We would like to thank Dr Hamish Campbell and Prof Antony Braithwaite for their help in developing the transduced MCF-7-LeGO cell lines. We would like to acknowledge our funding support by the Bloomfield Group Foundation through the Hunter Medical Research Institute. B.C.M is supported by an APA scholarship through the University of Newcastle and the MM Sawyer Scholarship through the Hunter Medical Research Institute.

대량 살상 무기 확산 시험 법 1. 준비 세포 주 : 각각의 방법은 분석 될 수 있도록 동일한 포맷에 동일하게 종자의 두 세포주를 준비한다. <ol><li> 사용 T에 MCF-7 레고 및 MCF-7 Δ40p53 75 ㎠로 조직 배양 플라스크 75-80% 합류 7 세포 성장 페놀 레드없는 10 % 소 태아 혈청으로 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM) (FBS) 200 mM의 L- 글루타민, 2 μg의 / ㎖ 인슐린, 5 % CO 2, 37 ℃에서 1 μg의 / ml의 퓨로 마이신. 멸균 바이오 안전성 캐비닛 클래스 II의 셀을 처리합니다. 참고 : 합류로 세포를 성장하는 데 걸리는 시간은 시드 희석에 따라 변한다. 확산 분석을위한 세포를 도금에 대비, 1에서 세포를 시드 : 보충 DMEM 3 희석 및 75~80%의 자랄 때까지 3 일 동안 정상적인 성장 조건에서 유지한다. </li><li> 에 미디어를 붓고, 플라스크에서 세포를 제거하려면폐기물 용기. 즉시 예열 배 트립신 2 ㎖의 세포 층을 세척한다. 기음 트립신. 5 % CO 2, 37 ℃에서 5 분 동안 항온 세포층과 장소에 미리 가온 된 트립신의 또이 용액을 추가한다. <ol><li> 세포가 분리되면, 신선한 DMEM을 보충 따뜻해진 10 ml의 세포를 씻는다. RT에서 5 분 동안 491 XG에 멸균 15 ml의 원심 분리 튜브에 세포 현탁액을 전송. 조심스럽게 기음과 뜨는 폐기하십시오. </li></ol></li><li> 신선한 보충 된 DMEM 5 ml의 세포 펠렛을 재현 탁. 96- 웰 플레이트에서 세포를 배정하는 정확한 농도를 결정하기 위해 셀 카운트를 수행한다. <ol><li> 900 ㎕의 1X 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS)에 세포 현탁액 100 ㎕를 희석. 자동 세포 계수기에 새로운 60 μm의 센서를 배치합니다. 플런저를 누른 상태에서 희석 세포 현탁액에 센서를 잠수함. 천천히 셀 카운터에 플런저를 놓습니다. 셀 COU에서 센서를 제거nter 완료 할 때. 주 : 세포 수는 세포 / ml의 세포 카운터에 표시된다. </li></ol></li><li> 20 % 컨 플루 ~에서 96 웰 플레이트 (DMEM)에서 100 μL의 최종 부피에서 종자 세포 3~5일 (표 1 참조)를 통해 증식 세포 증식 측정을위한 공간을 허용한다. 세중의 모든 세포 라인을 시드. 주 :이 실험을 위해, 세 가지 세포 밀도는 최적의 세포 밀도를 결정하기 위해 평가 하였다. 필요한 세포 수는 표 1에 요약되어있다. 종자 세포를 낮은 밀도보다 장기 성장의 측정이 필요한 경우. <ol><li> 혈구 및 발광 기반 분석의 경우 (즉, 분석 당 4 판) 시점 당 한 판을 준비합니다. 셀 메이져 분석의 경우, 실험 지속 기간 동안 하나의 플레이트를 준비한다. </li></ol></li><li> 24 시간 동안 5 % CO 2와 37 ° C에서 세포를 유지한다. </li></ol> 2. 결정 세포는 우리를 카운트혈구를 보내고 <ol><li> 세포 배양 인큐베이터에서 37 ° C까지 사전 따뜻한 두 매체와 트립신, 오븐 또는 물 목욕. 폐기물 용기에 세포를 대기음 매체는 2 배 트립신 30 μl를 한 번 세척하고, 트립신을 대기음. </li><li> 배 트립신 30 μl를 다시 세포를 씻으, 37 ° C에서 5 분 동안 품어. 부드럽게 판에서 셀을 제거하기 위해 판의 가장자리를 누릅니다. 보충 된 DMEM 50 μl를 첨가하고 세포를 단일 세포 현탁액을 형성 할 때까지 피펫 팅하여 세포를 혼합한다. </li><li> 70 % 에탄올로 표면과 유리 커버를 청소하여 혈구를 준비합니다. </li><li> 계산 챔버 위에 유리 커버 슬립을 놓고 &#39;뉴턴의 굴절 반지&#39;커버 슬립의 가장자리와 혈구 사이에 볼 수있을 때까지 부착합니다. 참고 :이 커버 슬립 올바르게 혈구에 부착 된 것을 나타냅니다. </li><li> 부드럽게 모세관 운동에 의해 카운팅 챔버를 채우고, 커버 슬립에 따라 세포 현탁액 20 μL 피펫.현미경의 10 배 배율에서 혈구를 놓고 그리드 레이아웃 계산 실을 시각화. </li><li> 그리드 레이아웃의 4 바깥 쪽 사각형의 세포를 계산합니다. 정확성을 개선하기 위해 추가로 외부 사각형의 반복 계산이 필요하거나 수까지 70에 도달하면 - 100 세포 14, 15입니다. <ol><li> 다음과 같이 ml의 당 세포 농도를 계산 : 사각형의 X 희석 계수 당 평균 세포 수를 (사용 된 경우) 10 (4) X </li></ol></li><li> 반복 2.1-2.8 매 24 시간 96 시간 동안 후 파종 단계를 반복합니다. </li></ol> 3. 발광 기반 분석법을 이용하여 세포 증식을 결정 참고 :이 엔드 포인트의 측정이다. 시약을 세포에 첨가하면, 플레이트 번만 정량화 할 수있다. <ol><li> 30 분 동안 22 ℃로 물을 욕조에 해동 발광 시약. </li><li> 부드럽게 균질 혼합물을 얻기 위해 병을 반전시킴으로써 시약을 혼합한다. </li><li> 단계에서 (시드 세포의 한 판 평형1.5)을 실온에서 30 분 동안. </li><li> 각 웰에 발광 시약 100 μl를 추가합니다. 