이 연구는 의학, 서울, 울산 대학교 의과 대학 학생 연구 그랜트 (13 ~ 14)과 아산 생명 과학 연구소, 서울, 한국에서 보조금 (2014-464)에 의해 지원되었다.

1. 세포주 <ol><li> 6 웰 플레이트에 문화 10 6 텔로 머라 제 - 불후의 인간의 각막 상피 세포 (인체 각막 상피 세포) : 기관지 상피 성장 매체 (BEGM)를 사용하여 5 % CO 2 분위기로 37 ° C 배양기에서 (밀도 1039.9 셀 / mm 2)까지 그들은 95 %의 합류에 도달합니다. </li></ol> 2. 웨스턴 블롯 분석 상피 스크래치 상처를 작성 후 <ol><li> 킬 멸균 200 μL 피펫 합류 배양 된 인체 각막 상피 세포의 잘의 표면을 가로 질러 팁 생물 안전 캐비닛 접시 당 네 번 (클래스 II, 유형 A2)와 5 % CO 2 분위기로 37 ° C 배양기에서 별도로 인체 각막 상피 세포를 배양 1, 5, 10, 30, 60 및 120 분. </li><li> 각막 상피 ​​상처 후 배양 시간에 따라 여섯 가지 샘플에 대해 하나의 6 웰 플레이트를 사용합니다. </li><li> 1X PBS로 부상 HCEC의 단일 층을 세 번 세척 한 후 각 웰에 2.0 ml의 BEGM를 추가합니다. </li><li> (2)를 사용하여 인체 각막 상피 ​​세포를 분리ml의 0.25 % 트립신 - 에틸렌 디아민 5 분 동안 잘 당 아세트산 (EDTA), 15 ML 튜브에서 5 분 900 XG에 원심 분리기 및 흡인 트립신 EDTA는 1 ml를 피펫을 사용하여. </li><li> PBS 1 배 1 ml의 인체 각막 상피 ​​세포를 일시 중단하고 1.5 ML 튜브로 전송. </li><li> 15 초 동안 10,000 XG에 원심 분리기 인체 각막 상피 ​​세포 및 흡인 1X PBS는 1 ml를 피펫을 사용하여. </li><li> 100 μl의 빙냉 용해 완충액에서 재현 탁 인체 각막 상피 세포 (10 mM 트리스, 10 mM의 NaCl을 2 mM의 EDTA, 25 mM의 NaF로부터, 2 mM의 나트륨 3 VO 4,1 밀리미터 페닐 메탄 설 포닐 플루오 라이드 [PMSF], 프로테아제 억제제 [A 펩 스타틴 1 μM, 1 μM의 류 펩틴, 0.1 μM 아프로 티닌] 0.5 % 트리톤 X-100의 pH 7) 및 그들을 잘 섞는다. </li><li> 세포 용해를 유도하는 얼음에 30 분 동안 세포를 인큐베이션. </li><li> 원심 분리기 15 분 동안 10,000 XG에 4 ° C에서 해물을하고 신선한 1.5 ml의 튜브 (90 μL 씩)에 상층 액을 전송하고 -80 ° C에 저장합니다. </li><li> 브래드 포드 (PR)을 사용하여 세포 용 해물의 전체 단백질 농도를 결정otein 분석. (9) </li><li> 나트륨 도데 실 설페이트 - 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)를위한 10 % 또는 12 % 아크릴 아마이드 겔에 부하 30 μg의 총 세포 단백질을 전기 영동 이동은 4 ℃에서 1 시간에 대해 200mA 전류 니트로 셀룰로오스 필터에 단백질 밴드 분리 C는 웨스턴 블롯 분석에 사용할 수 있습니다. </li><li> 5 % 차단 니트로 셀룰로오스 여과막 비 인산화 HSP27 대해 기본 토끼 폴리 클로 날 항체를 추가로 1 시간 동안 트윈 -20 (TBST)를 TBS 버퍼에서 탈지유 (1 : 1000 희석) 또는 인산화 HSP27 대해 기본 토끼 다 클론 항체 (1 : 1000 5 % 소 혈청 알부민에 희석) (BSA), 및 진탕 기에서 4 ℃에서 하룻밤 부화 막. </li><li> TBST로 10 분간 3 회 세척 한 후, 5 %의 BSA (10,000 희석 1) 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 - 결합 염소 항 - 토끼 항체를 사용하여 면역 반응성 밴드를 검출한다. </li><li> 서쪽 블로 팅 루미놀 시약에 멤브레인을 품어 (6-7m실온에서 1 분 동안 5cm 막 × 10cm) 당 리터. </li><li> 시약 용액으로부터 막을 제거, 플라스틱 시트 보호에 과잉 흡수 수건 액체과 장소를 제거합니다. </li><li> 안전한 빛 어두운 방에서 작업, 단백질면이 위를 향하도록 필름 카세트에 덮여 막 배치합니다. </li><li> 막 위에 X 선 필름을 넣고 1 분 동안 노출. </li></ol> 3. siRNA를 형질 분석 (10) <ol><li> 문화 5 × 10 5 세포에서 인체 각막 상피 세포 / 잘가 95 %의 합류에 도달 할 때까지 BEGM를 사용하여 5 % CO 2 분위기로 37 ° C 배양기에서 6 웰 플레이트. </li><li> 10 또는 50 nM의를 만들 수 감소 혈청 배지를 형질 전환 (희석 요인이 41 또는 14.3이었다) 100 ㎕를 감소 혈청 매체와 형질 전환 시약 (2.5 또는 7.5 μl를) 희석과 HSP27 별을 용해하고 100 μL에 제어 siRNA를 스크램블 HSP27 별 및 제어 siRNA의 스크램블. </li><li> 100 μ 믹스100 ㎕의 희석 된 형질 전환 시약 L 개의 siRNA의 용액 (1 : 1 비) 실온에서 15 분 동안 혼합물을 배양한다. </li><li> 세포에의 siRNA - 지질 단지를 추가합니다. 그 후 4 시간 변화 매체 후 37 ℃에서 2 일 동안 세포를 BEGM를 완료하고 부화합니다. </li><li> 4.7 절 4.1에서 설명 된 바와 같이, 웨스턴 블로 팅에 의해 형질 전환 된 세포를 분석 할 수 있습니다. </li></ol> siRNA를 형질 세포 (11) 4. 