This work is supported by the National Institutes of Health (NIH) grants R01DK093953 (X.L.), P30NS069271, BRFSG-2014-07 (X.L.). C.J. is partially supported by American Heart Associate pre-doctoral fellowship (14PRE20380168, to C.J.).

1. 멤브레인 시트 준비 및 고정 <ol><li> IRFP-PAmCherry1-PH PLC의 δ1으로 표시 막 시트를 준비 <ol><li> 플라스미드 DNA를 인코딩 IRFP PAmCherry1-PH-PLC는 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 23 δ1 준비한다. </li><li> 문화 INS-1 # 1.5에 세포 18mm 라운드 커버 슬립 표준 INS-1 세포 배양 프로토콜 (38, 39) 다음 50~70%의 컨 플루 30 μg의 / ㎖ 피브로넥틴 미리 코팅. 50 내지 70 %의 컨 플루 언시에 도달 한 후, 세포를 형질 하루. </li><li> IRFP PAmCherry1-PH-PLC로 형질 감염 세포를 제조자의 프로토콜을 다음 리포좀 형질 감염 시약을 이용 δ1. 형질 감염 후, 세포를 48 시간 동안 성장하는 것을 허용한다. </li><li> 실험 당일 ~ 0.5 코팅 된 커버 (한 쪽) - 500 μg의 / ㎖ 폴리 D 라이신 1 ㎖ 1-2 시간 동안 (PDL은 DH 2 O로 희석). 그런 다음에 티슈 페이퍼를 배치하여 PDL 드레인커버 슬립의 가장자리. 나중에 사용하기 위해 미리 냉장 (4 ℃로) 금속판에 커버 슬립을 놓습니다. </li><li> 1 mM의 EGTA를 포함하는 1 ML의 얼음처럼 차가운 인산 완충 식염수 (PBS) - ~ 0.5으로 된 커버에 성장 사전 형질 INS-1 세포를 씻으십시오. 세척을 세 번 반복 PBS 드레인. </li><li> 핀셋으로 미리 냉장 금속 접시에 PDL 코팅 커버 슬립에 배양 된 세포 (세포면이 아래를 향하도록)으로 된 커버를 놓습니다. 세포가 PDL 코팅 된 커버 (그림 2)에 부착 할 수 있도록 10 분 - 7 냉장고 (4 ℃)에서 접시를 둡니다. 주의 : 항온 처리 시간 (7)의 범위 내에 있어야 - PDL 코팅 표면에 세포를 잘 부착되도록 10 분. 냉장고 환경은 건조 및 배양 너무 오래 안됩니다. </li><li> 냉장고에서 금속판을 제거합니다. 부드럽게 핀셋을 사용하여 미리 형질 감염된 세포를 함유하는 커버 슬립을 벗겨. 이것은 셀에 막 시트를 얇게 만들어커버 슬립을 PDL은 코팅. 부드럽게 ~ 0.5으로 막 시트를 세척 - 1 ml를 빙냉 PBS 후 ~ 0.5으로 고정 - 1 ml의 빙냉 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) + 4 ℃에서 15 분 동안 PBS에서 0.2 % 글루 타르 알데히드 (GA). 주의 : 파라 포름 알데히드와 글루 타르 알데히드는 독성이. 피부와 눈 보호 흄 후드를 처리합니다. </li><li> 고정 후, 이미지 멤브레인 시트는 즉시 (3 절 참조) 또는 ~ 0.5 저장 - 4 ° C에서 1 ml의 PBS를. 참고 : 막 시트를 고정 후, 세포질에서 PI (4,5) P (2) PH 프로브의 결합에는 평형이 없습니다. 결합 된 PH 프로브는 점차적으로 막 시트에서 해리와 (이 주에 일이 걸릴 수도 있지만) 솔루션으로 확산됩니다. 따라서, 우측 시료 전처리 후 이미지를 고정 샘플을 권장한다. </li></ol></li><li> PI (4,5) P (2) 특정 항체 라벨링에 대한 멤브레인 시트를 준비 <ol><li> 문화 INS-1 # 1.5에 셀, 30 미리가 코팅 된 18mm 라운드 커버 슬립# 181; g / ㎖ 피브로넥틴 50 % -70 %의 합류. 단계 1.1.3에 기재된 DNA와 형질 세포 다음날 플라스미드. </li><li> 상술 한 바와 같이 1.1.7에 1.1.4에서 단계를 반복합니다. 참고 : 4 ° C에서 다음 절차를 수행합니다. </li><li> 1 ml의 얼음처럼 차가운 PBS의 50 mM NH 4 CL을 포함하는 - ~ 0.5로 고정 오후 시트를 세 번 포함 된 커버를 씻으십시오. ~ 0.5, 시트 담금질 - 7 분 동안 PBS 1 ml의 0.1 % 수소화 붕소 나트륨과 함께 세탁 ~ 0.5 - 1ml를 PBS (50 mM의 NH 4 CL없이). </li><li> 차단 용액 1 mL를 45 분 동안 (5 % (v / v)의 정상 염소 혈청, 5 % (v / v)의 소 혈청 알부민의 50 mM NH 4 CL 함유 PBS 용액) - ~ 0.5 샘플 블록. 1 시간 동안 차단 솔루션에 : (300 희석 1) 1 ml의 차 PI 2 항체 (4,5) P - 그럼 ~ 0.5로 품어. 1 ㎖의 PBS의 50 mM NH4Cl 등을 포함 - ~ 0.5로 세 번 (10 분마다) 세척 하였다. </li><li> 1 ml의 보조 F (AB &#39;) 2 - 염소 - 항 - 마우스 - ~ 0.5로 샘플을 품어1 시간 동안 블로킹 완충액에서 : 형광체 (300 1)와 접합 된 항체. 1 ml의 PBS - ~ 0.5로 3 회 씻는다. </li><li> 포스트 픽스 샘플을 4 % PFA + 0.2 % GA 15 분 후 PBS (7 분마다)로 샘플을 세 번 세척 하였다. 