이 작품은 DFG 프로젝트 #의 JA2108 / 2-1를 통해 DJJ에 자금에 의해 지원되었다.

참고 : 다음 단계는 L.의 배아와 애벌레 단계에서 현장 실험의를 수행하기위한 우리의 방법을 간략하게 설명 공정이 단어 &#39;주의&#39;와 모든 적절한 안전 절차에 의해 지시 된 유해 화학 물질의 사용을 포함 stagnalis이. 채용한다. 유해 화학 물질에 대한 대표 MSDS 시트에 대한 링크는 보조 파일 (1)에 제공됩니다. 모든 시약에 대한 조리법은 보조 파일이 제공됩니다. 디 캡슐 레이션 장치의 1 회의 <ol><li> 이를 위해,도 2a에 도시 된 바와 같이 적절한 길이로 P1,000 팁 절단하여 (1 mm의 내경 및 3 mm의 외경)의 실리콘 튜브에 20 ㎖의 일회용 주사기를 연결한다. </li><li> 반전 큰 페트리 접시에 표준 현미경 슬라이드를 테이프. 도에 도시 된 바와 같이, 현미경 슬라이드에 바로 인접 실리콘 튜브 테이프60, 2C 및 2D. </li><li> 현미경 슬라이드에 뽑아 유리 바늘 나머지 부드럽게 바늘의 선단이 배관의 내부 직경을 가로 지르는 방향의 약 20 %가 돌출 될 때까지 상기 실리콘 튜브에 삽입 (도 2C 및 2D 참조). 바늘은 페트리 접시에 위치 테이프를 아래에 있으면. </li><li> 실리콘 튜브의 자유 단은 ​​캡슐화가 자료를 수집 다른 배양 접시에서 휴식을 허용합니다. </li></ol> 2. 시료 채취, 고정 및 캡슐화 참고 : 별도의 표시가없는 한, 모든 단계는 실온에서 수행된다. <ol><li> 조심스럽게 수족관의 벽에서 계란 문자열을 수집합니다. 이를 위해, 기판 떨어져 계란 문자열을 긁어 주걱으로 유연한 플라스틱의 평면 조각을 사용하고, 물에서 부동 달걀 문자열을 물고기 플라스틱 차 여과기를 사용합니다. 단도에서 제공하는 가이드를 사용하여 현미경으로 재 정렬1. </li><li> 종이 타월에 계란 문자열을 놓고 페더급 집게를 사용하여 산란 량을 따라 세로 절개를합니다. 계란 문자열에서 계란 캡슐 롤과 페더급 집게를 사용하여 종이 타월 주위를 밀어 각 캡슐에서 가능한 한 젤리 소재의 정도를 제거합니다. </li><li> 페더급 집게를 사용하여, 수돗물 5 ㎖를 포함하는 페트리 접시에 달걀 캡슐을 전송합니다. 이 접시에 원하는 발달 단계의 탈 젤리 계란 캡슐을 수집하기 위해 계속합니다. 계획 WMISH 실험 후 다음 단계로 진행에 대한 모든 개발 단계에서 충분히 캡슐을 수집합니다. </li><li> 선진 애벌레로 작업 할 때 고정하기 전에 그들을 마취시키다 (5 일 먼저 절단 (dpfc) 이상 게시). 참고 : 이것은 매우 어려운 현장 염색 패턴의 해석을하게 계약에서 근육을 방지 할 수 있습니다. <ol><li> 그들의 capsu 여전히 동안 (애벌레를 휴식이전 고정 30 분 • 6H 2 O의 MgCl 2의 2 %에 v / w 솔루션 레). </li><li> 정착액 솔루션에 자신의 달걀 캡슐에 여전히 여러 애벌레 동안 침지 및 현미경 자신의 반응을 모니터링하여 30 분 후 휴식의 정도를 평가합니다. 완전 이완 된 애벌레가 응답하지 반면 불완전 편안한 유충은 껍질에 철회 할 것입니다. 이 유충이 완화되고 나면 다음 단계로 진행합니다. </li></ol></li><li> 계란 캡슐의 10 배 부피를 제공하는 밀봉 튜브로 넓은 구멍 플라스틱 피펫을 사용하여 난자 캡슐을 전송 (예., 정착 캡슐 1 ㎖는 10+ ml의 튜브를 필요). </li><li> 대기음만큼 관으로부터 가능한 한 액과 정착 계란 캡슐의 체적 배이다 정착액 용액의 부피로 교체한다. 