웨스턴 블롯 분석 <ol><li> HSP27 특정 추출하고 100 μl의 빙냉 용해 완충액 (10 mM 트리스, 10 mM의 NaCl을 2 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 25 mM의 NaF로부터, 2 mM의 나트륨 3 VO를 이용한 생물학적 안전 캐비넷 제어 siRNA를 형질 인체 각막 상피 세포를 스크램블링 4, 1 ㎜ 페닐 메탄 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF), 프로테아제 저해제, 및 0.5 % 트리톤 X-100, pH가 7). </li><li> 세포 용해를 유도하는 얼음에 30 분 동안 세포를 인큐베이션. </li><li> 10,000 XG에 펠렛 해물을 15 분 동안하고 신선한 1.5 ML의 욕조에 상층 액을 전송ES (90 μl의 분취 량) 및 -80 ° C에 저장합니다. </li><li> 브래드 포드 (Bradford) 단백질 분석을 이용하여 세포 용 해물의 단백질 농도를 결정한다. (9) </li><li> 10 % 또는 12 % 아크릴 아마이드 겔에 총 세포 단백질의 동일한 양의로드 샘플은 SDS-PAGE에 젤 대상 및 전기 영동 4 ° C에서 1 시간을 위해 200mA의 전류 니트로 셀룰로오스 필터로 분리 된 단백질 밴드를 전송 웨스턴 블롯 분석에 사용합니다. </li><li> , (1000 희석 1) (1000 희석 1) 인산화 된 Akt 5 % 블록 니트로 셀룰로오스 여과막 인산화 비 인산화 HSP27에 대한 일차 항체를 추가 1 시간 동안 트윈 -20 (TBST)를 TBS 버퍼에서 탈지유 Akt의 인산화되지 않은 (1 : 1000 희석, 세포 생존 마커로 사용됨), BCL-2 관련 X 단백질 (1 : 1000 희석, 프로 - 세포 사멸 단백질로 사용), 및 글리 세르 알데히드 -3- 포스페이트 탈수소 효소 (GAPDH 1 5 % 소 혈청 알부민으로 로딩 대조군으로 사용한 200 희석) (BSA), 및쉐이커에 4 ° C에서 하룻밤 멤브레인을 품어. </li><li> 세척 후 TBST로 3 회, 각 10 분간 세척을 5 % BSA에서 (10,000 희석 1) 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 - 결합 염소 항 - 토끼 항체를 사용하여 면역 반응성 밴드를 검출한다. </li><li> 실온에서 1 분 동안 웨스턴 블롯 루미놀 시약의 막 (6-7 mL의 10cm × 5cm 막) 부화. </li><li> 시약 용액으로부터 막을 제거, 플라스틱 시트 보호에 과잉 흡수 수건 액체과 장소를 제거합니다. </li><li> 안전한 빛 어두운 방에서 작업, 단백질면이 위를 향하게와 필름 카세트에 덮여 막 놓습니다. </li><li> 멤브레인 위에 X- 선 필름을 넣고 1 분 동안 노출. </li></ol> 5. 스크래치에 의한 세포 이동 (12)의 방향 상처 분석 평가 <ol><li> 생물 안전 캐비닛에서의 합류 문화의 잘의 표면을 멸균 피펫 팁을 드래그하여 상처를 만들HSP27 특정 siRNA를 형질 또는 스크램블 제어 siRNA를 형질 인체 각막 상피 ​​세포. </li><li> 바로 부상 후 부상 후 24 시간 동안 5 % CO 2 분위기로 37 ° C 배양기에서 BEGM 문화에서 그들을 1X 인산 완충 식염수 (PBS)로 두 번 세포를 씻어 유지한다. </li><li> 24 시간 부상 후 100 배의 배율로 직립 현미경을 사용하여 HCEC 이미지를 촬영하고 배경은 필터를 사용하여 병합 수행 이미지 분석 소프트웨어 명령어. </li><li> 선택 측정 명령을 사용하여 초기 상처의 끝과 끝에서 수직으로 커버 할 수있는 동일한 크기의 다각형과 관심 (AOI)의 영역을 정의하고, 각 샘플의 상처 지역에 세 가지 다른 AOI을 결정합니다. </li><li> 자동 카운트 / 크기 측정 메뉴 옵션을 사용하여 각 분야에서 세포 수를 계산. </li></ol> 세포 사멸 6. 유동 세포 계측법 분석 <ol><li> 문화 HSP27 특정 siRNA를 형질 및 제어의세포 BEGM 5 % CO 2 분위기로 37 ° C의 배양기에서 95 % 합류점에 도달 할 때까지 / 웰 6 웰 플레이트에 5 × 105 세포의 농도로 각 10 nM의 siRNA를 함유 인체 각막 상피 세포를 IRNA는 형질. </li><li> 1 ML의 피펫을 사용하여 5 15 ML 튜브에 분하고, 흡인 트립신 EDTA 900 XG에서 5 분, 원심 분리기 잘 당 2 ml의 0.25 % 트립신 - EDTA를 사용하여 인체 각막 상피 ​​세포를 분리합니다. </li><li> 차가운 PBS로 두 번 세포를 씻어 준 후 10 6 세포 / ml의 농도로 완충액 (0.1 M HEPES / NaOH로 [pH를 7.4, 1.4 M의 NaCl, 25 mM의 CaCl2를)를 결합 1X에서 세포를 재현 탁. </li><li> 5 ㎖의 배양 관 내로 세포 현탁액 (1 × 105 세포) 100 μL를 전송. </li><li> 5 μL를 형광 염료 - 복합 넥신 V 및 5 μL의 프로피 디움 아이오다 이드를 추가합니다. </li><li> 부드럽게 와동 세포 및 어둠 속에서 실온에서 15 분 동안이를 부화. </li><li> 흐름 C가 세포를 각 튜브에 1X 결합 버퍼의 200 μl를 추가하고 분석1 시간 내에 ytometer. </li></ol>

