS)에 의해 도전 마우스에서 TNFα의 수준을 감소시키면서 복막 PGE2 및 IL-10을 증가 복강 내로 주입 타원체하는 능력을 예시하는 대표 그래프. 샘플은 염증과 80 타원체 전달 유도 후 복막 세척액 6 시간으로 얻었다. 데이터는 평균 ± SD로, 학생의 t-test를 분석 하였다 표현 (* P &lt;0.05, 대조군과 비교 ** P &lt;0.01). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55126/55126fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell MSC Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

The therapeutic potential of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) is well-documented, however the best method of preparing the cells for patients remains controversial. Herein, we communicate protocols to efficiently generate and administer therapeutic spherical aggregates or 'spheroids' of MSCs primed under xeno-free conditions for experimental and clinical applications.

제노없는 조건에서 3-D 문화의 생산과 치료 중간 엽 줄기의 관리 / 기질 세포 (MSC) 타원체 뇌관

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

11.8K 조회수.  University of Mary Hardin-Baylor. The therapeutic potential of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) is well-documented, however the best method of preparing the cells for patients remains controversial. Herein, we communicate protocols to efficiently generate and administer therapeutic spherical aggregates or 'spheroids' of MSCs primed under xeno-free conditions for experimental and clinical applications.

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Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

약화 된 인간의 진피를 사용하여 유전자 변형의 Organotypic 피부 문화의 생성

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

연구

발생학

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

인간 태반 조직에서 추출 분리 및 중간 엽 줄기의 확장 / 기질 세포

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

과일 비행을 양육<em&gt; 노랑 초파리</em&gt; 무균 및 무균 조건에서

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells, represent a unique type of undifferentiated cells with promise in tissue engineering and for reprogramming into iPSC for future pediatric interventions and stem cell banking. The protocol presented here describes an optimized procedure for extracting and culturing primary amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells and generating episomal induced pluripotent stem cells from these cells in fully chemically defined culture conditions utilizing human recombinant vitronectin and the E8 medium. Characterization of the new lines by applying stringent methods &#8211; flow cytometry, confocal imaging, teratoma formation and transcriptional profiling &#8211; is also described. The newly generated lines express markers of embryonic stem cells &#8211; Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 &#8211; while being negative for the SSEA-1 marker. The stem cell lines form teratomas in scid-beige mice in 6-8 weeks and the teratomas contain tissues representative of all three germ layers. Transcriptional profiling of the lines by submitting global expression microarray data to a bioinformatic pluripotency assessment algorithm deemed all lines pluripotent and therefore, this approach is an attractive alternative to animal testing. The new iPSC lines can readily be used in downstream experiments involving the optimization of differentiation and tissue engineering.

This protocol describes the reprogramming of primary amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells into induced pluripotent stem cells using a non-integrating episomal approach in fully chemically defined conditions. Procedures of extraction, culture, reprogramming, and characterization of the resulting induced pluripotent stem cells by stringent methods are detailed.

기본 양수 및 Pluripotency 이종 무료 조건에서 막 셀 프로그래밍

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

유사 분열 동안 염색체 분리의 라이브 셀 이미징

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of human-induced pluripotent stem cells (iPSCs) is particularly attractive for neurodegenerative disease studies, including retinal dystrophies, where iPSC-derived retinal cell models mark a major step forward to understand and fight blindness. In this paper, we describe a simple and scalable protocol to generate, mature, and cryopreserve retinal organoids. Based on medium changing, the main advantage of this method is to avoid multiple and time-consuming steps commonly required in a guided differentiation of iPSCs. Mimicking the early phases of retinal development by successive changes of defined media on adherent human iPSC cultures, this protocol allows the simultaneous generation of self-forming neuroretinal structures and retinal pigmented epithelial (RPE) cells in a reproducible and efficient manner in 4 weeks. These structures containing retinal progenitor cells (RPCs) can be easily isolated for further maturation in a floating culture condition enabling the differentiation of RPCs into the seven retinal cell types present in the adult human retina. Additionally, we describe quick methods for the cryopreservation of retinal organoids and RPE cells for long-term storage. Combined together, the methods described here will be useful to produce and bank human iPSC-derived retinal cells or tissues for both basic and clinical research.

The production of specialized retinal cells from pluripotent stem cells is a turning point in the development of stem cell-based therapy for retinal diseases. The present paper describes a simple method for an efficient generation of retinal organoids and retinal pigmented epithelium for basic, translational, and clinical research.