영상에 대한 제 3 항에 진행하거나 나중에 사용하기 위해 4 ° C에서 ~ 0.5 ~ 1 ml의 PBS를에 저장합니다. 참고 : 4 ° C에서 샘플을 준비합니다. 는 PM에 phosphoinositides의 생리 학적 분포를 유지하기 위해 4 % PFA + 0.2 % GA 정착액을 사용합니다. 혼자 4 % PFA와 RT 준비 또는 고정 상당한 유물 (그림 4)의 원인이 될 수 있습니다. </li></ol></li></ol> mEOS3.1-PH PLC의 δ1와 라이브 셀 이미징 2. 세포 배양 준비 <ol><li> 앞서 설명한 바와 같이 23 mEOS3.1 PH-PLC의 δ1을 코딩하는 DNA 플라스미드를 준비한다. </li><li> # 1.5 18mm에 문화 INS-1 세포 라운드가 된 커버 30 μg의 / ㎖ 피브로넥틴가 도달 할 때까지 50 % -70 %의 confl 사전 코팅표준 INS-1 세포 배양 프로토콜 (38, 39)을 다음 uency. </li><li> 다음 날, DNA 플라스미드 제조의 프로토콜 다음 리포좀 형질 전환 시약을 사용하여 δ1 mEOS3.1-PH PLC와 INS-1 세포를 형질. 촬영 전에 48 시간 동안 품어. </li></ol> 멤브레인 시트 및 라이브 세포의 3 PALM 이미지 획득 <ol><li> 막 시트 PALM 화상 취득 주 : 여기에서, 전반사 형광 (TIRF) 현미경 SMLM 기반 시스템 (100X 오일, APO, NA = 1.49이 WD 0.12 mm) (23)가 모든 화상 획득에 사용된다. <ol><li> 촬영하기 전에, 10 ml의 PBS + 50 밀리미터의 MgCl 2 형광 구슬 솔루션 1 μl를 희석. 10 분 동안 (단계 1.1.8 / 1.2.6)에서 이미징 챔버 포함하는 세포 샘플로 솔루션을 희석 200 μl를 추가합니다. 그 후, PBS로 3 회 세척 하였다. </li><li> 손바닥 이미징 시스템을 시작합니다. 관련 이미징 소프트웨어,은 &quot;IRFP 채널 선택# 34; 버튼 (642 nm의 레이저 여기, 75분의 700 nm의 발광). IRFP 채널 PH 프로브를 발현시키는 세포막을 찾는다. 주 : 멤브레인 시트 근처 형광 구슬이 있어야합니다. 이것은 나중에 드리프트 보정이 필요합니다. </li><li> 미래 화상 재구성을위한 기준으로서 IRFP 채널에서 세포막의 종래 TIRF 화상을 수집하기 위해 &quot;촬영&quot;버튼을 사용한다. 이미징 설정 TIRF 각도에 2140를 입력하여 일반 TIRF 각도 (즉, 중요한 각도에 도달 한 후, 또 다른 150도 회전)를 설정합니다. 별도로 명시하지 않는 한 모든 단계에 대한 설정이 각도를 사용합니다. 주 : 여기에서 설명한 TIRF 시스템에서, 3500은 2200의 TIRF 임계각이며, 2140 TIRF 임계각 후 1.5 정도 이상 정상 TIRF 각도 인, 업 직각이다. 3.2.3 아래 언급 된 좁은 TIRF 각도는 TIRF 중요한 각도에 도달 한 후 다른 2 정도 인 2120입니다. </li><li> 일을 클릭하여 PAmCherry1 채널로 전환전자 RFP 채널 버튼 (561 nm의 여기, 50분의 600 nm의 방출 필터). 배경 막 형광 표백제에 10 ~ 20 초 동안 561 nm의 레이저의 전체 전력 조명을 오른쪽으로 &quot;AOTF&quot;패드에 모든 방법을 스크롤 막대를 조정합니다. </li><li> &#39;형식&#39;탭과 &#39;ND 시퀀스 획득 &quot;탭의 빠른 획득 프로토콜에 최적의 카메라 설정 (2 × 2 비닝 (binning))를 설정 (일반적으로 20 Hz에서 10,000-40,000 이미지). </li><li> &quot;지금 실행&quot;버튼을 클릭하여 - 낮은 수준 (1 %, 0.1 %)에서 동시에 405 nm의 레이저 활성화에 PAmCherry1 이미지 (전체 전력에서 561 nm의 레이저, 50 밀리 초 / 프레임)의 인수를 시작합니다. 각 프레임이 공간적으로 고립 된 개인 점을 쉽게 식별 할 수 있도록 405 nm의 레이저의 강도를 조절합니다. 참고 : 기동 PAmCherry1 분자의 수는 획득하는 동안 점차적으로 감소한다. 405 nm의 레이저 강도가 서서히 각 개별 분자 신호의 최적의 농도를 유지하기 위해 증가되어야틀. </li><li> 더 PAmCherry1 단일 분자 신호가 활성화되지 않을 때까지 이미지를 획득 계속합니다. </li></ol></li><li> 살아있는 세포에서 PALM 영상 <ol><li> 단계 3.1.1에 기재된 촬상 전에 10 분 동안 촬상 챔버 내로 형광 비드 희석. 그런 다음 관련 이미징 소프트웨어를 열어 PALM 영상을 시작합니다. 참고 : 라이브 세포 이미징을위한 자기 조정기 영상 실을 사용합니다. 135 mM의 염화나트륨, 5.6 mM의 KCl을 2.6 mM의 CaCl2를 1.2 밀리미터의 MgCl 2, 3 mM의 글루코오스, 20 MM : 외 완충액 (세포 외 용액으로 일정한 관류하에 온도 컨트롤러 35 ° C에서의 촬상 영역의 중심을 유지 HEPES, pH는 7.3). </li><li> GFP의 채널 버튼 (50분의 525 nm의 발광)을 선택합니다. 