This work was supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research (B) and a Grant-in Aid for Scientific Research on Innovative Areas 'Systems Molecular Ethology' from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT) of Japan. T.U. was the recipient of a Grant-Aid from the Japan Society for the Promotion of Science for Young Scientists.

단일 코호트 식민지 1. 준비 <ol><li> 세 꿀벌 식민지 두 개의 단일 코호트 식민지를 만들려면 새로 등장 노동자의 충분한 수를 얻기 위해를 준비합니다. <ol><li> 콤에 덮인 주변 세포의 일부 번데기는 갈색 눈과 핀셋을 사용하여 출장 빗를 열어 착색 된 표피가 있는지 확인합니다. 이 번데기 주변 콤 세포에 존재하는 경우, 전체의 빗 번데기 대부분 약 1~3일을에 등장 할 것이다. </li><li> 그 후, 모든 부착 성인 꿀벌이 브러시로 제거 된 후 이러한 번데기가 포함 된 빗를 수집하고 식민지 사이의 변동성을 최소화하기 위해 세 개의 식민지에서 빗 섞는다. </li></ol></li><li> 빈 하이브 상자에 수집 된 빗를 놓고 습한 조건에서 33 ° C (&gt; 60 % 상대 습도)에 품어. 수집 된 빗에서 삼일 (식민지 3,000 근로자)을 통해 약 6,000 새롭게 등장 근로자를 수집합니다. </li><li> worke의의 양을 결정오 새롭게 등장 노동자의 중량을 기준으로 R은 임의로 조작되지 식민지에서 수집. <ol><li> 무작위로 저울을 사용하여 조작되지 식민지에서 수집 한 다섯 새롭게 등장 노동자의 무게를. 참고 : 다섯 새롭게 등장 근로자의 무게는 일반적으로 500-600 밀리그램이다. </li><li> 오 새롭게 등장 근로자의 평균 무게에 의해 수집 된 노동자의 무게를 나누어 수집 된 노동자의 양을 추정한다. </li></ol></li><li> 수성 포스터 페인트 마커를 사용하여 약 1,800 근로자 (식민지 당 900 노동자)의 흉곽에 페인트 자국을 적용합니다. 참고 : 빨 마커 페인트를 적용하는 데 사용되는 재료의 표에 나열되어 있습니다. </li><li> 두 빗, 한 빗 포함 꿀, 보존 식품 등의 꽃가루와 알을 낳는 여왕에 의해 또 다른 빈 빗 포함 된 새 하이브 상자에 여왕 약 3,000 0-2일 된 근로자를 소개합니다. 꿀과 꽃가루 FR이 포함 된 빗를 수집톰 모든 부착 꿀벌 후 다른 조작되지 식민지가 제거됩니다. 참고 : 핵 하이브 상자 (소형 하이브 상자)의 사용을 권장합니다. </li><li> 단일 코호트 식민지를 만든 후 6 ~ 8 일 페인트 마크 간호사 꿀벌과 조숙 한 초지를 수집합니다. <ol><li> , 간호사 꿀벌 수집 한 무리 돌봐 빗 세포에 머리를 넣어 노동자를 선택합니다. 많은 무리와 성인 근로자를 포함 빗에서 간호사 꿀벌을 수집 핀셋을 사용합니다. 참고 : 단계 1.7에 설명 된대로 해부 할 때 수집 된 근로자의 HPGs이 개발하는 경우, 이러한 노동자들은 간호사 꿀벌로 정의됩니다. 핀셋으로 흉곽을 잡고하는 콤 근로자를 선택하는 것이 좋습니다. </li><li> 초지를 수집하려면, 자신의 뒷다리에 꽃가루 부하 자신의 두드러기로 돌아 근로자를 캡처하는 곤충 그물을 사용합니다. 참고 : 단계 1.7에 설명 된대로 해부 할 때 캡처 노동자의 HPGs이 수축 나타날 경우 해당 근로자는 초지로 정의됩니다. </li></ol></li><li> CLAS세 그룹, &#39;개발&#39;, &#39;중간&#39;으로 HPG를 sify하고, 실체 현미경 아래에서 절개하여 &#39;말라 비틀어 진&#39;. <ol><li> 꿀벌 비행 또는 걸을 수있을 때까지 10 ~ 15 분 동안 냉장고에 곤충 케이지에서 10 ~ 15 벌을 마취. 그런 다음 얼음에 꿀벌을 이동하고 5 분 동안 얼음에 마취를 완료합니다. 참고 : 마취를 달성하기 위해 총 15 ~ 20 분 정도 걸립니다. 마취 시간을 단축 할 필요가있을 때에는 케이지 벌 수 케이지 당 1-3 꿀벌로 감소되어야한다. </li><li> 가위와 핀셋으로 몸에서 머리를 해부하다. 핀 페트리 접시에 배치 치과 왁스에 머리를 고정합니다. 머리를 해결하기 위해 안테나의 기지에 두 개의 핀을 삽입합니다. 곤충 생리 식염수 (130 mM의 염화나트륨, 5 밀리미터의 KCl, 1 mM의 염화칼슘 2)에 고정 된 머리를 만끽 해보세요. </li><li> 쌍안 현미경 미세 핀셋을 사용하여 머리와 수술 용 칼의 표피의 앞쪽 부분을 제거합니다. 주 : HPGs 용이 C 제거한 후 헤드에 있습니다uticle. HPG는 머리에 뇌의 주위에 존재하는 botryoid 기관이다. </li><li> 표피 아래에 흰 막질 조직되는 기관 조직을 제거합니다. 그런 다음 천천히 족집게로 당겨 머리에서 HPGs을 해부하다. </li><li> &#39;개발&#39;과 같은 대형 원형 꽈리와 HPGs를 분류. &#39;말라 비틀어 진&#39;작은 왜곡 꽈리와 HPGs를 분류. HPGs이 &#39;중간&#39;으로도 &#39;개발&#39;이나 &#39;말라 비틀어 진&#39;에 해당하는 분류. 참고 : HPG 상태의 세 가지 클래스가 그림 2에 표시되어 보여 대표 사진. </li><li> 주제 &#39;개발&#39;과 같은 RNA 추출에 &#39;말라 비틀어 진&#39;HPGs 각각과 간호사 꿀벌과 초지 (4 절) 사이의 HPGs에서 유전자 발현을 비교하는 &#39;간호사 꿀벌 HPGs&#39;와 &#39;사일리지 콤바인 HPGs&#39;. </li></ol></li></ol> 20E 2. 주입 <ol><li> DESCR 전형적인 식민지에서 간호사 꿀벌 수집절차 1.6.1에서 ibed. 참고 : 꿀벌을 사육하는 바와 같이 HPGs이 꿀벌에 검사 할 수 없습니다. </li><li> 냉장고 (안 얼음)에서 4 ° C에서 꿀벌을 마취. 참고 : 마취를 달성하기 위해 약 30 분 소요됩니다. 