정의 된 이종 무료 및 급지대 무료 문화 세대의 인간 iPSC 파생 된 망막 세포 모델에 대 한

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are extremely scarce, but expanded CPCs could be useful for cell therapy. A prerequisite for their use is their ability to differentiate in a controlled manner into the various cardiac lineages using defined and efficient protocols. In addition, upon in vitro expansion, CPCs isolated from patients or preclinical disease models may offer fruitful research tools for the investigation of disease mechanisms.
Current studies use different markers to identify CPCs. However, not all of them are expressed in humans, which limits the translational impact of some preclinical studies. Differentiation protocols that are applicable irrespective of the isolation technique and marker expression will allow for the standardized expansion and priming of CPCs for cell therapy purpose. Here we describe that the priming of CPCs under a low fetal bovine serum (FBS) concentration and low cell density conditions facilitates the endothelial differentiation of CPCs. Using two different subpopulations of mouse and rat CPCs, we show that laminin is a more suitable substrate than fibronectin for this purpose under the following protocol: after culturing for 2 - 3 days in medium including supplements that maintain multipotency and with 3.5% FBS, CPCs are seeded on laminin at &#60;60% confluence and cultured in supplement-free medium with low concentrations of FBS (0.1%) for 20 - 24 hours before differentiation in endothelial differentiation medium. Because CPCs are a heterogeneous population, serum concentrations and incubation times may need to be adjusted depending on the properties of the respective CPC subpopulation. Considering this, the technique can be applied to other types of CPCs as well and provides a useful method to investigate the potential and mechanisms of differentiation and how they are affected by disease when using CPCs isolated from respective disease models.

This protocol describes an endothelial differentiation technique for cardiac progenitor cells. It particularly focuses on how serum concentration and cell-seeding density affect the endothelial differentiation potential.

낮은 혈 청 조건 하에서 심장 조상 세포에서 내 피 분화의 유도

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical insult to secondary injury processes, including apoptosis and inflammation. Animal modeling has been valuable in the search to unravel injury mechanisms and evaluate potential neuroprotective therapies. This protocol describes the controlled cortical impact (CCI) model of focal, open-head TBI. Specifically, parameters for producing a mild unilateral cortical injury are described. Behavioral consequences of CCI are analyzed using the adhesive tape removal test of bilateral sensorimotor integration. Regarding experimental therapy for TBI pathology, this protocol also illustrates a process for transplanting cultured cells into the brain. Neural cell cultures derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) were chosen for their potential to show superior functional restoration in human TBI patients. Chronic survival of hiPSCs in the host mouse brain tissue is detected using a modified DAB immunohistochemical process.

This protocol demonstrates methodologies for a mouse model of open-skull traumatic brain injury and transplantation of cultured human induced pluripotent stem cell-derived cells into the injury site. Behavioral and histologic tests of outcomes from these procedures are also described in brief.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 세포의 치료 이식으로 마우스 뇌 손상의 제어 피질 영향 모델

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous transplants to treat hematological and malignant disorders. Hemogenic endothelium (HE) is an amenable platform to produce functional HSPCs by transcription factors or to induce lymphocytes in a robust manner. However, current methods to derive HE are either costly or variable in yield. In this protocol, we established a cost-effective and precise method to derive HE within 4 days in a feeder- and xeno-free defined condition. The resultant HE underwent an endothelial-to-hematopoietic transition and produced CD34+CD45+ clonogenic hematopoietic progenitors. The potential capacity of our platform for generating functional HSPCs will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Here, we present a protocol to precisely form hemogenic endothelium from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free condition. This method will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

피더 및 제노 프리 정의 상태에서 인간 다능성 줄기 세포에서 혈생 내피 분화

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...

Formation of Human Periodontal Ligament Cell Spheroids on Chitosan Films

Periodontal ligament (PDL) cells hold great promise for periodontal tissue regeneration. Conventionally, PDL cells are cultured on two-dimensional (2D) substrates such as tissue culture polystyrene (TCPS). However, characteristic changes of PDL cells have been observed during in vitro culture. This phenomenon is probably because the 2D TCPS differs from the in vivo three-dimensional (3D) microenvironment. Compared to cells cultured on 2D substrates, cells grown in a 3D microenvironment exhibit more similarities to in vivo cells. Therefore, 3D cell culture models provide a promising alternative for conventional 2D monolayer cell culture. To improve conventional PDL cell culture models, we have recently developed a 3D cell culture method, which is based on spheroid formation of PDL cells on chitosan films. Here, we present detailed cell spheroid culture protocols based on chitosan films. The 3D culture system of PDL cellular spheroids overcome some of the limitations related to conventional 2D monolayer cell culture, and thus may be suitable for producing PDL cells with an enhanced therapeutic efficacy for future periodontal tissue regeneration.

Here, we present protocols of culturing human periodontal ligament (PDL) cell spheroids by chitosan films. The culture of three-dimensional (3D) cellular spheroids provides an alternative to conventional tissue culture polystyrene (TCPS) culture system.

키토산 필름에 인간 치주 인대 세포 스페로이드의 형성

Periodontal ligament (PDL) cells hold great promise for periodontal tissue regeneration. Conventionally, PDL cells are cultured on two-dimensional (2D) ...