2 분 동안 궤도 통에 내용을 섞는다. 플레이트는 실온에서 10 분 동안 배양 할 수 있습니다. </li><li> 다중 모드 플레이트 판독기 소프트웨어를 사용하여 발광 실험 설정. <ol><li> 멀티 모드 플레이트 리더를 켜고 소프트웨어를 엽니 다. &#39;작업 관리자&#39;에서 &#39;실험&#39;을 선택하고 파일 &#39;new&#39;.Select 만드는&#39;측 도구 모음에서, 그리고 아래의 &#39;프로토콜 절차&#39;를 &#39;탭을 선택&#39;. </li><li> 선택 &#39;Grenier의 96 평평한 바닥&#39;플레이트 유형 및 &#39;사용 뚜껑&#39;확인란을 선택합니다. &#39;읽는 방법&#39;상자에서 &#39;읽기&#39;작업을 선택합니다. &#39;발광&#39;검출 방법을 선택합니다. &#39;확인&#39;을 클릭합니다. </li><li> 읽기 단계 상자에서 &#39;전체 판&#39;탭에서 스캔 할 수있는 우물을 선택하고 빈 우물을 행동 우물을 선택합니다. </li><li> (: 구멍, 거울 : 없음 예를 들어, 플러그, 엠) 빈 필터 설정 필터를 설정합니다. 에 게인을 설정135 웰 당 0.5 초 적분 시간과 6.5 mm의 높이를 판독. 발광 읽기 설정을 저장하려면 &#39;확인&#39;을 클릭하십시오. </li></ol></li><li> 발광 읽기를 수행 <ol><li> &#39;기기 제어&#39;탭을 선택하여 플레이트 홀더를 꺼내와 &#39;뚜껑을 보장하는 것은 켜져 판 홀더에 96 웰 플레이트를 out&#39;.Place 판을 클릭합니다. 아래 &#39;기기 제어&#39;탭 &#39;에 판&#39;을 클릭하여 판 홀더를 닫습니다. 발광 읽기를 수행하기 위해 도구 모음에서 &#39;지금 읽기&#39;를 클릭합니다. </li><li> 또한 추가 분석을 위해 스프레드 시트에 각각의 상대 발광 장치 (RLU) 측정을 보냅니다. </li></ol></li><li> 반복 세포를 파종 한 후 증식에게 96 시간에 매일 24 시간 최대를 기록 할 3.1-3.6 단계를 반복합니다. </li></ol> 4. 셀 이미 저를 사용하여 세포 수를 결정 <ol><li> 다중 모드 셀 메이져 소프트웨어를 사용하여 세포 이미징 실험 설정 <ol><li> 멀티 모드 셀 이미 저와 오픈 일을 켭니다전자 소프트웨어. </li><li> &#39;작업 관리자&#39;에서 &#39;실험&#39;탭을 선택하고 &#39;도구 모음에서 클릭&#39;파일 &#39;new&#39;.On에게 만들기&#39;프로토콜 &#39;탭을 열고&#39;절차 &#39;tab.Select&#39;설정 온도 &#39;조치를. &#39;에&#39;에 인큐베이터를 설정하고 37 ° C로 온도를 설정하고 다음 단계 &#39;상자를 계속하기 전에&#39;예열 &#39;확인합니다. 설정을 저장하려면 &#39;확인&#39;을 클릭합니다. </li><li> &#39;읽기&#39;작업을 선택합니다. &#39;이미지&#39;검출 방법을 클릭하여 &#39;엔드 포인트 / 운동&#39;읽기 유형과 &#39;필터&#39;광학 유형을 선택합니다. 접시에 전체 판 &#39;탭&#39;에 OK&#39;.Click &#39;를 클릭하고 우물 군데한다. 설정을 저장하려면 &#39;확인&#39;을 클릭합니다. </li><li> &#39;목표&#39;옵션 드롭 다운에서 2.5 배의 목표를 선택합니다. GFP 469, 525 및 밝은 필드 &#39;채널&#39;탭에서 두 개의 채널을 선택합니다. 두 채널 모두를위한 &#39;자동&#39;노출을 확인하고 잘 자동 노출을 선택합니다. </li><li> AUT을 확인하려면오 포커스 설정이 &#39;자동 초점&#39;을 선택하고 &#39;옵션&#39;을 클릭합니다. 자동 초점 옵션의 경우, &#39;다음 자동 초점을 스캔하고&#39;방법을 선택합니다. 설정을 저장하려면 &#39;확인&#39;을 클릭합니다. </li><li> 설정 수평 및 수평 간격 (μm의) = 2881 및 수직 간격 (μm의) = 2127으로, 3 × 2 몽타주에 잘 당 여러 이미지를 스캔 0.Select하는 것이 아니라 (μm의)의 중심에서 수직 오프셋. 프로 시저 설정을 저장하려면 &#39;확인&#39;을 클릭합니다. 참고 : 읽기 매개 변수에 대한 표 2를 참조하십시오. </li></ol></li><li> 선정 된 플레이트에 대한 읽기 실험을 수행 <ol><li> 뚜껑을 보장하는 것은 켜져의 &#39;장비 제어&#39;탭을 클릭하고 &#39;밖으로 판&#39;function.Place에게 판 홀더 96 웰 플레이트를 선택합니다. &#39;기기 제어&#39;탭에서 함수 &#39;에서 판&#39;를 선택합니다. 선택 판 탭에서 &#39;지금 읽기&#39;. 96 시간의 후 파종 할 때마다 24 시간까지를 읽어 반복합니다. </li></ol></li><li> 를 사용하여 세포 수의 분석셀 이미 저 소프트웨어. <ol><li> 이미지를 분석하기 위해, 이미지화 된 판의 &#39;데이터&#39;탭을 클릭, 선택 &#39;사진 [GFP 469, 525 + 밝은 필드]. 잘 군데 온 두 번 클릭합니다. </li><li> 로드 이미지를 클릭하십시오. 선택 &#39;분석&#39;과 몽타주의 단일 이미지 분석을 선택합니다. GFP &#39;를 OK&#39;.Check&#39;클릭 &#39;만 채널 및 표 3에 설명 된대로 설정 매개 변수를. 클릭&#39;이미징 세포 매개 변수를 적용 START &#39;를. </li><li> 이미지 당 세포 수를 결정하는 데 사용되는 이미징 셀 위에 위치하는 셀 카운팅 마스크를 관찰한다. 클릭 실험을하는 동안 몇 군데 각 플레이트에 대해이 설정을 &#39;변경 사항을 적용&#39;을 유지한다. </li><li> 일단 다시 이미지화 된 판에, 다운 메뉴에서 &#39;데이터&#39;메뉴를 클릭하고 &#39;세포 수&#39;를 선택합니다. 이것은 물론 당 전체 세포 수를 생성합니다. </li><li> 추가 분석 O를위한 &#39;수출&#39;탭을 클릭하여 스프레드 시트에있는 모든 데이터를 내보내기웰 당 세포 수 (F). </li></ol></li></ol>