<ol>
	<li>Dua, H. S., Gomes, J. A., Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+epithelial+wound+healing.">Corneal epithelial wound healing.</a> Br. J. Ophthalmol. 78 (5), 401-408 (1994).</li><li>Estil, S., Primo, E. J., Wilson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+in+shed+human+corneal+cells.">Apoptosis in shed human corneal cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41 (11), 3360-3364 (2000).</li><li>Guay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+actin+filament+dynamics+by+p38+map+kinase-mediated+phosphorylation+of+heat+shock+protein+27.">Regulation of actin filament dynamics by p38 map kinase-mediated phosphorylation of heat shock protein 27.</a> J. cell. Sci. 110, 357-368 (1997).</li><li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+heat+shock+protein+mRNAs+under+in+vivo+glutathione+depletion+in+the+mouse+retina.">Differential expression of heat shock protein mRNAs under in vivo glutathione depletion in the mouse retina.</a> Neurosci. Lett. 413 (3), 260-264 (2007).</li><li>Rane, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+protein+27+controls+apoptosis+by+regulating+Akt+activation.">Heat shock protein 27 controls apoptosis by regulating Akt activation.</a> J. Biol. Chem. 278 (30), 27828-27835 (2003).</li><li>Shin, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+tumor+cell+migration+and+invasion+with+biphenyl+isoxazole+derivative+KRIBB3,+a+synthetic+molecule+that+inhibits+Hsp27+phosphorylation.">Blocking tumor cell migration and invasion with biphenyl isoxazole derivative KRIBB3, a synthetic molecule that inhibits Hsp27 phosphorylation.</a> J. Biol. Chem. 280 (50), 41439-41448 (2005).</li><li>Jain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+phosphorylated+heat+shock+protein+27+during+corneal+epithelial+wound+healing.">Expression of phosphorylated heat shock protein 27 during corneal epithelial wound healing.</a> Cornea. 31 (7), 820-827 (2012).</li><li>Alekseev, O. M., Richardson, R. T., Alekseev, O., O'Rand, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+expression+profiles+in+HeLa+cells+in+response+to+overexpression+or+siRNA-mediated+depletion+of+NASP.">Analysis of gene expression profiles in HeLa cells in response to overexpression or siRNA-mediated depletion of NASP.</a> Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 45 (2009).</li><li>Park, H. Y., Kim, J. H., Lee, K. M., Park, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+prostaglandin+analogues+on+tear+proteomics+and+expression+of+cytokines+and+matrix+metalloproteinases+in+the+conjunctiva+and+corea.">Effect of prostaglandin analogues on tear proteomics and expression of cytokines and matrix metalloproteinases in the conjunctiva and corea.</a> Exp. Eye. Res. 94 (1), 13-21 (2012).</li><li>Voegeli, T. S., Currie, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+knocks+down+Hsp27+and+increases+angiotensin+II-induced+phosphorylated+NF-kappaB+p65+levels+in+aortic+smooth+muscle+cells.">siRNA knocks down Hsp27 and increases angiotensin II-induced phosphorylated NF-kappaB p65 levels in aortic smooth muscle cells.</a> Inflamm. Res. 58 (6), 336-343 (2009).</li><li>Shi, B., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arsenite+pre-conditioning+reduces+UVB-induced+apoptosis+in+corneal+epithelial+cells+through+the+anti-apoptotic+activity+of+27+kDa+heat+shock+protein+(HSP27).">Arsenite pre-conditioning reduces UVB-induced apoptosis in corneal epithelial cells through the anti-apoptotic activity of 27 kDa heat shock protein (HSP27).</a> J. Cell. Physiol. 206 (2), 301-308 (2006).</li><li>Shen, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+corneal+epitheliotrophic+capacity+among+different+human+blood-derived+preparations.">Comparison of corneal epitheliotrophic capacity among different human blood-derived preparations.</a> Cornea. 30 (2), 208-214 (2011).</li><li>Song, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+protein+27+phosphorylation+is+involved+in+epithelial+cell+apoptosis+as+well+as+epithelial+migration+during+corneal+epithelial+wound+healing.">Heat shock protein 27 phosphorylation is involved in epithelial cell apoptosis as well as epithelial migration during corneal epithelial wound healing.</a> Exp Eye Res. 118 (1), 36-41 (2014).</li></ol>