조심스럽게 각 발달 단계 (그림 1 참조)에 해당하는 시간 동안 실온에서 정착액에 계란 캡슐을 회전합니다. </li><li> DiscontinUE의 회전과는 캡슐이 침몰하여, 적절한 폐기 용기에 정착액 솔루션을 대기음 할 수 있습니다. </li><li> 5 분 동안 실온에서 0.1 % 트윈 -20 (PBTw)을 인산염 완충 식염수로 정착액 용액을 1,8- 회전 계란 캡슐 씻는다. PBTw을 대기음 두 번 반복합니다. </li><li> 배아 및 장치를 사용하여 캡슐에서 유충을 제거 튜브를 통해 유리 바늘 아웃에 과거 캡슐 튜브를 연결 한 후 불식. 그림 2 (자세한 내용은 섹션 1 참조) 20 ML의 주사기로 헤어 캡슐을 그립니다 컬렉션 접시. 주 : 일반적으로, 모든 캡슐의 대부분 (&gt; 90 %) 장치를 통해 하나의 패스를 필요로한다. 많은 경우에있어서, 캡슐 막의 손상되지만 배아와 유충 파열 캡슐 안에 남아있다. 단순히 주사기로를 그리기 다시 밝혀하여이 물질을 재 처리. </li><li> 마이크를 사용하여 1.5 ML 튜브에 디 캡슐화 배아와 애벌레를 수집ropipette (0에 대한 P20 - 삼일 오래 유충 및 팁의 끝 이전의 유충에 대한 P200은 차단). 참고 :이 단계에서 할 수있는 프로토콜 (몇 개월까지에 대한) 일시 정지. 이것은 필요한 경우 decapsuled 재료 저장 1.5 ㎖의 튜브 (다음 단계로 진행)에 수집한다. 그렇지 않으면 프로토콜 3 즉시 계속합니다. </li><li> 배아와 애벌레 튜브의 바닥에 가라 뜨는을 대기음 할 수 있습니다. PBTw에서 33 % 에탄올 (EtOH로)로 교체하고 5 앉아 보자 - 10 분. PBTw에서 66 % EtOH로 100 % EtOH로 반복합니다. RT에서 100 % EtOH로 두 번 유충을 씻으십시오. 100 %의 EtOH에서 -20 ° C에서 자료를 저장합니다. </li><li> 10 분 - 준비가 계속되면, 다시 수화물 100 %의 EtOH를 제거하고 PBTw에 66 % EtOH로 교체하여 샘플은 5 앉아 보자. 10 분 - 5 방치, PBTw에 33 % EtOH로 반복합니다. 마지막으로 모든 EtOH를 제거하기 위해 PBTw의 3 배 5 분 세척으로 세척한다. </li></ol> 3. 테-K, TEA 및 포스트 - Fi를xation 참고 : 우리는 빨리 시간이 중요한 솔루션을 교환 메쉬 바닥으로 가장 효율적이고 부드러운 방법을 작은 바구니에 다음 단계를 수행 찾을 수 있습니다. 이들은 집에서 만든 수 있지만, 우리는 Intavis InSituPro -Vsi 액체 처리 로봇 (www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc)와 호환되는 바구니 (중간 크기)를 사용합니다. 이러한 바구니 쉽고 빠르게 교환 해결하기 위해, 12 웰 조직 배양 접시 (TCD)의 웰 사이에서 이동 될 수 있거나, 상기 용액은 잘 피펫을 사용하여 흡인 할 수있다. 대안 적으로, 모든 용액 교환 단순히 유충으로부터 상등액을 흡인하여이 바구니없이 수행 될 수있다. 이 경우에 완만 한 선회 운동 상등액은 웰의 에지로부터 제거 될 수 있도록 접시의 중앙에 모든 배아와 유충을 집중한다. 다음은 사용자가 용액 교류 바스켓을 이용하는 것으로 가정. <ol><li> 피펫을 사용하여, PBTw 2 ㎖로 12 웰 TCD에 앉아 바구니에 전송 배아와 애벌레. 참고 :. 추가 된 발달 단계에 따라 할 수있다 배아 및 / 또는 유충의 수는 있지만 엄지 손가락의 일반적인 규칙은 배아 / 애벌레 (즉, 무료로 공간의 25 % 이상을 유지하는 것입니다, 조사되고,하지 ) 바구니를 혼잡하게. </li><li> 적절한 테-K 용액 (도 1 참조) 2 ㎖, 2 ml의 0.2 %의 글리신 각각 다른 웰이 잘 인접를 준비한다. 