마취 시간이 단축되는 경우, 케이지 벌 수 케이지 당 1-3 꿀벌로 감소되어야한다. </li><li> 핀셋을 사용하여 페트리 접시에 배치 치과 왁스에 꿀벌을 고정. </li><li> 유리 바늘 풀러를 사용하여 보정 된 모세관 마이크로 피펫으로부터 이루어지는 분사구를 사용하여 헤드의 전방 측면에 20E 액 1 μl를 주입한다. <ol><li> 에탄올 곤충 식염수 (130 mM의 염화나트륨, 5 밀리미터의 KCl, 1 mM의 염화칼슘 2) 혼합물 (20E)를 용해 (1 : 4) 2.5 μg의에서 / μL. </li><li> 고무 튜브에 분사구를 연결 관의 양측에 옐로우 마이크로 피펫 팁을 연결한다. </li><li> 은 마이크로 피펫을 사용하여 파라 필름에 20E 솔루션 1 μl를 놓고 입에 노란색 마이크로 피펫 팁을 개최분사구로 용액을 그리 거라고. </li><li> 안테나의 기본에 주입 팁을 삽입하고 노란색 마이크로 피펫 팁을 통해 불어 솔루션을 주입. 주 :이 단계에 도시 된 프로토콜은 대표적인 주입 방법이지만, 자동 주입 장치의 사용이 20 필요한 안전 권장된다. </li></ol></li><li> 후면은 1 ~ 3 일 동안 어둡고 습한 조건 (&gt; 60 % 상대 습도)에서 33 ~ 36 ℃에서 곤충 케이지에 주입 된 꿀벌 (이상적인 온도는 35 ° C)입니다. 공급 꿀 - 물 혼합물 (1 : 1) 꿀벌에. 필요한 경우, 주사 후 꿀벌 생존 계산합니다. </li></ol> Methoprene 3. 응용 프로그램 <ol><li> 모든 부착 성인 꿀벌이 브러시로 제거 후 전형적인 식민지에서 번데기가 포함 된 빗를 수집합니다. 33 ~ 36 ℃에서 콤을 품어 일일 최대를위한 다습 한 조건에서 (&gt; 60 % 상대 습도) (이상적인 온도는 35 ° C)입니다. </li><l난&gt; 수집 된 빗에서 새로 등장 꿀벌 수집 및 단일 코호트 식민지를 준비하기위한 프로토콜에 설명 된 포스터 페인트를 사용하여 흉곽에 페인트 자국을 적용합니다. 그들의 식민지로 표시 꿀벌을 돌려줍니다. </li><li> 육일 후, 식민지에서 (6 일 이전) 그린 근로자를 수집합니다. 핀셋으로 자신의 흉곽을 잡고 빗에서 그린 근로자를 선택합니다. </li><li> 절차 2.2에서와 같이 (안 얼음) 냉장고에 4 ° C에서 꿀벌을 마취. 핀셋을 사용하여 페트리 접시에 배치 치과 왁스에 꿀벌을 고정 및 마이크로 피펫을 사용하여 머리에 아세톤에 용해 methoprene 용액 (50-250 μg의 / μL)의 1-5 μl를 적용합니다. 아세톤에 내성 필터 팁을 사용합니다. 참고 : 아세톤 죽음에 이르는 꿀벌에 유해한 영향을 미칠 수 있습니다. 꿀벌의 높은 사망률이 관찰되는 경우, 최소 1 μL로 아세톤의 양의 감소가 권장된다. </li><li> 후면 33 ~ 36 °의 C (이상적인 t에서 곤충 케이지에서 꿀벌럼 온은 어둡고 습한 조건에서 7 일간 35 ° C) (&gt; 60 % 상대 습도)입니다. 공급 꿀 - 물 혼합물 (1 : 1) 꿀벌에. 필요한 경우, 국소 적용 후 꿀벌 생존 계산합니다. 참고 :이 기사에서는 생존 꿀벌 7 일 응용 프로그램 (표 3) 후 계산됩니다. </li></ol> 4. RNA 추출 및 정량적 RT-PCR <ol><li> 꿀벌 마취 및 1.7.4에 단계 1.7.1에 설명 된대로 HPGs을 해부하다. </li><li> 사용할 때까지 -80 ° C에서 드라이 아이스와 저장소에 microcentrifuge 관에서 해부 HPGs를 수집합니다. </li><li> 단백질 변성을위한 시약 400 μl를 추가합니다. 참고 :이 시약 (재료의 표 참조) 상업적으로 사용할 수 있습니다. </li><li> 미세 원심 관 내부에 맞는 균질화 유봉과 전기 믹서 핸드 헬드를 사용하여 HPG 조직을 균질화. 끊는 얼음를 Lyse 조직 세포에 1 분 동안 약 300 rpm의 회전 속도로 균질화시킨다. (재료의 표 참조). </li><li> 80 μl의 클로로포름을 넣고 잘 섞는다. RT에서 5 분 동안 인큐베이션. </li><li> 4 ℃에서 15 분 동안 14,170 XG에서의 microcentrifuge 튜브를 원심 분리기. 새로운 튜브로 수성 단계를 전송합니다. 이소프로판올 1 μL 글리코겐 (5 ㎎ / ㎖)의 동일한 볼륨을 추가합니다. 적어도 20 분 동안 -20 ℃에서 인큐베이션. </li><li> 4 ° C에서 10 분 동안 14,170 XG에서의 microcentrifuge 튜브를 원심 분리기와 뜨는을 제거합니다. </li><li> 펠렛에 75 % 에탄올 400 μl를 추가하고 잘 혼합, 4 ° C에서 15 분 동안 14,170 XG에서의 microcentrifuge 튜브를 원심 분리하고, 상층 액을 제거합니다. 한 번 더이 절차를 반복합니다. </li><li> 5-10 분 동안 펠렛을 공기 - 건조 후, 10 μL의 RNase가없는 물에 녹인다. 참고 : 펠렛의 완전 건조가 물에 RNA 펠렛의 불용 화의 원인이 될 수 있습니다. 따라서, 약간 젖은 펠렛은 적합용해. </li><li> NanoDrop 또는 유사한 같은 분광 광도계를 사용하여 RNA 농도를 측정한다. </li><li> 어떤 오염 게놈 DNA를 분해하기 위해 30 분 동안 37 ℃에서 배양에서의 DNase I의 2.0 U와 총 RNA의 500 NG를 취급합니다. </li><li> 역 전사의 DNase I 처리 RNA 200 NG 및 시판되는 키트를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여 유전자 특이 적 프라이머 (mrjp2 (재료 및 시약의 테이블의 목록 참조) 5&#39;-AAATGGTCGCTCAAAATGACAGA-3 &#39;, 5 &#39;-ATTCATCCTTTACAGGTTTGTTGC-3&#39;, Hbg3 5&#39;-TACCTGGCTTCGTGTCAAC-3 &#39;와 5&#39;-ATCTTCGGTTTCCCTAGAGAATG-3&#39;). 다음과 같이 PCR을 수행 : 95 ° C X 30 초 + (95 ° C × 5 초 + 60 ° C X 15 초 + 72 ° C × 20 ​​초) 45 ~ 55주기를 X]. </li><li> 신장 인자 1α-F2 (EF1α˗F2) 또는 리보솜 단백질 49 (rp49) 9,16,21,22의와 성적 증명서의 양을 정상화. 이 유전자는 신뢰할 수있는 제어 g입니다QRT-PCR을 사용하여 HPGs 유전자 발현을 분석 ENES. </li><li> 통계 소프트웨어를 사용하여 두 실험 그룹 (간호사 꿀벌 대 조숙 기계, 제어 꿀벌 대 20E 처리 꿀벌 및 제어 꿀벌 대 methoprene 처리 꿀벌) 사이에 유의 한 차이를 감지하는 두 개의 꼬리 t 테스트를 수행합니다. 주 : F-테스트 분산의 균일 성을 가정하면, 스튜던트 t 검정을 사용할 수있다. 그렇지 않으면 웰치 t 테스트가 사용될 수있다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

