The authors would like to thank Autumn Peterson for assistance with mouse photography, Daniel Thoresen for assistance with mice, and Drs. Nicole Ward and Abdelmadjid Belkadi for assistance with surgical denervation. These studies were supported by funding from the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (grants R00AR059796 and R01AR065409); the University of Michigan Department of Dermatology; the Biological Sciences Scholars Program; the Center for Organogenesis; the University of Michigan Comprehensive Cancer Center; and the John S. and Suzanne C. Munn Cancer Fund. S.C.P. was supported by funding from the National Institute of General Medical Sciences (grant T32 GM007315). This work was also supported by the NIH Intramural Research Program, Center for Cancer Research, National Cancer Institute.

이 프로토콜에 설명 된 모든 절차는 실험 동물 의학에 대한 미시간 단위의 대학 설립 규정에 따라 수행되었다. 1. 마우스의 유전자 재조합을 유도 참고 : Gli1 TM3 (CRE / ERT2) ALJ / J 마우스 변형 (Gli1-CreERT2) (13)는 상피를 TD하기 위해 타목시펜에 의한 유전자 재조합의 대상으로 할 수 있습니다. Gli1를 생성하는 B6.129S4-GT는 (ROSA) 26Sor tm1Sor / J 기자 마우스 (LacZ를) (22)이 변형 크로스, LacZ를 동물 전체 마운트 아래 염색에 의해 TD 세포를 시각화 할 수 있습니다. <ol><li> 옥수수 유 12.5 ㎎ / ㎖의 농도로 타목시펜 용액을 준비한다. <ol><li> 1.5 ML 튜브에서 결정 타목시펜의 20 ㎎, 옥수수 기름을 1 ml의까지 추가 할 수 있습니다. 타목시펜이 완전히 (2-4 시간)에 용해 될 때까지 단단히 같이 와류 믹서에 튜브 및 RT에서 가장 높은 설정에서 지속적으로 소용돌이를 테이프타목시펜 미립자의 부재에 대한 해부 현미경 튜브를 조사하여 확인 하였다. </li><li> 15 ㎖의 튜브에 용액을 옮기고 추가의 옥수수 오일 용액 12.5 밀리그램 / 최종 농도로 희석 타목시펜. 추가로 30 초 동안 점성 용액을 볼 텍싱하여 혼합한다. 어둠 속에서 4 ° C에서 최대 1 주일이 솔루션을 저장합니다. </li></ol></li><li> Gli1로 복강 타목시펜 용액을 주입, LacZ를 쥐, 마우스 체중 20g 당 200 ㎕의 부피로, 20g 마우스 체중 당 2.5 밀리그램의 유효 타목시펜 복용량. </li></ol> 2. 수확 피부 생검 참고 : 타목시펜 유도 후 주에 실험에 따라 수확 피부 생검 몇 일. 모든 수술를 들어, 멸균 장갑을 사용하여 수술 용 마스크 또는 머리 그물을 착용하고, 절차를 수행하는 동안 무균 수술 드레이프와 동물을 다루는 포함 설치류 수술을위한 표준 프로토콜을 따르십시오. <ol><li> 물에 90 ㎎ / ㎖ 케타민 6.5 ㎎ / ㎖ 자일 라진을 혼합하여 10 배 스톡 마취 솔루션을 준비합니다. 그냥 사용하기 전에 멸균 PBS로이 원액 1:10 희석하고, 최대 8 개월 동안 어둠 속에서 실온에서 보관하십시오. <ol><li> 또는, 완전 동물을 마취 산소와 4 %의 가스 농도를 시작으로 이소 플루 란 흡입에 의해 마우스를 마취하고 후속 절차 기간 동안 1 ~ 2 %이 저하. </li></ol></li><li> 20g의 마우스 체중 당 200 μL의 용량으로 복강 내 마취 용액을 주입한다. 동물이 발가락 핀치 분석에 의한 진정 작용의 적절한면에 도달 한 것을 확인하고, 그 마음을 확인하고 호흡 속도는 (각각 약 600 비트와 분당 160 호흡) 정상입니다. </li><li> , 지느러미 다시 피부에 생검의 사이트에서 머리를 제거하지 닉에주의하면서 또는 기본 피부를 손상 전기 클리퍼를 사용합니다. </li><li> 면도를 닦아 수술 부위를 준비Betadine과 알코올 잎사귀를 사용하여 전방 대 후방 방향으로 D 영역. 모든 머리를 잘라낸 사이트에서 제거해야합니다. </li><li> , 검은 색 마커를 사용하여 조직 검사 사이트 개요 무균 수술 영역에서 온난화 패드에 동물을 배치하고, 무균 수술 드레이프와 커버 (데모 목적을 위해, 무균 드레이프는 가시성을 높이기 위해 생략). 참고 : 모낭의 길이 방향의 부분을 얻기 위해 생검의 긴 가장자리에, 전방 - 후방 방향으로 parasagital를 (모낭의 방향에 평행)을 실행해야합니다 (가장자리가 ~ 1cm가, 조직학에 대한 구분한다) 지느러미 중간 선 (그림 1A). </li><li> 기본 근육의 근막을 손상시키지 않고 표시된 지역에 따라 전체 두께 절제술을 만들기 위해 멸균 # 11 메스를 사용합니다. 참고 : 적출 피부 조직은 표피, 진피, 피하 지방과 panniculus의 카르노 서스를 포함한다. 출혈은 일반적으로 최소이다. </li><li> t을 평평그는 마른 종이 타월에 피부 샘플을 적출, 진피, 아래로 옆 초과 종이 타월을 멀리 트림 및 기타 샘플을 수집해야 할 경우 최대 1 시간 동안 차가운 PBS에서 샘플을 저장합니다. 준비가되면 조직 검사를위한 샘플, 또는 전체 마운트 β - 갈 락토시다 제 (LacZ를) 염색을위한 4 단계를 처리하는 단계 3.1 또는 3.2로 진행합니다. </li><li> 봉합사는 약 3mm 이격 간단한 인터럽트 패턴에 6-0 나일론 봉합사를 사용하는 생검 부위를 닫는다. </li><li> 전체 복구 후까지 다른 동물과 같은 케이지에 수술을받은 쥐를 반환하지 않습니다. </li><li> 수술 영역은 일반적으로 일주일 내, 치유 될 때까지 그들은 매일 또한 의식을 되 찾을 때까지 즉시 수술 후 동물을 모니터링합니다. 마우스는 통증이나 고통의 흔적을 나타내는 경우 지정 기관 동물 관리 및 사용 지침에 따라 진통제를 사용합니다. 수술 후 7 ~ 10 일이 봉합사를 제거합니다. 주 : 필요한 경우, (50 ㎎ / ㎖ 스톡 오디오 솔루션 카프로 펜 희석하여 용액을 제조 진통이온) 1 : 멸균 100. 20g 체중 당 200 μL (5 ㎎ / ㎏의 마우스 체중)의 투여 량으로, 목 목덜미 근처 견갑골 사이의 용액을 피하 주사. </li></ol> 조직학 3. 프로세스 샘플 해결하려면 및 적출 조직을 처리, 응용 프로그램에 따라 아래의 방법 중 하나를 사용합니다. <ol><li> 파라핀 조직 학적 샘플을 생성하려면 최대 2 주 동안 70 % 에탄올에서 RT에서 PBS O / N에서 3.7 % 포르말린에 피부와 저장소를 수정합니다. 파라핀에 삽입하기 전에 종이 타월을 제거합니다. </li><li> 냉동 조직 학적 샘플을 생성하기 위해, PBS 차가운 4 % 파라 포름 알데히드에서 조직 잠수함 천천히 1 시간 동안 흔들어. 