We would like to thank Prof. David Somers and Dr. Jeongsik Kim for the luciferase reporter plasmid and initial method development. Prof. Karen Halliday kindly provided all the circadian mutant lines used in this study. This research was supported by Royal Society research grants RS120372 and RS140275. GvO is a Royal Society University Research Fellow (UF110173).

참고 :이 프로토콜에서 설명 시약 및 볼륨 테스트 애기 줄에 표시되고, 그 유전자형에 대한 여섯 복제 우물 발생합니다. 하나 이상의 선을 분석 할 때 라인의 개수와 재료를 곱 분석한다. (추가 라인에서 대표적인 결과를 후속 제공 하겠지만) 비디오에서 야생형 애기는 주기성 시계 돌연변이 광고 ZTL 비교한다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 효소액 </td><td></td></tr><tr><td> 셀룰라아제 </td><td> 0.5 % (W / V) </td></tr><tr><td> 펙 티나 R10 </td><td> 0.25 % (w / v)의 </td></tr><tr><td> D- 만니톨 </td><td> 400 밀리미터 </td></tr><tr><td> 염화칼슘 (2) </td><td> 10 mM의 </td></tr><tr><td> KCl을 </td><td> 20 mM의 </td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 </td><td> 0.1 % (W / V) </td></tr><tr><td> MES, pH가 5.7 </td><td> 20 mM의 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> W5 솔루션 </td><td></td></tr><tr><td> 염화나트륨 </td><td> 150 밀리미터 </td></tr><tr><td> 염화칼슘 (2) </td><td> 125 밀리미터 </td></tr><tr><td> KCl을 </td><td> 5 밀리미터 </td></tr><tr><td> MES, pH가 5.7 </td><td> 2 밀리미터 </td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 5 밀리미터 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> MMG 솔루션 </td><td></td></tr><tr><td> MES, pH가 5.7 </td><td> 4 mM의 </td></tr><tr><td> D- 만니톨 </td><td> 400 밀리미터 </td></tr><tr><td> 의 MgCl 2 </td><td> 15 mM의 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> PEG 솔루션 </td><td></td></tr><tr><td> PEG 4000 </td><td> 40 % (W / V) </td></tr><tr><td> D- 만니톨 </td><td> 200 밀리미터 </td></tr><tr><td> 염화칼슘 (2) </td&gt; <td> 100 밀리미터 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> 이미징 솔루션 </td><td></td></tr><tr><td> W5 솔루션 </td><td> 최종 부피 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> 5 % (V / V) </td></tr><tr><td> 루시페린 </td><td> 1.2 밀리미터 </td></tr><tr><td> 암피실린 </td><td> 50 ㎎ / ㎖ </td></tr></tbody></table> 표 1 : 솔루션의 목록입니다. 재료 및 버퍼의 1. 준비 <ol><li> 식물 재료 <ol><li> 애기 장대 골 유지 -0 물에 씨앗을 1.5 ml의 튜브에 4 ° C에서 어둠 속에서 나흘. 냄비에 흙 위에 씨앗을 피펫 7 일 동안 21 ° C에서 긴 하루 조건 (16 시간 등 8 시간 어둠)에 전송할 수 있습니다. 높은 습도를 보장하기 위해 3 일을 위해 냄비에 뚜껑을 둡니다. 이식 여섯 새로운 8cm X 13cm X 5cm 냄비에 모종 및 anoth에 대해 동일한 조건에서 식물 성장 계속이십일일 어. 토양이 전체에 습기가 있는지 확인합니다. </li></ol></li><li> 리포터 플라스미드 <ol><li> 제조자의 지시에 따라 DNA 분리 키트를 이용하여 사전에 세균 배양 LUC 리포터 플라스미드 19 : CCA1pro 정제. 참고 : 20 μg의 리포터 플라스미드는 형질 전환을위한 (DH 2 O 2 μg의 / μL에 10 μl를)가 필요합니다. </li></ol></li><li> 솔루션 주 :이 다섯 해결책이 필요한 프로토콜의 경우 : 효소 용액을 워시 5 (W5) 용액, 만니톨 - 마그네슘 (MMG) 용액에, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 수용액 및 이미징 솔루션 (표 1). 