단일 코호트 식민지의 제조 여기에서 우리는 일벌의 역할의 변화와 관련된 HPG 생리학의 분석을 위해 단일 코호트 식민지를 준비하는 우리의 이전 연구 (16)에서 사용되는 프로토콜을 설명했다. 절차 1.6-1.7 및 그림 2에 설명 된 기준을 만족 간호사 꿀벌과 조숙 한 초지는 단일 코호트 식민지 (표 1)에서 관찰되었다. HPG의 분류 기준으로 미국에서 그림 2의 사진은 유용 할 것이다. 노동자의 행동과 HPG 개발 모두에 따라 기준은 전형적인 식민지에서 간호사 꿀벌 또는 초지를 정의하기위한 유효합니다. 점차 꼴로 간호의 역할 변화는 그 식민지에서 진행 : 그 꼴을 행동에 점차 역할 시프트 2시 증가하면서 간호 동작에서 보낸 시간의 양이 점차 감소한다. 따라서, 작업자가 그 독점적 수집하기 어렵다단지 행동 기준으로 간호 또는 꼴을 수행합니다. HPGs에 mrjp2 및 Hbg3의 발현이 노동자의 역할과 연결되어 있는지 그 결과는 분명히 여기에 설명 된 프로토콜은 단일 코호트 식민지에서 간호사 꿀벌과 조숙 한 초지 (그림 3)에서 HPG 생리를 조사하기 위해 채택 될 수 있음을 나타냅니다. 노동자의 행동과 HPG 개발 모두에 따라 기준은 단일 코호트 식민지에서 간호사 꿀벌과 조숙 한 초지를 정의에 적용 할 수 있습니다. HPGs 외에도 헤드 다른 외분비 땀샘 역할 시프트와 관련 생리적 변화를 겪는다. 예를 들어, 경보 페로몬 2- 헵 타논 (2)의 합성 브루 식품 지방산의 합성에서 하악 선 변경 기능. 여기에 설명 된 프로토콜에 따라서 HPGs 이외 외분비샘 역할 관련된 생리를 검사하도록 구성 될 수있다. (n)의 성공적인 컬렉션식민지가 준비 될 때 단일 코호트 식민지에서 urse 꿀벌과 조숙 한 초지 새롭게 등장 노동자의 충분한 수의 모음에 따라 달라집니다. 새로 등장 근로자의 낮은 번호가 수집 될 경우, 간호사 꿀벌과 조숙 한 초지를 충분히 수집하기 어렵다. 또한, 여왕의 조건은 성공적인 샘플 수집을위한 또 다른 중요한 포인트입니다. 큰 복부와 여왕이 여왕은 일반적으로 난소를 개발했기 때문에 산란을 위해 좋다. 따라서, 근로자의 노동은 무리가 지속적으로 여왕에 의해 공급되기 때문에 효과적으로 단일 코호트 식민지에서도 분할 될 것으로 생각된다. 아무런 무리가 제공되지 않는 경우, 단일 코호트 콜로니로부터 간호사 꿀벌 수집하기 어렵다. 초지 가끔 잘못된 식민지로 돌아가 있기 때문에 마지막으로, 포스터 페인트를 사용하여 근로자를 표시하는 근로자가 단일 코호트 식민지에서 수집되어 있는지 확인해야합니다. 효과적으로 조숙 한 초지를 수집하려면, 페인트 표시가 있어야한다가능한 한 많은 노동자 (단일 코호트 식민지 당 900 개 이상의 새롭게 등장 노동자)에 적용. 일반적으로 휘발성 유기 화합물을 함유하는 유성 잉크, 꿀벌의 화학 통신을 방해 할 수 있으므로 마킹 용 수성 잉크의 사용이 권장된다. 수성 잉크 자국은 실험 과정 동안 매우 퇴색되지 않았다. 호르몬 치료 우리는 또한 HPG 생리학 (mrjp2 및 Hbg3 식)의 에크 디손의 효과를 조사하는 노동자의 머리에 20E를 주입하기위한 프로토콜을 설명했다. 곤충 식염수 20E 용액 용 용매 주입 꿀벌의 생존율 20E 주입 실험 (표 2에 채택 될 수있는 분사구 및 20E 용액 용 용매를 사용하여 프로토콜 주사 여기 기재된 것을 나타내는, 후속 분석을 위해 충분 ). 또한, HPGs 유전자 발현의 비교20E 처리 꿀벌과 제어 꿀벌 사이에 주입 된 20E는 mrjp2 및 HPG 기능에 관련된 둘 Hbg3 (그림 5)의 발현을 변화 것으로 나타났다. 이 결과는 여기에 설명 된 프로토콜 HPG 생리학 에크 디손의 효과를 조사하기위한 유용 할 것이며, 그러한 하악 분비와 헤드의 다른 외분비샘을 검사 채용 될 수 있음을 시사한다. 또한, 상기 주입 방법은 다른 화학 물질을 주입 채용 할 수있다. 예를 들어, 여기에 설명 된 프로토콜 유전자 녹다운 실험을 위해 머리에 이중 가닥 RNA 용액을 주입하기에 적합하다. 20E 외에, 우리는 JH 유사체 methoprene을 적용하기위한 프로토콜을 설명했다. Methoprene 보통 복부에 적용된다. 한편, methoprene 여기서, 작업자의 머리에 적용 하였다. 거의 methoprene 또는 아세톤의 국소 적용으로 모든 꿀벌 7 일 치료 후 생존상기 헤드 5 μL의 methoprene 아세톤 용액의 애플리케이션을 제시하는 작업자 생존율 (표 3)에 거의 영향을 미치지 않는다. 또한, methoprene- 및 아세톤 처리 꿀벌의 HPGs에 mrjp2 및 Hbg3 식의 비교는 methoprene 응용 프로그램이 mrjp2 발현을 억제하고 Hbg3 식 (그림 6) 향상을 나타냅니다. 이러한 결과는 여기에 설명 된 프로토콜은 머리에서 HPGs 같은 외분비샘의 생리에 methoprene의 효과를 분석하기에 적합한 것이 좋습니다. 성공적인 호르몬 치료는 치료 꿀벌의 생존 속도에 따라 달라집니다. 냉장고에서 저온 노출은 꿀벌을 마취에 적합 할 수있다. 꿀벌이 낮은 생존율을 선도, 얼음에 젖어 있기 때문에 얼음에 마취는하지 않는 것이 좋습니다. 또한, 상기 주입 방법은 살아있는 꿀벌 유지하기위한 또 다른 중요한 점이 될 수있다. 그것은 m에 중요하다분사구 길고 얇은 주입하여 꿀벌의 손상을 최소화하기 위해 커터를 사용하여 날카로운 팁으로 형상 아케. methoprene에 대한 용매 아세톤에 부정적인 꿀벌의 생존 (표 4)에 영향을주기 때문에 그러나, 주입 방법은, HPG 생리학에 methoprene의 효과를 검사에 적합하지 않을 수 있습니다. 또한, 여기에 설명 된 주입 방법은 사출 후 다시 도입 될 때 주입 꿀벌이 자신의 식민지에서 제외되는 바와 같이 식민지에서 행동 분석에 적합하지 않을 수 있습니다. 약간의 부상 근로자는 식민지에서 제외 될 수 있습니다. 이러한 호르몬의 응용 프로그램 또는 경구 투여와 같은 다른 방법은, 행동 분석에 적합 할 수있다. 단일 코호트 식민지는 작업자 꿀벌 10, 11의 노동 분업의 규제를 검사하는 데 사용되었습니다. 또한, 소아 호르몬 치료는 동작 뇌 방지 동작의 시험에 사용 된노동 (11)의 분할에 관련합니다. 그러나, 단일 코호트 식민지의 준비와 JH와 치료 모두에 대한 자세한 프로토콜은 이전과 같은 상세하게 제공되지 않았습니다. 최근 노동의 부문의 에크 디손의 중요성이 점차 인식되고있다, 두 JH에 의해 노동과 에크 디손의 부문의 규제는 23을 권장합니다. 단일 코호트 식민지와 JH 등의 호르몬 치료 및이 문서에서 설명하는 에크 디손의 성공적인 준비에 대한 자세한 프로토콜은 작업자 생리학의 연구 발전에 기여할 수 있습니다.