솔루션을 제거하고 PBS 3 변화, 약 5 분 각각에 샘플을 씻는다. 다음으로, ( &quot;크로스 침몰&quot;) 조직을 cryoprotect하는 PBS 30 % 수크로오스에서 샘플 잠수함. </li><li> 4 ° C에서 부드럽게 흔들어 O / N로 품어. 다음 날, 종이 견인을 제거EL은 피부의 진피 측으로부터 과량의 지방 조직을 잘라 내고. 직접 10월에 조직을 포함하고 -80 ° C에서 냉동 블록을 저장합니다. 참고 : 이전에 5,19을 설명한대로 절편 한 후, 파라핀 또는 냉동 샘플 중 하나는, TDs를, 메르켈 세포 각각 케라틴 17, 각질 8 신경 미세 섬유,에 대한 항체를 사용하여 신경을 식별하기 위해 면역 조직 화학 염색으로 염색 할 수 있습니다. </li></ol> 전체 마운트 LacZ를 염색 4. 시각화 샘플 <ol><li> X-여자의 염색 액을 준비합니다. <ol><li> 멸균 수 250 mL에 0.94 g의 인산 나트륨 일 염기, 2.6 g 인산 나트륨을 결합한다. 7.3의 pH를 조정합니다. 여기에, 1 M 염화 마그네슘 0.5 ㎖, 페로 시안화 칼륨 0.528 g의 칼륨 페리시 아나이드의 0.412 g을 추가한다. 옥틸 - 폴리에틸렌 글리콜 250 μL 및 데 옥시 콜레이트 125 mg을 추가합니다. 염기 용액을 어둠 속에서 최대 6 개월 동안 4 ℃에서 저장 될 수있다. </li><li> 50 배 재고 X-여자의 soluti 준비50 ㎎ / ㎖ 솔루션을 생성하기 위해 X-여자의 재고 병에 디메틸 포름 아미드를 추가하여합니다. 어둠 속에서 -20 ° C에서이 솔루션을 저장합니다. </li><li> 염색 솔루션을 생성하기 위해 X-여자 기반 솔루션에 재고의 X-여자 솔루션 1:50 희석 사용하기 직전에. 작은 생검 (&lt;1cm 2), 샘플 당 염색 액의 나누어지는 1-2 ml의하십시오. </li></ol></li><li> 부드럽게 진탕 얼음 30 분 동안 차가운 PBS로 2 % 파라 포름 알데히드 / 0.2 % 글루 타르 알데히드를 함유하는 용액의 단계 2.7에서 수집 된 피부 샘플을 고정한다. 작은 생검 (&lt;1cm 2)의 경우, 샘플 당 정착액 솔루션의 1-2 ml를 사용합니다. 참고 : 또는 만 2-4% 파라 포름 알데히드에 샘플을 수정, 또는 0.5 % 글루 타르 알데히드에서만. 최적의 정착 조건은 조직 LacZ를 발현 및 응용 정도에 의존한다. </li><li> 정착액 솔루션을 제거하고 실온에서 진탕에 PBS의 3 변경, 5 분마다로 샘플을 씻어. </li><li> 샘플 아래에 종이 타월을 제거하고 exces를 절단무딘 집게로 지방을 파지 및 해부 가위 트리밍에 의해 피부의 진피 측면에서 지방 조직을이야. </li><li> X-여자의 염색 액의 샘플 잠수함, 37 ° CO / N에 품어. LacZ를 발현은 해부 현미경 (그림 1B)에서 파란색 얼룩으로 표시됩니다. 주 : 신호 강도가 약한 경우에는 염색 액 다음날 교체 및 O / N 항온 처리를 반복한다. 백그라운드 염색이 너무 강한 경우에는, 염색의 시간을 줄이거 나, C ° 37 RT에서 샘플을 부화 대신. </li><li> 염색 액을 제거하고 PBS 부드럽게 RT 진탕, 약 5 분 동안 3 % DMSO를 포함하는 3 변경에 샘플을 씻는다. </li><li> 5 분 각 70 % 에탄올 2-3 변화 워시 샘플. 70 % 에탄올에 보관 샘플. </li></ol> 5. 수술 탈 신경 <ol><li> 단계 2.2에서와 같이 동물을 마취하고 전체 등쪽 피부를 면도. </li><li> 수술 영역 (을)를 준비Betadine 및 알코올 잎사귀 및 무균 수술 드레이프와 동물 다루 사용하여 다시 피부 F (데모 목적을 멸균 드레이프는 가시성을 높이기 위해 생략). 무균 수술 영역에서 작동하는 동안 가열 패드를 사용하여 동물을 따뜻하게 유지. </li><li> 꼬리 위의 약 0.5 cm에 목 기지에서 지느러미 중간 선을 따라 멸균 # 11 메스를 사용하여 절개를합니다. </li><li> 무딘 집게를 사용하여 부드럽게 단지 뒷다리 위에서 목 근처 견갑골 지방 패드의 하부 조직을 시각화 떨어진 측면에서 좌측 피부를 반영한​​다. 참고 : 지느러미 피부 신경 (그림 2) 날카로운 굴곡을 피부 아래에 느슨한 결합 조직에 들어가기 전에 트렁크 벽의 반투명 밴드를 통해 꼬리 쪽 여행으로 흰색 가닥 나타납니다. </li><li> 해부 현미경 하에서 광 초미립자 집게를 사용하여 애니 왼쪽에서 독점적 신경 제거어디에서 따 버릴에 의해 해부학 사이트 T3-12에 위치한 리터 피부에 입국 사이트에 트렁크 벽 세그먼트 벤드 (그림 2). <ol><li> 동양 집게 수직 및 스트레칭과 주변 조직 (- E 그림 2C)에서 분리 신경을 일으키는 원인이 자신의 굴곡 사이트 아래 약 0.5 cm를 잡고 위쪽으로 잡아 당겨 신경을 제거합니다. 인접한 혈관을 파열 않도록주의하십시오. </li><li> 피부에 트렁크 벽으로부터 연장 모든 신경이 제거 될 때까지 계속합니다. 트렁크 벽의 밀도 밴드 내에서 신경을 방해하지 마십시오. 주기적 멸균 0.9 % 식염수 용액의 방울을 적용하여 절차 내내 습윤 티슈 유지. </li><li> 또한, 집게와 트렁크 벽 근처에 자신의 근위 끝을 잡고 미세 가위로 자르는 것은에 의해 신경을 제거합니다. 그 후, 피부에 가까운 말단부를 절단 (도 2F - H). 마지막으로, INT를 제거ervening 신경 세그먼트 (그림 2I). </li></ol></li><li> 단계 5.4에 노출 된 피부 플랩에서 모든 신경을 제거합니다. 이 섬유는 등쪽 피부 신경의 말단 가지를 포함하고, 피부 플랩의 피부 측 (도 2J - K)에 결합 조직 내에서 산발적으로 위치한 흰색 분기 가닥으로 나타납니다. <ol><li> 이 좋은 지점을 제거하려면 미세 집게이 약은 피부 표면에 평행 신경을 파악하고 혈관을 방해하고 피부를 천공 방지하기 위해 위쪽으로 뽑아 놓습니다. 보이는 모든 신경이 제거 될 때까지 계속합니다. </li></ol></li><li> 무딘 절개를 사용 등쪽 정중선 절개 오른쪽의 피부를 반영하지만, 신경 제거되지 않는다. 이 반대측 가짜로 작동하는 제어 될 것입니다. </li><li> 간단한 중단 패턴에서 지느러미 중간 선을 따라 봉합은 절개를 닫습니다. 복구 및 사후 운영자 동안 동물을 모니터링atively로 이전 (단계 2.8-10) 보여 주었다. 수술 후 7 ~ 10 일이 봉합사를 제거합니다. </li><li> 기능적으로 수술 후 몇 주 안정 탈 신경을 위로 평가하기 위해, 전기 클리퍼를 사용하는 등의 피부에서 머리를 제거합니다. </li><li> 부드럽게 피하 주사 바늘을 사용하여 denervated 피부 영역을 찌를하고, 동물이 일반적으로 몸서리 또는 머리를 돌려, 응답 여부를 확인합니다. 피부 영역이 안정적 denervated 된 경우, 동물은 거의 또는 전혀 반응을 나타낼 것이다. </li><li> 검정색 마커를 사용하여, 반응의 영역뿐만 아니라, 반대측 모의 측 유사한 크기 및 위치의 영역을 설명합니다. </li><li> 단계 분석을위한 2.1-2.9에서 이러한 사이트에서 조직 검사를 수집합니다. 참고 : 또는 denervated 및 가짜로 작동하는 지역을 포함한 전체 지느러미 다시 피부를, 4 단계에 설명 된대로 유사한 전체 마운트 염색에 대한 한 장으로 제거 할 수 있습니다. </li></ol>