테-K의 잘 포함하는 적당한 농도로 각각의 바구니를 이동하고 바로 타이밍을 시작합니다. </li><li> 10 분 후 잘 포함 0.2 % 글리신으로 각각의 바구니를 이동하고 5 분 동안 품어. 그런 다음 0.2 % 글리신과 두 번째 우물에 각 바구니를 이동하고 5 분 동안 품어. 3 ㎖ PBTw의 3 배 5 분의 교류와 글리신을 씻으십시오. </li><li> PBTw 솔루션을 제거하고 새로 제조 트리에탄올 아민 (TEA) 졸 한 번 샘플을 치료5 분주의에 대한의 ution은! 선동하지 마십시오. 5 분 동안 새로 제조 TEA 용액 3 ㎖로 교체하십시오. 선동하지 마십시오. 샘플에서 TEA 용액의 대부분을 흡인. 무수 초산 (TEAAA) 용액으로 새로 제조 트리에탄올 아민을 추가하고 5 분.주의 부화! 선동하지 마십시오. </li><li> 선택 사항 - 위의 단계가 배양되는 동안, TEAAA 솔루션의 또 다른 신선한 배치를 준비하고 위의 단계를 반복합니다. 참고 : TEAAA와이 두 번째 치료는 선택 사항이지만 완전히 배경을 생성하는 경향이 프로브 모든 배경을 제거하는 데 도움이 될 수 있습니다. </li><li> 우물에서 흡입하여 TEAAA 솔루션을 제거하고 PBTw 3 ㎖로 교체합니다. 선동하지 마십시오. PBTw를 제거하고 PBTw 3.7 % 포름 알데히드의 3 ㎖를 적용합니다. 부드럽게 30 분 배양하는 동안 때때로 소용돌이 친다. </li><li> 우물에서 흡입하여 정착액을 제거하고 PBTw 3 ㎖로 교체합니다. 1.5 ML 튜브로 자료를 전송합니다. 아르 자형하이브리드 버퍼로 PBTw을 eplace 및 RT에서 5 분 동안 품어 -주의. </li><li> RT 핫 블록에 튜브를 배치하고, 원하는 혼성화 온도까지 온도를 설정한다. 참고 : 하이브리드 온도가 특정 프로브이며, 경험적으로 최적화 될 필요가있을 것이다, 그러나 우리는 55 ° C 좋은 온도 처음 재판을받을 수 찾을 수 있습니다. 블록이 혼성화 온도오고, 샘플은 약 15 분 동안 예비 혼성화 할 수 있도록 허용 (즉, 그 이상은 리보 프로브를 제조하는 데 소요되는 시간은 필요하지 않다). 적절한 볼륨 희석 된 리보 프로브의 (일반적으로 100 μl를) 준비합니다. 우리는 초기 범위 100 및 500 ng를 / ㎖의 일반적으로 시험 프로브 농도. 우리는 12에 따라 리보 프로브를 준비합니다. </li><li> 시료의 혼성화 완충액을 제거하고 샘플을 혼성화 완충액에 프로브를 추가한다. 100 μL (또는 적절한 부피 오버레이 혼성화 buffe 위에 상을 형성R)의 미네랄 오일. 주 : 미네랄 오일이 긴 혼성화 단계에서 형성됩니다 광범위한 결로를 방지 할 수 있습니다. 광범위한 축합 크게 혼성화 용액의 화학 프로브의 농도 모두를 변경한다. </li><li> 프로브와 10 분 동안 75 ℃로 샘플을 가열함으로써 표적 RNA를 변성하고 원하는 혼성화 온도로 열을 감소시킨다. (- 48 시간 24) 하이브리드는 12 시간 (O / N) 이상 최소 할 수있게합니다. </li><li> 혼성화 중에는 열 블록으로부터 하나의 튜브를 제거 유상을 방해하지 않고 유충 중단 엄지와 집게 손가락 사이에서 급속으로 회전하고, 가열 블록에 교체한다. 12 시간 정도 -이 한 번 매 6를 반복합니다. </li></ol> 4. 뜨거운 세척 및 면역 적를 참고 : 우리는 다음 단계의 액체 처리 로봇을 사용하지만,이 또한 쉽게 수동으로 수행 할 수 있습니다. 이 경우, 배아와 애벌레 소자민련은. 그들은에서 혼성화 된 1.5 ml의 튜브에 보관 이후의 모든 솔루션 교환은 흡입과 P1,000 피펫으로 추가됩니다. 