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In this present study, we evaluated the potential role of HSP27 in corneal epithelial wounding using in vitro approaches. The critical steps involved siRNA transfection for HSP27 knock-down to observe the function of HSP27 in cells subjected to stress. Notably, a role for HSP27 was revealed by these experiments in epithelial cell migration and apoptosis during corneal epithelial wound healing. Unlike previous studies10 that used rat HSP27-specific siRNA to transfect vascular smooth muscle cells, we used a siRNA transfection technique to modify gene expression in human CECs to effectively knock-down HSP27-specific gene expression and study HSP27 function. Although there were differences in the target sequence that we used as well as in the cell density, final siRNA concentration, and incubation time, the protocol recommended by the manufacturer was explicitly followed. In terms of alternative methods, HSP27 knock-out mouse may be used to show if HSP27 phosphorylation involves epithelial migration and cell apoptosis. However, it is difficult to monitor the change of HSP27 phosphorylation in mouse model, because its phosphorylation occurs in very short period during epithelial wound healing.
There were several limitations to the present study. First, the in vitro environment in which we cultured human CECs certainly differed from the in vivo environment for human CECs, especially regarding cell survival. Second, the siRNA used in this study was not specific to the phosphorylated form of HSP27 as it affected the overall expression levels of HSP27, including both phosphorylated and non-phosphorylated forms.
In the future, a clinical application of these procedures would be to apply HSP27 to live human wounded corneas. We hope that the current findings will help to advance treatments of corneal epithelial tissue damage.

그들은 동시에 윤부 각막 상피 기저 층에서 세포로 대체하는 동안 각막 상피 세포 (CECs)이 지속적으로, 눈물 막으로 흘려된다. (1) 다양한 외부 스트레스가 CECs의 세포 사멸 및 박리를 유도 할 수 있습니다. 2 열 충격 단백질들 (HSPs) 고도로 보존되어 있으며, 분자의 크기에 따라 두 개 패밀리로 분할 될 수있다. (3) 최대 HSP 계열은 HSP90, HSP70, 및 HSP60 및 작은 가족 HSP27 포함을 포함한다. 4 HSP27의 인산화는 세포 생존에 중요한 역할을하는 것으로 알려져 때문에 굴지의 리모델링이 단백질의 역할의 세포 이동이 필요합니다. 5-7 따라서, 우리는 상피 상처 치유의 체외 모델에서 CEC 마이그레이션 및 세포 자멸사에서 HSP27 인산화의 잠재적 인 역할을 테스트하려고했습니다. RNA 간섭 (RNAi의) 작거나 짧은 간섭 RNA를 하나를 사용하여 (siRNA의)은 GE있다잠재적으로 허용하는 두 기초 및 응용 생물학 nerated 관심이 관심의 유전자의 발현이 노크 다운 될 수 있습니다. (8) 여기서, 우리는 CEC 상처 치유와 세포 자멸사에 대한 HSP27의 기여를 평가하기 위해 HSP27 특정 siRNA를 사용했다. 세포에서 유전자 노크 다운에 대한 기존의 RNAi 방법은 siRNA를을 만드는 조립 될 수있는 두 개의 수정되지 않은 21 메르 올리고 뉴클레오티드를 포함하는 합성 RNA 이중 가닥을 사용합니다. 우리가 본 연구에 사용 된 siRNA의 RNAi의 세포를 형질하는 간단하고 효율적인 방법이며,이 시약은 다양한 불멸화 세포주와 함께 작동한다. 이 연구에서는, 우리는 스크래치에 의한 방향 상처 분석, 웨스턴 블로 팅, siRNA를 형질 분석, 면역 형광 분석을 포함하여이 분석에 사용되는 방법을 설명하고, 유동 세포 계측법.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="767">
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:212px;">Biological safety cabinet</td>
			<td style="width:247px;">CHC LAB Co.Ltd,&#160; Daejeon, Republic of Korea&#160;</td>
			<td style="width:109px;">CHC-777A2-06</td>
			<td style="width:199px;">Class II, Type A2&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:212px;">Stealth RNAi&#8482; siRNA</td>
			<td style="width:247px;">Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:199px;">RNAi siRNA; scrambled control-siRNA and HSP27-specific siRNA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:212px;">BEGMTM</td>
			<td style="width:247px;">Lonza, Inc., Walkersville, MD</td>
			<td style="width:109px;">CC-3171, CC4175</td>
			<td style="width:199px;">Bronchial epithelium growth medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:212px;">Protease inhibitor&#160;</td>
			<td style="width:247px;">Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO</td>
			<td style="width:109px;">P8340 ,P7626</td>
			<td style="width:199px;">1 uM Pepstatin A, 1 uM Leupetin, 0.1 uM Aprotin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:212px;">Bradford protein assay&#160;</td>
			<td style="width:247px;">Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td style="width:109px;">#500-0001</td>
			<td style="width:199px;">Bradford protein assay&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:212px;">Nitrocellulose filters&#160;</td>
			<td style="width:247px;">Amersham, Little Chalfont, UK</td>
			<td style="width:109px;">RPN3032D</td>
			<td style="width:199px;">Western blotting membrane</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:212px;">Non-phosphorylated HSP27&#160;</td>
			<td style="width:247px;">Abcam Inc., Cambridge, MA</td>
			<td style="width:109px;">ab12351</td>
			<td style="width:199px;">1:1000 dilution (Total HSP27)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:212px;">Phosphorylated HSP27 (Ser85)</td>