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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+intestinal+tuft+cells+serve+as+colon+cancer-initiating+cells.">Long-lived intestinal tuft cells serve as colon cancer-initiating cells.</a> J Clin Invest. 124, 1283-1295 (2014).</li><li>Uhmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hedgehog+receptor+Patched+controls+lymphoid+lineage+commitment.">The Hedgehog receptor Patched controls lymphoid lineage commitment.</a> Blood. 110, 1814-1823 (2007).</li><li>Lau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+control+of+gene+deletion+in+sensory+ganglia+using+a+tamoxifen-inducible+Advillin-Cre-ERT2+recombinase+mouse.">Temporal control of gene deletion in sensory ganglia using a tamoxifen-inducible Advillin-Cre-ERT2 recombinase mouse.</a> Mol Pain. 7, 100 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

신경은 감각에서뿐만 아니라 포유류의 장기 개발, 유지 보수 및 재생 13,24-27에서뿐만 아니라 중요한 기능을 제공합니다. 신경 최근 다양한 피부 질환에 연루되어있는 바와 같이, 여기에 설명 된 기술은 동물 질병 모델의 다양한 신경 분포에 대한 요구 사항을 연구하는데 사용될 수있다. 사실, 일방적 탈 신경 기술은 동일한 마우스에서 손상 또는 파괴 신경 중 하나와 피부의 직접적인 비교를 할 수 있습니다. 후속 데이터가 짝 t 검정을 활용하여 분석이 동물 대 동물 차이를 보상하기 위해 이상적인 내부 제어를 제공한다. 여기에 설명 된 절차를 크게 LacZ를 리포터 유전자를 이용할 수 있지만, 이러한 실험은 Gli1-CreERT2 대립 유전자는 TD에서 유전자 발현을 변경하기 위해 다른 형광 리포터 또는 조건부 대립 유전자와 결합되도록 구성 될 수있다. 예를 들면 Gli1-CreERT2 생쥐 교차 할 수있다타목시펜 유도 오 후 TD-유도 된 종양을 형성 쥐를 생성 Patched1 (B6N.129-Ptch1 tm1Hahn / J) (28)의 조건부 대립 유전자를 품고 동물. Gli1-CreERT2 균주는 물리적 TD 13에서와 분리 Gli1 + 모낭 줄기 세포의 서브 세트에서의 재결합을 유도하는 것이 중요하다. 탈 신경 후, 피부 신경은 몇 달 (그림 3C) 5,19에 대한 안정적 절제된 남아있다. 다른 연구에서, 그러나, 어떤 재 신경 분포가 6 시간에 걸쳐 발생하는 것으로보고되고있다. 그 피부의 진피층에 삽입 위치에 근접한 시점에 흉벽에서 자신의 출구 사이 신경 부분을 절제하는 것이 절대적으로 중요하다 같이 denervated 표현형의 perdurance은 신경 제거의 완전성에 의존 할 수있다. 완전히 removi이전 조직 검사로 피부에서 머리를 ng를하면 이후 전체 마운트 염색 (그림 1B)로 TDS 파일을 시각화 할 수있는 능력을 향상시킬 수 있습니다. 이 2 분 동안 클리핑 피부에 제모 크림을 적용하고 면봉을 사용하여 전방 대 후방 방향으로 떨어져 머리를 닦아하여 수행됩니다. 그 탈모는 성장기 성장 단계 진입을 촉진하여 머리 사이클 반응 속도에 영향을 미칠 수 있습니다. 대안 적으로, 모발이 완전히 면도날을 사용하여 제거 할 수있다. 또한, 이전에 전체 23 설명한 바와 같이 면역 조직이 진피로부터 분리 상피 시트에 TDs를하고 메르켈 세포를 시각화하기 위해 수행 될 수있는 탑재. 가능성은 수술 탈 신경이 잠재적으로 관찰 된 표현형을 교란, 수술 부위에 염증을 일으킬 수 있다는 것을 남아있다. 담보 조직 손상이 SK에서 발생하기 때문에 우리의 경험에서 우리는 가능성이 탈 신경 후 상당한 염증을 관찰하지 않은절차가 제대로 수행되는 경우에 약간입니다. 염증의 결과에 영향을 줄 수있는 가능성을 최소화하기 위해, 추가 제어는 실험에 혼입 될 수있다. 예를 들어, 우리는 탈 신경 구체적으로 TD-유도 된 종양을 억제 아니라 인접 헤어 TD를 5에서 그 탈 신경-아닌 일반 상처에 의한 염증 반응-가능성이 억제 종양을 주장 같은 피부 샘플에서 병변을 뿌리 관련된 것을 관찰했다. 수술 탈 신경은 감각 및 교감 신경 섬유 (5)를 포함한 모든 피부 신경을 절제한다주의하는 것이 중요하다, 따라서 두 정상 또는 병에 걸린 피부에 이러한 신경의 영향에 대한 일반적인 전반적인 평가를 제공합니다. 이러한 에이전트는 역행 억제 불분명하지만 이러한 보툴리눔 신경 독소로 pharmacologics를 사용하여 예를 들어 다른 실험 방법은, 더 자세한 기계론의 통찰력 (7)를 얻을 수 있으며, 신경 전달을 차단하는이러한 고슴도치 리간드와 같은 사이토 카인의 분비. 대안 적으로, 6-hydroxydopamine 같은 화합물은 피부 9 교감 신경 브레이션 사용되고있다. 또, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드와 물질 P 등의 신경 유도 인자 수용체를 표적으로하는 것은 그 틈새 (6) 내에서 신경 주변 세포 간의 상호 작용을 특정 질의에 유용 할 수있다. 결국 여러 전략이 식별하는 조합에서 이용 될 수 있고, 또는 적어도 잠재적 인 시그널링 메커니즘을 배제. 마지막으로, 신경과 틈새 (19) 사이에 교환되는 신호를 해명하기위한 황금 표준을 나타낼 수 Wnt1-Cre 호텔 또는 Advillin-Cre 호텔을 사용하여 신경 계통에 신경 유래 인자의 유전 삭제를 대상으로. 이들 균주 모두는 타목시펜 - 유도 한, 그러나 일부주의 신경 발달 또는 적절한 TA를 손상하지 않는 이들 신호의 중단하도록주의해야신경 구 심성의 rgeting. 이러한 Advillin-CreERT2으로 타목시펜 유도 Cre 호텔의 사용은 이러한 문제 29 회피하는 데 도움이 될 수 있습니다. 전반적으로, 기술은 정상과 병에 걸린 피부에 신경의 영향을 공부 혈통 추적, 휴대 시각화 및 수술 탈 신경-제공하는 강력한 접근 여기-조합을 설명했다. 경험이 절차는 동물 또는 연구자에 고통을 최소화시키면서, 일상적으로 안정적으로 수행 될 수있다.