488 nm의 레이저 여기에서 mEOS3에서 녹색 형광을 기반으로 형광 프로브를 표현하는 세포막을 확인합니다. 근처의이 같은 영상 중에 포함 된 형광 구슬이 오프라인 건조기가 나중에 필요하다는 것을 확인하십시오피트 보정. </li><li> 참조 화상으로서 mEOS3 (녹색) 채널에서의 세포막의 TIRF 화상을 수집하기 위해 &quot;캡처&quot;버튼을 클릭한다. 라이브 세포 이미징을위한 설정 TIRF 각도에 2120을 입력하여 (임계각에 도달 한 후, 다른 2도 회전) 얕은 소멸 파 여기 조명을 사용합니다. 참고 :이 세포막에 세포질 인접한에서 언 바운드 mEos3-PH에서 형광을 최소화 할 수 있습니다. </li><li> 은 &quot;RFP 채널&quot;버튼 (561 nm의 여기, 50분의 600 nm의 방출)로 전환합니다. (3.1.4 참조) &quot;AOTF 패드&quot;의 스크롤 10 ~ 20 초 동안 멤브레인 시트의 배경 형광 표백제 전체 전력 561 nm의 레이저를 사용합니다. </li><li> 동시에 405 nm의 레이저 활성화에 (이하 &quot;카메라&quot;설정 탭에서 10 밀리 초 / 프레임 설정 561 nm의 최대 전력) 빨강 채널에서 &quot;지금 실행&quot;버튼을 클릭하여 이미지 수집을 시작합니다. 공간적으로 분리 된 지점을 활성화하기 위해 405 nm의 레이저 강도를 조정각각의 프레임이다. 주 : 분자 수는 서서히 감소 mEOS3.1 PH-PLC 미 변환 δ1 취득 진행됨. 점차적으로 단일 분자 신호를 최적화하기 위해 405 nm의 레이저 파워를 증가시킨다. 촬상 수집 길이는 실험 목적에 따라 달라진다. 정상적인 조건에서 5 분 동안 연속적으로 이미지를 획득. 장기간 취득이 필요한 경우, 그 대신 하나의 큰 이미지 스택의 여러 이미지 스택을 모은다. 각 이미지 스택의 파일 크기는 4GB를 초과하지 않아야하거나 나중에 소프트웨어 분석에 영향을 미칠 것이다. </li></ol></li></ol> 4. SMLM 이미지 처리 및 재건 <ol><li> 화상 분석 스테이션, 화상 파일 (화상이 .tif 스택)를 옮긴다. 다음, 다음 &quot;새 파일&quot;을 &quot;열기&quot;이전 37 설명 된대로 매트랩 이미지 재건 프로그램 (사용자 정의 작성)를 실행하고 메인 메뉴에서 &quot;파일&quot;탭을 클릭하여 이미지 스택을로드합니다. </li><li> 확인하고 삶을각 프레임에서 개별 분자 이벤트를 발자. 은 &quot;웨이브 렛&quot;의 임계 수 (1-10)과 강도 임계치를 필터링 설정한다. 시각적 재구성 전에 점 검출을위한 최적의 파라미터 설정을 확인한다. 그런 다음 &quot;PALM&quot;탭으로 이동하여 이미지 재구성을 시작합니다 &quot;한 단계 프로세스&quot;를 클릭합니다. 참고 : 포인트 검출을위한 강도 임계 값이 임의이며, 개인적인 경험에 따라 달라집니다. 여러 임상 시험은 둘 다 너무 많은 규정되지 않은 (흐리게) 포인트를 집어하지 않고 너무 많은 자격 (밝은) 점을 필터링하는 것이 최적의 검출 임계 값을 생성해야 할 수 있습니다. 데이터 분석을 최적화하는 다른 매개 변수를 조정합니다. 여기, 동네 거리 (결합되는 거리에 인접 프레임의 형광 점) 65 나노 (1/2 픽셀 폭)로 설정하고 단일 분자로 장착되어 있습니다. 갭 프레임 (결합과 단일 분자 이벤트로 장착 된이 프레임과 주변 거리 내에서 발생한 개별 분자 이벤트)입니다PAmCherry1 영상 (40) 26 프레임 (1.3 초)로 설정합니다. SMLM 40를 계산 오버 방지하기 위해 단일 분자 프로브 및 수집 속도의 특성에 따라 이러한 매개 변수를 조정합니다. 복원 자료 중 형광 구슬 드리프트 보정을 적용합니다. <ol><li> IRFP PAmCherry1-PH-PLC를 δ1로 표시된 고정 된 멤브레인 시트 이미징 단일 수퍼 - 해상도 이미지 (37)에 동일한 막 시트로부터 화상 전체 스택을 재구성. </li><li> mEOS3.1-PH PLC를 δ1로 표시된 생균 샘플 1,000 프레임 여러 작은 스택으로 화상 전체 스택을 분리 1000 연속 프레임 스택의 시간 해상도를 가지고 하나의 초 해상도 영상으로 복원되도록 10 초. 결국 최종 시계열 스택 (23)에 모두 시계열 화상을 결합한다. 참고 : 라이브 세포 PALM 영상에서 활성화 프로브 적은 수의 이동 또는 해리 할 수있다표백 전에 오후에 PI (4,5) P 2에서. 프로브의 오버 샘플링을 설명하기 위해 이미지 분석에서 단일 방사 이벤트로 (대신에 65 nm 인) 130 nm의 인접 프레임 내의 개별 분자 신호를 결합한다. </li></ol></li><li> 재구성 된 화상을 취득 한 후, 한 쌍의 상관 (41)의 분자 밀도 마이크로 도메인 밀도 / 크기, 클러스터 분석 정량화 매트랩 맞춤 작성 프로그램에 상기 이미지 분석을 수행한다. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