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M., Loessner, D., Friis, T., Reichert, J. C., Hutmacher, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrepancies+between+metabolic+activity+and+DNA+content+as+tool+to+assess+cell+proliferation+in+cancer+research.">Discrepancies between metabolic activity and DNA content as tool to assess cell proliferation in cancer research.</a> J Cell Mol Med. 14 (4), 1003-1013 (2010).</li><li>Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. , 1-12 (2011).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

이 프로토콜에서 배양 된 세포에서 세포 증식을 측정하는 방법은 세 가지 조사 하였다. 각 방법은 96 시간 동안 세포 증식 재현하고 정확한 측정을 할 수 있었고, 그 결과 (도 2 및 3) ​​실험 방법 각간에 비교 하였다. 발광 기반 분석법 및 세포 영상 법은 모두 96 시간 후 세포 증식의 선형 증가를 나타내는 가장 강력한 결과를 생성 (도 2b, c). 또한, 시간이 지남에 따라 셀 이미징 형질 도입 및 비 - 형질 도입 된 세포주 (도 4) 사이의 성장 속도에 큰 차이를 도시하지 않는다. 이 많은 장점과 단점은,이 프로토콜에서 검사 각 방법위한 요약 표 5 참조. 혈구를 사용하는 종래의 전지의 계산 방법은 매우 적은 또는 부가적인 시약을 필요 effo 저비용 방법실온 준비하고 실행합니다. 또한,이 방법은 세포 / ㎖ (14)의 절대 셀 카운트 quantitates. 그러나, 카운트 사이의 큰 표준 편차를 초래 세포 계수, 높은 에러 레이트의 자연 소모되는 시간 및 셀 번호 고역 정확한 세포 수에 필요하다는 사실을 포함하는 심각한 단점이있다. 이는 혈구 세포를 이용한 계산은 이후 시점에서 낮은 세포 밀도에서 변수 결과, 큰 표준 편차를 보였다도 2a에서 볼 수있다. 이러한 단점은 작은 접시의 크기와 파종 밀도가 필요한 큰 높은 처리량 측정을위한이 방법은 작은 샘플 크기의 셀 계산에 유용하고, 불충분합니다. 세포 밀도가 세포 계수의 최소 개수는 100보다 큰 셀의 문턱에 시작되도록, 증가 된 경우 이러한 제한이 경감 될 수있다. 개 세포 현탁액을 희석하거나 셀 D 저하ensity 미만 100 세포 수를 계산하고 (15)를 복제 사이 따라서 가변성을 증가시키는 더 많은 기회. 그러나,이 방법에 의한 낮은 세포 표면 영역에, 96 웰 플레이트에 적합하며, 따라서, 분석에 사용할 수있는 셀의 수가 충분. 이것은이 방법이 기능이 필요한 사용자에 대한 명확한 단점의 높은 처리 능력의 부족을 강조한다. 발광 기반 분석은 대사 활성 셀 (16)의 유무의 측정은 ATP의 양을 측정함으로써 세포 생존 능력을 결정한다. 이 분석은 세포 증식을 결정하기 위해 96 웰 플레이트 형식으로 여러 시료 고 처리량 스크리닝을 위해 설계된다. 이 간단한 방식은 대사 적 활성 세포의 ATP의 존재에 비례하는 플레이트 판독기를 사용하여 상대 발광 단위 (RLU)과 같이 세포 증식을 quantitates. 그러나,이 방법의 주요 단점은 t이다그 시약 비용 및 세포의 대사 활성의 측정 의존성. 온도 나 세포주기 시점 등 다양한 세포 배양 조건은 쉽게 분석 (17)에 의해 발생되는 발광 신호에 직접적으로 비례하는 세포에 의해 생성 된 ATP의 양에 영향을 미칠 수있다. 따라서, 경험적 실험 조건은 세포의 대사 활동에 방해가 잠재적으로 세포에 의해 생성 된 신호의 상대 발광을 방해하지 않는 것으로 판단하는 것이 중요하다. 세포 증식을 결정하기 위해 조사 된 세번째 방법은 상대적인 세포 카운트를 수행하는 생균 이미 저와 소프트웨어이다. 이 분석의 기간에 걸쳐 동일한 셀을 사용하여, 온도 제어에 따라 실시간으로 각 웰에 대해 다수의 이미지를 캡처하는 자동화 할 수 있으므로 이미 저 셀은 높은 처리 능력을 갖는다. 도 4에 도시 된 바와 같이, 세포 증식 될 수 m세포 계수 분석과 함께 세포 집단에 관한 추가 정보를 제공 할 수있는 시간에 걸쳐 동일한 플레이트에 onitored. 이를 통해 96 웰 플레이트 형식에서 일반적이다 크로스 플레이트 변동 셀 시드 오류를 제거으로 매우 유리하다. 셀 이미 저에 따라 소프트웨어를 표 2 및 3에 제시된 파라미터를 이용하여 세포 수의 정량을 허용한다. 그것은 높은 처리량 설정에 따라서 유용하고 쉽게 사멸 또는 세포 독성 등의 세포 기능을 측정하는 다른 분석으로 다중화 될 수있다. 시스템의 주요 단점은 터치 물체를 분할 할 수있는 능력이 제한되어있는 소프트웨어이다. 이 하부 합류 세포에서이 기능을 수행 할 수 있지만, 상기 분석의 주요 한계이므로 셀 타입 별 최적화를 필요로한다. 이미 저를 사용하여 개별 실험은 매우 낮은 비용이 판에 의해 플레이트 규모에있는 동안 또한,이 방법에 대한 것기기가 이미 실험실에서 설정된 경우 LY는 비용 대비 효과가 될 수있다. 따라서, 이것은 높은 처리량 분석이 방법이 적합하게 배양 된 세포의 세포 증식을 측정하는 새로운 방법을 제공하며, 추가의 시약을 필요로하지의 큰 장점을 가지며, 96 웰 플레이트 자동 카운팅 할 수있다. 이것은 종래의 혈구 세포 계산 방법에 크게 향상하고, 발광 기반 분석에 대한보다 비용 효과적인 선택이다. 셀 화상 카메라를 사용하는 중요한 단계는 촬영 된 이미지와 이미지 당 이후의 세포 수의 분석 중입니다. 이러한 이미지는 세포 이미징 플랫폼의 개수를 사용하여 처리 될 수있다. 조사중인 셀 타입에 대한 가장 적절한 소프트웨어를 결정하는 것이 중요하다. 이는 다른 이미지 소프트웨어를 이용하여 세포의 이미 저에 의해 취득 된 화상으로부터 세포 수를 확인하는 데 유용하다. 이 프로토콜은 적용될 수있다Y 배양 세포 그러나 분석 파라미터는 각각의 세포주에 대해 정의 될 것이다. 이것은 시간이 먼저 소비 될 수 있지만, 파라미터를 설정 한 후에,이 방법은 한 번에 전체 이미지 플레이트 자동화 될 수있다. 그들이 세포 수 (혈구 세포 이미 저) 또는 대사 활성 (발광 기반 분석)을 수단으로 시간에 걸쳐, 이러한 분석법 사실 증식 간접 측정 한 것이 중요하다. 이러한 방법은 쉽게 증식에 영향을 미칠 수있는 다른 중요한 인자를 측정하기 위해 수정 될 수있다. 예를 들면, 트립 판 블루 제외 방법을 쉽게 사균을 제외하고 따라서 세포 생존 (13)를 결정하는 혈구 세포 또는 이미 저 방법 중 하나에 포함될 수있다. 발광 기반 분석은 셀 상태에 대한 추가 정보를 제공하기 위하여 독성 분석을 다중화하고, 상기 분석 동안 측정 대사 활성은 또한 세포 viabi를 측정 할 수있다lity 12. 따라서 이러한 분석의 유연성은 각 방식의 강점은 추가적인 셀룰러 정보를 제공하기 위해 다른 분석에 함께 다중화한다. 이 프로토콜은 안정적 GFP 유전자를 함유 레고 IG2 - 순수하지 않아 + 벡터로 형질 도입 된 인간 유방암 세포주 MCF-7을 사용했다. 이 배양액에있는 색소 제를 추가 할 필요없이 이미지의 GFP 광학 필터 셀의 사용을 허용한다. 이 방법은 간단하거나 증식 마커와 세포를 라벨링하여, 어느 시야 광학계 방식을 사용하여 셀을 촬상하여 화상 GFP - 음성 세포 또는 일차 세포주로 변형 될 수있다. 이 프로토콜에 비해 방법은 다양한 세포주의 다양한 사용에 충분히 강력하지만 각각의 세포주에 대한 최적의 프로토콜 설정이 먼저 결정되어야한다. 밝은 필드 채널을 사용하여 세포의 이미징은 주요 가전에 가장 적합한 옵션을 나타냅니다LLS 또는 이에있어서의 장기 특성으로 느린 성장을 된 것. 이러한 발광 기반 분석 등 종점 분석법, 장기 세포 성장 분석에 적합하지 않는다. 이 프로토콜은 시험관 내에서 세포 증식을 측정하기위한 세 가지 방법을 설명 하였다. 각 방법은 통상적으로 세포의 성장을 측정하는 실험을 수행 할 수 있으며, 대부분의 실험실 방법 중 하나를 수행하기 위해 필요한 기술을 갖고있다. 그러나, 또한 분열하는 세포를 측정 사용할 수있는 다른 분석의 범위가 있습니다. 다음은 DNA 합성, 대사 활동을 측정하는 방법, 확산 또는 ATP 농도 (9)의 관련 항원을 포함 할 수있다. 예를 들어, 분석의 수는 3H 티미 딘으로 방사성 물질과 세포를 라벨에 의해 세포의 DNA 합성의 속도를 측정하기 위해 개발되었다. 이 방법의 단점은 방사성 물질 및 그 처분의 명백한 사용이다. 다른통상적으로 세포 증식을 측정하기 위해 사용되는 방법은 18 유세포 분석을 이용하여 측정 할 수있다 새로 형성된 DNA의 BrdU의 표지의 사용을 포함한다. 유동 세포 계측법 셀 번호뿐만 아니라 세포주기 정보 모두를 분석하는데 사용될 수있다. 그러나, 이것은이 방법의 단점은 사이토 흐름을 제공하고, 생성 된 데이터 (18)를 분석하기 위해 추가의 시간과 같이, 고가의 시약을 증가 사용자 훈련 능력을 포함 특정 실험에서 바람직한 결과 일 수있다. 따라서,이 세포의 성장을 평가 과학자 가능한 다양한 분석법이 있으며, 선택된 방법에 사용되는 세포 유형, 사용자 자신의 스킬 레벨, 실험의 엔드 포인트에서 요구되는 데이터의 유형에 크게 의존한다. 결론적으로, 세포 증식을 측정하는 방법은 세 가지 유방암 세포를 사용하여 비교 하​​였다. 각 방법은 많은 장점과 disadvantag이ES, 따라서 사용자 의존적 각 실험을위한 요구 사항에 기초하여, 셀 카운팅을 수행하는 최적의 분석 조건의 결정이다.