유럽 ​​꿀벌, API를 mellifera이는 고도로 조직 된 사회 (1)와 eusocial 곤충이다. 작업자 꿀벌 (노동 계급) 식민지 활동을 유지하기 위해 다양한 작업에 종사하고 있으며, 이러한 작업은 노동 2-4의 연령과 관련된 부문이라고 우화 후 작업자 꿀벌의 연령에 따라 변경합니다. 젊은 노동자 (&lt;십삼일 세) 고령 근로자는 동안, 로얄 제리 (간호사 꿀벌)을 분비하여 하이브에 무리를 돌봐 (&gt; 15 일)는 하이브 (초지) 2-4 이외의 꿀과 꽃가루를 수집합니다. 노동자의 생리는이 역할 변화와 관련하여 변경합니다. 예를 들어, 하인두암 샘 (HPGs)의 기능은 2,5를 구하고으로 간호의 역할 변화와 관련 외분비 머리에있는 땀샘, 변화를 쌍. 간호사 꿀벌 HPGs는 주로 꿀벌 우유의 주요 구성 요소 주요 로얄 젤리 단백질을 합성. 한편, 주로 사일리지의 HPGs포도당과 과당 수크로오스로 변환하여 허니에 꿀을 처리하기 위해, 예컨대 α 글루코 III 탄수화물 대사 효소를 합성한다. 우리의 이전 연구는 밝혀 그 역할 변화 6-9시 α - 글루코시다 III, 변경 내용을 암호화하는 주요 로얄 젤리 단백질 및 Hbg3를 인코딩 mrjp2의 표현. HPGs 포함 작업자 조직에서 생리적 변화는, 롤 시프트 또는 작업자의 나이와 관련되어 있는지 여부를 확인하기 위해, 단일 집단을 조제 같은 꿀벌 콜로니 인구 조성물을 조작하는 것이 유용 할 것이다 식민지는 거의 같은 나이의 노동자들은 다른 작업 10, 11을 수행합니다. 로빈슨 등의 알. (1989)는 단일 콜로니 10 코호트를 구축하는 방법을 설명했다. 단일 코호트 식민지 초기에 여왕과 0~2일 된 근로자를 포함한다. 며칠 식민지를 설정 한 후, ALM의 노동자같은 나이 OST 다른 작업을 가정합니다. 다른 근로자가 평소보다 일찍 꼴 작업을 수행함으로써 조숙 한 초지라고하는 반면 일부 노동자들은 전형적인 식민지로 간호 작업을 수행합니다. 간호사 꿀벌과 조숙 한 초지 사이의 유전자 발현 비교는 노동자 조직 12-16의 역할 관련된 생리에 대한 유용한 정보를 제공 할 것이다. 여기, 우리는 HPGs (16)의 역할 - 및 / 또는 연령 관련 생리학의 분석을 위해 단일 코호트 식민지를 준비하기위한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 또한 간단히 HPG 생리학을 평가하기 위해 정량적 역전사 - 중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR)에 의해 mrjp2 및 Hbg3의 유전자 발현을 확인하는 방법을 설명한다. 단일 코호트 식민지에서 노동자 생리학의 분석뿐만 아니라, 내분비 시스템의 검사 역할 관련 작업자 생리의 규제 메커니즘을 분석하는 것이 중요하다. 알것입니다 청소년 호르몬 (JH)곤충 애벌레의 &#39;현 상태&#39;호르몬과 같은 WN, 작업자 꿀벌 11 꼴에 간호의 역할에 변화를 가속화합니다. 또한, 변형하는 동안 털갈이 호르몬으로 알려져있다 에크 디손은, 버섯 몸에 작업자 뇌 17-19의 높은 중심을 표현 에크 디손 신호 분자를 코딩하는 유전자와 같은 역할 변화에 관여 할 수 있습니다. 따라서, 우리는 또한 HPG 생리학의 내분비 시스템의 효과 분석 (의 발현에 대한 자세한 에크 디손의 활성 형태 20E 근로자를 치료하기 위해 우리의 이전 연구 (16)에 사용되는 프로토콜 및 methoprene하는 JH 아날로그를 설명 mrjp2 및 Hbg3).

<table><tbody><tr><td>UNIPOSCA</td><td>Mitsubishi pencil</td><td>PC-5M</td><td>Marker pen for the application of marks to bees&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>20-hydroxyecdysone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H5142</td><td></td></tr><tr><td>Methoprene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>33375</td><td></td></tr><tr><td>Breeding case insect</td><td>IRIS OHYAMA</td><td>CP-SS</td><td></td></tr><tr><td>Electromotion mixier&amp;nbsp;</td><td>ISO</td><td>23M-R25</td><td>homogenization of tissue</td></tr><tr><td>TRIZol Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>the reagent for total RNA extraction</td></tr><tr><td>DNase I&amp;nbsp;</td><td>Takara</td><td>2270A</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript RT reagent kit</td><td>Takara</td><td>RR037A</td><td>the reagent for reverse transcription</td></tr><tr><td>SYBR Premix ExTaq II</td><td>Takara</td><td>RR820A</td><td>the reagent for real-time PCR</td></tr><tr><td>LightCycle 1.2 Instrument</td><td>Roche</td><td>12011468001</td><td>the instrument for real-time PCR</td></tr><tr><td>LightCycle Capillaries (20&amp;mu;l)</td><td>Roche</td><td>4929292001</td><td>the material for real-time PCR</td></tr></tbody></table>

preparation of single-cohort colonies and hormone treatment of worker honeybees to analyze physiology associated with role and/or endocrine system

Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related division of labor). Young workers are engaged in nursing the brood (nurse bees), while older workers are engaged in foraging for nectar and pollen (foragers). The physiology of the workers changes in association with this role shift. For example, the main function of the hypopharyngeal glands (HPGs) changes from the secretion of major royal jelly proteins (MRJPs) to the secretion of carbohydrate-metabolizing enzymes. Because worker tasks change as the workers age in typical colonies, it is difficult to discriminate the physiological changes that occur with aging from those that occur with the role shift. To study the physiological changes in worker tissues, including the HPGs, in association with the role shift, it would be useful to manipulate the honeybee colony population by preparing single-cohort colonies in which workers of almost the same age perform different tasks. Here we describe a detailed protocol for preparing single-cohort colonies for this analysis. Six to eight days after single-cohort colony preparation, precocious foragers that perform foraging tasks earlier than usual appear in the colony. Representative results indicated role-associated changes in HPG gene expression, suggesting role-associated HPG function. In addition to manipulating the colony population, analysis of the endocrine system is important for investigating role-associated physiology. Here, we also describe a detailed protocol for treating workers with 20-hydroxyecdysone (20E), an active form of ecdysone, and methoprene, a juvenile hormone analogue. The survival rate of treated bees was sufficient to examine gene expression in the HPGs. Gene expression changes were observed in response to 20E- and/or methoprene-treatment, suggesting that hormone treatments induce physiological changes of the HPGs. The protocol for hormone treatment described here is appropriate for examining hormonal effects on worker physiology.

단일 콜로니 코호트 제조 프로토콜의 개요는도 1a에 도시되어있다. 컬렉션 샘플 단일 코호트 식민지를 준비에서 실험의 시간 코스는 그림 1B에 표시됩니다. 간호 행동이나 구하고 행동에 대한 행동 기준을 만족 근로자는 단일 코호트 식민지에서 수집하고, HPG의 개발은 이러한 노동자 추정 표 1은 세 그룹으로 HPG 개발의 분류를 보여줍니다.; 크기에 따라 &#39;개발&#39;, &#39;중간&#39;및 &#39;주름진&#39;. HPGs의 세 가지 클래스를 보여주는 대표적인 사진은 그림 2에 표시됩니다. 결과는 간호사 꿀벌과 조숙 한 초지 모두, 프로토콜에 설명 된 기준에 따라, 또한 단일 코호트 식민지에서 관찰되었다 나타냅니다. HPGs에 mrjp2 및 Hbg3의 발현이었다 엔HPG 기능은 작업자의 역할 (그림 3) (16)와 연결되어 있음을 나타내는 각각 간호사 꿀벌과 조숙 한 기계,에 riched. 작업자에 헤드 (20E)를 주입하기위한 절차.도 4에 도시되어 생존 꿀벌 5 7 일간 생존을 조사 주사 후 1 센다 곤충 생리 식염수 또는 20E 실험 전에 20E 솔루션에 대한 용매를 주입 꿀벌의 속도입니다. 주입 후 7 일에서 주입 꿀벌의 약 60-80% 살아 있었고, 20E 솔루션을위한 용매로 주입 꿀벌의 생존율은 곤충 생리 식염수 (표 2)에 필적했다. 20E 주입의 영향 (도 5) 16 HPGs 모두 mrjp2 및 Hgb3의 발현을 감소시켰다. 20E, mrjp2 및 Hbg3 국소 methoprene 응용 프로그램의 효과에 더하여 </em&gt;은 HPGs의 발현을 조사 하였다. 국소 적용에 의해 methoprene- 또는 아세톤으로 처리 꿀벌의 약 70 ~ 100 응용 프로그램 (표 3) 후 7 일에서 살아 남았다. 한편, 꿀벌의 약 20 % 내지 30 %가 주입 아세톤 / 꿀벌 염수 (1 : 4) 생존 꿀벌 5 7 일간 주사 후 3 일 계산되었을 때 용액을 7 일 주사 후 생존 (표 4) . 따라서 methoprene 처리 용 도포 방법을 채용 하였다. methoprene의 적용 mrjp2의 발현을 억제하고 (도 6) 16 Hbg3의 발현을 향상. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54240/54240fig1.jpg" /> 단일 코호트 식민지 실험 그림 1. 개요. (A) 계획 단일 코호트 식민지를 준비합니다. (B) 실험의 시간 코스 preparin에서간호사 꿀벌과 조숙 한 초지를 수집하는 g 단일 코호트 식민지. 수평 화살표는 단일 코호트 식민지에서 근로자의 평생의 과정을 나타냅니다. 수직 라인 숫자는 근로자의 나이를 나타냅니다. 조숙 한 초지뿐만 아니라 과시 효 간호사 꿀벌 (28~32일 이전)뿐만 아니라이 단일 코호트 식민지 (15)에서 발견되는 것으로보고있다. 문제는이 연구에서 수행되지 않았지만 따라서, 과시 효 간호사 꿀벌과 초지의 생리의 비교, 단일 코호트 식민지에서 수행 할 수 있습니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54240/54240fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54240/54240fig2.jpg" /> HPG 상태의 세 개의 클래스를 나타내는도 2의 사진. 개발 (A), 중간체 (B), 및 주름진 (C </str옹&gt;) HPGs 의정서의 1.7.5는이 그림에 표시됩니다 단계에서 설명했다. HPG의 각 클래스에 세 대표 사진이 표시됩니다. 각각의 하위 도면에서 낮은 패널 상단 패널에 점선 사각형 영역의 확대보기를 나타냅니다. 스케일 바는 500 μm의 =. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54240/54240fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54240/54240fig3.jpg" /> 그림 3. 역할 관련된 단일 코호트 식민지 노동자의 HPGs에 mrjp2 및 Hbg3의 발현을. 그래프는 두 개의 단일 코호트 공동에서 간호사 꿀벌 (N)와 조숙 한 초지 (PF) 사이의 HPGs에 mrjp2 (A) 및 Hbg3 (B)의 mRNA 수준의 비교를 표시lonies. 각 유전자의 mRNA 발현이 리보솜 단백질 49 (rp49)의 정규화 하였다. 간호사 꿀벌 HPGs 각 유전자의 상대적인 mRNA의 수준은 몇 조숙 초지 mrjp2에서의 mRNA 발현 때문에, 검출 임계 값보다 낮은 신호 세기로 정량화 될 수없는 1로 정의 하였다. 