멤브레인 시트 생산 및 샘플 고정 : 문제 해결을 위해이 프로세스는 특별한주의가 필요합니다. 프로토콜에 기재된 바와 같이, 단계 1.1.6의 커버 슬립의 배양 시간은 막 시트 생산을 위해 중요하다. 우리의 실험 조건에서 최적의 배양 시간은 7-10 분 (그림 2)입니다. 10 분 배양 이상은 작거나 PDL 코팅 된 커버에 아무런 멤브레인 시트로 이어질 것 대신 PDL의 커버 슬립 짧은 배양에 막 시트의 손상 세포를 생성합니다. 프로토콜에서 설명한 바와 같이, 고정시 고정 제와 온도는 PM의 PI (4,5) P (2) 분포를 유지하기 위해 중요합니다. RT에서 고정 또는 단독 4 % -PFA의 사용은 PM의 정상 지질 분포를 왜곡 할 수있다. 지질 연구를 막 PALM 현미경을 적용하여, 우리는 (4,5) P (2), m을 매개 키 포스 PI의 나노 미터 크기의 분포를 관찰 할 수있다근본적인 세포 활동. INS-1 세포에서의 제한 농도 구배와 PI (4,5) P (2)이 공간적 분포는 지질 단백질 상호 작용 및 PI 이러한 세포에서 (4,5) P (2) 지역 신호 이벤트를 다시 생각하기위한 프레임 워크를 제공합니다. 더욱이, 본 연구에서 개발 된 방법은 또한 생물학적 과정에서 phosphoinositides을 연구하는 새로운 도구를 제공함으로써, 적절한 프로브 다른 막 인지질 연구에 적용될 수있다. 세제 처리 및 세포질에서 잠재적 인 신호 오염이 작품에 막 시트의 사용은 인지질 형태 학적 연구에서 두 가지 주요 문제를 무시합니다. 세제는 종종 클러스터링 및 오후 인지질 신호의 상당한 손실을 야기한다. 세포질 신호의 오염은 PI (3,4,5) P (3) 및 PI (3,4) P (2)와 PM (23)에 둘러 풍부한 phosphoinositides의 경우에 특히 문제가된다. 멤브레인 시트 샘플은 새로운 Circu 할 수 있습니다그러한 상당히 피질 액틴 그물 세공 및 클라 코팅 피트 42,43 아니라 세포막과 연결된 구조를 방해하지 않고 이러한 문제를 mvent. 된 PM의 PI (4,5) P (2)의 상대적으로 균일 한 분포가 섬유 아세포 성 멤브레인 (44)에 GST-PH PLC δ1의 프로브를 사용하여 다른 빠른 냉동 EM 연구와 잘 일치한다. 이 부적절한 시료 처리 조건이 잘못된 결과를 생성 할 수 있다는 것을 주목하는 것이 중요하다. 첫째, 저온 (4 ℃)에서 고정 단계를 수행하고, 막 시트의 생산을위한 정착액 GA를 사용하는 것이 중요하다. 도 3에 도시 된 바와 같이, GA없는 따뜻한 온도 PFA 고정 셀의 PM phosphoinositides를 해결하기에 충분하지 않다. 이 그대로 PI (4,5) P (2) 분포를 왜곡하고 생리 학적 조건에서 살아있는 세포에서 관찰되지 않는 날카로운 클러스터를 생성 할 수 있습니다. 둘째, PAmCherry1 사용로서SMLM 프로브는, 오히려 다른 프로브보다 양적 PALM 이미징을위한 중요한 것입니다. PAmCherry1 응용 프로그램의 장점은 밝기, 높은 광 활성화 효율성과 무엇보다도, 매우 제한된 사진 - 깜박이는 등의 잘 특성화 단일 분자 광 물리적 특성 35,40,45에서 온다. 이러한 속성은 사진 깜박 잠재적 클러스터 아티팩트를 제거하고 정량적으로 막 PI (4,5) P (2)의 분자 밀도를 분석 할 수있게. 이러한 접근 방식은 또한 한계가있다. 셀 촬상 전에 중단되기 때문에 먼저, 본 연구에 사용 된 멤브레인 시트 법 완전히 PI (4,5) P (2)의 생체 분포를 흉내낼 수있다. 그러나, 우리의 라이브 PALM 영상은 멤브레인 시트 샘플 관찰 결과를 지원하는 PI (4,5) P (2)의 유사 상대적으로 균일 한 분포를 보여줍니다. 우리는 우리의 이전 작업 (23)에 설명 된대로 둘째, SMLM 이미징 전문 지식과 추가로 필요합니다의 장력은 사용 된 프로브, 샘플 준비 및 고정, 이미지 샘플링 및 재구성 등 다양한 공정에서 발생할 수있는 이미지 아티팩트를 방지 할 수 있습니다. 산도 도메인 기반 프로브 및 항체 널리 포스 공부 (46, 47)에 사용되어 왔지만 마지막으로, 상기 멤브레인의 모든 PI (4,5) P (2)는이 방법에 의해 검출 될 수있는 가능성이 남아있다. 예를 들어, 다른 내인성 단백질에 의해 구속 PI (4,5) P (2) PH 프로브 또는 항체에 액세스 할 수 없습니다 수 있으며,이 때문에 자신을 프로브의 공간 방해에 PI (4,5) P (2)의 과소 평가의 원인이 될 수 있습니다. 라벨 PI (4,5) P (2) 다른 방법은 원래의 꼬리에 수정과 정상 플 루어 PI (4,5) P 2 (48), 미리 라벨링 PI (4,5) P (2) 아날로그를 사용하는 것 PI (4,5) P (2). 그 이노시톨 링 endogenou와 동일하기 때문에, 그것은 빠르게 생균 대사에 의하여 다른 포스 아형으로 빠르게 변환 될 수있다님의 PI (4,5) P (2). 이것은 살아있는 세포에서이 미리 라벨링 PI (4,5) P (2) 아날로그 충실 PI (4,5) P (2)보다는 대사 제품을 대표 할 수 있는지 우려를 제기한다. 따라서, 일부 제한에도 불구하고, PH 도메인 기반 프로브 널리 세포의 PM에 PI (4,5) P (2) 분포와 역학을 모니터하기 위해 사용 된 가장 프로브 중 계속된다. 이 방법론의 미래 애플리케이션은 PI (3,4,5) P (3) 및 PI (3,4) P (2)와 같은 다른 포스 연구로 확장 될 수있다. 요약하면, 여기에 사용되는 새로운 SMLM 접근 방식은 세포에서 포스를 연구 할 수있는 새로운 방법을 엽니 다. 예를 들어 PI (4,5) P (2)를 사용하여, 우리는 고유 세포막 분자의 형태 및 정량 연구 PALM 영상의 특성뿐만 아니라, 그 단점을 보여준다. 이 방법은 관심의 다른 분자에 적용 할 수 있으며, 세포 생물학의 다양한 응용 프로그램을 제공합니다.