			<td style="width:247px;">Abcam Inc., Cambridge, MA</td>
			<td style="width:109px;">ab5594</td>
			<td style="width:199px;">1: 1000 dilution HSP27 was phosphorylated at Ser85</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Lipofectamine&#174; RNAiMAX reagent&#160;</td>
			<td style="width:247px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:109px;">13-778-075</td>
			<td style="width:199px;">Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:212px;">Phosphorylated Akt (Ser473)</td>
			<td style="width:247px;">Cell Signaling Technology, Danvers, MA</td>
			<td style="width:109px;">No. 4060</td>
			<td style="width:199px;">1: 1000 dilution Akt was phosphorylated at Ser473 (cell survival marker)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:212px;">Non-phosphorylated Akt&#160;</td>
			<td style="width:247px;">Cell Signaling Technology, Danvers, MA</td>
			<td style="width:109px;">No. 4061</td>
			<td style="width:199px;">1:1000 dilution (Total Akt)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:212px;">Bcl-2-associated X protein&#160;</td>
			<td style="width:247px;">Cell Signaling Technology, Danvers, MA</td>
			<td style="width:109px;">No. 4062</td>
			<td style="width:199px;">1: 1000 (anti-apoptotic protein marker)</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:212px;">GAPDH</td>
			<td style="width:247px;">Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA</td>
			<td style="width:109px;">No. 4063</td>
			<td style="width:199px;">1:1000 loading control&#160; marker (house keeping gene)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:212px;">Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies</td>
			<td style="width:247px;">Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td>
			<td style="width:109px;">NCI1460KR</td>
			<td style="width:199px;">1:10000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:212px;">OPTI-MEM</td>
			<td style="width:247px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:109px;">31985</td>
			<td style="width:199px;">reduced serum medium for transfection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:212px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:247px;">Olympus, Inc., Tokyo, Japan</td>
			<td style="width:109px;">Image-Pro Plus 5.0</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:212px;">Skimed milk powder&#160;</td>
			<td style="width:247px;">Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlstruhe, Germany</td>
			<td style="width:109px;">T145.2</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:212px;">Tris&#160;</td>
			<td style="width:247px;">Amresco LCC, Inc. Solon, OH</td>
			<td style="width:109px;">No-0497</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:212px;">Sodium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:247px;">Amresco LCC, Inc. Solon, OH</td>
			<td style="width:109px;">No-0241</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:212px;">Six well culture plate</td>
			<td style="width:247px;">Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td>
			<td style="width:109px;">140675</td>
			<td style="width:199px;">35.00 mm diameter / well</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:212px;">24-well culuture dish</td>
			<td style="width:247px;">Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td>
			<td style="width:109px;">142475</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:212px;">Orbital shaker</td>
			<td style="width:247px;">N-Bioteck, Inc., Seoul, South Korea</td>
			<td style="width:109px;">NB1015</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:212px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:247px;">Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA</td>
			<td style="width:109px;">sc-2323&#160;</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:212px;">BDFACSCantoTM II</td>
			<td style="width:247px;">BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:199px;">Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:212px;">X-Ray Film</td>
			<td style="width:247px;">Kodak, Rochester, NY</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:199px;">Medical X-Ray Cassette with Green 400 Screen&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:212px;">western blotting luminol reagent</td>
			<td style="width:247px;">Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA</td>
			<td style="width:109px;">sc-2048&#160;</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:212px;">FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I</td>
			<td style="width:247px;">BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td style="width:109px;">556547</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna interference-based investigation of the function of heat shock protein 27 during corneal epithelial wound healing