따라서, 샘플 수는 유전자 사이에서 다르다. 상대 mRNA 수준은 표준 오차로 표시됩니다. 별표는 간호사 꿀벌과 조숙 한 초지 사이에 유의 한 차이를 나타냅니다 (* P &lt;0.05; t 테스트). 이 수치는 우에노 등의 알에서 재현 할 수 있습니다., (2015) 16. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54240/54240fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54240/54240fig4.jpg" /> 20E의 injec에 대한 프로토콜의 그림 4. 계획기. 절차 2.3 프로토콜 섹션에서 2.4이이 그림에 나와 있습니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54240/54240fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54240/54240fig5.jpg" /> 그림 HPGs 16 mrjp2 및 Hbg3 식에 20E 주입 5. 효과. 그래프 mrjp2의 mRNA 수준의 비교를 나타낸다 20E 처리 꿀벌 (20E의 +) 및 제어 꿀벌 (20E-) 사이의 HPGs에서 (A) 및 Hbg3 (B). 그래프 아래의 숫자는 20E 처리 후의 일을 나타냅니다. 각 유전자의 mRNA의 수준은 신장 인자 1α-F2 (EF1α-F2)의 정규화 하였다. 상대의 mRNA 수준1. 상대적인 mRNA의 수준은 표준 오차로 표시되는 바와 같이, 제어 꿀벌 HPGs 각 유전자를 정의 하였다. 별표는 20E 처리 꿀벌과 제어 꿀벌 사이에 유의 한 차이를 나타냅니다 (* P &lt;0.05; t 테스트). 이 수치는 우에노 등의 알에서 재현 할 수 있습니다., (2015) 16. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54240/54240fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/54240/54240fig6.jpg" /> 그림 HPGs 16 mrjp2 및 Hbg3 식에 methoprene 응용 프로그램 6. 효과. 그래프 methoprene 처리 꿀벌 제어 꿀벌의 HPGs mrjp2의 (A) 및 Hbg3 (B)의 mRNA 수준의 비교를 나타낸다. 그만큼각 유전자의 mRNA의 수준은 EF1α-F2의 정규화 하였다. 1. 상대 mRNA 수준이 표준 오차로 표시됩니다으로 제어 꿀벌 HPGs의 각 유전자의 상대 mRNA의 수준을 정의 하였다. 별표는 methoprene 처리 꿀벌과 제어 꿀벌 사이에 유의 한 차이를 나타냅니다 (* P &lt;0.05; t 테스트). 이 수치는 우에노 등의 알에서 재현 할 수 있습니다., (2015) 16. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54240/54240fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> 식민지 번호 </td><td rowspan="2"> 관찰 된 동작 </td><td colspan="3"> 각 HPG 클래스에서 개인의 수 </td><td></td></tr><tr><td> 개발 </td><td> 중간의 </td><td> 시든 </td><td> 합계 </td></tr><tr><td rowspan="2"> 1 </td><td> 육아 </td><td> 8 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> (10) </td></tr><tr><td> 꼴 </td><td> 0 </td><td> 4 </td><td> (7) </td><td> (11) </td></tr><tr><td rowspan="2"> 이 </td><td> 육아 </td><td> 4 </td><td> 이 </td><td> 0 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> 꼴 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> (5) </td><td> (5) </td></tr></tbody></table> 표 1 : 간호 또는 구하고 행동 단일 코호트 식민지에서 관찰되었다 노동자의 HPGs의 분류. HPG의 두 개의 단일 코호트 식민지 노동자의 크기 (식민지의 제 1, 2). 세 가지 클래스로 분류 하였다 &#39;개발&#39;, &#39;중간&#39;과 크기에 의해 &#39;말라 비틀어 진&#39;. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> 주입 후 일수 </td><td> 아니 주입하지 </td><td> 곤충 생리 식염수 </td><td> 20E의 SOLN 용제 </td></tr><tr><td rowspan="4"> 시험 1 </td><td> Day0 </td><td> 15/15 </td><td> 15/15 </td><td> 14/15 </td></tr><tr><td> 첫째날 </td><td> 15/15 </td><td> 14/15 </td><td> 13/15 </td></tr><tr><td> Day5 </td><td> 14/15 </td><td> 13/15 </td><td> 11/15 </td></tr><tr><td> Day7 </td><td> 14/15 </td><td> 12/15 </td><td> 9/15 </td></tr><tr><td rowspan="4"> 시험 2 </td><td> Day0 </td><td> 15/15 </td><td> 15/15 </td><td> 15/15 </td></tr><tr><td> 첫째날 </td><td> 15/15 </td><td> 13/15 </td><td> 15/15 </td></tr><tr><td> Day5 </td><td> 15/15 </td><td> 11/15 </td><td> 12/15 </td></tr><tr><td> Day7 </td><td> 14/15 </td><td> 10/15 </td><td> 12/15 </td></tr></tbody></table> 표 2 : 20E 솔루션을 용매로 주입 꿀벌의 생존율. 다섯 노동자는 각 실험군에서 제조 하였다. <table border=&quot;1&quot;FO : 유지-together.within 페이지 = &quot;1&quot;FO : 유지 -에 - next.within 페이지 = &quot;항상&quot;&gt; <tbody><tr><td></td><td> 일 신청 후 </td><td> 아세톤 </td><td> Methoprene </td></tr><tr><td> 시험 1 </td><td> 날 0 </td><td> 7/7 </td><td> 8/8 </td></tr><tr><td></td><td> 7 일 </td><td> 7/7 </td><td> 6/8 </td></tr><tr><td> 시험 2 </td><td> 날 0 </td><td> 7/7 </td><td> 8/8 </td></tr><tr><td></td><td> 7 일 </td><td> 7/7 </td><td> 8/8 </td></tr></tbody></table> 표 3 :.와 methoprene 7 ~ 8 근로자가 각 실험군에서 제조 된 처리 꿀벌의 생존율. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 주입 후 일수 </td><td> 아니 주입하지 </td><td> 아세톤 / 꿀벌 식염수 (1 : 4) </td></tr><tr><td> 날 0 </td><td> 15/15 </td><td> 15/1(5) </td></tr><tr><td> 1 일 </td><td> 15/15 </td><td> 6/15 </td></tr><tr><td> 3 일 </td><td> 15/15 </td><td> 5/15 </td></tr><tr><td> 5 일 </td><td> 15/15 </td><td> 4/15 </td></tr><tr><td> 7 일 </td><td> 15/15 </td><td> 4/15 </td></tr></tbody></table> 표 4 (4 일). 솔루션 다섯 근로자가 각 실험 그룹에 대한 준비 하였다 아세톤 / 꿀벌의 생리 식염수를 주입 꿀벌의 생존율. 아세톤 / 꿀벌 염수 (1 : 4) 용액 작업자의 복부에 주사 하였다. 꿀벌 식염수의 조성은 130 mM의 염화나트륨, 6 mM의 KCl을,를 4mM의 MgCl 2, 2.5 mM의 CaCl2를 160 mM의 슈 크로스, 25 mM의 글루코오스, 10 mM의 HEPES (PH 7.0).