Phosphoinositides 총 막 지질의 일부에 기여하지만, 셀룰러 다양한 공정에서 중요한 역할을한다. 그들은 제 3의 이노시톨 반지의 가역적 인산화 또는 탈 인산화에서 파생 된 일곱 멤버, 4 번째와 5 번째 위치 (1)을 포함한다. 포스파티딜 이노시톨 4 포스페이트 (PI4P) 및 포스파티딜 이노시톨 4,5- 비스 포스페이트 (PI (4,5) P 2)는 세포 원형질막 (PM)의 2,3- 행렬식 지질 비교적 독립적으로 기능 두 가지 phosphoinositides이다. 포스파티딜 이노시톨 (3,4,5) -trisphosphate (PIP 3) 훨씬 덜 풍부한 PI4P 및 PI (4,5) P 2 이상이지만, 암 (4)과 당뇨병 (5) 등 다양한 세포 과정에 고유 한 기능을 가지고있다. 이러한 지질는 이펙터 및 다른 많은 단백질과 복잡한 분자 상호 작용을 가지고있다. 따라서, 이러한 포의 공간적 구성을 이해하기 위해 중요나노 미터 스케일에서 오후에 sphoinositides. 장착 증거는 제한 PM 분야에서 단백질 복합체 또는 분자 클러스터가 핫스팟 (6) 신호 역할을 할 수 있음을 보여 주었다. 예를 들어, 신택의 1A, 막 융합 7-9를 조절하는 중요한 단백질은 오후에 클러스터 조직을 표시합니다. 신택 (1a)의 클러스터 조직의 합의 뷰에서 고유의 오후에 phosphoinositides의 공간 분포는 논쟁의 여지가있다. PI (4,5) P 2 분포 패턴을 사용하는 클러스터 14-18, 세포 유형에 따라 실험 방법을 조밀하기 위해, 균일 10-12, 큰 패치 13, 14 이르기까지 다양합니다. 높은 해상도에서 PI (4,5) P (2)의 공간 조직은 일치하지 않습니다. 자극 방출-고갈을 사용하는 연구는 (STED) 현미경 (19)는 조밀 한 PI (4,5) P (2) 나노 클러스터의 큰 숫자를 공개했다 (~ 직경 73 nm의) PC-12 세포 (20)의 PM 시트에 </s&gt;입니다. 이러한 결과는 신속한 동결 전자 현미경 (EM) 21, 22, 화학적 고정화보다 훨씬 생균의 손상 PM 구조를 유지 접근법을 사용하는 연구와 다르다. 후자는 PI (4,5) P (2)의 별개의 풀을 보여 주었다; 상대적으로 집중 PI (4,5) 카베 올래 및 코팅 된 구덩이에서 P 2뿐만 아니라 평면 PM 영역에 균일 한 분포. 또한, 멤브레인 시트에 나노 PI (4,5) P (2) 조직은 라이브와 고정 된 세포에서 다를 수 있습니다. 우리의 최근의 연구는 단일 분자 현지화 현미경 (SMLM) (23)를 사용하여 두 고정 사는 INS-1 세포에서이 문제를 조사 하였다. SMLM 개별 형광이 높은 정밀도로 현지화 될 수 있도록 확률 적 주어진 시간에 형광의 작은 하위 집합에 전환을 기반으로합니다. 많은 초해 촬상 방법은 종래의 광학 현미경의 회절 한계를 능가하는 유사한 원리를 사용하여 개발되었다 이러한님의 photoactivation 현지화 현미경 (PALM) (24), 형광 photoactivation 현지화 현미경 (FPALM) (25), 확률 적 광 재건 현미경 (STORM) 26, 27 및 직접 STORM (dSTORM) 28. 사진 전환 또는 광활성 형광 물질 (염료 또는 형광 단백질)로, SMLM 기술은 살아있는 세포 (31, 32)에 비디오 속도 나노 미터 해상도 24,29,30에서 이미지 생물학적 구조에 과학자를 할 수 있습니다. 예를 들어 PI (4,5) P 2를 사용하여, 우리는 오후에 phosphoinositides의 나노 크기의 분포를 연구하기 SMLM 방식을 도입했다. 특히 PI에 결합 PLCδ1 (포스 C의 δ1)의 PH 도메인 (4,5) P 2는 오후에 영상 PI (4,5) P (2) 하위 세포 분포 및 역학 33, 34에 대한 잘 확립 된 프로브입니다 . 우리는 유 전적으로 두 형광 단백질, PAmCherry1 35 IRFP (36)이 도메인을 태그 한 </SUP&gt; 이중 색상 융합 단백질 (IRFP-PAmCherry1-PH PLCδ1)를 생성하기 위하여 (도 1A-B는). PAmCherry1 손바닥위한 PH 도메인의 광활성 프로브로서 기능하고 IRFP는 PALM 취득 전에 형질 감염된 세포를 식별하는 일반적인 지표 역할 . 우리는 고정 된 멤브레인 시트에 SMLM 영상이 듀얼 컬러 형광 프로브를 적용합니다. 라이브 PALM 촬상을 위해, 우리는 더 나은 광자 효율 및 휘도 (도 1C-D)에 대한 mEOS3.1-PH의 PLCδ1 프로브를 생성 PH의 PLCδ1 도메인 mEOS3 37 대신 PAmCherry1 태그. 인슐린 분비 INS-1 세포 (38)의 PM 이러한 새로운 프로브 SMLM 영상은 PI (4,5)에 오후 지역의 대부분에서 P 2뿐만 아니라 진한 PI (4,5) P (2)의 균일 한 라벨을 발견했다 드문 드문 평면 오후 일부 filopodia 같은 구조 (23)에 혼합되어 마이크로 도메인. 개구PI (4,5) P (2)의 noScale로 분포는 살아있는 세포에서 기능하는 방법을 다시 생각하기위한 구조적 기반을 제공합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="791">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microscope</td>
			<td style="width:199px;">Nikon</td>
			<td style="width:184px;">Ti-U</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sCMOS camera</td>
			<td style="width:199px;">Andor</td>
			<td style="width:184px;">Neo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spinning disk</td>
			<td style="width:199px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:184px;">CSU X-1, 10,000 rpm&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">&#160;High Power Monolithic Laser Combiner SP with 405, 488, 561 and 642 nm lasers.</td>
			<td style="width:199px;">Agilent</td>
			<td style="width:184px;">MLC400</td>
			<td style="width:193px;">laser original powers &#38; powers at the end of optical fiber) 
			405nm: 15 mW &#38; 13 mW; 
			488nm: 45 mW &#38; 42 mW; 
			561nm: 45 mW &#38; 40 mW; 
			640nm: 35 mW &#38; 16 mW.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100X Objective</td>
			<td style="width:199px;">Nikon</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td>APO 100X Oil, NA 1.49, WD 0.12mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nikon acquisition and analysis software(NIS Element)</td>
			<td style="width:199px;">Nikon</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Matlab</td>
			<td style="width:199px;">MathWorks</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Coverslip</td>
			<td style="width:199px;">Warner</td>
			<td style="width:184px;">64-0714</td>
			<td>Round 18mm coverslip, #1.5&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:199px;">Millipore</td>
			<td style="width:184px;">FC010-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Lipofectamin 3000(transfection reagent)</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:184px;">L3000-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:199px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:184px;">#16120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PI(4,5)P2 1st antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-53412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">secondary antibody&#160; F(ab&#8217;)2-goat-anti-mouse Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen</td>
			<td>A-21237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tetraspeck beads</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:184px;">T7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">magnetic quick release imaging chamber&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:184px;">Cat#641994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">temperature controller</td>
			<td style="width:199px;">Warner Instruments</td>
			<td>TC-344C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphate buffer saline</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EGTA</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:184px;">3780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">A0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Goat serum</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">bovine serum albumin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaCl2*2H2O</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:184px;">223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MgCl2*6H2O</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraformaldyhyde</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule super-resolution imaging of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the plasma membrane with novel fluorescent probes