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a synthetic RNA duplex created to specifically target a mRNA transcript to induce its degradation and it has been used to identify novel pathways in various cellular processes. Few reports exist regarding the role of phosphorylated heat shock protein 27 (HSP27) in corneal epithelial wound healing. Herein, cultured human corneal epithelial cells were divided into a scrambled control-siRNA transfected group and a HSP27-specific siRNA-transfected group. Scratch-induced directional wounding assays, and western blotting, and flow cytometry were then performed. We conclude that HSP27 has roles in corneal epithelial wound healing that may involve epithelial cell apoptosis and migration. Here, step-by-step descriptions of sample preparation and the study protocol are provided.

인산화 HSP27의 발현은 크게 5, 10로 증가하고, 처음 30 분 후에는 13 unwounded 인체 각막 상피 세포에 비하여 부상. 웨스턴 블롯 분석 Bax의 발현이 크게 HSP27 특정 siRNA를 형질 인체 각막 상피 세포 (그림 1A-E)에서 증가하는 반면 인산화 HSP27과 인산화 된 Akt의 발현이 모두 유의하게 감소 된 것으로 나타났습니다. 인산화 HSP27의 발현을 30 % 40 10 뉴 멕시코 % 및 HSP27 고유의 50 nm의 siRNA를 형질 감염된 세포를 각각 제어 siRNA를 형질 세포 있지만 인산화 HSP27의 발현에 비해 감소되지 않았다 (도 1A-B로 감소시켰다 ). 또한, 비 인산화 HSP27의 발현은 10 nM 내지 20 % 및 30 % 감소 하였다 siRNA를 형질 감염된 세포에 각각하지만 비 인산화 HSP27의 발현이 감소되지 않았다 (도 1a HSP27 별 및 C의 50 nM의 &lt;/ STRONG&gt;). 스크래치에 의한 방향 상처 분석은 상처, HSP27 특정 siRNA를 형질 세포 후 24 시간에서 10, 50 nM의 마이그레이션 (그림 2) 감소 나타내었다 것으로 나타났다. 또한, HSP27 특정 siRNA의 형질 인체 각막 상피 세포는 유동 세포 계측법에 의해 스크램블링 된 제어 siRNA를 형질 세포 (도 3)에 비해 더 많은 세포 사멸 및 괴사 성 세포 사멸을 시행 하였다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54280/54280fig1.jpg" /> 인산화 HSP27 (p-HSP27) 비 인산화 HSP27 (비 P-HSP27), 인산화 된 Akt (Akt 인산화)는 세포 생존 마커로서 Akt의 비 인산화에 대한 항체를 사용하여도 1 웨스턴 블롯 분석 (비 P-된 Akt), BCL-2eassociated X 단백질 프로 - 세포 사멸 단백질로 (백스), 및 GAPDH (A). 비 인산화, 인산화 및 HSP27의 발현 및<html> 제어 siRNA를 형질 감염된 세포에서 관찰되는 것과 비교 그러나 Bax의 발현은 유의하게 상기 HSP27 특이 적 siRNA를 형질 인체 각막 상피 세포 (E)의 증가 - (D B) (모두 p &lt;0.05), 인산화 된 Akt 크게 감소 하였다. 인산화 HSP27의 발현을 30 %와 10 nm의 40 %를 각각 모의 제어와 비교 HSP27 고유의 50 nM의 siRNA를 형질 감염된 세포에 의해 감소되었지만, 인산화 HSP27의 발현은 10 nM의 감소 및 제어 siRNA를 50 nM의되지 -transfected 세포 (B). **, *; †, ††; ‡, ‡‡; §§, § : 집단 간 통계적으로 유의 한 차이 (p &lt;0.05). 오차 막대는 표준 편차 (SD)를 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54280/54280fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> &quot;&gt; <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54280/54280fig2.jpg" /> 그림 2. siRNA를 형질 인체 각막 상피 세포에 부상 후 세포 이동을 평가하는 방향 상처 분석을 스크래치는 유도. 스크래치 상처는 제어 및 HSP27 특정 siRNA를 형질 세포 (A)에서 만들어졌습니다. 세포는 &#39;드래그&#39;영역에서 제거되었습니다. 상처 후 24 시간에서, HSP27 특정 siRNA를 형질 감염된 세포를 10 내지 50nm가 10 내지 50nm 제어 siRNA를 형질 세포 (B)에 비하여 세포 이주 낮은 수치를 나타내었다. ** 및 * 그룹들 사이에 통계적으로 유의 한 차이 (p &lt;0.05)를 나타냅니다. 데이터는 ± 표준 편차를 의미있다. 도시 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54280/54280fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54280/54280fig3.jpg" /> &lt;스크램블 siRNA의 제어 및 아 넥신 V 및 PI (A 및 B)로 표지 HSP27 특정 siRNA의 형질 각막 상피 세포 (인체 각막 상피 세포)를 50 nm 인 BR /&gt;도 3 유세포. 사분면의 전체 세포의 비율은 늦게 사멸 세포 (아 넥신 V 양성과 PI 양성 세포, Q2, 오른쪽), (Q4, 오른쪽 아래, 아 넥신 V 양성과 PI-음성 세포) 초기 사멸 세포에 맞습니다 .. 및 괴사 세포 (아 넥신 V-부정과 PI 양성 세포, Q1, 왼쪽 위). HSP27 특정 siRNA를-트랜의 인체 각막 상피 세포는 siRNA를 형질 세포를 제어보다 더 많은 세포 자멸사 및 괴사 세포 사멸을 가지고 있었다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54280/54280fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

Herein, we present a protocol to use heat shock protein 27 (HSP27)-specific small interfering RNA to assess the function of HSP27 during corneal epithelial wound healing. RNA interference is the best method for effectively knocking-down gene expression to investigate protein function in various cell types.

각막 상피 ​​창상 치유 기간 동안 열 충격 단백질 27의 기능의 RNA 간섭 기반 조사

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

rna-interference-based-investigation-function-heat-shock-protein-27

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

7.4K 조회수.  Saevit Eye Hospital. Herein, we present a protocol to use heat shock protein 27 (HSP27)-specific small interfering RNA to assess the function of HSP27 during corneal epithelial wound healing. RNA interference is the best method for effectively knocking-down gene expression to investigate protein function in various cell types.

비디오: RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase activity. Although TERT is named as a reverse transcriptase, structural and phylogenetic analyses of TERT demonstrate that TERT is a member of right-handed polymerases, and relates to viral RNA-dependent RNA polymerases (RdRPs) as well as viral reverse transcriptase. We firstly identified RdRP activity of human TERT that generates complementary RNA stand to a template non-coding RNA and contributes to RNA silencing in cancer cells. To analyze this non-canonical enzymatic activity, we developed RdRP assay with recombinant TERT in 2009, thereafter established in vitro RdRP assay for endogenous TERT. In this manuscript, we describe the latter method. Briefly, TERT immune complexes are isolated from cells, and incubated with template RNA and rNTPs including radioactive rNTP for RdRP reaction. To eliminate single-stranded RNA, reaction products are treated with RNase I, and the final products are analyzed with polyacrylamide gel electrophoresis. Radiolabeled RdRP products can be detected by autoradiography after overnight exposure.

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) synthesizes not only telomeric DNA but also double-stranded RNA through RNA-dependent RNA polymerase activity. Here, we describe a newly established assay to detect RNA-dependent RNA polymerase activity of endogenous TERT.

인간의 Telomerase 역전사 단백질의 RNA 의존 RNA 중 합 효소 활동의 반 정량적 검출

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

연구

유전학

Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in production or degradation of RNA. This protocol describes a method for measurement of RNA production, using 5-Bromouridine labelling of RNA followed by immunoprecipitation, which enables investigation of RNA synthesized within a short timeframe (e.g., 1 h). The advantage of 5-Bromouridine-labelling and immunoprecipitation over the use of toxic transcriptional inhibitors, such as &#945;-amanitin and actinomycin D, is that there are no or very low effects on cell viability during short-term use. However, because 5-Bromouridine-immunoprecipitation only captures RNA produced within the short labelling time, slowly produced as well as rapidly degraded RNA can be difficult to measure by this method. The 5-Bromouridine-labelled RNA captured by 5-Bromouridine-immunoprecipitation can be analyzed by reverse transcription, quantitative polymerase chain reaction, and next generation sequencing. All types of RNA can be investigated, and the method is not limited to measuring mRNA as is presented in this example.