수동으로 수행하는 경우 다음 단계의 각각은 각각의 용액 1 ㎖를 채용한다. <ol><li> 열 적절한 볼륨 배속, 2 배의 (3 ㎖ 각 샘플에 대한 각) 및 하이브리드 온도 1X 세척 솔루션을. </li><li> 하이브리드 온도에서 15 분 각각의 모든 샘플을 4 배 세척 버퍼에 세 번 씻으십시오. 하이브리드 온도에서 15 분 각각의 모든 샘플을 2 배 세척 버퍼에 세 번 씻으십시오. 하이브리드 온도에서 15 분 각각의 모든 샘플을 1X​​ 세척 버퍼에 세 번 씻으십시오. </li><li> 하이브리드 온도에서 1 배 나트륨 염화 나트륨 시트르산 버퍼 + 0.1 % 트윈 (SSC + 0.1 % 트윈) 한 번 모든 샘플을 씻으십시오. 샘플을 실온으로 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 승 MAB를 반복 말레 산 버퍼 (MAB)이 1 배 SSC 솔루션을 교체 15 분 동안 1 배 SSC + 0.1 % 트윈에 두 번 모든 샘플을 세척하고 10 분 동안 앉아 보자금연 건강 증진 협회. 블록 솔루션 MAB를 교체하고 1.5 시간 동안 품어. </li><li> (1 : 블록 솔루션 항체의 10,000 희석) 항체 용액의 블록 솔루션을 교환하고 부드러운 교반과 함께 실온에서 12 시간 (O / N) 동안 품어. </li></ol> 5. 컬러 개발 및 장착 <ol><li> 항체 솔루션을 기음 10 분 각각 PBTw으로 15 회 반복한다. 1 배 알칼리성 인산 버퍼 (AP)와 PBTw를 교체하고 10 분 동안 품어. </li><li> 주의 - 상기 배양 단계로 진행하여 상기 AP 염색 액을 제조하는 동안 (보조 파일 2 참조). 잘 TCD로 자료를 전송하고 AP 염색 용액으로 1 배 AP 솔루션을 교체합니다. 시간의 길이는 발색 반응을 기록 할 수있는 장소를 차지하도록 현재 시간을 참고. 배경 잡음비가 최적이 될 때까지 염색 패턴의 발전을 모니터한다. </li><li> 색상 개발을 중지하려면, 해당 WAST에 처분합니다 (1 배 AP 염색 용액을 제거전자 용기), 그리고 PBTw 2 ㎖을 적용하고 현재 시간을 확인합니다. 5 분마다 두 번 더 PBTw와 린스. 1.5 ML 튜브로 자료를 전송하는 데 다음과 헹굼 중 하나를 사용합니다. </li><li> (이것은 또한 O / N을 수행 할 수 있습니다)에 PBTw를 제거하고 PBTw 3.7 % 포름 알데히드 1 ㎖을 적용하고 교반 또는 실온에서 적어도 30 분을 돌립니다. </li><li> PBT의 3 세척 (적절한 폐기물 용기에 폐기물 정착액을 폐기)와 정착을 씻으십시오. 탈 이온수에 50 ° C에서 샘플을 3 회 반복한다. 참고 :이 세척은 삭제 및 시각화 단계에서 표시 될 수 있습니다 염의 침전을 제거한다. </li><li> 벤질 알코올 (BB : 또한 머레이의 맑은로 알려진 BA) 또는 글리세롤 샘플이 벤질 벤조 에이트에 설치할지 여부를 결정합니다. 참고 : 우리는 더 강력한 청소 에이전트 BB를 선호 : BA를 L.로 stagnalis 배아는 다소 불투명하다. 샘플은 BB에 장착 할 수 있습니다 : BA 먼저 에탄올 시리즈를 통해 탈수해야합니다. 샘플은 60 %에 마운트 될글리세롤 바로 장착 될 수있다. </li><li> 피펫을 사용하여 : (BA 또는 60 % 글리세롤 BB) 장착 용액에 샘플을 전송합니다. BB에 설치시 : 참고는 BA이 잘 된 유리에 수행해야합니다 (BB : BA는 폴리 카보네이트 플라스틱을 녹여 것입니다). </li><li> 10 분 후 스페이서로 적층 된 커버 적절한 수의 (샘플 &lt;1 dpfc, 샘플이 된 커버&gt; 1 dpfc 1 커버 슬립)를 사용하여 슬라이드에 그들을 탑재 - 샘플이 5 취소 할 수 있습니다. 참고 : 전체 마운트는 지금 DIC 광학와 복합 현미경을 사용하여 몇 군데 할 수 있습니다. </li></ol>