Over the past few years, there has been a widening appreciation for the influence of nerves on diseases not typically regarded as classical neuropathies1-4. In the skin, recent experimental evidence has suggested that sensory nerves can modulate diverse pathologies ranging from psoriasis to cancer5-9. This has been demonstrated using techniques such as surgical denervation and pharmacological inhibition of neural function in rodents. In the case of psoriasis, these studies have provided a mechanistic framework for understanding why human psoriatic plaques regress following loss of neural function7,10-12.
Cutaneous nerves can also affect gene expression13,14 and are critical for mechanosensing in normal skin15. In particular, touch dome (TD) epithelia are comprised of a patch of columnar epidermal cells in juxtaposition with neuroendocrine Merkel cells innervated by slowly adapting type 1 (SA1) nerve fibers16-18. TDs mediate light touch sensation and have been shown to display Hedgehog pathway activity5,19. TD maintenance depends on innervation20,21, as nerves secrete Hedgehog ligands to sustain normal TDs and their associated Merkel cells19. In addition, innervation promotes Hedgehog-dependent tumor formation from TD epithelia5. Together, these studies reinforce the notion that intricate molecular interactions occurring between nerves and the surrounding cells in their niche are crucial for normal TD physiology as well as disease.
To interrogate the nature of these interactions, we describe here a series of in vivo techniques for manipulating gene expression in the TD, as well as for harvesting skin biopsies for TD visualization after lineage tracing. Finally, we describe procedures for performing unilateral surgical denervation, wherein nerves are removed from one side of the mouse dorsal skin, while leaving the contralateral side intact as a sham internal control. Several weeks after surgery, denervated and sham control skin are compared to assess changes that occur when nerves are ablated. Although these techniques are described in the context of normal TDs, the denervation procedure has been used to examine the requirement for nerves in mouse models of psoriasis6, wound healing13 and tumorigenesis5. Finally, since the skin is amenable to repeated biopsies, this provides an opportunity to monitor the long-term fates of labeled cells or to assess disease progression over multiple time points.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alcohol prep pads</td>
			<td>PDI</td>
			<td>B339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnaSed (Xylazine)</td>
			<td>Lloyd</td>
			<td>NADA 139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody, anti-Keratin 8</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>TROMA-I</td>
			<td>rat antibody, use at 1:500 concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody, anti-Keratin 17</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#4543</td>
			<td>rabbit antibody, use at 1:1,000 concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody, anti-Neurofilament</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>C28E10</td>
			<td>rabbit antibody, use at 1:500 concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine prep pads</td>
			<td>Medline</td>
			<td>MDS093917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen (Rimadyl)</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cordless rechargable clipper</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>trimmer model 8900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn Oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td>use at 1:1000 concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory Cream</td>
			<td>Nair</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylforamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>319937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge Pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCl</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC 0409-2051-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48404-454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH0502-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 nylon sutures</td>
			<td>DemeTECH</td>
			<td>NL166012F4P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octylphenyl-polyethylene glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottasium ferrocyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottasium ferricyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>702587</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5648-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra fine forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0103-5-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 651 745 001</td>