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a determinant phosphoinositide of the plasma membrane (PM), and it is required to modulate ion channels, actin dynamics, exocytosis, endocytosis, intracellular signaling, and many other cellular processes. However, the spatial organization of PI(4,5)P2 in the PM is controversial, and its nanoscale distribution is poorly understood due to the technical limitations of research approaches. Here by utilizing single molecule localization microscopy and the Pleckstrin Homology (PH) domain based dual color fluorescent probes, we describe a novel method to visualize the nanoscale distribution of PI(4,5)P2 in the PM in fixed membrane sheets as well as live cells.

우리의 슈퍼 해상도 시스템의 현지화 불확실성 (σ)는 14.73 내지 23이다. TIRF와 PALM 이미지 사이의 직접 비교는 공간 해상도의 상당한 개선을 보여 주었다. 그림 3A-B는 PI (4,5) P (2) 항체 및 IRFP-PAmCherry1-PH PLC 레이블을 대표 PI (4,5) P 2 TIRF의 이미지를 보여줍니다 일반적인 멤브레인 시트와 살아있는 세포에서 δ1. 멤브레인 시트에 기존의 TIRF 현미경과 이미지가 강화 된 녹색 형광 단백질 표지 그대로 살아있는 세포의 것과 매우 유사하다 (EGFP)는 (그림 3C) (EGFP-PH PLCδ1) PH 도메인 태그. 모든 샘플 프로브의 고른 분포를 보였다. 대조적으로, 샘플의 비 최적 정착 날카로운 조밀 PI (4,5) P (2) 클러스터 및 신호 강도의 저하 (도 4)였다. 최적의 고정 조건 하에서 t그는 PI 고정 된 세포에서 (4,5) P (2) (그림 5)의 슈퍼 해상도의 이미지는 제한된 농도 구배와 PM의 상당 부분에서 프로브의 균일 한 분포를 밝혔다. PI (4,5) P 2 프로브와 풍부한 일부 막 패치는 띄엄 띄엄 분산 및 다양한 크기를 가지고 있었다. 라이브 셀 PALM 이미지 (그림 6) 고정 된 세포와 유사한 공간 분포를 표시합니다. 폭 넓은 분야에서의 풍부한의 큰 변화없이 PI (4,5) P 로컬 영역에서 빠른 역학에서 시간의 결과를 통해이 신호의 상세 분석. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig1.jpg" /> 본 연구에 사용 된 형광 프로브 그림 1. 계획. 고정 막 시트 실험에 사용 (AB) IRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 프로브. 종래 TIRF 영상 (A), 640 nm의 중<html> 레이저는 IRFP 자극하는 데 사용됩니다 (예 : 692 nm의, 엠 : 713 ㎚). 이 상태에서 촬영 TIRF 이미지 PALM 영상 (B)에 의해 얻어진 초 해상도 영상 TIRF 대한 참조 화상으로서 역할을한다. 405 나노 레이저에 사용되는 PAmCherry1의 형광을 사진 활성화 및 561 nm의 레이저는 PAmCherry1 자극하는 데 사용됩니다 (예를 : 564 nm의, 엠 : 595 ㎚) PALM 이미징을. (CD) 생균 실험에 사용 mEos3.1-PH의 PLCδ1 프로브. 종래 TIRF 촬상 중에 (C)이, 488 nm의 레이저 mEOS3.1 (:; 519 내지 506 nm의 엠 예)를 자극하기 위해 사용된다. (: 573 nm의, 엠 : 예 584 ㎚) 405 nm의 레이저에 의한 광 변환 후 (D)는 mEos3.1는 빨간색 형태로 변합니다. PALM 인수에 사용하고, 561 nm의 레이저 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54466/54466fig1large.jpg" target="_blank">의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림.</a> S / ftp_upload / 54466 / 54466fig2.jpg &quot;/&gt; INS-1 세포에서 막 시트 준비를위한 그림 2. 계획. (A)는 PDL 코팅 커버 슬립에 아래로 향하게 배양 된 세포와 커버 슬립을 놓고 PDL-에 세포 부착 할 수 있도록 4 ° C에서 7 ~ 10 분 동안 기다립니다 코팅 된 커버 슬립. (B) 핀셋 상단 커버 슬립을 벗겨과 PDL 사전 코팅 커버 슬립에 부착 된 멤브레인 시트를 고정합니다. (C) 이미지 TIRFM과 PALM와 샘플을. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54466/54466fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig3.jpg" /> 그림 3. PI (4,5) P (2) 공간 조직이 기존의 TIRF 현미경으로 막 시트와 그대로 살아있는 세포와 유사하다. (A)막 시트의 전형적인 TIRF 이미지는 4 % PFA 0.2 % GA와 4 ° C로 고정. PI (4,5) P (2)는 PI (4,5) P (2) 특정 항체로 표지 하였다. (B) IRFP PAmCherry1-PH-PLC의 δ1을 발현하는 INS-1 세포로부터의 막 시트. 서로 다른 수준에서 EGFP-PH의 PLCδ1 표현이 그대로 살아있는 세포의 (C) TIRF 이미지입니다. 스케일 바 : (A) : 3 μm의; (B)와 (C). 5 μm의 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54466/54466fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig4.jpg" /> 그림 4. PI 막 시트 2 공간 조직이 일반적인 고정 조건에 민감하다 (4,5) P. (A) 멤브레인 시트는 혼자 4 % PFA 37 ° C로 고정및 (그림 3A에서와 같이) PI (4,5) P (2) 특이 항체로 표지. (B) 멤브레인 시트 혼자 PFA와 RT에 고정 및 PI (4,5) P (2) 특이 항체로 표지. PI의 밀집이 (4,5) P (2) 프로브는도 3a에 도시 된 더에도 형광 화상 달리 TIRF 현미경으로 명확하게 볼 수 있습니다. 스케일 바 : AB :. 3 μm의 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54466/54466fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig5.jpg" /> PI 그림 5. PALM 이미징 (4,5) P 2 프로브는 INS-1 세포 오후 자신의 나노 미터 크기 분포를 알 수있다. (A) IRFP-PAmCherry1-PH를 표현한 INS-1 세포에서 막 시트의 IRFP TIRF 이미지를 PLCPAmCherry1 신호 재구성을 기반으로 같은 지역에 오후의 PALM 이미지를 해당 δ1. (B). 균일 한 PI (4,5) P 주요 PM 지역과 여러 PI (4,5) P 2 마이크로 도메인 2 공간 분포를합니다. (C) (B)의 박스 부분의 확대도. 화살표 띄엄 띄엄 PI (4,5) P 2 프로브 풍부 오후 마이크로 도메인을 배포 나타냅니다. 스케일 바 : A와 B : 3 μm의; C : 500 nm의. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54466/54466fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig6.jpg" /> 라이브 INS-1 세포에서 그림 6. PALM 영상. (A) mEos3.1-PH PLC를 표현하는 라이브 INS-1 세포에서 PI (4,5) P (2)의 TIRF 이미지δ1. 이미지가 빠르게 PALM 수집 (35 °에 C) 전에 녹색 채널에 인수되었다. (B) 10 초 간격으로 연속 라이브 셀 PALM 이미지. 세트는 로컬 PI (4,5) P 2 (B)에 서로 다른 시간에 동일 직선을 따라 위치 1 밀도 (C)의 강도 프로파일을 도시한다. 10 초 내에서 큰 지역의 강도를 변경합니다. (D) PI의 평균 강도의 변화 시간 경과 (4,5) (B)의 넓은 영역 (BOX2, 3 × 3 μm의) 작은 서클 (3, 4, 5, 500 nm의 직경)의 P 2~5 중 PALM 영상의 분 (프레임 / 10 초). 로컬 PI (4,5) P (2) 프로브의 급격한 강도 변동 주 (3 원, 4, 5)를 넓은 면적 박스 (2)의 매우 작은 변화에 비해. 지정된 시간에 (B)에서 BOX2 영역 (E) 확대 PALM 이미지. 화살표 페이지에서 PI (4,5) P (2) 농축 막 패치를 표시hysiological 조건. 스케일 바 : C : 3 μm의; E : 500 nm의. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54466/54466fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