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Preparation of Single-cohort Colonies and Hormone Treatment of Worker Honeybees to Analyze Physiology Associated with Role and/or Endocrine System

여기에서 우리는 단일 코호트 꿀벌 식민지의 제조를위한 우리의 상세한 프로토콜을 설명 - 롤 관련 근로자의 생리를 분석하기위한 유용한 도구입니다. 우리는 또한 작업자의 행동 및 / 또는 생리 조절에 이러한 호르몬의 참여를 평가하기 위해 청소년 호르몬과 에크 디손과 근로자를 치료하기위한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

단일 코호트 식민지와 노동자 꿀벌의 호르몬 치료의 준비 역할 및 / 또는 내분비 시스템과 생리학 관련 분석하기

Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related ...

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Nanyang Technological University

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15.7K 조회수.  The University of Tokyo.  여기에서 우리는 단일 코호트 꿀벌 식민지의 제조를위한 우리의 상세한 프로토콜을 설명 - 롤 관련 근로자의 생리를 분석하기위한 유용한 도구입니다. 우리는 또한 작업자의 행동 및 / 또는 생리 조절에 이러한 호르몬의 참여를 평가하기 위해 청소년 호르몬과 에크 디손과 근로자를 치료하기위한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 

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Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered &#34;bee-safe,&#34; there is mounting evidence that fungicide residues in pollen are associated with bee declines (for both honey and bumble bee species). While the mechanisms remain relatively unknown, researchers have speculated that bee-microbe symbioses are involved. Microbes play a pivotal role in the preservation and/or processing of pollen, which serves as nutrition for larval bees. By altering the microbial community, it is likely that fungicides disrupt these microbe-mediated services, and thereby compromise bee health. This manuscript describes the protocols used to investigate the indirect mechanism(s) by which fungicides may be causing colony decline. Cage experiments exposing bees to fungicide-treated flowers have already provided the first evidence that fungicides cause profound colony losses in a native bumble bee (Bombus impatiens). Using field-relevant doses of fungicides, a series of experiments have been developed to provide a finer description of microbial community dynamics of fungicide-exposed pollen. Shifts in the structural composition of fungal and bacterial assemblages within the pollen microbiome are investigated by next-generation sequencing and metagenomic analysis. Experiments developed herein have been designed to provide a mechanistic understanding of how fungicides affect the microbiome of pollen-provisions. Ultimately, these findings should shed light on the indirect pathway through which fungicides may be causing colony declines.

Microbial consortia within bumble bee hives enrich and preserve pollen for bee larvae. Using next generation sequencing, along with laboratory and field-based experiments, this manuscript describes protocols used to test the hypothesis that fungicide residues alter the pollen microbiome, and colony demographics, ultimately leading to colony loss.

실험, Metagenomic, 및 계산 기법 밝히는 어떤 균 타협 꿀벌 건강 메커니즘

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

연구

환경과학

Evaluating the Effect of Environmental Chemicals on Honey Bee Development from the Individual to Colony Level

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be brought back to the beehive after the bees have foraged on flowers that have been sprayed with pesticides. Pesticide contaminated food can be exchanged between workers which then feed larvae and therefore can potentially affect the development of honey bees. Thus, residual pesticides in the environment can become a chronic damaging factor to honey bee populations and gradually lead to colony collapse. In the presented protocol, honey bee feeding methods are described and applied to either an individual honey bee or to a colony. Here, the insect growth regulator (IGR) pyriproxyfen (PPN), which is widely used to control pest insects and is harmful to the development of honey bee larvae and pupae, is used as the pesticide. The presenting procedure can be applied to other potentially harmful chemicals or honeybee pathogens for further studies.

Herein we present a method to feed pesticide contaminated food to both an individual honey bee and a beehive colony. The procedure evaluates the pesticide effect on individual honey bees by in vivo feeding of basic larval diet and also on the natural condition of beehive colony.

식민지 수준에 개인에서 꿀 꿀벌 개발에 대한 환경 화학 물질의 효과를 평가

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be ...

In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors

Although solitary bees provide crucial pollination services for wild and managed crops, this species-rich group has been largely overlooked in pesticide regulation studies. The risk of exposure to fungicide residues is likely to be especially high if the spray occurs on, or near host plants while the bees are collecting pollen to provision their nests. For species of Osmia that consume pollen from a select group of plants (oligolecty), the inability to use pollen from non-host plants can increase their risk factor for fungicide-related toxicity. This manuscript describes protocols used to successfully rear oligolectic mason bees, Osmia ribifloris sensu lato, from egg to prepupal stage within cell culture plates under standardized laboratory conditions. The in vitro-reared bees are subsequently used to investigate the effects of fungicide exposure and pollen source on bee fitness. Based on a 2 &#215; 2 fully crossed factorial design, the experiment examines the main and interactive effects of fungicide exposure and pollen source on larval fitness, quantified by prepupal biomass, larval developmental time, and survivorship. A major advantage of this technique is that using in vitro-reared bees reduces natural background variability and allows the simultaneous manipulation of multiple experimental parameters. The described protocol presents a versatile tool for hypotheses testing involving the suite of factors affecting bee health. For conservation efforts to be met with significant, lasting success, such insights into the complex interplay of physiological and environmental factors driving bee declines will prove to be critical.

In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors

Fungicide sprays on flowering plants may expose solitary bees to high concentrations of pollen-borne fungicide residues. Using laboratory-based experiments involving in vitro-reared bee larvae, this study investigates the interactive effects of consuming fungicide-treated pollen derived from host and non-host plants.

생체 외에서 고독한 꿀벌의 양육: 애벌레 위험 요소를 평가 하기 위한 도구

Although solitary bees provide crucial pollination services for wild and managed crops, this species-rich group has been largely overlooked in pesticide ...

Measuring Hypopharyngeal Gland Acinus Size in Honey Bee (Apis mellifera) Workers

The nurse hypopharyngeal glands produce the protein fraction of the worker and royal jelly that is fed to developing larvae and queens. These paired glands that are located in the head of the bee are highly sensitive to the quantity and quality of pollen and pollen substitutes that the nurse bee consumes. The glands get smaller when nurses are fed deficient diets and are large when they are fed complete diets. Because nurse hypopharyngeal gland size is a robust indicator of nurse nutrition, it is essential that those studying honey bee nutrition know how to measure these glands. Here, we provide detailed methods for dissecting, staining, imaging, and measuring nurse bee hypopharyngeal glands. We present comparisons of unstained and stained tissue and data that were used to study the impact of pollen on gland size. This method has been used to test how diet impacts hypopharyngeal gland size but has further use for understanding the role of these glands in hive health.

Measuring Hypopharyngeal Gland Acinus Size in Honey Bee Apis mellifera Workers

Hypopharyngeal gland acinus size is a robust measure of nurse honey bee nutrition. Here, we provide a detailed protocol for dissecting, staining, imaging, and measuring nurse bee hypopharyngeal gland acini.

꿀 꿀벌 (Apis mellifera) 노동자의 Hypopharyngeal 동맥 Acinus 크기 측정

The nurse hypopharyngeal glands produce the protein fraction of the worker and royal jelly that is fed to developing larvae and queens. These paired ...

A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research

Insects modify their responses to stimuli through experience of associating those stimuli with events important for survival (e.g., food, mates, threats). There are several behavioral mechanisms through which an insect learns salient associations and relates them to these events. It is important to understand this behavioral plasticity for programs aimed toward assisting insects that are beneficial for agriculture. This understanding can also be used for discovering solutions to biomedical and agricultural problems created by insects that act as disease vectors and pests. The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol was developed for honey bees (Apis mellifera) over 50 years ago to study how they perceive and learn about floral odors, which signal the nectar and pollen resources a colony needs for survival. The PER procedure provides a robust and easy-to-employ framework for studying several different ecologically relevant mechanisms of behavioral plasticity. It is easily adaptable for use with several other insect species and other behavioral reflexes. These protocols can be readily employed in conjunction with various means for monitoring neural activity in the CNS via electrophysiology or bioimaging, or for manipulating targeted neuromodulatory pathways. It is a robust assay for rapidly detecting sub-lethal effects on behavior caused by environmental stressors, toxins or pesticides.
We show how the PER protocol is straightforward to implement using two procedures. One is suitable as a laboratory exercise for students or for quick assays of the effect of an experimental treatment. The other provides more thorough control of variables, which is important for studies of behavioral conditioning. We show how several measures for the behavioral response ranging from binary yes/no to more continuous variable like latency and duration of proboscis extension can be used to test hypotheses. And, we discuss some pitfalls that researchers commonly encounter when they use the procedure for the first time.