종양 억제 유전자는 p53의는 세포주기 억류, 아폽토시스 및 노화 한 포함한 세포 프로세스의 개수의 필수 레귤레이터이다. 이는 게놈 안정성을 유지할 책임이 있으며, 따라서, 세포 사멸 및 세포 성장의 균형을 유지하는데 중요하다. p53의 돌연변이 암에서 흔히 조절되지 않은 암 세포 증식이 선도 p53의 불 활성화의 주요 원인이다. 흥미롭게도, p53의 돌연변이는 다른 메커니즘은 p53의 기능의 손실에 대해 책임이 있음을 시사 유방암 3의 약 25 %를 차지한다. 최근에 발견 된 p53의 이성체는 인간 암의 다수의 과발현되는 것으로 도시되어 있고, p53의 기능 4,5-를 변조 할 수있다. 우리는 p53의 이성체, Δ40p53는 유방암에서 가장 높은 발현 이성체가 있음을 이전에 도시 한 통상 인접 담배 마는에 비해 상당히 유방암 세포에서 상향 조절된다UE (6). 이것에 따라, 우리는 안정적 레고 IG2 - 순수하지 않아 + 벡터 (GFP의 +)를 이용하여 7 Δ40p53 과발현하는 인간 유방암 세포주 MCF-7 형질. 이들 세포는 높은 Δ40p53 식​​ 유방암 세포에서 세포의 증식 속도가 증가하면 조사 하였다. 시험관 8,9 배양 세포의 세포 증식을 측정하는 다수의 직접 및 간접 방법이있다. 이러한 시간에 따른 연속 측정 또는 종점 분석법 10 중 수행 될 수있다. 기존의 방법은 혈구를 사용하여 세포 계수로, 여전히 유용하다. 이 분석은 낮은 비용과 셀 번호 직접 측정이지만, 계산에서 오류가 큰 표준 편차를 최소화하기 위해 큰 세포 수 및 숙련 된 훈련에 의존 않는다. 고 스루풋 포맷과 호환 측정을 수행 할 필요가 멀티 웰 플레이트 검정의 개발을 유도 하였다. 이 발광 기반 분석은 measu셀 (11, 12)의 대사 활동에 비례하는 발광 신호에 기초하여 세포 수를 재. 최근에, 고 함량의 이미징 플랫폼의 도입 양적 및 질적 표현형 데이터 수집을 제공하는 동안 세포 증식을 모니터링 할 수있는 새로운 도구시키고, 시스템 (13)의 다양한 종류를 포함하고있다. 이들 방법은 모두 연속적인 측정 또는 종점 분석법에 의해 하나, 세포의 성장을 측정하는 길을 제공하며, 각 따라 적절하게 칭량 할 수 모두 감도에 관해서, 시료 번호의 처리량 및 셀 정보 장단점 범위를 가지고 연구 질문에. 이 프로토콜은 감도, 재현성 및 멀티 웰 플레이트 포맷의 다른 범위를 이용하여 각 방법으로 시험관 내에서 세포 증식을 측정하기위한 세 가지 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 혈구 계수 차의 사용과 비교 대상mber 96 시간의 시간 과정을 통해 세포 증식의 측정에 기반 발광 세포 생존력 분석법 및 세포 이미 저. 이를 위해, 벡터 - 형질 도입 된 세포 (MCF-7 LEGO)의 성장은 세 가지 세포 밀도를 사용 Δ40p53 (MCF-7 Δ40p53)를 과발현하는 형질 도입 된 세포와 비교 하​​였다. 세포 증식은 최대 96 시간 동안 매 24 시간을 측정 하였다. 각 방법은 자체의 장점 및 단점을 갖는 것으로, 상기 실험의 목적에 따라 각 여전히 증식 속도에 대한 정보를 제공하기위한 유용한 방법 하였다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1031">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium, no phenol-red</td>
			<td style="width:99px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21063-045</td>
			<td style="width:597px;">Supplemented with 10% FBS, 200mM L-glutamine, 2&#181;g/ml insulin and 1&#181;g/ml puromycin</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">L-glutamine solution (100x)</td>
			<td style="width:99px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Insulin solution human</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I9278-5ML</td>
			<td style="width:597px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:99px;">Bovogen Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">SFBS-F-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Puromycin dihydrochloride</td>
			<td style="width:99px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9620-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">0.5% trypsin-EDTA solution (10x)</td>
			<td style="width:99px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15400-054</td>
			<td>Dilute to 2x in DPBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x)</td>
			<td style="width:99px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">30028-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:216px;">Tissue culture flask, 75cm2 growth area</td>
			<td style="width:99px;">Greiner Bio-One</td>
			<td align="right" style="width:119px;">658175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Scepter 2.0 Cell Counter</td>
			<td style="width:99px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96 well multiwell plate, flat bottom</td>
			<td style="width:99px;">Nunc</td>
			<td align="right" style="width:119px;">167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Improved Neubauer Hemocytometer</td>
			<td style="width:99px;">BOECO Germany</td>
			<td style="width:119px;">BOE 01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Olympus IX51 inverted microscope</td>
			<td style="width:99px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CellTiter-Glo 2.0 Assay</td>
			<td style="width:99px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G9242</td>
			<td>Luminescence-based assay</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader</td>
			<td style="width:99px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gen5 Data Analysis Software</td>
			<td style="width:99px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">GEN5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comparison of three different methods for determining cell proliferation in breast cancer cell lines