PI (4,5) P (2)는 다양한 세포 기능을 조절하지만, 세포 세포막에서의 나노 조직 잘못 이해된다. 라벨 PI 플렉스 트린 상동 도메인에 융합 된 이중 색상 형광 프로브 (4,5) P (2)에 의해, 우리는 나노 미터 스케일에서 (4,5) P 원형질막 2 공간 분포를 PI를 연구하는 새로운 방법을 기술 .

소설 형광 프로브와 플라즈마 막에서 포스파티딜 이노시톨 -4,5- 비스 포스페이트의 단일 분자 슈퍼 해상도 이미징

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.4K 조회수.  University of Wisconsin-Madison.  PI (4,5) P (2)는 다양한 세포 기능을 조절하지만, 세포 세포막에서의 나노 조직 잘못 이해된다. 라벨 PI 플렉스 트린 상동 도메인에 융합 된 이중 색상 형광 프로브 (4,5) P (2)에 의해, 우리는 나노 미터 스케일에서 (4,5) P 원형질막 2 공간 분포를 PI를 연구하는 새로운 방법을 기술 . 

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High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule level in multiparameter fluorescence detection (MFD) mode is presented here. MFD maximizes the usage of all &#34;dimensions&#34; of fluorescence to reduce photophysical and experimental artifacts and allows for the measurement of interdye distance with an accuracy up to ~1 &#197; in rigid biomolecules. This method was used to identify three conformational states of the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor to explain the activation of the receptor upon ligand binding. When comparing the known crystallographic structures with experimental measurements, they agreed within less than 3 &#197; for more dynamic biomolecules. Gathering a set of distance restraints that covers the entire dimensionality of the biomolecules would make it possible to provide a structural model of dynamic biomolecules.

A protocol for high-precision FRET experiments at the single molecule level is presented here. Additionally, this methodology can be used to identify three conformational states in the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor. Determining precise distances is the first step towards building structural models based on FRET experiments.

생체 분자 구조 결정을위한 단일 분자 수준의 고정밀 FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

연구

생화학

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA processing, and telomere elongation. During these processes, various proteins bind and resolve G4 structures to perform their function. As the function of G4 often depends on the stability of its folded structure, it is important to investigate how G4 binding proteins regulate the stability of G4. This work presents a method to manipulate single G4 molecules using magnetic tweezers, which enables studies of the regulation of G4 binding proteins on a single G4 molecule in real time. In general, this method is suitable for a wide scope of applications in studies for proteins/ligands interactions and regulations on various DNA or RNA secondary structures.

A single-molecule magnetic tweezers platform to manipulate G-quadruplexes is reported, which allows for the study of G4 stability and regulation by various proteins.

마그네틱 핀셋으로 G-quadruplexes의 단일 분자 조작

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage by extracellular oxidants. This process of transporting electrons from intracellular reductants to extracellular oxidants is not well defined. Here we present spectrophotometric assays by C2C12 myotubes to monitor tPMET utilizing the extracellular electron acceptors: water-soluble tetrazolium salt-1 (WST-1) and 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP or DCIP). Through reduction of these electron acceptors, we are able to monitor this process in a real-time analysis. With the addition of enzymes such as ascorbate oxidase (AO) and superoxide dismutase (SOD) to the assays, we can determine which portion of tPMET is due to ascorbate export or superoxide production, respectively. While WST-1 was shown to produce stable results with low background, DPIP was able to be re-oxidized after the addition of AO and SOD, which was demonstrated with spectrophotometric analysis. This method demonstrates a real-time, multi-well, quick spectrophotometric assay with advantages over other methods used to monitor tPMET, such as ferricyanide (FeCN) and ferricytochrome c reduction.

The goal of this protocol is to spectrophotometrically monitor trans-plasma membrane electron transport utilizing extracellular electron acceptors and to analyze enzymatic interactions that may occur with these extracellular electron acceptors.

C2C12 Myotubes에 의해 트랜스-플라즈마 막 전자 전송 측정

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and functions. It gave us the opportunity to explore a multiplicity of biophysical mechanisms, e.g., how bacterial adhesins bind to host surface receptors in more detail. Among other factors, the success of SMFS experiments depends on the functional and native immobilization of the biomolecules of interest on solid surfaces and AFM tips. Here, we describe a straightforward protocol for the covalent coupling of proteins to silicon surfaces using silane-PEG-carboxyls and the well-established N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) chemistry in order to explore the interaction of pilus-1 adhesin RrgA from the Gram-positive bacterium Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) with the extracellular matrix protein fibronectin (Fn). Our results show that the surface functionalization leads to a homogenous distribution of Fn on the glass surface and to an appropriate concentration of RrgA on the AFM cantilever tip, apparent by the target value of up to 20% of interaction events during SMFS measurements and revealed that RrgA binds to Fn with a mean force of 52 pN. The protocol can be adjusted to couple via site specific free thiol groups. This results in a predefined protein or molecule orientation and is suitable for other biophysical applications besides the SMFS.

This protocol describes the covalent immobilization of proteins with a heterobifunctional silane coupling agent to silicon-oxide surfaces designed for the atomic force microscopy based single molecule force spectroscopy which is exemplified by the interaction of RrgA (pilus-1 tip adhesin of S. pneumoniae) with fibronectin.

단일 분자 힘 분광학에 대 한 단백질의 화학식 동원 정지

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a fluorescent dye and are spotted by a photodetector following their separation. Single molecule fluorescence imaging can provide ultrasensitive protein detection with its ability for visualizing individual fluorescent molecules. However, the application of this powerful imaging method to electrophoresis assays is hampered by the lack of ways to characterize the homogeneity of fluorescent labeling of each protein species across the proteome. Here, we developed a method to evaluate the labeling homogeneity across the proteome based on a single molecule fluorescence imaging assay. In our measurement using a HeLa cell sample, the proportion of proteins labeled with at least one dye, which we termed &#8216;labeling occupancy&#8217; (LO), was determined to range from 50% to 90%, supporting the high potential of the application of single molecule imaging to sensitive and precise proteome analysis.