원형질체 분리 단계를 계속하기 전에 다음을 준비합니다. <ol><li> 표 1에 따라 효소 용액 10 ㎖를 준비 효소 마지막으로 추가하고, 필터를 0.22 μm의 주사기 필터를 통해 살균 용액. </li><li> 다음 볼륨에 남아있는 솔루션을 준비 : 15 ml의 W5 용액, 10 ml의 MMG의olution, 1 표 1에 따라 ml의 PEG 용액 1.5 ml의 이미징 솔루션을 제공합니다. 참고 :이 PEG 솔루션은 PEG가 완전히 용해 된 것을 확인하기 위해 형질 전에 시간보다 더 적게 준비하는 것이 중요합니다. 필터는 0.22 μm의 주사기 필터를 통해 이미징 솔루션 살균. </li></ol></li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54586/54586fig1.jpg" /> 그림 1 :. 원형질체 분리 성인 애기 장대 식물 (A)의 잎은 하부 표피 층 (B)를 향 오토 클레이브 테이프에 고정되어있다. (C) 매직 테이프 부드럽게 15ml의 원뿔형 튜브의 선단과 하부 표피층에 가압된다. (D) 매직 테이프 엽육 세포 (E)를 노출시키기 위해 제거된다. (F) 휴가와 오토 클레이브 테이프의 스트립첨부의이 용액에 원형질체를 방출 효소액 함유 셀룰라아제와 펙 티나​​에 뜨게된다. (G)는 해골 효소 분해 후 오토 클레이브 테이프에 남아 있고 잎은 효소 용액 (H)의 원형질체를 떠나, 삭제됩니다. (I) 최종 결과 엽육의 원형질체 (스케일 바 = 50 μm의). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54586/54586fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 2. 원형질체 분리 <ol><li> 페트리 접시에 레이블을 10 ml의 필터 살균 효소 솔루션을 추가 할 수 있습니다. </li><li> 깨끗한 실험실 표면에 접착면이 위로와 오토 클레이브 테이프의 네 개의 스트립을 수정 한 스트립의 배양 접시의 크기를 표시합니다. </li><li> (4 주 오래된 식물 (그림 1a)의 잎을 잘라와 위를 향하도록 하부 표피 표면, 즉 (오토 클레이브 테이프에 상부 표피를 누르십시오 <stroNG&gt; 그림 1b)). </li><li> 조심스럽게 15 ML 원뿔 튜브를 사용하여 하부 표피 표면에 매직 테이프의 스트립을 누릅니다. 잎 조직 (그림 1C)을 분쇄 않도록주의하십시오. 조심스럽게 낮은 표피를 제거하는 마법의 테이프를 떼어 (그림 1D)와 엽육 세포를 (그림 1E)를 노출합니다. </li><li> 페트리 접시에 테이프를 이동하고 효소 용액 (그림 1 층)에 떠있는, 사용 핀셋을 배양 접시에 맞게 오토 클레이브 테이프를 잘라, 아래로 향하게 둡니다. 원형질체이 용액에 출시 될시 60 분을위한 플랫폼 통에 60 rpm으로 회전합니다. </li><li> 50 ML 원뿔 튜브에 원형질체 (그림 1 시간)을 포함하는 용액을 제거하고 오토 클레이브 테이프 (그림 1g)의 스트립을 폐기하고 피펫 핀셋을 사용합니다. 넓은 구멍 피펫 팁을 (예 : P5000 끝이나 끝과 P1000 팁이 차단 등) 사용합니다. </li><li> 100 ×에서 원형질체를 원심 분리기4 ° C에서 3 분 동안 g 및 피펫으로 뜨는을 제거합니다. 펠렛은 매우 느슨로,주의하십시오. </li><li> 부드럽게 튜브를 소용돌이 10 ML의 W5의 원형질체에 솔루션에 resuspend을 추가합니다. </li><li> 30 ~ 60 분 동안 얼음에 원형질체를 휴식. 이 단계에서, 혈구 (그림 1I)에 원형질체를 계산하여 수율을 평가합니다. </li><li> 4 ° C에서 3 분 동안 100 × g에서 원심 분리하여 원형질체를 수집하고 피펫으로 뜨는을 제거합니다. 펠렛은 매우 느슨로,주의하십시오. </li><li> MMG 용액에 5 × 105 원형질체 / ml의 농도로 재현 탁 원형질체. </li></ol> 3. 원형질체 형질 <ol><li> 15 ML 원뿔 관에 10 μl의 리포터 플라스미드 (2 μg의 / μL)를 추가합니다. </li><li> 튜브에 400 ㎕의 원형질체를 추가합니다. </li><li> 하나의 볼륨 (410 μL) PEG 솔루션을 추가하고 원형질체를 형질 부드럽게 12 번 튜브를 반전하여 섞는다. </li><li> 8-15 분 INC 후실온에서 ubation는 4 권 (1640 μL) W5 용액과 원형질체-DNA-PEG 혼합물을 희석하고 부드럽게 여섯 번 반전 섞는다. </li><li> 실온에서 2 분 동안 100 XG에서 원심 분리에 의해 형질 전환 된 원형질체를 수집하고 피펫으로 뜨는을 제거합니다. 펠렛은 매우 느슨로 다시 한 번,주의하십시오. </li><li> 1250 ㎕의 이미징 솔루션의 원형질체를 재현 탁. </li><li> 육으로 나누어지는 200 μL는 W5 솔루션 빈 우물을 작성 및 발광 영상에 적합한 접착제 명확한 뚜껑 접시를 밀봉, 96 웰 플레이트의 우물을 복제합니다. </li></ol> 4. 이미지 <ol><li> 식물의 이미지에 적합한 임의의 발광 이미지 설정에 접시를 전송합니다. 우물 사이에 응축 압력 차이를 방지하기 위해 전송 후 판 10 ~ 15 분에 접착제 뚜껑을 변경 한 후 촬영을 시작합니다. 플레이트를 실온에서 5 일 동안 모든 ~ 45 분 (3 초 아니라 당) 참조하십시오. 참고 :판의 주파수를 읽고 잘 당 판독 시간은 영상 설정에 따라 달라질 수 있습니다. </li></ol> 5. 데이터 분석 <ol><li> 모든 분석 소프트웨어 (예를 들면, 생체 리듬 분석 소프트웨어 시스템 (BRASS) 22)를 이용하여 발광 결과를 분석한다. 일중 결함을 나타 내기 위해 야생 형 컨트롤 돌연변이 라인을 비교합니다. </li></ol>