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S., Wanninger, A., Gunter, H. M., Degnan, B. M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+MAPK+signaling+in+patterning+and+establishing+axial+symmetry+in+the+gastropod+Haliotis+asinina.">The role of MAPK signaling in patterning and establishing axial symmetry in the gastropod Haliotis asinina.</a> Dev. Biol. 311 (1), 200-212 (2007).</li><li>Lartillot, N., Lespinet, O., Vervoort, M., Adoutte, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+pattern+of+Brachyury+in+the+mollusc+Patella+vulgata+suggests+a+conserved+role+in+the+establishment+of+the+AP+axis+in+Bilateria.">Expression pattern of Brachyury in the mollusc Patella vulgata suggests a conserved role in the establishment of the AP axis in Bilateria.</a> Development. 129 (6), 1411-1421 (2002).</li><li>Jackson, D. J., W&#246;rheide, G., Degnan, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+expression+of+ancient+and+novel+molluscan+shell+genes+during+ecological+transitions.">Dynamic expression of ancient and novel molluscan shell genes during ecological transitions.</a> BMC Evol. Biol. 7 (1), 160 (2007).</li><li>Jackson, D. J., Meyer, N. P., Seaver, E., Pang, K., McDougall, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+expression+of+COE.+across+the+Metazoa+supports+a+conserved+role+in+neuronal+cell-type+specification+and+mesodermal+development.">Developmental expression of COE. across the Metazoa supports a conserved role in neuronal cell-type specification and mesodermal development.</a> Dev Genes Evol. 220, 221-234 (2010).</li><li>Perry, K. J., Lyons, D. C., Truchado-Garcia, M., Fischer, A. H. L., Helfrich, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deployment+of+regulatory+genes+during+gastrulation+and+germ+layer+specification+in+a+model+spiralian+mollusc.">Deployment of regulatory genes during gastrulation and germ layer specification in a model spiralian mollusc.</a> Dev. Dyn. , (2015).</li><li>Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+patterns+of+engrailed+and+dpp+in+the+gastropod+Lymnaea+stagnalis.">Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis.</a> Dev Genes Evol. 218 (5), 237-251 (2008).</li><li>Shimizu, K., Iijima, M., Setiamarga, D. H. E., Sarashina, I., Kudoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left-right+asymmetric+expression+of+dpp+in+the+mantle+of+gastropods+correlates+with+asymmetric+shell+coiling.">Left-right asymmetric expression of dpp in the mantle of gastropods correlates with asymmetric shell coiling.</a> EvoDevo. 4 (1), 15 (2013).</li><li>Christodoulou, F., Raible, F., Tomer, R., Simakov, O., Trachana, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ancient+animal+microRNAs+and+the+evolution+of+tissue+identity.">Ancient animal microRNAs and the evolution of tissue identity.</a> Nature. 463, (2010).</li><li>Koga, M., Kudoh, T., Hamada, Y., Watanabe, M., Kageura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+triple+staining+method+for+double+in+situ+hybridization+in+combination+with+cell+lineage+tracing+in+whole-mount+Xenopus+embryos.">A new triple staining method for double in situ hybridization in combination with cell lineage tracing in whole-mount Xenopus embryos.</a> Dev Growth Differ. 49 (8), 635-645 (2007).</li><li>Lauter, G., S&#246;ll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+in+the+embryonic+zebrafish+brain+using+differential+detection+systems.">Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems.</a> BMC Dev. Biol. 11 (1), 43 (2011).</li><li>Davison, A., Frend, H. T., Moray, C., Wheatley, H., Searle, L. J., Eichhorn, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+behaviour+in+Lymnaea+stagnalis.+pond+snails+is+a+maternally+inherited,+lateralized+trait.">Mating behaviour in Lymnaea stagnalis. pond snails is a maternally inherited, lateralized trait.</a> Biol. Lett. 5 (1), 20-22 (2009).</li><li>Kuroda, R., Endo, B., Abe, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chiral+blastomere+arrangement+dictates+zygotic+left-right+asymmetry+pathway+in+snails.">Chiral blastomere arrangement dictates zygotic left-right asymmetry pathway in snails.</a> Nature. 462 (7274), 790-794 (2009).</li><li>Shibazaki, Y., Shimizu, M., Kuroda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Body+handedness+is+directed+by+genetically+determined+cytoskeletal+dynamics+in+the+early+embryo.">Body handedness is directed by genetically determined cytoskeletal dynamics in the early embryo.</a> Curr. Biol. 14 (16), 1462-1467 (2004).</li><li>Lu, T. Z., Feng, Z. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sodium+leak+current+regulates+pacemaker+activity+of+adult+central+pattern+generator+neurons+in+Lymnaea+stagnalis.">A sodium leak current regulates pacemaker activity of adult central pattern generator neurons in Lymnaea stagnalis.</a> PLoS One. 6 (4), e18745 (2011).</li><li>Dawson, T. F., Boone, A. N., Senatore, A., Piticaru, J., Thiyagalingam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Splicing+of+an+Invertebrate+Beta+Subunit+(LCav-beta)+in+the+N-Terminal+and+HOOK+Domains+and+Its+Regulation+of+LCav1+and+LCav2+Calcium+Channels.">Gene Splicing of an Invertebrate Beta Subunit (LCav-beta) in the N-Terminal and HOOK Domains and Its Regulation of LCav1 and LCav2 Calcium Channels.</a> PLoS ONE. 9 (4), e92941 (2014).</li><li>Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+evolutionary+relationships+of+molluscs+with+phylogenomic+tools.">Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools.</a> Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).</li><li>Gregory, T. R., Nicol, J. A., Tamm, H., Kullman, B., Kullman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+genome+size+databases.">Eukaryotic genome size databases.</a> Nuc. Acids. Res. 35 (Database issue), D332-D338 (2007).</li></ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