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.

배양 된 세포의 증식 - Δ40p53 MCF-7 세포를 형질 도입의 세포 증식을 측정하는 다른 방법을 연구하는 비 형질 MCF-7 레고 유방암 세포주와 비교 하​​였다. 비교 된 세 가지 방법 - 도식에 설명 된 분석 - 종래 방법 혈구 세포 생존력 발광 분석법 및 세포 이미징 (도 1). 각 방법의 장점은 정확하게 시간이 지남에 따라 셀 계수를 측정하는 단점을 가지고 있으며, 가장 효과적인 방법은 실험의 끝점 요구 및 세포 집단에 대해 획득 될 수있는 정보에 의존한다. MCF-7 및 MCF-레고 -7- Δ40p53 세포의 성장은 4 일 동안 24 시간 후에 측정 하였다. 도 1에 도시 된 바와 같이, 두 개의 세포주는 세 가지 세포 밀도 (1.5 × 103로 접종 하였다 </s&gt; 최대; 3 × 103; / 웰)을 세포 계수 5 × 103 세포를 접종 한 후 24, 48, 72 및 96 시간 행 하였다. 각 방법은 96 시간 이상 혈구, 발광 기반 분석법, 및 셀이 메이져 (각각도 2A, B와 C)을 사용하여, 증가 된 세포의 증식을 보였다. 세포 증식의 큰 증가는 높은 세포 밀도 (5 × 103 세포)에서 볼 나타내며 이는 이들 세포의 증식을 측정하기위한 최적의 세포 밀도로 제시, 각 시점에서 대부분의 재현 가능한 결과를 보였다. 세포주와 세포의 증식에 유의 한 차이가 없었다. 다른 방법 사이 세포 증식의 측정은 선형 회귀 분석 (6) (표 4도 3)에 의해 비교 ​​하였다. 다른 방법의 각 사이에 유의 한 상관 관계 테스트가 있었다, 비교 C양 세포주의 세포 밀도 모두에서 엘 증식 (도 3a 및 b). 강한 상관 발광 기반 분석의 비교 및 셀 이미 저간에 관찰되었다 (R 2 = 0.8899, P ≤0.0001; R 2 = 0.9805, P ≤0.0001 각각도 3a 및 b). 셀 이미 저를 사용하여 세포 증식의 시각적 표현 (그림 4) 표시됩니다. 이 방법은 하나의 판의 연속 측정을 사용하기 때문에 세포가 100 %의 합류점 부근에 도달 할 때까지 세포를 매 24 시간을 이미지화 할 수있다. 도 2에 도시 된 바와 같이, MCF-7 및 MCF-레고 -7- Δ40p53 세포의 성장 속도는 모든 시점에 걸쳐 비교 하였다. 이 방법은 시각적으로 여러 날에 걸쳐 세포의 성장을 모니터하고, 셀 크기 및 셀 모토을 비교할 수있는 세포를 포함한 유용한 정보를 제공한다다른 세포 라인 사이의 뜻. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54350/54350fig1.jpg" /> 도 1 : 세포 증식을 측정하는 세 가지 방법의 개략도 세포를 96 시간 동안 5 % CO 2, 37 ℃에서 여러 96- 웰 플레이트에 세 가지 세포 밀도로 접종하고 배양 하였다.. 매일 24 시간, 세포 증식이 혈구, 발광 기반 분석 또는 세포 이미징을 사용하거나하여 측정 하였다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54350/54350fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54350/54350fig2.jpg" /> 그림 2 :. 세포 증식의 측정은 96 시간 셀 카운트 후 MCF-7 차전에서 96 시간 동안 매 24 시간을 측정 하였다O 및 MCF-7 세포 Δ40p53 세 가지 세포 밀도로 접종. 세포 수는 (b) 발광 계 상대 발광 단위 분석 (RLU) 또는 (c) 세포 / 이미지 셀 이미 저를 사용하여 연속적인 세포 수를 사용하여, 세포 / ml의 (a) 혈구를 사용하여 측정 하였다. 셀 이미 저 조건은 모든 실험은 3 개의 독립적 인 실험의 평균을 나타내는 표 2에 나타낸다는 SD ± <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54350/54350fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54350/54350fig3.jpg" /> 도 3. 유방암 세포주에서 세포 증식을 측정하는 세 가지 방법의 비교는 선형 회귀 분석은 상이한 m 사이의 상관 관계를 비교 하였다<html> (a) MCF-7 세포와 레고 (b) MCF-7 Δ40p53 세포에서 세포 증식을 측정하는 시험 ethods. 피어슨의 상관 계수를 계산하고, 중요성은 세포 증식을 측정하는 다양한 방법간에 (p &lt;0.05)를 측정 하였다. 모든 결과는 3 개의 독립적 인 실험의 평균 ± 표준 편차를 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54350/54350fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54350/54350fig4.jpg" /> 그림 4 :. GFP 양성 MCF-7 레고 및 MCF-7 Δ40p53 유방암 세포의 이미지 세포의 대표 이미지 5 × 10 (3) 접종 세포는 세포 이미 저마다 24 시간을 사용하여 캡처. 스케일 바는 1,000 μm의를 나타냅니다. 세포 이미징을위한 파라미터는 표 2에 요약되어있다.<html> = &quot;https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54350/54350fig4large.jpg&quot;대상 = &quot;_ 빈&quot;HREF&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> 셀 밀도 (세포 / 웰) </td></tr><tr><td> 셀 유형 </td><td> 1.5 × 10 3 </td><td> 3.0 × 103 </td><td> 5 × 10 (3) </td></tr><tr><td> MCF-7 레고 </td><td> 8.4 ml의 미디어에 76 μl를 </td><td> 8.3 ml의 미디어 152 μL </td><td> 8.2 ml의 미디어 254 μL </td></tr><tr><td> MCF-7 Δ40p53 </td><td> 8.4 ml의 미디어에 93 μl를 </td><td> 8.3 ml의 미디어에 185 μL </td><td> 8.2 ml의 미디어에 308 μL </td></tr></tbody></table> 표 1 : 96 웰 플레이트 셀 시드 볼륨. &quot;fo를하기 : 유지 -에 - next.within 페이지 =&quot;항상 &quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="2"> 매개 변수를 읽기 </td></tr><tr><td> 플레이트 유형 </td><td> 96 웰 </td></tr><tr><td> 방법 </td><td> 영상 </td></tr><tr><td> 목표 </td><td> 2.5 배 </td></tr><tr><td> 색 </td><td> GFP (469, 525), 밝은 필드 </td></tr><tr><td> 노출 </td><td> 자동 </td></tr><tr><td> 집중하다 </td><td> 자동 (스캔 후 자동 초점) </td></tr></tbody></table> 표 2 : 셀 이미 저를 사용하여 세포 이미징을위한 읽기 매개 변수. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"> 영상 매개 변수 </td></tr><tr><td> 문지방 </td><td> 5000 </td></tr><tr><td> 최소 개체 크기 (μm의) </td><td> (30) </td></tr><tr><td> 최대 객체 크기 (μm의) </td><td> (300) </td></tr></tbody></t수&gt; 표 3 : 세포 계수 분석을위한 이미징 매개 변수. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> MCF-7 레고 </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> R 광장 </td><td> p 값이 </td></tr><tr><td> 발광 기반 분석 대 혈구 </td><td> 0.6301 </td><td> 0.0021 </td></tr><tr><td> 혈구 대 셀 이미 저 </td><td> 0.7524 </td><td> 0.0003 </td></tr><tr><td> 셀 이미 저 대 발광 기반 분석 </td><td> 0.8899 </td><td> &lt;0.0001 </td></tr><tr><td> MCF-7 Δ40p53 </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> R 광장 </td><td> p 값이 </td></tr><tr><td> 루 대 혈구minescence 기반 분석 </td><td> 0.8983 </td><td> &lt;0.0001 </td></tr><tr><td> 혈구 대 셀 이미 저 </td><td> 0.9303 </td><td> &lt;0.0001 </td></tr><tr><td> 셀 이미 저 대 발광 기반 분석 </td><td> 0.9805 </td><td> &lt;0.0001 </td></tr></tbody></table> 표 4 : 테스트 세 가지 확산 방법의 선형 회귀 분석. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 방법 </td><td> 장점 </td><td> 단점 </td><td> 기술 노트 </td><td> 최종 출력 </td></tr><tr><td rowspan="4"> 혈구 </td><td> 저가 </td><td> 높은 인간의 오류 </td><td> 단일 세포 현탁액을 제조하기 위해 여러 번 피펫 </td><td rowspan="4"> 세포 / ml </td></tr><tr><td> 최소한의 장비가 필요합니다 </td><td> 단일 세포 현탁액이 필요합니다 </td><td> 정확도를 달성하기 위해 다수의 계수를 수행 </td></tr><tr><td> 직접 세포 수 </td><td> 세포의 수가 많으면 세포 수의 정확한 평가에 필요한 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 엔드 포인트 </td><td></td></tr><tr><td rowspan="6"> 발광 기반 분석 </td><td> 멀티 웰 플레이트 형식으로 사용 </td><td> 비싼 시약 </td><td> 빛으로부터 보호 </td><td rowspan="6"> 상대 발광 장치 (RLU) / 웰 </td></tr><tr><td> 수행하기 쉬운 </td><td> 발광 플레이트 리더를 필요 </td><td> 배경 발광을 결정하는 제어 우물을 포함 </td></tr><tr><td> 빠른 분석 </td><td> 온도에 민감한 </td><td></td></tr><tr><td> 세포 생존 정보 제공 </td><td> 변수 세포의 신진 대사 활동에 따라</td><td></td></tr><tr><td></td><td> 간접 측정 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 엔드 포인트 </td><td></td></tr><tr><td rowspan="6"> 셀 이미 저 </td><td> 연속 측정 </td><td> 비싼 이미 저 </td><td> 확인 셀 이미 저 37 ° C로 설정 </td><td rowspan="6"> 세포 / 이미지 </td></tr><tr><td> 온도 제어 </td><td> 집중 스킬 </td><td> 세포의 불필요한 흔들림 또는 중단을 방지 </td></tr><tr><td> 휴대 정보를 제공합니다 </td><td> 세포의 합류에 따라 변수 </td><td></td></tr><tr><td> 비용 효율적인 (당신이 이미 저이있는 경우) </td><td> 상대 수 </td><td></td></tr><tr><td> 직접 측정 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 멀티 웰 플레이트 형식의 자동 영상 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table><stroNG&gt; 표 5 : 장점과 다른 세포 계수 방법의 단점의 비교.