			<td>Disolve in dimethylforamide to create 50x stock prior to use</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cutaneous surgical denervation:  a method for testing the requirement for nerves in mouse models of skin disease

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies have suggested that nerves may also modulate skin disorders including atopic dermatitis, psoriasis and cancer. Here, we describe protocols for testing the requirement for nerves in maintaining a cutaneous mechanosensory organ, the touch dome (TD). Specifically, we discuss methods for genetically labeling, harvesting and visualizing TDs by whole-mount staining, and for performing unilateral surgical denervation on mouse dorsal back skin. Together, these approaches can be used to directly compare TD morphology and gene expression in denervated as well as sham-operated skin from the same animal. These methods can also be readily adapted to examine the requirement for nerves in mouse models of skin pathology. Finally, the ability to repeatedly sample the skin provides an opportunity to monitor disease progression at different stages and times after initiation.

생성 타목시펜 - 유도 Gli1 CreERT2 - 발현 생쥐와 LacZ를 리포터 대립함으로써, TD 상피를 시각화하고 시간이 지남에 따라 이들 세포의 운명을 추적 할 수있다. 전체 탈 신경 절차는 통상적으로, 마우스 당 1 시간 내에 완료 될 수 있고, 동물에게 최소의 고통을 야기한다. 5,19 - 우리의 이전 연구는 신경이 정상 TDs를뿐만 아니라 관련 각질 8 + 메르켈 세포 (C도 3a)을 모두 유지하기위한 중요한 것을 나타낼. 신경도 TD (그림 3D)에 Gli1 식을 촉진하기위한 중요하다. 피부 (그림 1B)에 걸쳐 TD 클러스터의 비교적 드문 모양을 감안할 때, 그것은 정확하게 TD 주파수를 정량하기 위해 여러 동결 절편을 샘플링하는 것이 필수적이다. 일반적으로, 우리는 15이 아닌 단점을 평가각 동물에서 모두 가짜 및 denervated 피부에서 (각 10 μm의 두께와 ~ 1cm 길이) ecutive 섹션. TD를시 피부에 걸쳐있는 다음 탈 신경 신경 안정 손실은 앞서 고정 된 파라핀 섹션 (도 3a 및도 3c에서 이러한 신경 미세 섬유와 같은 표준 팬 신경 마커에 대한 면역 조직 화학 염색의 부재에 의해 확인 될 수 있고, 보고 5). 대안 적으로, 신경도-β3 또는 튜 불린 PGP9.5 6,9- 발현에 의해 확인할 수있다. Gli1 사용함으로써, LacZ를 쥐, 상기 TD에서 헤지 호그 신호를 활성화 및 타목시펜 - 유도 재결합 탈 신경의 순서를 변경함으로써 TD 세포의 운명을 유지하는 신경에 대한 요구를 모두 확인 가능하다. 탈 신경 전에 재결합이 수행되면, 예를 들면, 이는 헤지 호그 pathwa을 활성화하는 신경에​​ 대한 요구를 테스트 할Y,이 동물에서 Gli1 식으로 상관 관계가 Cre 호텔의 재조합 효소의 활동 수준에 의해 모니터링으로. 탈 신경은 재결합 후에 행하면 한편,이 TD 이미 표지 된 세포를 유지하는 신경에​​ 대한 요구 사항을 평가할 것이다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54050/54050fig1.jpg" /> 그림 1. 피부 생검 및 TD 상피의 전체 마운트 LacZ를 염색. (A) 생검 후 마우스 (위) 사진 및 봉합하기 전에. (하단 왼쪽) 생검 사이트의 확대 이미지입니다. (오른쪽 아래) 피부 샘플은 건조 종이 타월에 평평하게 확산의 진피면 조직 검사에서 얻은. (B)는 Gli1에서 피부 전체 마운트 LacZ를 염색, LacZ를 마우스 7 일 타목시펜 유도 후는 피부의 시각화를 개선하기 위해 생검 직전를 면도. Gli1는 + / LacZ를 + TDs를이 강렬한 푸른 클러스터로 표시됩니다.스케일 바 = 1cm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54050/54050fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54050/54050fig2.jpg" /> 그림 2. 지느러미 피부를 denervating에 대한 두 가지 접근 방법. 신경 지배 마우스 피부 (A) 만화도. 빨간 점선은 트렁크 벽 (보라색)과 반사 피부 아래 진피 (회색, 별표)에 기본이되는 근육을 노출 지느러미 중간 선을 따라 만든 하나의 절제를 나타냅니다. 그들은 (검은 색 화살표가 하나의 굴곡을 나타냅니다) 트렁크 벽을 떠날 꼬리 쪽 여행 피부 신경은 &quot;밴드&quot;로 표시 지느러미. 신경 세그먼트는 검은 색 점선으로 경계가되는 절제한다. 표시 (화살표)를 절곡 부위와 손상 신경의 (B)의 사진. 파란색 화살표는 REM 수면이 될 것이 신경 세그먼트를 가리oved. 탈 신경 기법을 보여주는 - (C D) 사진. 굽​​힘 및 바깥쪽으로 당겨 자신의 사이트 아래에있는 신경을 그립, 0.5 cm를 초 미세 집게를 사용. (E)이 신경 세그먼트 (파란색 화살표)을 제거한 후, 체강을 보여주는 사진. 나머지 신경도 제거해야합니다. (F - 나는) 신경이 자신의 근위부에 냈다 곳 신경 제거를위한 다른 방법이 묘사되어 그냥 아래 끝 어디 벤드 (화살촉) (G), 또한 원심으로, 피부에 항목의 사이트에 가까운 (화살촉) (H). 이러한 이미지의 중간 선 절개가 더 나은 시각화의 목적에 대한 일반적인 이상 있음을 유의하십시오. 정중선의 일측에 반사 피변의 피부 측 (J)의 사진. (K) 신경은 빨간색으로 표시 큰 혈관으로, (검은 선) 설명되어 있습니다. 스키의 진피 측에 위치 신경n 개의 플랩은 절제해야합니다. 별표, 반사 된 피부 플랩에서 진피를 기본. 스케일 바 = 1mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54050/54050fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54050/54050fig3.jpg" /> 신경과 탈 신경 후의 TDS 악화 그림 3. 안정 손실. (A) 면역이 가짜로 작동하는 피부 각질 8 + 메르켈 세포 (녹색 K8)과 신경 미세 섬유 + 신경 (NF, 빨간색)와 TD 상피을 표시합니다. (B) TD 녹색에서 보라색, 메르켈 세포에서 강조 상피, 청색의 감각 신경 만화 묘사. TD를 지역 내에서 메르켈 세포 신경 돌기 단지가없는 (C) 면역 보여주는 denervated 피부 (덴). 점선 노란색 라인, 모낭 상피. 별표, backgroun입니다D 염색. (D) Gli1 LacZ를에서 전체 마운트 LacZ를 백 등의 염색 피부 / + 마우스 이주 일방적 피부 탈 신경 후. 치유 정중선 절개 (화살표)의 왼쪽에있는 상자에 풍부한 표시 TD의 상피 세포가 가짜로 작동하는 피부에서 관찰된다. 정중선의 오른쪽에, TDs를가 denervated 피부에 표시되지 않습니다. (A), (C)에 대한 눈금 막대 = 10 μm의; 및 (D) 1 mm이다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54050/54050fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Cutaneous Surgical Denervation:  A Method for Testing the Requirement for Nerves in Mouse Models of Skin Disease