여기에 설명 된 방법은 Lymnaea stagnalis의 모든 개발 단계에서 아마도 다양한 발현 수준과 RNA 전 사체를 효율적으로 시각화 할 수 있습니다. 그들의 캡슐에서 배아 및 유충을 제거하려면 우리가 다른 encapsulated-보고 화학, 삼투압 충격 및 물리적 처리의 다양한 평가판을 모델 생물을 개발하고 있습니다. 그러나, 우리의 손에 우리는 여기에서 설명하는 방법은 배아와 유충 손상없이...

연체 동물은 과학 분야의 폭 넓은 다양성의 관심을 보유 동물의 그룹입니다. 자신의 형태 학적 다양성 (1)에도 불구하고, 종, 3 상업 의료 4 및 과학 문제 5-8의 넓은 범위와 관련 (종수 (2)의 관점에서 만 절지로 두 번째) 풍요 로움을 주장 할 수있다 상대적으로 적은 연체 동물 종들이있다 잘 갖추어 진 과학 모델과 실험실 환경에서 유지 보수가 용이 모두합니다. 많은 등의 신경 생물학 9, 생태 독성학 (10)과 최근 진화 생물학 11, 12 등의 분야에서 사용되는 하나의 연체 동물은 주로 때문에 광범위하게 배포 및 유지 보수의 극단적 인 용이성, Lymnaea의 stagnalis입니다. 는 &#39;모델&#39;유기체로서의 인기와 L. 사용할 발달 생물 학자 13-19, 분자 도구의 범위와 능력으로 사용의 오랜 역사에도 불구하고 stagnALIS 과학 사회는 훨씬 더 전통적인 동물 모델 (초파리, 마우스, 성게, 선충)의 뒤에 자리 잡고 있습니다. 분자 모델 쉘 형성을 유도 분자 메커니즘에 대한 관심에서 비롯된 우리의 욕망은 Lymnaea을 개발. 이 Lymnaea의 개발 기간 동안 유전자 발현의 효율적이고 일관성있는 민감한 시각화 허용하는 기술의 집합을 수정하는 동기를 부여. 현장 하이브리드의 전체 마운트 (WMISH)는 널리 모델 생물의 다양한 채용되며, 40 년 이상 20 사용되었습니다. 그 다른 guises에서 ISH 공간적 염색체 rRNA의, mRNA의 마이크로 RNA를 특정 유전자좌 국산화 사용될 수있다. 과제 중 하나는 이전 L.하는 WMISH 방법 정련 해결할 필요 stagnalis 부드럽게하고 효율적으로 추출하는 배아와 t에서 다양한 단계의 애벌레의 문제였다그는 그들이 퇴적 된 계란 캡슐. 이는 추출 또는 &#39;캡슐화&#39;는에 적합한 재료를 수집하기 위해 효율적으로 달성 할 필요가있는 동시에 형태 및 세포의 무결성을 유지하면서, 현장 실험에서 주어진. 다른 모델 생물도 캡슐화 개발을 겪는 동안, 우리 손에 그 종에 대해보고 된 방법 중 어느 것도 성공적 L.에 사용되지 않았다 stagnalis. 이 방법의 전반적인 목표는 따라서 다음과 같습니다 L.를 추출 stagnalis 높은 처리량 방식으로 그들의 캡슐에서 배아 및 유충 이미징을위한 만족스러운 WMISHsignals와 배아 및 유충을 준비하려면 WMISH 신호를 최적화 사전 하이브리드 치료를 적용합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2203">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Featherweight forceps</td>
			<td style="width:173px;">Ehlert &#38; Partner</td>
			<td style="width:104px;">#4181119</td>
			<td style="width:1547px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicon tubing</td>
			<td>Glasger&#228;tebau OCHS GmbH</td>
			<td>760070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass capillaries</td>
			<td>Hilgenberg</td>
			<td>1403547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12 well tissue culture dishes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CE55.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">37% Formaldehyde</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P733.1</td>
			<td>CAUTION - May cause cancer. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Toxic: danger of very serious irreversible effects through inhalation, in contact with skin and if swallowed.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediamine tetraacetic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN06.3</td>
			<td>CAUTION - CAUSES EYE IRRITATION. MAY CAUSE RESPIRATORY TRACT AND SKIN IRRITATION. Avoid breathing dust. Avoid contact with eyes, skin and clothing. Use only with adequate ventilation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2189.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9127.1</td>
			<td>CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3957.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ficoll type 400</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN90.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">polyvinylpyrrolidone K30 (MW 40)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4607.1</td>
			<td>CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nuclease freeBovine Serum Albumin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8895.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Salmon sperm</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5434.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7692.1</td>
			<td>CAUTION - ADVERSE EFFECTS INCLUDE HEMORRHAGE, LOCAL IRRITATION. POSSIBLE ALLERGIC REACTION IF INHALED, INGESTED/CONTACTED. EYES/SKIN/RESPIRATORY TRACT IRRITANT. POSSIBLE HYPERSENSITIZATION. DURING PREGNANCY HAS BEEN REPORTED TO INCREASE RISK OF STILLBIRTH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase-K</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7528.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycine</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3790.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deionised formamide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P040.1</td>
			<td>CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Standard formamide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6749.3</td>
			<td>CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triethanolamine</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6300.1</td>
			<td>CAUTION - Avoid breathing vapor or mist. Avoid contact with eyes. Avoid prolonged or repeated contact with skin. Wash thoroughly after handling.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetic anhydride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4483.1</td>
			<td>CAUTION - CAUSES SEVERE SKIN AND EYE BURNS. REACTS VIOLENTLY WITH WATER. HARMFUL IF SWALLOWED. VAPOR IRRITATING TO THE EYES AND RESPIRATORY TRACT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Maleic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K304.2</td>
			<td>CAUTION - Very hazardous in case of eye contact (irritant), of ingestion, . Hazardous in case of skin contact (irritant), of inhalation (lung irritant). Slightly hazardous in case of skin contact (permeator). Corrosive to eyes and skin.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzyl benzoate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6630-250ML</td>
			<td>CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. Harmful if swallowed.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzyl alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10,800-6</td>
			<td>CAUTION - Harmful if swallowed. Harmful if inhaled. Causes serious eye irritation.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3783.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blocking powder</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11096176001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti DIG Fab fragments AP conjugated</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris-HCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9090.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-Nitro blue tetrazolium chloride in dimethylformamide&#160;</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4421.3</td>
			<td>CAUTION - May cause harm to the unborn child. Harmful by inhalation and in contact with skin. Irritating to eyes.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A155.3</td>
			<td>CAUTION - Potentially harmful if ingested. Do not get on skin, in eyes, or on clothing. Potential skin and eye irritant.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-acetyl cysteine</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4126.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6908.1</td>
			<td>CAUTION - May cause eye and skin irritation. May cause respiratory and digestive tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tergitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NP40S</td>
			<td>CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Sodium dodecyl sulphate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN30.3</td>
			<td>CAUTION - Harmful if swallowed. Toxic in contact with skin. Causes skin irritation. Causes serious eye damage. May cause respiratory irritation.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4.2H2O)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4984.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3904.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Tri sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7.2H2O)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3580.1</td>
			<td>CAUTION - May cause eye, skin, and respiratory tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Mineral oil&#160;</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td style="width:104px;">HP50.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">InSituPro-Vsi&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Intavis</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a whole mount in situ hybridization method for the gastropod mollusc lymnaea stagnalis