The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol, developed for the honey bee (Apis mellifera), provides an ecologically-relevant and easily quantifiable means for studying several different mechanisms of learning in many insect species.

코 확장 응답 곤충의 행동 소성을 조사하기위한 프로토콜 : 기본, 바이오 메디컬에 응용 프로그램, 및 농업 연구

Insects modify their responses to stimuli through experience of associating those stimuli with events important for survival (e.g., food, mates, threats). ...

신경과학

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize and to study. Therefore, bees have long been a favored model amongst neurobiologists and neuroethologists for studying the neural basis of social and natural behavior. It is important, however, that the experimental techniques used to study bees do not interfere with the behaviors being studied. Because of this, it has been necessary to develop a range of techniques for pharmacological manipulation of honey bees. In this paper we demonstrate methods for treating restrained or free-flying honey bees with a wide range of pharmacological agents. These include both noninvasive methods such as oral and topical treatments, as well as more invasive methods that allow for precise drug delivery in either systemic or localized fashion. Finally, we discuss the advantages and disadvantages of each method and&#160;describe common hurdles and how to best overcome them. We conclude with a discussion on the importance of adapting the experimental method to the biological questions rather than the other way around.

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

This manuscript describes several protocols for administering pharmacological agents to honey bees, including simple noninvasive methods for free-flying bees, as well as more invasive variants that allow precise localized treatment of restrained bees.

절제된 자유 비행 꿀 꿀벌의 Neuropharmacological 조작,<em&gt; API를 mellifera이</em

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize ...

Obtaining Specimens with Slowed, Accelerated and Reversed Aging in the Honey Bee Model

Societies of highly social animals feature vast lifespan differences between closely related individuals. Among social insects, the honey bee is the best established model to study how plasticity in lifespan and aging is explained by social factors.
The worker caste of honey bees includes nurse bees, which tend the brood, and forager bees, which collect nectar and pollen. Previous work has shown that brain functions and flight performance senesce more rapidly in foragers than in nurses. However, brain functions can recover, when foragers revert back to nursing tasks. Such patterns of accelerated and reversed functional senescence are linked to changed metabolic resource levels, to alterations in protein abundance and to immune function. Vitellogenin, a yolk protein with adapted functions in hormonal control and cellular defense, may serve as a major regulatory element in a network that controls the different aging dynamics in workers.
Here we describe how the emergence of nurses and foragers can be monitored, and manipulated, including the reversal from typically short-lived foragers into longer-lived nurses. Our representative results show how individuals with similar chronological age differentiate into foragers and nurse bees under experimental conditions. We exemplify how behavioral reversal from foragers back to nurses can be validated. Last, we show how different cellular senescence can be assessed by measuring the accumulation of lipofuscin, a universal biomarker of senescence.
For studying mechanisms that may link social influences and aging plasticity, this protocol provides a standardized tool set to acquire relevant sample material, and to improve data comparability among future studies.

In honey bee workers, aging depends on social behaviors rather than on chronological age. Here we show how worker-types with very different aging patterns can be obtained and analyzed for cellular senescence.

둔화 가속과 반전 꿀 꿀벌 모델에서 노화와 표본을 얻기

Societies of highly social animals feature vast lifespan differences between closely related individuals. Among social insects, the honey bee is the best ...

생물학

Methods for Comparing Nutrients in Beebread Made by Africanized and European Honey Bees and the Effects on Hemolymph Protein Titers

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees collect and convert to beebread by placing colonies in a specially constructed enclosed flight area. Methods were developed to analyze the protein and amino acid composition of the pollen and beebread. We also describe how consumption of the beebread was measured and methods used to determine adult worker bee hemolymph protein titers after feeding on beebread for 4, 7 and 11 days after emergence. Methods were applied to determine if genotype affects the conversion of pollen to beebread and the rate that bees consume and acquire protein from it. Two subspecies (European and Africanized honey bees; EHB and AHB respectively) were provided with the same pollen source. Based on the developed methods, beebread made by both subspecies had lower protein concentrations and pH values than the pollen. In general, amino acid concentrations in beebread made by either EHB or AHB were similar and occurred at higher levels in beebread than in pollen. Both AHB and EHB consumed significantly more of the beebread made by AHB than by EHB. Though EHB and AHB consumed similar amounts of each type of beebread, hemolymph protein concentrations in AHB were higher than in EHB. Differences in protein acquisition between AHB and EHB might reflect environmental adaptations related to the geographic region where each subspecies evolved. These differences could contribute to the successful establishment of AHB populations in the New World because of the effects on brood rearing and colony growth.

Here are methods to quantify nutrients in pollen before and after its conversion to beebread by two subspecies of honeybees. We describe techniques to measure beebread consumption and resulting protein titers in both subspecies.

아프리칸 유럽 꿀 꿀벌에 의해 만들어 Beebread의 영양소를 비교하는 방법과하는 Hemolymph 단백질 역가에 미치는 영향

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees ...

Monitoring Colony-level Effects of Sublethal Pesticide Exposure on Honey Bees

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment methods. Here we describe methods to measure the quantities of adult bees, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, by photographing frames, and by installing hives on scales and with internal sensors. Data from these periodic evaluations are then combined with running average and daily detrended data on hive weight and internal hive temperature. The resulting datasets have been used to detect colony-level effects of imidacloprid applied in a sugar syrup as low as 5 parts per billion. The methods are objective, require little training, and provide permanent records in the form of sensor output and photographs.

Sublethal doses of pesticides may affect colonies in ways that are difficult to detect using only periodic or visual methods. Methods to measure total adult bee mass, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, photographing frames, and installing sensors, are provided. Data analysis is also addressed.

꿀 꿀벌에 Sublethal 농약 노출의 식민지 수준 효과 모니터링

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment ...

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees (Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee health, including exposure to viral pathogens. Such viruses can cause a wide variety of devastating effects and can often be challenging to study due to multiple factors that make it difficult to separate the effects of experimental treatments from preexisting background infection. Here we present a method to mass produce large quantities of virus particles along with a high throughput bioassay to test viral infection and effects. Necessitated by the current lack of a continuous, virus-free honey bee cell line, viral particles are amplified in vivo using honey bee pupae, which are extracted from the hive in large volumes using minimally stressful methodology. These virus particles can then be used in honey bee cage bioassays to test inocula viability, as well as various other virus infection dynamics, including interactions with nutrition, pesticides, and other pathogens. A major advantage of using such particles is that it greatly reduces the chances of introducing unknown variables in subsequent experimentation when compared to current alternatives, such as infection via infected bee hemolymph or homogenate, though care should still be taken when sourcing the bees, to minimize background virus contamination. The cage assays are not a substitute for large-scale, field-realistic experiments testing virus infection effects at a colony level, but instead function as a method to establish baseline viral responses that, in combination with the semi-pure virus particles, can serve as important tools to examine various dimensions of honey bee-virus physiological interactions.

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera

Here we describe two protocols: first to propagate, extract, purify, and quantify large quantities of honey bee non-enveloped virus particles, including a method for removing honey bee pupae and second to test the effects of viral infection using a highly repeatable, high-throughput cage bioassay.

꿀벌의 구강 감염을위한 바이러스 풍부 접종물 준비 (Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee ...