본 연구는 CLL 글로벌 연구 재단에서 기금에 의해 지원되었다. 텍사스 MD 앤더슨 암 센터의 대학은 암 센터 지원 그랜트 (P30CA16672)을 통해 국립 보건원 (National Institutes of Health)에 의해 부분적으로 지원됩니다.

1. 데이터 마이닝 접근법을 사용하여 마이크로 RNA 유전자의 프로모터에서 전사 인자 바인딩 사이트를 확인 <ol><li> DNA 요​​소 (ENCODE) 프로젝트의 백과 사전의 일부로서 생성 된 크로 마틴 면역 침강 (칩) 시퀀싱 데이터를 추출하기 위해 캘리포니아 대학 산타 크루즈 (UCSC) 게놈 브라우저를 사용합니다. <ol><li> UCSC 게놈 브라우저에서 테이블 브라우저를 엽니 다. </li><li> 테이블을 추출하기 위해 다음과 같은 사양을 사용하여 계통 군 (포유류), 게놈 (인간), 조립 (Feb2009 (GRch37 / hg18)), 그룹 (규제), 트랙 (TxnFactorChIP을), 테이블 (weEncoderesTFbsCo7steredv3), 지역 (게놈), 출력 형식 (선택 테이블에서 모든 유전자). </li><li> .txt 파일로 스프레드 시트에 1.1.2의 출력을 저장합니다. </li><li> 관심있는 전사 인자 (예를 들어, STAT2)에 대한 정렬 및 필터. </li></ol></li><li> Baeer 등에서 사용할 수 H3K4me3의 후성 유전학 서명을 기반으로 마이크로 RNA 프로모터의 목록을 사용합니다. (9) </suP&gt;. .txt 파일에이 목록을 복사합니다. </li><li> 인간 게놈의 좌표에 따른 일치 (예를 들어, STAT3은 추정 마이크로 RNA 프로모터에 결합) 1.1 및 1.2에서 데이터를 매핑 파일 1 코딩 기업에서 설명한 바와 같이 날카로운 C에 기록 된 코드를 이용하여 평균 결합 친화도를 결정한다. </li></ol> 2. 사용의 shRNA 관심의 전사 인자의 발현을 다운 조절 <ol><li> 플레이트에서 약 50 % 합류 (DMEM, 10 % FBS)와 10cm 플레이트에서 293 인간 배아 신장 세포주에서 1.5 × 106 세포. </li><li> shRNA를 함유 녹색 형광 단백질 (GFP) 렌티 바이러스 5 μg의 293 인간 배아 신장 세포주에서 형질 세포는 관심의 전사 인자에 관한 포장 벡터 5㎍을가 제조사의 프로토콜에 따라 부착 된 세포 형질 감염 시약을 이용하여 함께. </li><li> 대조군으로서, 293 인간 배아 신장 세포주에서 세포를 형질shRNA를 제조사의 프로토콜에 따라 패키징 벡터를 스크램블링. </li><li> (37 ° C, CO 2 배양기에서) 16 시간 동안 세포에 형질 전환 믹스를 유지 한 후 10 % FBS와 신선한 10 % DMEM 미디어 10 ml의 미디어를 변경합니다. </li><li> 48 시간 포스트 형질을 기다립니다 세포 배양 (300 XG, 5 분) 원심 분리 및 감염 상층 액을 수집합니다. 부동 세포를 제거하기 위해 0.45 μm의 주사기 필터 (25 mm 계면 활성제 무료 셀룰로오스 아세테이트 막)을 통해 뜨는을 필터링합니다. </li><li> 상등액을 농축시키고 100 kDa의의 임계 값과 함께 ultracentrifugal 필터 장치를 사용하는 렌티 바이러스를 수집한다. (30) 950 XG에 스핀 - 볼륨까지 60 분 미만 250 μL에 집중하고있다. -80 ° C에서 집중 바이러스를 저장합니다. </li><li> 렌티 바이러스와 함께 세포를 형질 감염. -80 ° C의 냉동고에서 냉동 렌티 바이러스를 제거하고 실온에 해동. 새로운 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브에 바이러스 뜨는 100 μl를 전송합니다. <ol><li> 브린g까지 감소 된 혈청 배지 1 ㎖의에 튜브에 볼륨. 10 ng를 / ㎖의 최종 농도 1 ml의 바이러스 현탁액에 hexadimethrine 브로마이드를 추가 부드럽게 혼합하고, 혼합물을 5 분 동안 서 보자. </li></ol></li><li> 원심 5 × 106 세포에 대한 각각의 전달 부드럽게 바이러스를 함유 배지에 0.5 ml의 세포 펠렛을 재현 탁. 다음, 10 % FBS의 최종 농도로 20 % FBS 배지로 0.5를 가하여 24 시간 - 셀 4 동안 인큐베이터에 머물게. </li><li> 48 ~ 72 시간을 기다린 요오드화 프로피 듐 (PI) 및 제조업체의 지침에 따라 녹색 형광 단백질 (GFP)와 세포를 얼룩. 빛으로부터 세포를 보호하고 GFP + / PI의 속도 측정하기 위해 FACS 분류기를 사용 - 세포. PI 얼룩 만 사균 때문에,이 비율은 살아있는 세포에서 형질 감염 효율의 추정치이다. </li><li> 이전 10 설명 된대로 FACS 분류기에 의한 GFP 발현 (GFP의 +)에 대한 긍정적 인 세포 인구를 정렬합니다. </li><li> 사용 WesteRN 면역 블롯은 이미 전에 shRNA를 지정하여 (예를 들어, CLL 세포) 관심의 세포를 감염 후 관심있는 전사 인자의 수준을 결정하기 위해 열을 설명했다. </li></ol> 3. 전사 인자-shRNA를 형질 세포에서 마이크로 RNA 전 사체 (Transcriptome)의 발현 수준을 결정 <ol><li> RNA는 제조자의 프로토콜에 따라 상업적 키트를 사용하여 분리. </li><li> RNA의 레이블 및 마이크로 RNA 마이크로 어레이 (11)에 혼성화. </li><li> 전사 인자의 shRNA 또는 빈 벡터 제어 5 형질 감염된 세포에서 차별적으로 발현 마이크로 RNA를 결정합니다. </li><li> PCR 5 실시간하여 가장 차별적으로 발현 마이크로 RNA에 대한 마이크로 어레이 결과를 검증. </li></ol> 4. 전사 인자 종속 사체 (Transcriptome)를 설명하기에 생물 정보학 및 shRNA를 접근 사이의 중복 결정 <ol><li> DET하려면, 형질 전환 된 세포를 자신의 프로모터에 결합 부위 전사 인자 항구 및 전사 인자의 shRNA에서 하향 조절 된 마이크로 RNA 유전자의 예상 및 관찰 비율을 족제비 다음을 수행하십시오 <ol><li> 1.3에서 생성 된 목록에서 자신의 프로모터 / 총 마이크로 RNA에 대한 관심의 전사 인자 항구 유전자의 비율을 얻습니다. 이 목록은 (예를 들어, STAT3 결합 부위 / 총 마이크로 RNA 유전자와 마이크로 RNA 유전자 = 0.25 시험) 예상 비율이다. </li><li> 3.3 생성 목록에서 전사 인자 shRNA를 형질 감염된 세포에서 하향 조절 1.3 생성 목록에서 관심 결합 부위의 전사 인자를 가지고 있었다 유전자의 수를 결정한다. 하향 조절 유전자의이 수 / 총 수는 관찰 된 비율 (예를 들어, 하향 조절 마이크로 RNA의 STAT3 사이트를 결합 / 총 수 = 0.6과 마이크로 RNA 유전자). </li></ol></리&gt; <li> 상기 생성 된 관찰 예상 비율을 비교하고 전사 인자 shRNA를 형질 세포에서 하향 조절 된 유전자의 목록을 자신의 발기인에 전사 인자 결합 부위에 농축되어 있는지 여부를 확인하기 위해 통계를 χ2 사용합니다. </li></ol>

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The authors declare no competing financial interests.

단백질 코딩 유전자의 RNA 폴리머 라제 전사에 의존 II- 근본적인 메커니즘은 광범위하게 연구되어왔다. 이들 원소는 1 %를 구성하지만 - 인간 게놈의 2 %, 인 코드 프로젝트 증거가 인간 게놈의 80 % 이상이 전사 17 겪을 수 있고, 어떻게 비 - 코딩 DNA 요소의 전사를 조절하는 것을 제안은 거의 알려지지 않았다 6 . 폴 II는 또한 마이크로 RNA (6) 등 일부 비 단백질 코딩 유전자의 전사에 대한 책임이 있음을 나타내는 여러 연구는 잠재력을 해독하기 위해 공개적으로 이용 가능한 자원, 계산 알고리즘에서와 시험관 연구에서 데이터를 결합 전략을 개발하기 위해 우리를 안내 마이크로 RNA의 전사를 조절에 대한 관심이 전사 인자의 기능. 여기에서 제안 된 전략이 중요한 단계를 포함한다. 먼저 우리는 전사 인자 (B)을 식별하기 위해 공개적으로 이용 가능한 데이터를 사용하여마이크로 RNA 프로모터에 inding. 이를 위해 우리는 전사 결합 인자 및 마이크로 RNA-발기인의 간접적 인 지표로 발기인을 대표한다 후생 유전 학적 서명을 식별 할 ENCODE 컨소시엄에 의해 출판 칩 서열 데이터를 사용합니다. 이러한 데이터 세트에서 유전 적 좌표를 횡단하는 것은 관심의 전사 인자가 마이크로 RNA-프로모터에 결합하는 방법을 자주의 총 추정을 제공한다. 둘째 전사 인자의 발현을 침묵의 shRNA 기술을 사용하여 마이크로 RNA-배열 셀을 실시함으로써, 마이크로 RNA-사체에 전사 인자의 기능적 의미를 탐색 할 수있다. 마이크로 RNA 발현의 변화는 부분적으로 전사 인자에 따라 조절하여 설명한다. 화학 양 론적 변화와 다른 세포 또는 세포 외 요인이 중요한 역할을하고 제안 된 알고리즘의 시뮬레이션되지 않습니다. 다른 제한은 다음과 같다 : H3K4me3에 기초한 프로모터 분석서명은 939 주석 마이크로 RNA에 이루어졌다. 그 이후로 많은 마이크로 RNA의 게놈 위치가 확인되었다. 그러나 업데이트 된 데이터베이스를 기반으로 우리의 지식보다 포괄적 인리스트의 최선을 아직 게시되지 않았습니다. 939 마이크로 RNA 유전자의 프로모터 영역을 대표한다 H3K4me3은 781 마이크로 RNA 유전자 (83 %)로 확인되었다. 이 분석은 명확 불완전한 데이터 세트에 기초하면서 그러므로, 마이크로 RNA-사체의 상당 부분을 캡처한다. 또한, 후성 유전학의 서명이 부분에 각인 및 부품 세포 특이입니다. 따라서, 후성 유전학 마커에 의해 정의 된 추정 발기인의 generability는 의문을 제기 할 수있다. H3K4me3이 전사 18 독립적 지속 있기 때문에 일반적으로 각인 발기인의 마커로 간주됩니다. 이러한 프로모터가 다른 세포 -에서 확인 된 경우에 우리가 여기에 제시 분석 알고리즘은 따라서 세포 특이 마이크로 RNA 프로모터를 놓칠 수 있습니다유형. 마지막으로, 결론은 테스트해야하고 경험적으로 확인했다. 특히, 전사 인자의 다운 조절 간의 연결을하고 (마이크로 RNA 어레이에 의​​해 식별 된) 마이크로 RNA 발현 (shRNA를 접근법을 사용하여) 그러한 염색질 면역 (칩) 또는 전기 영동 이동성과 같은 허용되는 분석법에 의해 확인되어야 직접 전사 역할을 제안 할 변화 분석 (EMSA). 여기에 제안 된 방법에 대한 수정은 마이크로 RNA 프로모터를 식별하는 여러 가지 방법과 예를 들어 전사 인자의 발현을 쓰러 뜨린 다른 방법, 대신의 shRNA의 작은 간섭 RNA를 포함한다. 마이크로 RNA의 전사 조절 단백질 코딩 유전자 (유전자 내 마이크로 RNA) 및 (유전자 간 마이크로 RNA) 그렇지 않은 내에 상주 마이크로 RNA에 대한 실질적으로 다를 수 있습니다. 유전자 내 마이크로 RNA는 통상적으로 그들의 숙주 유전자 (19)와 함께 전사되기 때문에 프로모터는 일반적으로 즉시 발견 upstrea전사 시작 사이트를 해요. 그러나 일반적으로 단백질 코딩 유전자에 사용되는 많은 유전자 간 전사 개시 사이트가 제대로 주석이 마이크로 RNA 및 예측 툴 저조한 20 수행합니다.

마이크로 RNA는 일반적으로 전사 후 수준에서 mRNA 발현의 부정적인 레귤레이터 기능 내생 작은 비 코딩 규제 RNA를합니다. 약 1,000 비 코딩 긴 마이크로 RNA가 인간 게놈 1,2에서 발견되는 20 뉴클레오티드 25. 마이크로 RNA는 통상 3 &#39;비 번역 영역 대상의 mRNA (UTR)에있는 마이크로 RNA와 상보 시드 일치 서열의 시드 서열 간의 정규 염기쌍을 통해 유전자 발현을 조절한다. 종합적으로, 마이크로 RNA는 단백질 코딩 유전자 (3)의 30 % 이상을 조절하지만, 단지 작은 마이크로 RNA는 DNA로부터의 전사에 대해 공지되어있다. 이는 마이크로 RNA 전사의 조절이 mRNA의 4,5- 유사한 것으로 제안되었다. 특히, 단백질을 코딩하는 유전자의 전사를 촉진하는 활성과 유사하게, 전사 인자는 마이크로 RNA (6)의 전사를 활성화하는 것으로 생각된다. 전사 인자-microRNA의 작용 유전자 발현 (7)의 변조 요소로보고되었으며 수도 또한 피드백 및 피드 포워드 루프를 형성한다. 예를 들어, Yamakuchi 등 알.이 p53과 p53의 차례로 리프레 SIRT 환산하여 p53의 활성을 증가 8 억제 microRNA34a의 발현을 유도하는 피드백 루프를보고 하였다. 마이크로 RNA의 전사 인자 의존성 발현의 구체적인 예는보고 된 반면, 관심의 전사 인자는 마이크로 RNA-사체의 발현을 조절하는 방법에 관한 정보를 제공하는 방법으로 인정이 부족하다. 본 명세서에 제안 된 프로토콜의 목적은 마이크로 RNA-사체의 전사 인자 의존성 규제에 대해 자세히 설명한다. 공개적으로 이용 가능한 데이터, 생물 정보학 도구 결합 및 마이크로 어레이 기술을 사용하여이 알고리즘을 수행 연구자 게놈 규모에 캡처 할 수있는 얼마나관심 셀 타입의 전사 인자는 마이크로 RNA-사체의 발현을 조절하고 마이크로 RNA 발현을 조절하는 전사 인자의 mRNA의 기여도를 추정 탐색.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamin 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668027</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m syringe filter</td><td>Thermo Scientific (Nalgene)</td><td>190-2545</td><td></td></tr><tr><td>Amicon ultracentrifugal filter device with threshold of 100&amp;nbsp;kDa</td><td>Merck Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Merck Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol reagent</td><td>Life Tachnologies (Invitrogen)</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>293 Cell line human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85120602</td><td></td></tr></tbody></table>

describing a transcription factor dependent regulation of the microrna transcriptome

단백질 코딩 유전자의 전사 조절이 광범위하게 연구 동안, 약간은 특히 마이크로 RNA 전사 인자가 비 코딩의 RNA 전사에 관여하는 방법에 공지되어있다. 여기서, 우리는 공개적으로 이용 가능한 데이터, 연산 리소스 및 높은 처리량 데이터를 이용하여 마이크로 RNA의 전사를 조절하는 전사 인자의 잠재적 인 역할을 연구하기위한 전략을 제안한다. 우리는 전사 인자 결합 부위에 충실 마이크로 RNA 프로모터를 식별 할 ENCODE 프로젝트에서 -sequencing 데이터를 마이크로 RNA 발기인 및 염색질 면역 침전 (칩)을 식별 할 H3K4me3 후생 유전 학적 서명을 사용합니다. shRNA를 관심 전사 인자 타겟팅 및 마이크로 RNA 배열 셀을 실시하여 원하는 세포를 형질 감염함으로써, 우리는 마이크로 RNA 전 사체에서이 전사 인자의 효과를 연구한다. 예시 예를 들어 우리는 만성 만민의 마이크로 RNA 전 사체에 STAT3의 효과에 대한 연구를 사용mphocytic 백혈병 (CLL) 세포.

STAT3은 전형적 항 세포 사멸 및 증식 효과가 12 유전자의 전사를 유도하는 전사 인자이다. STAT3 여부는 비 코딩 된 RNA 전 사체는 현재 알려지지 않은 영향을 미친다. 모든 CLL 세포에서 STAT3는 세린 (707) 잔류 10,13에 구성 적 인산화이다. 핵에 포스 포세린 STAT3 셔틀은 DNA에 결합하고, 다른 세포 유형 10 티로신 pSTAT3 의해 활성화 될 것으로 알려진 유전자를 활성화합니다. CLL은 마이크로 RNA 네트워크 (14)의 전역 완화 특징으로하기 때문에, 우리는 세린 pSTAT3의 존재 CLL 세포에서 마이크로 RNA의 발현에 영향을 미치는 것으로 가정 하였다. 이 STAT3 바인딩 사이트를 식별 할 수 있었다 항구 마이크로 RNA의 프로모터를 가설을 말씀 테스트합니다. 하여 배어 등. (9) 영역의 H2K4me3 히스톤 후 변형에 의해 생성 된 데이터를 건너STAT3은 칩 서열 실험 15에 의해 식별 결합 부위와 프로모터 부위를 특징 양이온, 추정 STAT3 결합 부위가 확인되었다. 160 추정 발기인 100 (가장 낮은 점수)에서 1,000 (최고 점수) (표 1)에 이르기까지 결합 점수 (N = 200) 조사 마이크로 RNA 유전자의 약 25 %에서 발견 된이 방법을 사용. 그 후 CLL 세포는 STAT3-shRNA를하거나 빈 벡터 및 마이크로 RNA 배열을 이용하여 형질 아래로 형질 전환 (그림 1) STAT3이 마이크로 RNA의 전사를 촉진 것을 건의 다음과 같은 규정 된 63 마이크로 RNA를 발견했다. 63 마이크로 RNA 하향 조절 유전자의 60 % (N = 38) 확률 (p &lt;0.0001)에 의해 기대되는 것보다 훨씬 더 많은 유전자의 상류에 위치 추정되는 프로모터에 결합 STAT3 확인 칩 서열 데이터. 형질 감염 후 하향 조정했다 나인 마이크로 RNA,STAT3에 부정적인 전사의 수준을 조절하는 것을 제안. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53300/53300fig1.jpg" /> STAT3-shRNA를 가진 CLL 세포의 형질 감염도 1은 STAT3 단백질 및 STAT3 mRNA의 발현 수준을 감소시킨다. A :. (서양 면역 검출 오른쪽 패널)을 STAT3 단백질의 STAT3-의 shRNA (정량적 RT-PCR에 의해 검출 왼쪽 패널) STAT3의 mRNA의 수준과 수준 CLL 세포의 형질 전환 후 유의하게 감소 B : CLL의 마이크로 RNA 배열 세포는 발현 빈 벡터로 형질 STAT3-shRNA를 형질 CLL 세포와 CLL 세포 사이에 유의 한 차이 (23) 마이크로 RNA를 묘사했다. . 0.01 미만의 P 값이 통계적으로 유의 C 여겨졌다 다음을 사용하여 STAT3-shRNA를 처리 후 차동 표현했다 7 마이크로 RNA의에 의해 정량화 평균 발현 RT-PCR마이크로 RNA 배열입니다. 바는 평균의 표준 오차를 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53300/53300fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 기업 코딩 파일 1 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53300/Supplemental_coding_file_1.docx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 마이크로 RNA 유전자 </td><td> 염색체 </td><td> 발기인 시작 좌표 </td><td> 프로모터 최종 좌표 </td><td> 중앙값 (범위) STAT3 결합 점수 * </td></tr><tr><td> 은 miR-1205은 miR-1206은 miR-1207 </td><td> 8 q24.21 </td><td> 128961454 </td><td> 128962791 </td><td> 1000 (1,000에서 1,000 사이) </td></tr><tr&gt; <td> 은 miR-1537 </td><td> 1 q42.3 </td><td> 236045425 </td><td> 236047415 </td><td> 1000 (1,000에서 1,000 사이) </td></tr><tr><td> 은 miR-21 </td><td> 17 q23.1 </td><td> 57901872 </td><td> 57921277 </td><td> 1000 (112-1000) </td></tr><tr><td> 은 miR-3124 </td><td> 1 Q44 </td><td> 249115404 </td><td> 249123965 </td><td> 1000 (1,000에서 1,000 사이) </td></tr><tr><td> 은 miR-451 </td><td> 17q11.2 </td><td> 27222251 </td><td> 27224114 </td><td> 1000 (1,000에서 1,000 사이) </td></tr><tr><td> 은 miR-92B </td><td> 1 Q22 </td><td> 155162340 </td><td> 155168439 </td><td> 1000 (1,000에서 1,000 사이) </td></tr><tr><td> 은 miR-3197 </td><td> 21 q22.2 </td><td> 42537544 </td><td> 42543023 </td><td> 943 (943-943) </td></tr><tr><td> 은 miR-646 </td><td> 20 q13.33 </td><td> 58712550 </td><td> 58715320 </td><td> 789 (789-789) </td></tr><tr><td> 은 miR-629 </td><td> 15 Q23 </td><td> 70383751 </td><td> 70394586 </td><td> 773 (661-885) </td></tr><tr><td> 은 miR-30E 미르-30C-1 </td><td> 1 p34.2 </td><td> 41173077 </td><td> 41177703 </td><td> 759 (759-759) </td></tr><tr><td> 은 miR-3125 </td><td> 2 p24.3 </td><td> 12855381 </td><td> 12862915 </td><td> 756 (756-756) </td></tr><tr><td> 은 miR-3145 </td><td> 6 q23.3 </td><td> 138776942 </td><td> 138779365 </td><td> 743 (487-1000) </td></tr><tr><td> 은 miR-645 </td><td> 20 q13.13 </td><td> 49199911 </td><td> 49201187 </td><td> 743 (743-743) </td></tr><tr><td> 은 miR-1256 </td><td> 1 p36.12 </td><td> 21346830 </td><td> 21350211 </td><td> 725 (725-725) </td></tr><tr><td> 은 miR-619 </td><td> 12 q24.11 </td><td> 109248263 </td><td> 109253306 </td><td> 719 (719-719) </td></tr><tr><td> 은 miR-181a-2 미르-181b-2 </td><td> 9 q33.3 </td><td> 127418928 </td><td> 127426139 </td><td> 710 (710-710) </td></tr><tr><td> 은 miR-29A 미르-29B-1 </td><td> 7 q32.3 </td><td> 130583383 </td><td> 130597803 </TD&gt; <td> 697 (482-1000) </td></tr><tr><td> 은 miR-202 </td><td> 10 q26.3 </td><td> 135069499 </td><td> 135077337 </td><td> 696 (393-1000) </td></tr><tr><td> 은 miR-3142 미르-146A </td><td> 5 Q34 </td><td> 159890882 </td><td> 159899475 </td><td> 671 (671-671) </td></tr><tr><td> 은 miR-548C </td><td> 12 q14.2 </td><td> 65000968 </td><td> 65011503 </td><td> 660 (660-660) </td></tr><tr><td> 은 miR-630 </td><td> 15 q24.1 </td><td> 72764289 </td><td> 72769197 </td><td> 627 (255-1000) </td></tr><tr><td> 은 miR-135B </td><td> 1 q32.1 </td><td> 205416952 </td><td> 205452990 </td><td> 622 (245-1000) </td></tr><tr><td> 은 miR-29C 미르-29B-2 </td><td> 1 q32.2 </td><td> 207991044 </td><td> 208002382 </td><td> 608 (608-608) </td></tr><tr><td> 은 miR-1825 </td><td> 20 q11.21 </td><td> 30791020 </td><td> 30798310 </td><td> 604 (209-1000) </td></tr><tr><td> 은 miR-548h-1 </td><td> 14 q23.2 </td><td> (64)578834 </td><td> 64581657 </td><td> 587 (174-1000) </td></tr><tr><td> 은 miR-612 </td><td> 11 q13.1 </td><td> 65183633 </td><td> 65198528 </td><td> 581 (157-1000) </td></tr><tr><td> 은 miR-148B </td><td> 12 q13.13 </td><td> 54717640 </td><td> 54721204 </td><td> 578 (578-578) </td></tr><tr><td> 은 miR-3174 </td><td> 15 q26.1 </td><td> 90543381 </td><td> 90549092 </td><td> 576 (152-1000) </td></tr><tr><td> let7a-3, let7b </td><td> (22) </td><td> 46480680 </td><td> 46481826 </td><td> 573 (146-1000) </td></tr><tr><td> 은 miR-1255a </td><td> 4 Q24 </td><td> 102263848 </td><td> 102272541 </td><td> 557 (557-557) </td></tr></tbody></table> STAT3 결합 부위와 표 1. 추정 적 마이크로 RNA의 발기인.이 프로토콜은 게시 된 데이터의 데이터 마이닝을 이용하여 마이크로 RNA의 추정 프로모터에 결합 전사 인자를 식별하는 방법을 제공. 예로서, 여기 추정 마이크로 RNA 프로모터 STAT3의 결합을 도시하는 테이블을 제안한다. 바인딩 점수는 ENCODE 프로젝트 (15)의 일부로 게시 전체 게놈 칩의 서열 데이터로부터 0 1,000 규모로 제공됩니다. 발기인은 H3K4me3 후생 유전 학적 서명 (9)의 존재에 의해 식별됩니다.

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Describing a Transcription Factor Dependent Regulation of the MicroRNA Transcriptome

Herein we propose a strategy to study the effect of a transcription factor of interest on the microRNA transcriptome using publically available data, computational resources and high throughput data from microRNA arrays after transfecting cells with small hairpin (sh)RNA targeting a transcription factor of interest.

마이크로 RNA 전 사체 (Transcriptome)의 전사 인자 종속 규정을 설명

While the transcription regulation of protein coding genes was extensively studied, little is known on how transcription factors are involved in ...

describing-transcription-factor-dependent-regulation-microrna

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.3K 조회수.  Rabin Medical Center. Herein we propose a strategy to study the effect of a transcription factor of interest on the microRNA transcriptome using publically available data, computational resources and high throughput data from microRNA arrays after transfecting cells with small hairpin (sh)RNA targeting a transcription factor of interest. 

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Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; untranslated region (UTR) of target mRNA to inhibit protein translation or in some instances cause mRNA degradation. The binding of the miRNA to the 3&#39; UTR of the target mRNA is mediated by a 2&#8211;8 nucleotide seed sequence at the 5&#39; end of miRNA. While the role of miRNAs as cellular regulatory molecules is well established, identification of the target mRNAs with functional relevance remains a challenge. Bioinformatic tools have been employed to predict sequences within the 3&#39; UTR of mRNAs as potential targets for miRNA binding. These tools have also been utilized to determine the evolutionary conservation of such sequences among related species in an attempt to predict functional role. However, these computational methods often generate false positive results and are limited to predicting canonical interaction between miRNA and mRNA. Therefore, experimental procedures that measure direct binding of miRNA to its mRNA target are necessary to establish functional interaction. In this report, we describe a sensitive method for validating direct interaction between the cellular miRNA miR-125b and the 3&#39; UTR of PARP-1 mRNA. We elaborate a protocol in which synthetic biotinylated-miRNA mimics were transfected into mammalian cells and the miRNA-mRNA complex in the cellular lysate was pulled down with streptavidin-coated magnetic beads. Finally, the target mRNA in the pulled-down nucleic acid complex was quantified using a qPCR-based strategy.

This report describes a fast and reliable method for validating mRNA targets of cellular miRNAs. The method uses synthetic biotinylated Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA mimics to capture target mRNA. Subsequently, streptavidin-coated magnetic beads are employed to pulldown the target mRNA for quantification by qPCR polymerase chain reaction.

Biotin 기반 풀 다운 유효성 검사 mRNA를 표적 세포 miRNAs 분석 결과

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

연구

유전학

A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells

MicroRNAs (miRNAs) are short RNA molecules that are widespread in eukaryotes. Most miRNAs are transcribed from introns, and their maturation involves different RNA-binding proteins in the nucleus. Mature miRNAs frequently mediate gene silencing, and this has become an important tool for comprehending post-transcriptional events. Besides that, it can be explored as a promising methodology for gene therapies. However, there is currently a lack of direct methods for assessing miRNA expression in mammalian cell cultures. Here, we describe an efficient and simple method that aids in determining miRNA biogenesis and maturation through confirmation of its interaction with target sequences. Also, this system allows the separation of exogenous miRNA maturation from its endogenous activity using a doxycycline-inducible promoter capable of controlling primary miRNA (pri-miRNA) transcription with high efficiency and low cost. This tool also allows modulation with RNA-binding proteins in a separate plasmid. In addition to its use with a variety of different miRNAs and their respective targets, it can be adapted to different cell lines, provided these are amenable to transfection.

We developed an intronic microRNA biogenesis reporter assay to be used in cells in vitro with four plasmids: one with intronic miRNA, one with the target, one to overexpress a regulatory protein, and one for Renilla luciferase. The miRNA was processed and could control luciferase expression by binding to the target sequence.

포유류 세포에서 인트로닉 마이크로RNA 성숙을 분석하기 위한 리포터 분석

MicroRNAs (miRNAs) are short RNA molecules that are widespread in eukaryotes. Most miRNAs are transcribed from introns, and their maturation involves ...

암 연구학

MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and understanding the biological properties of viruses. There are several mechanisms for regulating viral tropism, however they tend to be virus class specific and many result in virus attenuation. Additionally, many viruses, including picornaviruses, exhibit size constraints that do not allow for incorporation of large amounts of foreign genetic material required for some targeting methods. MicroRNAs are short, non-coding RNAs that regulate gene expression in eukaryotic cells by binding complementary target sequences in messenger RNAs, preventing their translation or accelerating their degradation. Different cells exhibit distinct microRNA signatures and many microRNAs serve as biomarkers. These differential expression patterns can be exploited for restricting gene expression in cells that express specific microRNAs while maintaining expression in cells that do not. In regards to regulating viral tropism, sequences complementary to specific microRNAs are incorporated into the viral genome, generally in the 3' non-coding regions, targeting them for destruction in the presence of the cognate microRNAs thus preventing viral gene expression and/or replication. MicroRNA-targeting is a technique that theoretically can be applied to all viral vectors without altering the potency of the virus in the absence of the corresponding microRNAs. Here we describe experimental methods associated with generating a microRNA-targeted picornavirus and evaluating the efficacy and specificity of that targeting in vitro. This protocol is designed for a rapidly replicating virus with a lytic replication cycle, however, modification of the time points analyzed and the specific virus titration readouts used will aid in the adaptation of this protocol to many different viruses.

We describe here a method for regulating picornavirus tropism by incorporating sequences complementary to specific microRNAs into the viral genome. This protocol can be adapted to all different classes of viruses with modifications based upon the length and nature of their life cycle.

피 코르 나 바이러스과의 바이러스 친 화성의 마이크로 RNA-기반 규제

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and ...

면역학 및 감염병학

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide cDNA library cloned into the 3'UTR downstream from the dual-selection fusion protein, thymidine kinase-zeocin (TKzeo). The first round of selection is for stable transformants, followed with introduction of a miRNA of interest, and finally, selecting for cDNAs containing the miRNA's target. Selected cDNAs are identified by sequencing (see Figure 1-3 for Target ID Library Workflow and details).
To ensure broad coverage of the human transcriptome, Target ID Library cDNAs were generated via oligo-dT priming using a pool of total RNA prepared from multiple human tissues and cell lines. Resulting cDNA range from 0.5 to 4 kb, with an average size of 1.2 kb, and were cloned into the p3&#900;TKzeo dual-selection plasmid (see Figure 4 for plasmid map). The gene targets represented in the library can be found on the Sigma-Aldrich webpage. Results from Illumina sequencing (Table 3), show that the library includes 16,922 of the 21,518 unique genes in UCSC RefGene (79%), or 14,000 genes with 10 or more reads (66%).

The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide collection of cloned cDNA used to identify miRNA targets. Here we demonstrate its use and application.

선교 대상 아이디 라이브러리를 사용하여 miRNA 목표를위한 게놈 - 와이드 스크린

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

생물학

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes. More than 700 human miRNAs have been identified so far with each having up to hundreds of unique target mRNAs. Computational tools, expression and proteomics assays, and chromatin-immunoprecipitation-based techniques provide important clues for identifying mRNAs that are direct targets of a particular miRNA. In addition, 3'UTR-reporter assays have become an important component of thorough miRNA target studies because they provide functional evidence for and quantitate the effects of specific miRNA-3'UTR interactions in a cell-based system. To enable more researchers to leverage 3'UTR-reporter assays and to support the scale-up of such assays to high-throughput levels, we have created a genome-wide collection of human 3'UTR luciferase reporters in the highly-optimized LightSwitch Luciferase Assay System. The system also includes synthetic miRNA target reporter constructs for use as positive controls, various endogenous 3'UTR reporter constructs, and a series of standardized experimental protocols.
Here we describe a method for co-transfection of individual 3'UTR-reporter constructs along with a miRNA mimic that is efficient, reproducible, and amenable to high-throughput analysis.

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and have been shown to play a role in numerous biological processes. To better understand miRNA-UTR interactions, we have created a genome-wide collection of 3 UTR luciferase reporters paired with a novel luciferase gene and assay reagent, the LightSwitch system.

3&#39;UTR - 기자의 구성과 microRNA를 사용하여 LightSwitch의 루시페라제 분석 시스템과 인간 microRNAs의 확인 대상이 자기편 세포의 모방

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

3&#39;LIFE의 분석을 사용하여 높은 처리량 miRNA의 표적의 탐지

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

The Ago2-miRNA-co-IP Assay to Study TGF- &#946;1  Mediated Recruitment of miRNA to the RISC in CFBE Cells

Micro(mi)RNAs are short, non-coding RNAs that mediate the RNA interference (RNAi) by post-transcriptional mechanisms. Specific miRNAs are recruited to the cytoplasmic RNA induced silencing complex (RISC). Argonaute2 (Ago2), an essential component of RISC, facilitates binding of miRNA to the target-site on mRNA, followed by cleaving the miRNA-mRNA duplex with its endonuclease activity. RNAi is mediated by a specific pool of miRNAs recruited to RISC, and thus is referred to as the functional pool. The cellular levels of many miRNAs are affected by the cytokine Transforming Growth Factor-&#946;1 (TGF-&#946;1). However, little is known about whether the TGF-&#946;1 affects the functional pools of these miRNAs. The Ago2-miRNA-co-IP assay, discussed in this manuscript, is designed to examine effects of TGF-&#946;1 on the recruitment of miRNAs to RISC and it helps to determine whether changes in the cellular miRNA levels correlate with changes in the RISC-associated, functional pools. The general principles of the assay are as follows. Cultured cells treated with TGF-&#946;1 or vehicle control are lysed and the endogenous Ago2 is immunoprecipitated with immobilized anti-Ago2 antibody, and the active miRNAs complexed with Ago2 are isolated with a RISC immunoprecipitation (RIP) assay kit. The miRNAs are identified with quantitative reverse-transcriptase polymerase chain reaction (qRT-PCR) using miRNA-specific stem-looped primers during reverse transcription, followed by PCR using miRNA-specific forward and reverse primers, and TaqMan hydrolysis probes.

Here, we describe the Ago2-miRNA-co-IP assay designed to quantify an active pool of specific miRNAs induced by TGF-&#946;1 in human bronchial epithelial CFBE41o- cells. This assay provides functional information on the recruitment of miRNA to the RNA induced silencing complex, quantified by qRT-PCR using specific miRNA primers and TaqMan hydrolysis probes.

Micro(mi)RNAs are short, non-coding RNAs that mediate the RNA interference (RNAi) by post-transcriptional mechanisms. Specific miRNAs are recruited to the ...

CRISPR Gene Editing Tool for MicroRNA Cluster Network Analysis

MicroRNAs (miRNAs) have emerged as important cellular regulators (tumor suppressors, pro-oncogenic factors) of cancer and metastasis. Most published studies focus on a single miRNA when characterizing the role of small RNAs in cancer. However, ~30%&#160;of human miRNA genes are organized in clustered units that are often co-expressed, indicating a complex and coordinated system of noncoding RNA regulation. A clearer understating of how clustered miRNA networks function cooperatively to regulate tumor growth, cancer aggressiveness, and drug resistance is required before translating noncoding small RNAs to the clinic.
The use of a high-throughput clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-mediated gene editing procedure has been employed to study the oncogenic role of a genomic cluster of seven miRNA genes located within a locus spanning ~35,000 bp in length in the context of prostate cancer. For this approach, human cancer cell lines were infected with a lentivirus vector for doxycycline (DOX)-inducible Cas9 nuclease grown in DOX-containing medium for 48 h. The cells were subsequently co-transfected with synthetic trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA) complexed with genomic site-specific CRISPR RNA (crRNA) oligonucleotides to allow the rapid generation of cancer cell lines carrying the entire miRNA cluster deletion and individual or combination miRNA gene cluster deletions within a single experiment.
The advantages of this high-throughput gene editing system are the ability to avoid time-consuming DNA vector subcloning, the flexibility in transfecting cells with unique guide RNA combinations in a 24-well format, and the lower-cost PCR genotyping using crude cell lysates. Studies using this streamlined approach promise to uncover functional redundancies and synergistic/antagonistic interactions between miRNA cluster members, which will aid in characterizing the complex small noncoding RNA networks involved in human disease and better inform future therapeutic design.