Here, we present a protocol to assess the labeling homogeneity for each protein species in a complex protein sample at the single molecule level.

단일 분자 수준에서 동질성을 라벨의 프로테옴 와이드 정량화

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary mechanism of amyloid aggregate-induced toxicity in neurodegenerative diseases. However, most reports describing the mechanisms of membrane disruption are based on phospholipid model systems, and studies directly targeting events occurring at the level of biological membranes are rare. Described here is a model for studying the mechanisms of amyloid toxicity at the membrane level. For mitochondrial isolation, density gradient medium is used to obtain preparations with minimal myelin contamination. After mitochondrial membrane integrity confirmation, the interaction of amyloid fibrils arising from &#945;-synuclein, bovine insulin, and hen egg white lysozyme (HEWL) with rat brain mitochondria, as an in vitro biological model, is investigated. The results demonstrate that treatment of brain mitochondria with fibrillar assemblies can cause different degrees of membrane permeabilization and ROS content enhancement. This indicates structure-dependent interactions between amyloid fibrils and mitochondrial membrane. It is suggested that biophysical properties of amyloid fibrils and their specific binding to mitochondrial membranes may provide explanations for some of these observations.

Provided here is a protocol for investigating the interactions between native form, prefibrillar, and mature amyloid fibrils of different peptides and proteins with mitochondria isolated from different tissues and various areas of the brain.

아밀로이드 피브릴스뇌 미토콘드리아의 상호 작용 및 막 관과화

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and others. Many of these functions require motors to operate in ensembles. Despite a wealth of knowledge about the mechanisms of individual cytoskeletal motors, comparatively less is known about the mechanisms and emergent behaviors of motor ensembles, examples of which include changes to ensemble processivity and velocity with changing motor number, location, and configuration. Structural DNA nanotechnology, and the specific technique of DNA origami, enables the molecular construction of well-defined architectures of motor ensembles. The shape of cargo structures as well as the type, number and placement of motors on the structure can all be controlled. Here, we provide detailed protocols for producing these ensembles and observing them using total internal reflection fluorescence microscopy. Although these techniques have been specifically applied for cytoskeletal motors, the methods are generalizable to other proteins that assemble in complexes to accomplish their tasks. Overall, the DNA origami method for creating well-defined ensembles of motor proteins provides a powerful tool for dissecting the mechanisms that lead to emergent motile behavior.

The goal of this protocol is to form ensembles of molecular motors on DNA origami nanostructures and observe the ensemble motility using total internal reflection fluorescence microscopy.

단일 분자 관찰을 위한 DNA 종이 접기 나노 구조에 다인 및 키네신 모터 앙상블 생산

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve intracellular structures and the dynamics of biomolecules with ~20 nm precision. A prerequisite for SMLM are fluorophores that transition from a dark to a fluorescent state in order to avoid spatio-temporal overlap of their point spread functions in each of the thousands of data acquisition frames. BODIPYs are well-established dyes with numerous conjugates used in conventional microscopy. The transient formation of red-shifted BODIPY ground-state dimers (DII) results in bright single molecule emission enabling single molecule localization microscopy (SMLM). Here we present a simple but versatile protocol for SMLM with conventional BODIPY conjugates in living yeast and mammalian cells. This procedure can be used to acquire super-resolution images and to track single BODIPY-DII states to extract spatio-temporal information of BODIPY conjugates. We apply this procedure to resolve lipid droplets (LDs), fatty acids, and lysosomes in living yeast and mammalian cells at the nanoscopic length scale. Furthermore, we demonstrate the multi-color imaging capability with BODIPY dyes when used in conjunction with other fluorescent&#160;probes. Our representative results show the differential spatial distribution and mobility of BODIPY-fatty acids and neutral lipids in yeast under fed and fasted conditions. This optimized protocol for SMLM can be used with hundreds of commercially available BODIPY conjugates and is a useful resource to study biological processes at the nanoscale far beyond the applications of this work.&#160;

Conventional BODIPY conjugates can be used for live-cell single-molecule localization microscopy (SMLM) through exploitation of their transiently forming, red-shifted ground state dimers. We present an optimized SMLM protocol to track and resolve subcellular neutral lipids and fatty acids in living mammalian and yeast cells at the nanoscopic length scale.

라이브 셀 슈퍼 분해능 현미경 및 단일 분자 추적을 위한 기존의 BODIPY 접합체

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed extensive studies of cap-dependent translation and its regulation, high resolution kinetic characterization of this translation pathway is still lacking. Recently, we developed an in vitro assay to measure cap-dependent translation kinetics with single-molecule resolution. The assay is based on fluorescently labeled antibody binding to nascent epitope-tagged polypeptide. By imaging the binding and dissociation of antibodies to and from nascent peptide&#8211;ribosome&#8211;mRNA complexes, the translation progression on individual mRNAs can be tracked. Here, we present a protocol for establishing this assay, including mRNA and PEGylated slide preparations, real-time imaging of translation, and analysis of single molecule trajectories. This assay enables tracking of individual cap-dependent translation events and resolves key translation kinetics, such as initiation and elongation rates. The assay can be widely applied to distinct translation systems and should broadly benefit in vitro studies of cap-dependent translation kinetics and translational control mechanisms.

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Tracking individual translation events allows for high-resolution kinetic studies of cap-dependent translation mechanisms. Here we demonstrate an in vitro single-molecule assay based on imaging interactions between fluorescently labeled antibodies and epitope-tagged nascent peptides. This method enables single-molecule characterization of initiation and peptide elongation kinetics during active in vitro cap-dependent translation.

캡 의존형 번역 역학 분석을 위한 생체외 단일 분자 이미징 분석

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 (FET) family of fusion oncoproteins, is one of the most frequently involved fusion genes in Ewing sarcoma. These FET family fusion proteins typically harbor a low-complexity domain (LCD) of FET protein at their N-terminus and a DNA-binding domain (DBD) at their C-terminus. EWS-FLI1 has been confirmed to form biomolecular condensates at its target binding loci due to LCD-LCD and LCD-DBD interactions, and these condensates can recruit RNA polymerase II to enhance gene transcription. However, how these condensates are assembled at their binding sites remains unclear. Recently, a single-molecule biophysics method-DNA Curtains-was applied to visualize these assembling processes of EWS-FLI1 condensates. Here, the detailed experimental protocol and data analysis approaches are discussed for the application of DNA Curtains in studying the biomolecular condensates assembling on target DNA.

Here, we describe the use of the single-molecule imaging method, DNA Curtains, to study the biophysical mechanism of EWS-FLI1 condensates assembling on DNA.

DNA에 조립되는 EWS-FLI1 응축수의 단일 분자 이미징

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...