This article includes detailed protocols for genetic labeling of mouse skin, surgical denervation, skin biopsy and visualizing labeled epithelia by whole-mount &#946;-galactosidase staining. These methods can be used to test the requirement for nerves in mouse models of normal and pathological skin.

탈 신경 외과 피부 : 피부 질환의 마우스 모델에서 신경에 대한 요구를 테스트하기위한 방법

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies ...

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Nanyang Technological University

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JoVE Journal

Medicine

9.7K 조회수.  University of Michigan. This article includes detailed protocols for genetic labeling of mouse skin, surgical denervation, skin biopsy and visualizing labeled epithelia by whole-mount β-galactosidase staining. These methods can be used to test the requirement for nerves in mouse models of normal and pathological skin.

비디오: Cutaneous Surgical Denervation:  A Method for Testing the Requirement for Nerves in Mouse Models of Skin Disease

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues as well as altered cytokine homeostasis. The innate immune system plays a crucial role in recognizing pathogens and other endogenous danger stimuli. One of the major cytokines released by innate immune cells is Interleukin (IL)-1. Therefore, we utilize a whole blood stimulation assay in order to measure the secretion of inflammatory cytokines and specifically of the pro-inflammatory cytokine IL-1&beta; 1, 2, 3.
Patients with genetic dysfunctions of the innate immune system causing autoinflammatory syndromes show an exaggerated release of mature IL-1&beta; upon stimulation with LPS alone. In order to evaluate the innate immune component of patients who present with inflammatory-associated pathologies, we use a specific immunoassay to detect cellular immune responses to pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), such as the gram-negative bacterial endotoxin, lipopolysaccharide (LPS). These PAMPs are recognized by pathogen recognition receptors (PRRs), which are found on the cells of the innate immune system 4, 5, 6, 7. A primary signal, LPS, in conjunction with a secondary signal, ATP, is necessary for the activation of the inflammasome, a multiprotein complex that processes pro-IL-1&beta; to its mature, bioactive form 4, 5, 6, 8, 9, 10.
The whole blood assay requires minimal sample manipulation to assess cytokine production when compared to other methods that require labor intensive isolation and culturing of specific cell populations. This method differs from other whole blood stimulation assays; rather than diluting samples with a ratio of RPMI media, we perform a white blood cell count directly from diluted whole blood and therefore, stimulate a known number of white blood cells in culture 2. The results of this particular whole blood assay demonstrate a novel technique useful in elucidating patient cohorts presenting with autoinflammatory pathophysiologies.

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&#946; using a Whole Blood Stimulation Assay

We describe a simple immunoassay to measure the production of pro-inflammatory cytokines, such as IL-1 beta production, in patients presenting with autoinflammatory phenotypes. By activating cells in whole blood cultures with pathogen-associated molecular patterns, specifically with lipopolysaccharide, cytokine secretion can be conveniently evaluated in whole blood supernatants.

전체 혈액 자극 분석을 사용하여 프로 염증성 시토킨 IL - 1β의 정확하고 간단한 측정

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

연구

의학

Clinical Testing and Spinal Cord Removal in a Mouse Model for Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS)

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disorder resulting in progressive degeneration of motoneurons. Peak of onset is around 60 years for the sporadic disease and around 50 years for the familial disease. Due to its progressive course, 50% of the patients die within 30 months of symptom onset. In order to evaluate novel treatment options for this disease, genetic mouse models of ALS have been generated based on human familial mutations in the SOD gene, such as the SOD1 (G93A) mutation. Most important aspects that have to be evaluated in the model are overall survival, clinical course and motor function. Here, we demonstrate the clinical evaluation, show the conduction of two behavioural motor tests and provide quantitative scoring systems for all parameters. Because an in depth analysis of the ALS mouse model usually requires an immunohistochemical examination of the spinal cord, we demonstrate its preparation in detail applying the dorsal laminectomy method. Exemplary histological findings are demonstrated. The comprehensive application of the depicted examination methods in studies on the mouse model of ALS will enable the researcher to reliably test future therapeutic options which can provide a basis for later human clinical trials.