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Genet. 217 (1), 6-12 (1989).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+rice+green+tissue+protoplast+system+for+transient+gene+expression+and+studying+light/chloroplast-related+processes.">A highly efficient rice green tissue protoplast system for transient gene expression and studying light/chloroplast-related processes.</a> Plant Methods. 7 (1), 30 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

여기, 우리는 원형질체 분리, 형질 전환 및 luminecent 영상을 포함한 애기 라인의 circadian 기간 결함을 화면에 신속한 분석을 제시한다. 야생형의 일주기 기간 애기 장대와 시계 돌연변이 cca1 / lhy, ZTL 및 CCA1 -ox는 CCA1pro에서 발광 측정으로부터 계산 하였다 : LUC 기자와 더 많은 시간 -를 사용하여 전체 식물에서 생성 된 게시 된 데이터와 일치하는 것으로 소비 형질 전환 방법 (표 2). 애기 돌연변이를 스크리닝이 분석을 사용하여 시간이 걸리고 전용 특정 돌연변이는 야생형 리듬을 나타내는 것으로 밝혀 수도 형질 발광 라인을 생성하도록 초기 조건을 회피한다. 이 프로토콜의 명확한 장점은 애기 장대 라인은 식물의 타임 키핑에 영향을 미치는 많은 유전자의 식별 도움이 될 것 변경된 주기성 전사 리듬을 위해 짧은 시간에 상영 될 수 있다는 것이다. (26, 27)에 도달하도록하는 효소 용액으로 스트립 침투 얇은 스트립 진공으로 잎 또는 모종 절단 포함한다. 후속 소화 효소 용액으로 원형질체를 분리하는 어두운 적어도 3 시간 동안 배양을 필요로한다. 진공 침투가 적용되지 않는 경우 18 시간까지 배양 시간의 최대 권장된다. 효소로 꿰 뚫을 표피 세포층이 테이프에 의해 제거되기 때문에 여기에 제시된 프로토콜에서 진공 함침이 불필요하다. 식물 재료를 절단하여 원형질체를 생성 할 때 이것은 소화 후 세포벽 파편 원형질체로부터 분리 할 필요가있다; 이것은 일반적으로 상기 용액을 여과 또는 당 그라데이션 27,26에 정제가 수행된다. 여기에, 모든 소화되지 않은 조직은 오토 클레이브 테이프 이후에 남아소화 원형질체 여과 설탕 구배 정제를 생략 할 수 있도록. 장기간 protoplasting 절차에 기인하는 응력이 세포 생존 및 주기성 시계에 영향을 미치는 가능성이있다. 여기 시각화 테이프 기반 protoplasting 방법 (20)는 원형질체의 높은 숫자를 산출; 및 주기성 시계열상에서 세포의 생존 능력을 부여하고 원형질체 및 전체 모종 (표 2)의 정합 기간의 길이는 여기에 설명 된 방법은 원형질체를 생성하는 다른 방법에 비해 바람직하다. 프로토콜의 형질 전환 단계는 원형질체의 생존에 미치는 영향 중요한 단계이다. 페그 용액을 세포 내로 전달하는 DNA, 두 배양 시간이 용액에 (단계 3.4) 및 실험적으로 결정되어야한다 PEG의 비율을 가능하게한다. 표준 농도 변환 효율 및 높은 저감 낮은 농도로 20 % 인생존 (28)을 감소 농도. 오분 같은 짧은 배양 시간은 원형질체 (27)의 효율적인 형질 전환을 수득 할 수있다. 원형질체는 어떤 발광 이미징 플랫폼에서 이미지화 할 수있다. 이 비디오에서는, 우리는 높은 처리량 검사 및 자주 측정 할 수 있습니다 (~ 20 μE의 결합 강도에 각각 빨간색과 파란색의 LED, 630 및 470 nm의) 외부 조명이 장착 된 발광 플레이트 리더를 사용하고 있습니다. 조명 광합성 사용할 바와 같은 전하 결합 소자 (CCD) 카메라를 기반 대안 플레이트 리더 나 설정 등의 발광을 검출하고, 다른 촬상 장치는, 긴 똑같이 잘 적용될 수있다. 제어 가능한 캐비닛에 장착 된 CCD 카메라를 사용하는 장점은 가볍고 온도를 프로그래밍 할 수있다. 단점은 교란에 추가하여 원형질체에 스트레스를 일으킬 수 어둠의 장기간을 도입, 긴 캡처 시간내생 계시를 보내고. 에 관계없이 선택 실험하는 플랫폼의 설정을 조정 모종 또는 성숙한 식물에 대한 설정과 비교해야 할 것으로 보인다. 우리의 경험에서 영상 버퍼에 형질 전환 및 / 또는 루시페린 동안 리포터 플라스미드의 농도를 증가시키는 것은 초기 실험에서 발생할 수있는 불규칙하거나 빠르게 둔화 리듬을 해결할 수 있습니다. 미래의 실험에서, 여기에 설명 된 방법은 임의의 돌연변이 애기 라인의 주기성 표현형 연구에 적용될 수있다. 약간의 수정과 함께, 계시에 예를 들어, 다양한 약물의 효과는이 설정에서 연구 할 수있다. 또한, 형질 감염은 또한이 프로토콜의 다양성을 확대 19 유전자 침묵 인공 마이크로 RNA를 포함하도록 수정 될 수있다. 쌀 원형질체를 생성하는 프로토콜 29 잘 확립되어 있으며 여기에 제시된 촬상 프로토콜 동등 우리 U를 더욱 적용될 수있다경제적으로 중요한 단자엽 작물의 시계 nderstanding.

대부분의 생명체는 환경에 대한 매일의 변화를 효율적으로 협상을 돕기 위해 내생 시계를 가지고있다. 이 시계의 일 주기성 시계는 외부 환경에서 예측 가능한 변화를 예측하는 생물의 신진 대사와 생리학의 여러 측면을 조절한다. 4 - 예를 들어 식물에서, 시간적으로 예측 병원균이나 초식 동물의 공격을 예상 강하게 전체 감수성 1을 줄일 수 있습니다. 전분 대사는 긴밀하게 길거나 짧은 하루 조건 5에서 성장 여부를 새벽까지 마지막 전분 매장량을 보장하기 위해 일 주기성 시계에 의해 조절된다. 실제로, 24 시간의 환경 쇼 증가 성장률 일치 주기성 시계 식물, 탄소 고정 률과 생존율 동안 부정합 (6)의 클럭을 실행하는 식물에 비해. 이 모든 과정에서 활동 일주기의 광범위한 영향은 세 번째까지의 리듬 규정에서 크게 발생애기 장대 (7) 총 사체의. 이러한 리듬 유전자 산물이 대사 경로 호르몬 신호 및 스트레스 반응 7 세포 과정을 포함하는 넓은 범위에 포함된다. 그 꼭대기에, 단백질 기능을 직접 주기성 조절이 인산화 8 일주기 규제와 아마 다른 번역 후 변형 (PTMS)에 의해 설정됩니다. 이 매일 전사 재 프로그램을 구동하는 일 주기성 시계의 중심에 / 번역 피드백 아침 발현 유전자를 포함하는 (TTFLs을), 루프 전사의 네트워크 거짓말 발현을 억제 주기성 시계 ASSOCIATED 1 (CCA1) 및 LATE 연장 배축 (LHY) - 11 LUX ARRHYTHMO (LUX), 개화 3 (ELF3), 및 ELF4 9, 저녁 유전자 CAB 1 (TOC1), GIGANTEA (GI) 저녁 복합체 (EC)의 구성원의 타이밍의. 함께 지혜H 의사 RESPONSE 레귤레이터 -genes (PRR3, 5, 7, 9) EC가 양의 레귤레이터 (12)로서 작용하는 반면, TOC1가 CCA1 / LHY 발현을 억제한다 - 14. TTFL 네트워크 구성 요소의 피드백 메카니즘에 추가적인 전사 후 및 번역 후 조절은 튜닝 활동 일주기에서 중요한 역할을한다. 현재까지, 일 주기성 시계 단백질에 확인 된 가장 풍부한 PTM은 인산화 (15)이다. 카제인 키나제 2 (CK2)에 의해 CCA1의 인산화는 발기인 16을 대상으로 바인딩과 주기성 시계 (17)의 온도 보상을위한 중요한 영향을 미친다. PRR 단백질이 차등 일주기 사이클에 인산화 및 TOC1의 인산화가 부정적인 레귤레이터와의 상호 작용에 영향을 미치는되어, 저녁 - 위상 클럭 구성 요소 ZEITLUPE (ZTL) 18. 이러한 예는 설명 방법을 24 시간에 PTMS 및 단백질 - 단백질 상호 작용을 조정 TTFL 네트워크전사 발진기. 전사 시계 네트워크 및 규제에 대한보다 자세한 소개는, 우수한 최근 리뷰 (예를 들어 기준 15)을 사용할 수 있습니다. 그러나 무엇 불분명 남아있는 것은 리듬 조절 과정과 세포 대사의 다른 측면은 다시 계시 메커니즘 자체에 공급하는 정도입니다. 시계 결함에 대한 애기 장대 돌연변이의 광범위한 선별 메커니즘 또는 신호 전달 경로가 TTFL 네트워크에서 24 시간 리듬의 생성에 관여 할 수있는 더 이해를 얻을 수 있습니다. 이를 위해 김 써머 이전에 어떤 애기 라인 (19)에 시계 기능의 효율적이고 신속한 분석을위한 돌파구 방법을 발표했다. 원형질체의 과도 발현의 사용에 기초하여,이 방법은 안정한 형질 전환 라인에 대한 필요성을 능가 또는 형광 마커 클록 라인에 교차. 여기에, 우리는 높은 항복 원형질체의 isolatio을 시각화최적화 프로토콜과 함께 해당 방법 20 96- 웰 플레이트 판독기에서 일시적으로 발현 클록 마커 발광 이미징에 의해 주기성 결함을 선별한다. 우리는 변경된 활동 일주기를 감지 여기에 성공적으로 설명하는 방법을 확인하기 위해 잘 특성화 시계 돌연변이 체에 야생형 Col- 0 애기을 비교합니다. LUC 19 : CCA1pro,이 라인에서 파생 된 원형질체는 주기성 CCA1 발기인에서 반딧불의 루시 페라을 표현 리포터 구조로 형질된다. 루시퍼 라제는 이러한 원형질체의 기간의 진폭 및 전사 리듬의 위상을 평가 시간이 지남에 이미징되는 광 출사 21 oxyluciferin 루시페린이 전자적으로 여기 된 변환 된 다단계 반응을 촉매. 프로토콜은 세 개의 주요 부분으로 구성된다; 리포터 플라스미드 및 발광 IM로 원형질체를 형질 감염, 원형질체를 분리노화. 이들 세 부분은 항상 새로 제조 완충액 및 시약을 사용하여 매일 수행한다. 