현장 하이브리드의 전체 마운트 (WMISH는) 관심 (예 : 태아 또는 애벌레 같은)에 &#39;전체 마운트&#39;조직 준비 내의 핵산 분자 (보통의 mRNA)의 공간 해상도, 또는 발달 단계를 위해 할 수있는 기술이다. 따라서 매우 복잡한 후생 동물 게놈의 기능적 특성, 차세대 시퀀스 데이터의 범람에 병목이 더 있다는 반칙에 기여할 수 있기 때문에 WMISH은 매우 강력하다. 많은 시간은 종종 새로운 모델 시스템 WMISH 실험에 고유 한 각종 파라미터를 최적화하는데 필요한 기술의 개념적 단순함에도 불구하고; 조직 유형 및 발달 단계의 세포 및 생화학 적 특성의 미묘한 차이는 하나의 WMISH 방법은 모든 상황에 적합하지 않을 수 있다는 것을 의미한다. 우리는 일관 생성하고 다시 새로운 복족류 모델 Lymnaea의 stagnalis에 대한 WMISH 방법의 세트를 개발했다유전자의 모든 발달 단계에 걸쳐 범위에 대한 명확한 WMISH 신호. 이러한 방법은 개체 발생 창에 알 수없는 연대기 나이의 애벌레의 할당, 자신의 계란 캡슐에서 효율적으로 배아를 제거하고 유충, 각각의 개체 발생 창에 적절한 테-K 치료의 응용 프로그램 및 하이브리드, 이후 하이브리드 및 면역을 포함 단계. 이 방법은 주어진 RNA 전 사체에 대한 결과 신호는 프로브 특정 조정 (주로 농도와 혼성화 온도 프로브)을 추가로 정제 할 수있는 기반을 제공합니다.