This method can be used to measure RNA synthesis. 5-Bromouridine is added to cells and incorporated into synthesized RNA. RNA synthesis is measured by RNA extraction immediately after labelling, followed by 5-Bromouridine-targeted immunoprecipitation of labelled RNA and analysis by reverse transcription and quantitative polymerase chain reaction.

5-Bromouridine 라벨 및 Immunoprecipitation를 사용 하 여 RNA 합성의 조사

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding RNA&#39;s family. Although their biological functions remain largely unknown, the number of these lncRNAs has steadily increased and it is now estimated that humans may have more than 10,000 such transcripts. Some of these are known to be involved in important regulatory pathways of gene expression which take place at the transcriptional level, but also at different steps of RNA co- and post-transcriptional maturation. In the latter cases, RNAs that are targeted by the lncRNA have to be identified. That&#39;s the reason why it is useful to develop a method enabling the identification of RNAs associated directly or indirectly with a lncRNA of interest.
This protocol, which was inspired by previously published protocols allowing the isolation of a lncRNA together with its associated chromatin sequences, was adapted to permit the isolation of associated RNAs. We determined that two steps are critical for the efficiency of this protocol. The first is the design of specific anti-sense DNA oligonucleotide probes able to hybridize to the lncRNA of interest. To this end, the lncRNA secondary structure was predicted by bioinformatics and anti-sense oligonucleotide probes were designed with a strong affinity for regions that display a low probability of internal base pairing. The second crucial step of the procedure relies on the fixative conditions of the tissue or cultured cells that have to preserve the network between all molecular partners. Coupled with high throughput RNA sequencing, this RNA pull-down protocol can provide the whole RNA interactome of a lncRNA of interest.

This RNA pull-down method allows identifying the RNA targets of a long non-coding RNA (lncRNA). Based on the hybridization of home-made, designed anti-sense DNA oligonucleotide probes specific to this lncRNA in an appropriately fixed tissue or cell line, it efficiently allows the capture of all RNA targets of the lncRNA.

오래 비 코딩 RNA의 RNA 표적 식별에 RNA 풀 다운 절차

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand genome maintenance mechanisms. Since recruitment and exchange of proteins at lesions are highly dynamic, their study requires the ability to generate DNA damage in a rapid and spatially-delimited manner. Here, we describe procedures to locally induce DNA damage in human cells using a commonly available laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser line. Accumulation of genome maintenance factors at laser stripes can be assessed by immunofluorescence (IF) or in real-time using proteins tagged with fluorescent reporters. Using phosphorylated histone H2A.X (&#947;-H2A.X) and Replication Protein A (RPA) as markers, the method provides sufficient resolution to discriminate locally-recruited factors from those that spread on adjacent chromatin. We further provide ImageJ-based scripts to efficiently monitor the kinetics of protein relocalization at DNA damage sites. These refinements greatly simplify the study of the DDR dynamics.

Studying DNA damage repair kinetics requires a system to induce lesions at defined sub-nuclear regions. We describe a method to create localized double-stranded breaks using a laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser and provide automated procedures to quantify the dynamics of repair factors at these lesions.

단백질 DNA 장애 405 Nm 레이저 마이크로 방사선 조사를 사용 하 여 채용의 조사

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

감수 분열 동안 인간 유전자 기능을 평가 하기 위해 마우스 Oocytes를 사용 하 여 나

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame (ORF) annotation impose two arbitrary criteria: a minimum length of 100 codons and a single ORF per transcript. However, a growing number of studies report expression of proteins from allegedly non-coding regions, challenging the accuracy of current genome annotations. These novel proteins were found encoded either within non-coding RNAs, 5' or 3' untranslated regions (UTRs) of mRNAs, or overlapping a known coding sequence (CDS) in an alternative ORF. OpenProt is the first database that enforces a polycistronic model for eukaryotic genomes, allowing annotation of multiple ORFs per transcript. OpenProt is freely accessible and offers custom downloads of protein sequences across 10 species. Using OpenProt database for proteomic experiments enables novel proteins discovery and highlights the polycistronic nature of eukaryotic genes. The size of OpenProt database (all predicted proteins) is substantial and need be taken in account for the analysis. However, with appropriate false discovery rate (FDR) settings or the use of a restricted OpenProt database, users will gain a more realistic view of the proteomic landscape. Overall, OpenProt is a freely available tool that will foster proteomic discoveries.

OpenProt is a freely accessible database that enforces a polycistronic model of eukaryotic genomes. Here, we present a protocol for the use of OpenProt databases when interrogating mass spectrometry datasets. Using OpenProt database for analysis of proteomic experiments allows for discovery of novel and previously undetectable proteins.