식물 성장 및 리포터 플라스미드 충분한 양의 정제를 미리 수행되어야하며, 이러한 프로토콜에서 가시화되지 않는다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CELLULYSIN Cellulase, Trichoderma viride&#160;</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>219466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pectinase R10</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M4125&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>327765000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>327300010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>G/0500/60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol (PEG) 4000</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>434630010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Firefly</td>
			<td>Biosynth AG</td>
			<td>L-8200</td>
			<td>Dissolve luciferin powder in 0.1M trisphosphate buffer pH 8.0 to a concentration of 50mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Comply Steam Indicator Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>1222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>819-1460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>SLS2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 96 well, flat bottom, white</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TopSeal-A, adhesive lids for 96-well plates</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6050195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 ml, w/o needle</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>302188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.22 &#181;m</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Rhythms Analysis Software System (BRASS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Free download at amillar.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAfilter Maxiprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Fuch-Rosenthal counting chamber, double cell</td>
			<td>Hawksley</td>
			<td>AC6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field microscope</td>
			<td>Optika Microscopes</td>
			<td>B-150POL-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB942 TriStar2 multimode reader, with luminescence module</td>
			<td>Berthold Technologies Ltd</td>
			<td>57947/57948</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid analysis of circadian phenotypes in arabidopsis protoplasts transfected with a luminescent clock reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.

야생형 애기 장대의 원형질체 cca1 / lhy (단기간 변이체 2) ZTL (장기간 돌연변이 23)과 과발현 라인 CCA1 -ox가 (24 부정맥) 공지 클럭 돌연변이 비교 하였다. 모두 일시적으로 CCA1pro로 형질했다 : LUC 기자 5 일 동안 플레이트 리더에 일정한 빛 군데. 여기에서 우리는 cca1 / lhy 돌연변이에, 일주기 조절 유전자 발현의 자유 실행 기간이 발광 시계의 안정적인 형질 발현이 2,9 마커 분석 게시 기간과 일치, (그림 2a)를 단축 것을 보여줍니다. ZTL 돌연변이의 원형질체의 일 주기성 진동의주기는 야생형보다 더 긴 (그림 2B), 모종에서 이전에 게시 된 결과에 따라, 세포 현탁액의 cultu입술과 원형질체 19,23,25. CCA1의 과발현은 아침 상에 시계를 고정 및 글로벌 전사는 부정맥 (24)가된다. CCA1의 -ox의 원형질체 (그림 2C)에서 LUC 식 : 지속적으로, 우리는 CCA1pro에는 진동을 관찰합니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54586/54586fig2.jpg" /> 그림 2 : Col- 0, cca1 / lhy, ZTL 및 CCA1의 원형질체 활동 일주기 원형질체 -ox 일시적으로 CCA1pro로 형질 전환 하였다 : LUC는 구성과 발광의 활동 일주기 5 일 동안 몇 군데 있었다 (A - C). (D) 골 -0, cca1 / lhy 및 ZTL에 발광 흔적에 따라 일주기 기간 추정치 (A - B). 나를± SEM은, N = 3-5, 표시 t 테스트 p- 값으로. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54586/54586fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 유전자형 </td><td> 기간 (원형질체) </td><td> 기간 (유전자 변형) </td><td> 에 의해보고 : </td><td> 참조 </td></tr><tr><td> Col- 0 </td><td> 23.0 ± 0.21 </td><td> 24.4 ± 0.09 </td><td> pCCA1 : 골에 LUC -0 </td><td> (2) </td></tr><tr><td> cca1 / lhy </td><td> 20.6 ± 0.13 </td><td> 19.9 ± 0.11 </td><td> pCCA1 : 골에 LUC -0 </td><td> (2) </td></tr><tr><td></td><td></td><td> ~ 18 </td><td> L 어 배경 RNA </td><td> (9) </td></tr><tr><td&gt; ZTL </td><td> 25.1 ± 0.12 </td><td> 27.4 ± 0.5 </td><td> CAB2 : C24 생태형에 LUC </td><td> (22) </td></tr><tr><td> CCA1 -ox </td><td> 부정맥 </td><td> 부정맥 </td><td> pCCA1 : LUC (LD 데이터 전용) </td><td> (2) </td></tr><tr><td></td><td></td><td> 부정맥 </td><td> 골 -0 배경에 RNA와 단백질 </td><td> (23) </td></tr></tbody></table> 표 2 : 형질 전환 모종에 비해 원형질체의 활동 일주기 pCCA1의 일주기 기간 :. 기간의 첫 번째 돌연변이보고 길이와, 가능한 경우와 비교하여 원형질체에 LUC 식 pCCA1과 : 골 -0에 LUC 식입니다.

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Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

주기성 시계는 애기 사체의 제에 대한 규제 만 계시로 피드백 유전자의 비율은 알 수없는 남아 있습니다. 여기에서 우리는 신속하게 일시적으로 원형질체에 표시되는 주기성 기자의 발광 이미지를 사용하여 애기 장대의 돌연변이 라인에서 일주기 표현형을 평가하는 방법을 시각화.