This protocol describes a high-throughput clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) gene editing workflow for microRNA cluster network analysis that allows the rapid generation of a panel of genetically modified cell lines carrying unique miRNA cluster member deletion combinations as large as 35 kb within a single experiment.

마이크로RNA 클러스터 네트워크 분석을 위한 CRISPR 유전자 편집 도구

MicroRNAs (miRNAs) have emerged as important cellular regulators (tumor suppressors, pro-oncogenic factors) of cancer and metastasis. Most published ...

Regulation of Expression Occurs at Multiple Steps

Gene expression can be regulated at almost every step from gene to protein. Transcription is the step that is most commonly regulated. This involves the binding of proteins to short regulatory sequences on the DNA. This association can either promote or inhibit the transcription of a gene associated with the respective sequence.
Transcription results in the generation of precursor (pre-mRNA) that consists of both exons and introns, which needs further processing before being translated to a protein. This happens through mRNA splicing, which involves the removal of non-coding regions and merging of the coding ones. mRNA processing can also be used as a regulatory mechanism through variation in splicing patterns such as skipping of certain exons, alternative splicing, and inclusion of introns.&#160;
The addition of a poly-A tail at the 3&#8217; end and a 5&#8217; cap to produce the mature mRNA are also regulatory points during RNA processing. Regulation occurs through variation in the polyadenylation signal, which determines where the poly-A tail will be added onto the mRNA.&#160; In some cases, more than one poly-A signal is present at the 3&#8217; end which will change the length of the 3&#8217; untranslated region, but the final protein product will be the same. However, the stability and the translation potential the variants mRNA may differ, which can alter the amount of protein produced. In other cases, an additional poly-A signal is present on the intron or exon within the gene sequence which may lead to variation in splicing sites for polyadenylation and result in different proteins from the same strand of pre-mRNA.The addition of the 5&#8217; cap, which is made up of methylated guanosine, is regulated by two mechanisms.&#160; One involves the regulation of the methyltransferases that add the methyl group to the guanosine, and the other is through regulation of the cellular signaling pathways that lead to methylation.
Next, the mature mRNA needs to be transported from the nucleus to the cytoplasm through nuclear pore complexes (NPCs) to be translated. This is regulated by the mRNA to forming a complex, known as the ribonucleoparticle, with RNA binding proteins. NPCs only allow mRNAs that are in the complex to pass into the cytoplasm. Once an mRNA enters the cytoplasm for translation, it can either be targetted individually or as a part of a group through specific regulations, or it can undergo a common regulation with all other mRNAs in the cytoplasm. In specific regulation, particular trans-acting elements, like proteins and different types of RNAs, regulate transcription. In general regulation, the proteins involved in the translation machinery are activated or inhibited, which in turn affects the translation of all transcripts. The most common translational regulatory mechanism is the modification of the translation initiation factor.
Gene expression can also be regulated through post-translational modifications, where an enzyme-catalyzed reversible modification can alter the function of a protein. A common post-translational modification is phosphorylation, which is carried out by enzymes known as kinases. Dephosphorylation of proteins, on the other hand, is carried out by proteins known as phosphatases. Phosphorylation of a protein can result in its activation or deactivation and alter its function.

Regulation of Expression during Transcription and Translation

여러 단계에서 일어나는 발현 조절

Gene expression can be regulated at almost every step from gene to protein. Transcription is the step that is most commonly regulated. This involves the ...

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유전자 발현

주요 용어 및 개념

Regulation of Expression at Multiple Steps

The gene expression in cells is regulated at different stages: (i) transcription, (ii) RNA processing, (iii) RNA localization, and (iv) translation. Transcriptional regulation is mediated by regulatory proteins such as transcription factors, activators, or repressors&#8212;these control gene expression by initiating or inhibiting the transcription of genes. Once a precursor or pre-mRNA is produced, it undergoes post-transcriptional modification, including 5&#39; capping, splicing, and the addition of a 3&#39; poly-A tail, forming the mature mRNA. Only those mature mRNAs that associate with RNA-binding proteins (RBPs) forming ribonucleoprotein particles are prevented from degradation and are selectively transported out of the nucleus for protein synthesis. mRNAs that do not associate with RBPs are not transported out of the nucleus and hence not translated into proteins. Alternatively, if a mature mRNA binds a complementary microRNA, it undergoes degradation, thereby inhibiting protein synthesis.
However, once the mRNA is translated, the newly synthesized protein undergoes modification that affects its activity. For example, adding functional groups, such as methyl groups, phosphate, or acetyl groups, may activate or inactivate the protein. In contrast, adding multiple ubiquitin proteins to a substrate protein marks them for degradation. Thus, ubiquitination regulates protein stability and its functional activity.

여러 단계에서의 표현 조절

The gene expression in cells is regulated at different stages: (i) transcription, (ii) RNA processing, (iii) RNA localization, and (iv) translation. ...

마이크로 RNA 전 사체 (Transcriptome)의 전사 인자 종속 규정을 설명

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