질량 분석 기반 Proteomics 분석 소설 단백질을 공개할 OpenProt 데이터베이스를 사용 하 여 비 정식 열려있는 독서 프레임에서 번역

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

박테리아에서 단백질 RNA 결합을 정량화하기위한 분석

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT employs two purification steps. First, immunoprecipitation of a tagged RNP subunit is followed by mild RNase digestion and subsequent non-denaturing affinity elution. A second immunoprecipitation of another RNP subunit allows for enrichment of a defined complex. Following a denaturing elution of RNAs and proteins, the RNA footprints are converted into high-throughput DNA sequencing libraries. Unlike the more popular ultraviolet (UV) crosslinking followed by immunoprecipitation (CLIP) approach to enrich RBP binding sites, RIPiT is UV-crosslinking independent. Hence RIPiT can be applied to numerous proteins present in the RNA interactome and beyond that are essential to RNA regulation but do not directly contact the RNA or UV-crosslink poorly to RNA. The two purification steps in RIPiT provide an additional advantage of identifying binding sites where a protein of interest acts in partnership with another cofactor. The double purification strategy also serves to enhance signal by limiting background. Here, we provide a step-wise procedure to perform RIPiT and to generate high-throughput sequencing libraries from isolated RNA footprints. We also outline RIPiT&#39;s advantages and applications and discuss some of its limitations.

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Here, we present a protocol to enrich endogenous RNA binding sites or &#34;footprints&#34;&#160;of RNA:protein (RNP) complexes from mammalian cells. This approach involves two immunoprecipitations of RNP subunits and is therefore dubbed RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT).

RNA의 발자국 의 식별:연속RNA 면역 침전을 통한 단백질 복합체 시퀀싱 (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding sites for transcriptional regulators to modulate gene expression. Alterations of CREs have been implicated in various diseases including cancer. While promoters and enhancers have been the primary CREs for studying gene regulation, very little is known about the role of silencer, which is another type of CRE that mediates gene repression. Originally identified as an adaptive immunity system in prokaryotes, CRISPR/Cas9 has been exploited to be a powerful tool for eukaryotic genome editing. Here, we present the use of this technique to delete an intronic silencer in the human RUNX1 gene and investigate the impacts on gene expression in OCI-AML3 leukemic cells. Our approach relies on electroporation-mediated delivery of two preassembled Cas9/guide RNA (gRNA) ribonucleoprotein (RNP) complexes to create two double-strand breaks (DSBs) that flank the silencer. Deletions can be readily screened by fragment analysis. Expression analyses of different mRNAs transcribed from alternative promoters help evaluate promoter-dependent effects. This strategy can be used to study other CREs and is particularly suitable for hematopoietic cells, which are often difficult to transfect with plasmid-based methods. The use of a plasmid- and virus-free strategy allows simple and fast assessments of gene regulatory functions.

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Direct delivery of preassembled Cas9/guide RNA ribonucleoprotein complexes is a fast and efficient means for genome editing in hematopoietic cells. Here, we utilize this approach to delete a RUNX1 intronic silencer and examine the transcriptional responses in OCI-AML3 leukemic cells.

급성 골수성 백혈병 세포에서 CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질에 의한 RUNX1 내성 소음기의 전사 적 역할 조사

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

Analyzing Satellite Cell Function During Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injury and Injection of Self-delivering siRNA In Vivo

Skeletal muscle possesses an enormous capacity to regenerate after injury. This process is mainly driven by muscle stem cells, also termed satellite cells. Satellite cells are characterized by the expression of the transcription factor Pax7 and their location underneath the basal lamina in the resting skeletal muscle. Upon injury, satellite cells get activated, undergo self-renewal or differentiation to either form new myofibers or to fuse with damaged ones. The functionality of satellite cells in vivo can be investigated using a cardiotoxin based injury model of skeletal muscle. To study the function of one gene during the regeneration of skeletal muscle, transgenic mouse models are mostly used. Here, we present an alternative method to transgenic mice, to investigate the gene function in satellite cells during regeneration, e.g., in cases where transgenic mice are not available. We combine the cardiotoxin mediated injury of a specific skeletal muscle with the injection of a self-delivering siRNA into the regenerating muscle which is then taken up by satellite cells among other cells. Thereby, we provide a method to analyze gene function in satellite cells during regeneration under physiological conditions without the need for transgenic mice.

We describe an in vivo method to investigate the functional loss of a specific gene in satellite cells by using a combination of cardiotoxin mediated injury of skeletal muscle and the injection of a self-delivering siRNA.

심장 독소 부상에 의한 골격 근육 재생 중 위성 세포 기능 분석 및 생체 내 자체 전달 siRNA 주입

Skeletal muscle possesses an enormous capacity to regenerate after injury. This process is mainly driven by muscle stem cells, also termed satellite ...

각막 상피 창상 치유 기간 동안 열 충격 단백질 27의 기능의 RNA 간섭 기반 조사

요약

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인간의 Telomerase 역전사 단백질의 RNA 의존 RNA 중 합 효소 활동의 반 정량적 검출

5-Bromouridine 라벨 및 Immunoprecipitation를 사용 하 여 RNA 합성의 조사

오래 비 코딩 RNA의 RNA 표적 식별에 RNA 풀 다운 절차

단백질 DNA 장애 405 Nm 레이저 마이크로 방사선 조사를 사용 하 여 채용의 조사

감수 분열 동안 인간 유전자 기능을 평가 하기 위해 마우스 Oocytes를 사용 하 여 나

질량 분석 기반 Proteomics 분석 소설 단백질을 공개할 OpenProt 데이터베이스를 사용 하 여 비 정식 열려있는 독서 프레임에서 번역

박테리아에서 단백질 RNA 결합을 정량화하기위한 분석

RNA의 발자국 의 식별:연속RNA 면역 침전을 통한 단백질 복합체 시퀀싱 (RIPiT-Seq)

급성 골수성 백혈병 세포에서 CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질에 의한 RUNX1 내성 소음기의 전사 적 역할 조사

심장 독소 부상에 의한 골격 근육 재생 중 위성 세포 기능 분석 및 생체 내 자체 전달 siRNA 주입

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