발광 시계 기자와 애기 장대 원형질체 트랜의 일주기 표현형의 신속한 분석

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.7K 조회수.  University of Edinburgh.  주기성 시계는 애기 사체의 제에 대한 규제 만 계시로 피드백 유전자의 비율은 알 수없는 남아 있습니다. 여기에서 우리는 신속하게 일시적으로 원형질체에 표시되는 주기성 기자의 발광 이미지를 사용하여 애기 장대의 돌연변이 라인에서 일주기 표현형을 평가하는 방법을 시각화. 

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Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts from different plant tissues was first reported more than 40 years ago 1 and has since been adapted to study a variety of cellular processes, such as subcellular localization of proteins, isolation of intact organelles and targeted gene-inactivation by double stranded RNA interference (RNAi) 2-5. Most of the protoplast isolation protocols use leaf tissues of mature Arabidopsis (e.g. 35-day-old plants) 2-4. We modified existing protocols by employing 14-day-old Arabidopsis seedlings. In this procedure, one gram of 14-day-old seedlings yielded 5 106-107 protoplasts that remain intact at least 96 hours. The yield of protoplasts from seedlings is comparable with preparations from leaves of mature Arabidopsis, but instead of 35-36 days, isolation of protoplasts is completed in 15 days. This allows decreasing the time and growth chamber space that are required for isolating protoplasts when mature plants are used, and expedites the downstream studies that require intact protoplasts.

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

This video shows a procedure for isolating intact protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis. Given that the isolated protoplasts remain intact for at least 96h and are isolated from seedlings instead of one-month-old mature plants, this procedure expedites assays requiring intact protoplasts.

14 일 된 모종의 조직에서 Protoplasts의 분리 Arabidopsis thaliana</em

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts  from different plant tissues was first ...

연구

생물학

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis thaliana, the floral-dip transformation method1-2 has replaced all previous methods because of its simplicity, efficiency, and low cost. Specifically, shoots of young flowering Arabidopsis plants are dipped in a solution of Agrobacterium tumefaciens carrying specific plasmid constructs. After dipping, the plants are returned to normal growth and yield seeds, a small percentage of which are transformed with the foreign gene and can be selected for on medium containing antibiotics. This floral-dip method significantly facilitated Arabidopsis research and contributed greatly to our understanding of plant gene function. In this study, we use the floral-dip method to transform a reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), under the control of TSO2 promoter. TSO2, coding for the Ribonucleotide Reductase (RNR) small subunit3, is a cell cycle regulated gene essential for dNDP biosynthesis in the S-phase of the cell cycle. Examination of GUS expression in transgenic Arabidopsis seedlings shows that TSO2 is expressed in actively dividing tissues. The reported experimental method and materials can be easily adapted not only for research but also for education at high school and college levels.

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

This article illustrates the floral-dip method of Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of Arabidopsis thaliana. By introducing a cell-cycle regulated promoter-reporter, pTSO2::&beta;-glucuronidase (GUS), into Arabidopsis, we illustrates how one detects GUS reporter expression in transgenic seedlings.

의 꽃 - 물놀이 변환 Arabidopsis thaliana 검사 pTSO2 : β - glucuronidase 리포터 유전자 발현

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

에 Postembryonic Phenotypes을 식별하기 위해 RNAi 심사 C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks (reviewed1,2). The circadian time-keeping system is a hierarchical multi-oscillator network, with the central clock located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) synchronizing and coordinating extra-SCN and peripheral clocks elsewhere1,2. Individual cells are the functional units for generation and maintenance of circadian rhythms3,4, and these oscillators of different tissue types in the organism share a remarkably similar biochemical negative feedback mechanism. However, due to interactions at the neuronal network level in the SCN and through rhythmic, systemic cues at the organismal level, circadian rhythms at the organismal level are not necessarily cell-autonomous5-7. Compared to traditional studies of locomotor activity in vivo and SCN explants ex vivo, cell-based in vitro assays allow for discovery of cell-autonomous circadian defects5,8. Strategically, cell-based models are more experimentally tractable for phenotypic characterization and rapid discovery of basic clock mechanisms5,8-13.
Because circadian rhythms are dynamic, longitudinal measurements with high temporal resolution are needed to assess clock function. In recent years, real-time bioluminescence recording using firefly luciferase as a reporter has become a common technique for studying circadian rhythms in mammals14,15, as it allows for examination of the persistence and dynamics of molecular rhythms. To monitor cell-autonomous circadian rhythms of gene expression, luciferase reporters can be introduced into cells via transient transfection13,16,17 or stable transduction5,10,18,19. Here we describe a stable transduction protocol using lentivirus-mediated gene delivery. The lentiviral vector system is superior to traditional methods such as transient transfection and germline transmission because of its efficiency and versatility: it permits efficient delivery and stable integration into the host genome of both dividing and non-dividing cells20. Once a reporter cell line is established, the dynamics of clock function can be examined through bioluminescence recording. We first describe the generation of P(Per2)-dLuc reporter lines, and then present data from this and other circadian reporters. In these assays, 3T3 mouse fibroblasts and U2OS human osteosarcoma cells are used as cellular models. We also discuss various ways of using these clock models in circadian studies. Methods described here can be applied to a great variety of cell types to study the cellular and molecular basis of circadian clocks, and may prove useful in tackling problems in other biological systems.