Clinical Testing and Spinal Cord Removal in a Mouse Model for Amyotrophic Lateral Sclerosis ALS

A mouse model for amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is examined clinically and behaviorally. As a prerequisite for an accompanying immunohistological analysis the preparation of the spinal cord is depicted in detail.

루게릭병에 대한 마우스 모델 (ALS)의 임상 시험 및 척수 제거

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disorder resulting in progressive degeneration of motoneurons. Peak of onset is around 60 ...

Mouse Models for Graft Arteriosclerosis

Graft arteriosclerois (GA), also called allograft vasculopathy, is a pathologic lesion that develops over months to years in transplanted organs characterized by diffuse, circumferential stenosis of the entire graft vascular tree. The most critical component of GA pathogenesis is the proliferation of smooth muscle-like cells within the intima. When a human coronary artery segment is interposed into the infra-renal aortae of immunodeficient mice, the intimas could be expand in response to adoptively transferred human T cells allogeneic to the artery donor or exogenous human IFN-&gamma; in the absence of human T cells. Interposition of a mouse aorta from one strain into another mouse strain recipient is limited as a model for chronic rejection in humans because the acute cell-mediated rejection response in this mouse model completely eliminates all donor-derived vascular cells from the graft within two-three weeks. We have recently developed two new mouse models to circumvent these problems. The first model involves interposition of a vessel segment from a male mouse into a female recipient of the same inbred strain (C57BL/6J). Graft rejection in this case is directed only against minor histocompatibility antigens encoded by the Y chromosome (present in the male but not the female) and the rejection response that ensues is sufficiently indolent to preserve donor-derived smooth muscle cells for several weeks. The second model involves interposing an artery segment from a wild type C57BL/6J mouse donor into a host mouse of the same strain and gender that lacks the receptor for IFN-&gamma; followed by administration of mouse IFN-&gamma; (delivered via infection of the mouse liver with an adenoviral vector. There is no rejection in this case as both donor and recipient mice are of the same strain and gender but donor smooth muscle cells proliferate in response to the cytokine while host-derived cells, lacking receptor for this cytokine, are unresponsive. By backcrossing additional genetic changes into the vessel donor, both models can be used to assess the effect of specific genes on GA progression. Here, we describe detailed protocols for our mouse GA models.

We describe protocols for our mouse graft arteriosclerois (GA) models which involve interposition of a mouse vessel segment into a recipient of the same inbred strain. By backcrossing additional genetic changes into the vessel donor, the model can assess the effect of specific genes on GA.

이식 동맥 경화에 대한 마우스 모델

Graft arteriosclerois (GA),  also called allograft vasculopathy, is a pathologic lesion that develops over  months to years in transplanted organs ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

A simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or expensive animal. One of the reasons that this is not done more routinely is that it is relatively difficult, despite there being several published studies that describe ways to achieve it. In this paper we demonstrate a procedure that eliminates one of the major hurdles associated with this intubation, that of visualizing the trachea during the entire time of intubation. The approach uses a 0.5 mm fiberoptic light source that serves as an introducer to direct the intubation cannula into the mouse trachea. We show that it is possible to use this procedure to measure lung mechanics in individual mice over a time course of at least several weeks. The technique can be set up with relatively little expense and expertise, and it can be routinely accomplished with relatively little training. This should make it possible for any laboratory to routinely carry out this intubation, thereby allowing longitudinal studies in individual mice, thereby minimizing the number of mice needed and increasing the statistical power by using each mouse as its own control.

This paper describes a striaghforward and efficient method of intubating mice for pulmonary function measurements or pulmonary instillation, that allows the mice to recover and be studied at later times. The procedure involves an inexpensive fiberoptic light source that directly illuminates the trachea.

마우스 폐 삽관 법의 간단한 방법

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Tibial Nerve Transection - A Standardized Model for Denervation-induced Skeletal Muscle Atrophy in Mice

The tibial nerve transection model is a well-tolerated, validated, and reproducible model of denervation-induced skeletal muscle atrophy in rodents. Although originally developed and used extensively in the rat due to its larger size, the tibial nerve in mice is big enough that it can be easily manipulated with either crush or transection, leaving the peroneal and sural nerve branches of the sciatic nerve intact and thereby preserving their target muscles. Thus, this model offers the advantages of inducing less morbidity and impediment of ambulation than the sciatic nerve transection model and also allows investigators to study the physiologic, cellular and molecular biologic mechanisms regulating the process of muscle atrophy in genetically engineered mice. The tibial nerve supplies the gastrocnemius, soleus and plantaris muscles, so its transection permits the study of denervated skeletal muscle composed of fast twitch type II fibers and/or slow twitch type I fibers. Here we demonstrate the tibial nerve transection model in the C57Black6 mouse. We assess the atrophy of the gastrocnemius muscle, as a representative muscle, at 1, 2, and 4 weeks post-denervation by measuring muscle weights and fiber type specific cross-sectional area on paraffin-embedded histologic sections immunostained for fast twitch myosin.

The tibial nerve transection model is a well-tolerated, validated, and reproducible model of skeletal muscle atrophy. The model surgical protocol is described and demonstrated in C57Black6 mice. &#160;

경골 신경 절개 - 마우스의 탈 신경에 의한 골격근의 위축에 대한 표준 모델

The tibial nerve transection model is a well-tolerated, validated, and reproducible model of denervation-induced skeletal muscle atrophy in rodents. ...

Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely replicates both the technical and pathological processes that occur in human renal transplantation. Although mouse models of allogeneic rejection in organs other than the kidney exist, and are more technically feasible, there is evidence that different organs elicit disparate rejection modes and dynamics, for instance the time course of rejection in cardiac and renal allograft differs significantly in certain strain combinations. This model is an attractive tool for many reasons despite its technical challenges. As inbred mouse strain haplotypes are well characterized it is possible to choose donor and recipient combinations to model acute allograft rejection by transplanting across MHC class I and II loci. Conversely by transplanting between strains with similar haplotypes a chronic process can be elicited were the allograft kidney develops interstitial fibrosis and tubular atrophy. We have modified the surgical technique to reduce operating time and improve ease of surgery, however a learning curve still needs to be overcome in order to faithfully replicate the model. This study will provide key points in the surgical procedure and aid the process of establishing this technique.

Here, we present a protocol to study the immunology of rejection. The surgical model presented reports a short operating time and a concise technique. Depending on the donor-recipient strain combination, the transplanted kidney may develop acute cellular rejection or chronic allograft damage, defined by interstitial fibrosis and tubular atrophy.

마우스 신장 이식 : 동종 이식 거부의 모델

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely ...

A Mouse Fetal Skin Model of Scarless Wound Repair

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs across species but is age dependent. The transition from a scarless to scarring phenotype occurs in the third trimester of pregnancy in humans and around embryonic day 18 (E18) in mice. However, this varies with the size of the wound with larger defects generating a scar at an earlier gestational age. The emergence of lineage tracing and other genetic tools in the mouse has opened promising new avenues for investigation of fetal scarless wound healing. However, given the inherently high rates of morbidity and premature uterine contraction associated with fetal surgery, investigations of fetal scarless wound healing in vivo require a precise and reproducible surgical model. Here we detail a reliable model of fetal scarless wound healing in the dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

During mammalian development, early gestational skin wounds heal without a scar. Here we detail a reliable and reproducible model of fetal scarless wound healing in the cutaneous dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

흉터 상처 수리의 마우스 태아의 피부 모델

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs ...

Surgical Models of Gastroesophageal Reflux with Mice

Multiple surgical procedures have been reported to induce gastroesophageal reflux in animals. Herein, we report three surgical models with mice aiming to induce reflux of gastric contents, duodenal contents or mixed contents. Surgical procedures and general principles have been described in detail. A researcher with surgical experience should be able to grasp the technique after a short period of practice. After surgery, most mice can survive and develop reflux esophagitis similar to that in humans. However, it should be noted that histological differences between mouse and human esophagus are the inherent limitations of these surgical models. If used for research on Barrett&#8217;s esophagus and adenocarcinoma, these procedures may need to be combined with genetic modifications.

This article demonstrates surgical procedures of gastroesophageal reflux with mice. These models are useful tools for research on mechanisms and treatment of gastroesophageal reflux disease and potentially Barrett&#8217;s esophagus and esophageal adenocarcinoma.

마우스와 위식도 역류의 외과 모델

Multiple surgical procedures have been reported to induce gastroesophageal reflux in animals. Herein, we report three surgical models with mice aiming to ...

Surgical Placement of Catheters for Long-term Cardiovascular Exercise Testing in Swine

This protocol describes the surgical procedure to chronically instrument swine and the procedure to exercise swine on a motor-driven treadmill. Early cardiopulmonary dysfunction is difficult to diagnose, particularly in animal models, as cardiopulmonary function is often measured invasively, requiring anesthesia. As many anesthetic agents are cardiodepressive, subtle changes in cardiovascular function may be masked. In contrast, chronic instrumentation allows for measurement of cardiopulmonary function in the awake state, so that measurements can be obtained under quiet resting conditions, without the effects of anesthesia and acute surgical trauma. Furthermore, when animals are properly trained, measurements can also be obtained during graded treadmill exercise.
Flow probes are placed around the aorta or pulmonary artery for measurement of cardiac output and around the left anterior descending coronary artery for measurement of coronary blood flow. Fluid-filled catheters are implanted in the aorta, pulmonary artery, left atrium, left ventricle and right ventricle for pressure measurement and blood sampling. In addition, a 20 G&#160;catheter is positioned in the anterior interventricular vein to allow coronary venous blood sampling.
After a week of recovery, swine are placed on a motor-driven treadmill, the catheters are connected to pressure and flow meters, and swine are subjected to a five-stage progressive exercise protocol, with each stage lasting 3 min. Hemodynamic signals are continuously recorded and blood samples are taken during the last 30 sec of each exercise stage.
The major advantage of studying chronically instrumented animals is that it allows serial assessment of cardiopulmonary function, not only at rest but also during physical stress such as exercise. Moreover, cardiopulmonary function can be assessed repeatedly during disease development and during chronic treatment, thereby increasing statistical power and hence limiting the number of animals required for a study.

Here we present a protocol to assess cardiopulmonary function in awake swine, at rest and during graded treadmill exercise. Chronic instrumentation allows for repeated hemodynamic measurements uninfluenced by cardiodepressive anesthetic agents.

돼지의 장기 심장 혈관 운동 테스트를위한 카테터의 외과 배치

This protocol describes the surgical procedure to chronically instrument swine and the procedure to exercise swine on a motor-driven treadmill. Early ...

Repeated Measurement of Respiratory Muscle Activity and Ventilation in Mouse Models of Neuromuscular Disease

Accessory respiratory muscles help to maintain ventilation when diaphragm function is impaired. The following protocol describes a method for repeated measurements over weeks or months of accessory respiratory muscle activity while simultaneously measuring ventilation in a non-anesthetized, freely behaving mouse. The technique includes the surgical implantation of a radio transmitter and the insertion of electrode leads into the scalene and trapezius muscles to measure the electromyogram activity of these inspiratory muscles. Ventilation is measured by whole-body plethysmography, and animal movement is assessed by video and is synchronized with electromyogram activity. Measurements of muscle activity and ventilation in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis are presented to show how this tool can be used to investigate how respiratory muscle activity changes over time and to assess the impact of muscle activity on ventilation. The described methods can easily be adapted to measure the activity of other muscles or to assess accessory respiratory muscle activity in additional mouse models of disease or injury.

This paper introduces a method for repeated measurements of ventilation and respiratory muscle activity in a freely behaving amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mouse model throughout disease progression with whole-body plethysmography and electromyography via an implanted telemetry device.

신경 근육 질환의 마우스 모델에서 호흡 근육 활동 및 환기의 반복 측정

Accessory respiratory muscles help to maintain ventilation when diaphragm function is impaired. The following protocol describes a method for repeated ...