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Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.

유방암 세포주에서 세포 증식을 결정하기위한 세 가지 방법 비교

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

comparison-three-different-methods-for-determining-cell-proliferation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

19.4K 조회수.  Hunter Medical Research Institute. This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.

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Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and accuracy. Cell counts are important for monitoring cell health and proliferation rate, assessing immortalization or transformation, seeding cells for subsequent experiments, transfection or infection, and preparing for cell-based assays. It is important that cell counts be accurate, consistent, and fast, particularly for quantitative measurements of cellular responses.
Despite this need for speed and accuracy in cell counting, 71% of 400 researchers surveyed1 who count cells using a hemocytometer. While hemocytometry is inexpensive, it is laborious and subject to user bias and misuse, which results in inaccurate counts. Hemocytometers are made of special optical glass on which cell suspensions are loaded in specified volumes and counted under a microscope. Sources of errors in hemocytometry include: uneven cell distribution in the sample, too many or too few cells in the sample, subjective decisions as to whether a given cell falls within the defined counting area, contamination of the hemocytometer, user-to-user variation, and variation of hemocytometer filling rate2.
To alleviate the tedium associated with manual counting, 29% of researchers count cells using automated cell counting devices; these include vision-based counters, systems that detect cells using the Coulter principle, or flow cytometry1. For most researchers, the main barrier to using an automated system is the price associated with these large benchtop instruments1.
The Scepter cell counter is an automated handheld device that offers the automation and accuracy of Coulter counting at a relatively low cost. The system employs the Coulter principle of impedance-based particle detection3 in a miniaturized format using a combination of analog and digital hardware for sensing, signal processing, data storage, and graphical display. The disposable tip is engineered with a microfabricated, cell- sensing zone that enables discrimination by cell size and cell volume at sub-micron and sub-picoliter resolution. Enhanced with precision liquid-handling channels and electronics, the Scepter cell counter reports cell population statistics graphically displayed as a histogram.

The Scepter Cell Counter is a handheld automated device that can be used to count cells, monitor cell diameter and volume, and be used to check the health and quality of cellular populations from one culture to the next.

샙터 셀 카운터를 사용하여 세포 배양 동안 휴대폰 번호를 결정

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and ...

연구

생물학

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

셀 추적 염료를 사용하여 전지 부문 모니터링에 최적화 된 착색 및 확산 모델링 방법

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA Expression

A major approach in the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of genes of interest in selected cell lines, with the aim to reveal one or several of the gene's function(s) using transient/stable overexpression or knockdown of the gene of interest. Unfortunately, for various cell biological investigations this approach is unsuitable when manipulations of gene expression result in cell growth/proliferation defects or unwanted cell differentiation. Therefore, researchers have adapted the Tetracycline repressor protein (TetR), taken from the E. coli tetracycline resistance operon1, to generate very efficient and tight regulatory systems to express cDNAs in mammalian cells2,3. In short, TetR has been modified to either (1) block initiation of transcription by binding to the Tet-operator (TO) in the promoter region upon addition of tetracycline (termed Tet-off system) or (2) bind to the TO in the absence of tetracycline (termed Tet-on system) (Figure 1). Given the inconvenience that the Tet-off system requires the continuous presence of tetracycline (which has a half-life of about 24 hr in tissue cell culture medium) the Tet-on system has been more extensively optimized, resulting in the development of very tight and efficient vector systems for cDNA expression as used here.
Shortly after establishment of RNA interference (RNAi) for gene knockdown in mammalian cells4, vectors expressing short-hairpin RNAs (shRNAs) were described that function very similar to siRNAs5-11. However, these shRNA-mediated knockdown approaches have the same limitation as conventional knockout strategies, since stable depletion is not feasible when gene targets are essential for cellular survival. To overcome this limitation, van de Wetering et al.12 modified the shRNA expression vector pSUPER5 by inserting a TO in the promoter region, which enabled them to generate stable cell lines with tetracycline-inducible depletion of their target genes of interest.
Here, we describe a method to efficiently generate stable human Tet-on cell lines that reliably drive either inducible overexpression or depletion of the gene of interest. Using this method, we have successfully generated Tet-on cell lines which significantly facilitated the analysis of the MST/hMOB/NDR cascade in centrosome13,14 and apoptosis signaling15,16. In this report, we describe our vectors of choice, in addition to describing the two consecutive manipulation steps that are necessary to efficiently generate human Tet-on cell lines (Figure 2). Moreover, besides outlining a protocol for the generation of human Tet-on cell lines, we will discuss critical aspects regarding the technical procedures and the characterization of Tet-on cells.

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible Tet-on shRNA or cDNA Expression

A rapid and simple way to generate human cell lines with inducible and reversible cDNA overexpression or shRNA-mediated knock-down of the gene of interest. This method enables researchers to reliably and highly reproducibly manipulate cell lines that are difficult to alter by transient transfection methods or conventional knockdown/knockout strategies.

테트라싸이클린-inducible (Tet-에서) shRNA 또는 cDNA 표현과 안정적인 인간 세포 라인의 생성

A major approach in  the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of  genes of interest in selected cell lines, with the aim ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

에 상처 응답에 대한 피부 상처에 대한 방법 및 분석 실험<em&gt; C. 엘레</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.

CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.

CRISPR / Cas9를 통해 포유 동물 세포주의 게놈에 삭제 세대

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, techniques for studying the regulatory mechanism of this system are essential to elucidating the cellular and molecular processes of the aforementioned diseases. The use of hemagglutinin derived ubiquitin probes outlined in this paper serves as a valuable tool for the study of this system. This paper details a method that enables the user to perform assays that give a direct visualization of deubiquitinating enzyme activity. Deubiquitinating enzymes control proteasomal degradation and share functional homology at their active sites, which allows the user to investigate the activity of multiple enzymes in one assay. Lysates are obtained through gentle mechanical cell disruption and incubated with active site directed probes. Functional enzymes are tagged with the probes while inactive enzymes remain unbound. By running this assay, the user obtains information on both the activity and potential expression of multiple deubiquitinating enzymes in a fast and easy manner. The current method is significantly more efficient than using individual antibodies for the predicted one hundred deubiquitinating enzymes in the human cell.

The current protocol details a method for measuring the activity of functionally homologous deubiquitinating enzymes. Specialized probes covalently modify the enzyme and allow for detection. This method holds the potential to identify new therapeutic targets.

세포주 및 조직 샘플에서 Deubiquitinating 효소의 활성을 측정 방법

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is partitioned into ~20,000 nano-sized, water-in-oil droplets, and PCR amplification occurs in individual droplets. The ddPCR approach is in identifying sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving targeted genes. Here, we demonstrate the use of ddPCR as a powerful technique for precisely quantitating rare BRAF V600E mutations in FFPE reference standard cell lines, which is helpful in identifying individuals with cancer. In conclusion, ddPCR technique offers the potential to precisely profile the specific rare mutations in different genes in various types of FFPE samples.

The goal of this video is to demonstrate how to perform&#160;automated DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) reference standard cell lines and digital droplet PCR&#160;(ddPCR) analysis to detect rare mutations in a clinical setting. Detecting mutations in FFPE samples demonstrates the clinical utility of ddPCR in FFPE samples.

디지털 물방울 PCR은 포르말린 고정 파라핀 포함 된 참조 표준 세포주에서 BRAF의 V600E 돌연변이를 검출하기 위해 채용

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical proteins, such as antibodies, vaccine candidates and enzymes. These must be purified from the plant biomass but chromatography steps are hindered by the high concentrations of host cell proteins (HCPs) in plant extracts. However, most HCPs irreversibly aggregate at temperatures above 60 &#176;C facilitating subsequent purification of the target protein. Here, three methods are presented to achieve the heat precipitation of tobacco HCPs in either intact leaves or extracts. The blanching of intact leaves can easily be incorporated into existing processes but may have a negative impact on subsequent filtration steps. The opposite is true for heat precipitation of leaf extracts in a stirred vessel, which can improve the performance of downstream operations albeit with major changes in process equipment design, such as homogenizer geometry. Finally, a heat exchanger setup is well characterized in terms of heat transfer conditions and easy to scale, but cleaning can be difficult and there may be a negative impact on filter capacity. The design-of-experiments approach can be used to identify the most relevant process parameters affecting HCP removal and product recovery. This facilitates the application of each method in other expression platforms and the identification of the most suitable method for a given purification strategy.

Three heat precipitation methods are presented that effectively remove more than 90% of host cell proteins (HCPs) from tobacco extracts prior to any other purification step. The plant HCPs irreversibly aggregate at temperatures above 60 &#176;C.

본래 식물을 표백제로 또는 추출물의 열처리에 의한 담배 숙주 세포 단백질 제거 방법의 비교

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical ...

Inducible LAP-tagged Stable Cell Lines for Investigating Protein Function, Spatiotemporal Localization and Protein Interaction Networks

Multi-protein complexes, rather than single proteins acting in isolation, often govern molecular pathways regulating cellular homeostasis. Based on this principle, the purification of critical proteins required for the functioning of these pathways along with their native interacting partners has not only allowed the mapping of the protein constituents of these pathways, but has also provided a deeper understanding of how these proteins coordinate to regulate these pathways. Within this context, understanding a protein's spatiotemporal localization and its protein-protein interaction network can aid in defining its role within a pathway, as well as how its misregulation may lead to disease pathogenesis. To address this need, several approaches for protein purification such as tandem affinity purification (TAP) and localization and affinity purification (LAP) have been designed and used successfully. Nevertheless, in order to apply these approaches to pathway-scale proteomic analyses, these strategies must be supplemented with modern technological developments in cloning and mammalian stable cell line generation. Here, we describe a method for generating LAP-tagged human inducible stable cell lines for investigating protein subcellular localization and protein-protein interaction networks. This approach has been successfully applied to the dissection of multiple cellular pathways including cell division and is compatible with high-throughput proteomic analyses.

We describe a method for generating localization and affinity purification (LAP)-tagged inducible stable cell lines for investigating protein function, spatiotemporal subcellular localization and protein-protein interaction networks.

조사 단백질 기능, 시공간 현지화 및 단백질 상호 작용 네트워크를위한 유도 LAP-태그 안정 세포주

Multi-protein complexes, rather than single proteins acting in isolation, often govern molecular pathways regulating cellular homeostasis. Based on this ...

Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that the incubation in normoxic (5% CO2 in air) or hypoxic (low oxygen levels) conditions followed by an anoxic incubation (an absence of free oxygen) results in limited viability (2&#8211;3 days). A novel methodology was developed that enables an anoxic cell cultivation (for at least 17 days; the maximum time tested). The most critical aspect of this methodology is to ensure that no oxygen is introduced into the system. This is obtained by the degassing of media, and by flushing tubes, dishes, flasks, and pipettes with an anaerobic gas mixture (H2, CO2, N2) followed by permitting the materials to equilibrate to the anoxic (non-oxygen) environment prior to usage.&#160;Additional care must be exercised when acquiring photomicrographs to ensure that the micrographs obtained do not contain artifacts. In the absence of oxygen, cell morphology is significantly altered. Two distinct morphotypes are noted for all anaerobically-grown cells. The ability to grow and maintain mammalian cells in the absence of oxygen can be applied to the analysis of cell physiology, polymicrobial interactions, and the characterization of biosynthetic pathways for novel cancer drug development.

Here, we describe a new method that enables the anaerobic long-term cultivation of established cell lines. The maximum survival time that was tested is 17 days. This method is suitable for the testing of cytotoxic agents and exploring the physiology of anoxically replicating cells.

혐 기성 성장 및 포유류 세포의 유지 보수

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that ...