Circadian clocks function within individual cells, i.e., they are cell-autonomous. Here, we describe methods for generating cell-autonomous clock models using non-invasive, luciferase-based real-time bioluminescence technology. Reporter cells provide tractable, functional model systems for studying circadian biology.

루시 페라 제 Bioluminescence 기자를 사용하여 유전자 발현의 셀 자치 Circadian 시계 리듬을 모니터링

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

헤어 재생시 상피 - 중간 엽 시그널링의 빠른 유전 분석

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

에서 초기 단계의 배아의 효율적이고 신속한 분리<em&gt; 애기 장대</em&gt; 씨앗

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a novel Drosophila circadian output, called the temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night 3. Surprisingly, the TPR and locomotor activity are controlled through distinct circadian neurons3. Drosophila locomotor activity is a well&#160;known circadian behavioral output and has provided strong contributions to the discovery of many conserved mammalian circadian clock genes and mechanisms4. Therefore, understanding TPR will lead to the identification of hitherto unknown molecular and cellular circadian mechanisms. Here, we describe how to perform and analyze the TPR assay. This technique not only allows for dissecting the molecular and neural mechanisms of TPR, but also provides new insights into the fundamental mechanisms of the brain functions that integrate different environmental signals and regulate animal behaviors. Furthermore, our recently published data suggest that the fly TPR shares features with the mammalian BTR3. Drosophila are ectotherms, in which the body temperature is typically behaviorally regulated. Therefore, TPR is a strategy used to generate a rhythmic body temperature in these flies5-8. We believe that further exploration of Drosophila TPR will facilitate the characterization of the mechanisms underlying body temperature control in animals.

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

We recently identified a novel Drosophila circadian output, temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night. TPR is regulated independently from another circadian output, locomotor activity. Here&#160;we describe the design and analysis of TPR in Drosophila.

드로소필라의 온도 선호도 행동과 Circadian 리듬의 설계 및 분석

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

고해상도 용융 분석과 PCR을 이용하여 신속하고 효율적인 Zebrafish의 유전자형

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial development will allow for more rigorous analysis of orofacial phenotypes upon abrogation with substances that can genetically or molecularly manipulate gene expression or protein function. Using two dimensional images of the embryonic heads, traditional size dimensions-such as orofacial width, height and area- are measured. In addition, a roundness measure of the embryonic mouth opening is used to describe the shape of the mouth. Geometric morphometrics of these two dimensional images is also performed to provide a more sophisticated view of changes in the shape of the orofacial region. Landmarks are assigned to specific points in the orofacial region and coordinates are created. A principle component analysis is used to reduce landmark coordinates to principle components that then discriminate the treatment groups. These results are displayed as a scatter plot in which individuals with similar orofacial shapes cluster together. It is also useful to perform a discriminant function analysis, which statistically compares the positions of the landmarks between two treatment groups. This analysis is displayed on a transformation grid where changes in landmark position are viewed as vectors. A grid is superimposed on these vectors so that a warping pattern is displayed to show where significant landmark positions have changed. Shape changes in the discriminant function analysis are based on a statistical measure, and therefore can be evaluated by a p-value. This analysis is simple and accessible, requiring only a stereoscope and freeware software, and thus will be a valuable research and teaching resource.

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

A method to quantify the orofacial size and shape of Xenopus laevis embryos has been developed. In this protocol, traditional size measurements are combined with geometric morphometrics to allow for more sophisticated analyses of orofacial development and defects.

구강 안면 표현형의 정량화에<em&gt; Xenopus의</em

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency1, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.

Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell&#8217;s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.