도 3에 도시 된 대표적인 WMISH 염색 패턴이 상술 한 기술을 이용하여 생성하고, 쉘의 형성에 이르기까지의 분자 다양한 프로세스에 관여하는 유전자에 대한 공간 발현 패턴의 다양한 반영 하였다 (신규 유전자 1, 2, 3, 4) 개발 단계의 범위에 걸쳐 전사 조절 (Brachyury)으로 세포 - 세포 신호 (DPP)에 관한 것이다. 우리는 그들이 같은 것이라...

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A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

전체 산<em&gt; 현장에서</em복족류 연체 동물 용&gt; 하이브리드 방법<em&gt; Lymnaea의 stagnalis</em

The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

8.7K 조회수.  Georg-August University of Göttingen. The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

비디오: A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

조기 칙 태아의 현장 하이브리드화에서 더블 전체 산

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

연구

생물학

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

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Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

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Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of specific mRNA transcripts within whole mount specimen. This technique (adapted from Albertson and Yelick, 2005) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom at Syracuse University. The first two thirds of the Comparative Vertebrate Biology lab course gave students the opportunity to study the embryology and gross anatomy of several organisms representing various chordate taxa primarily via traditional dissections and the use of models. The final portion of the course involved an innovative approach to teaching anatomy through observation of vertebrate development employing molecular techniques in which WISH was performed on zebrafish embryos. A heterozygous fibroblast growth factor 8 a (fgf8a) mutant line, ace, was used. Due to Mendelian inheritance, ace intercrosses produced wild type, heterozygous, and homozygous ace/fgf8a mutants in a 1:2:1 ratio. RNA probes with known expression patterns in the midline and in developing anatomical structures such as the heart, somites, tailbud, myotome, and brain were used. WISH was performed using zebrafish at the 13 somite and prim-6 stages, with students performing the staining reaction in class. The study of zebrafish embryos at different stages of development gave students the ability to observe how these anatomical structures changed over ontogeny. In addition, some ace/fgf8a mutants displayed improper heart looping, and defects in somite and brain development. The students in this lab observed the normal development of various organ systems using both external anatomy as well as gene expression patterns. They also identified and described embryos displaying improper anatomical development and gene expression (i.e., putative mutants).
For instructors at institutions that do not already own the necessary equipment or where funds for lab and curricular innovation are limited, the financial cost of the reagents and apparatus may be a factor to consider, as will the time and effort required on the part of the instructor regardless of the setting. Nevertheless, we contend that the use of WISH in this type of classroom laboratory setting can provide an important link between developmental genetics and anatomy. As technology advances and the ability to study organismal development at the molecular level becomes easier, cheaper, and increasingly popular, many evolutionary biologists, ecologists, and physiologists are turning to research strategies in the field of molecular biology. Using WISH in a Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom is one example of how molecules and anatomy can converge within a single course. This gives upper level college students the opportunity to practice modern biological research techniques, leading to a more diversified education and the promotion of future interdisciplinary scientific research.

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology course in addition to vertebrate dissections. This gave students the opportunity to study gene expression patterns as well as gross anatomy, linking the study of molecular and organismal biology within one course.

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Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

전체 산<em&gt; 현장에서</emE11.5 마우스 태아에 E8.5의&gt; 하이브리드

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene expression. Microarray and next generation sequencing approaches are being used to investigate developmental, physiological and stress response processes, dissect epigenetic and small RNA pathways, and build large gene regulatory networks1-3. While these techniques facilitate the simultaneous analysis of large gene sets, they typically provide a very limited spatiotemporal resolution of gene expression changes. This limitation can be partially overcome by using either profiling method in conjunction with lasermicrodissection or fluorescence-activated cell sorting4-7. However, to fully understand the biological role of a gene, knowledge of its spatiotemporal pattern of expression at a cellular resolution is essential. Particularly, when studying development or the effects of environmental stimuli and mutants can the detailed analysis of a gene's expression pattern become essential. For instance, subtle quantitative differences in the expression levels of key regulatory genes can lead to dramatic phenotypes when associated with the loss or gain of expression in specific cell types. 
Several methods are routinely used for the detailed examination of gene expression patterns. One is through analysis of transgenic reporter lines. Such analysis can, however, become time-consuming when analyzing multiple genes or working in plants recalcitrant to transformation. Moreover, an independent validation to ensure that the transgene expression pattern mimics that of the endogenous gene is typically required. Immunohistochemical protein localization or mRNA in situ hybridization present relatively fast alternatives for the direct visualization of gene expression within cells and tissues. The latter has the distinct advantage that it can be readily used on any gene of interest. In situ hybridization allows detection of target mRNAs in cells by hybridization with a labeled anti-sense RNA probe obtained by in vitro transcription of the gene of interest. 
Here we outline a protocol for the in situ localization of gene expression in plants that is highly sensitivity and specific. It is optimized for use with paraformaldehyde fixed, paraffin-embedded sections, which give excellent preservation of histology, and DIG-labeled probes that are visualized by immuno-detection and alkaline-phosphatase colorimetric reaction. This protocol has been successfully applied to a number of tissues from a wide range of plant species, and can be used to analyze expression of mRNAs as well as small RNAs8-14.

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

The in situ hybridization protocol described here allows a direct localization of mRNA and small RNA expression at the cellular level with high sensitivity and specificity. The procedure is optimized for paraffin-embedded plant tissue sections, is applicable to a wide range of plants and tissues, and can be completed within ten days.

식물의 성적 증명서의 정확한 현지화에 대한 원위치 하이브리드화에서

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

전체 마운트 RNA 형광<em&gt; 현장에서</em의&gt; 하이브리드<em&gt; Drosophila</em&gt; 태아

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNA<em&gt; 현장에서</em전체 마운트 태아 및 세포 조직학에서&gt; 하이브리드는 해양 Elasmobranchs을위한 적응

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

높은 해상도 전체 마운트<em&gt; 제자리에서</em유전자 발현 및 기능을 연구하는 제브라 피쉬 배아에서&gt; 하이브리드

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...