This work was supported by the Intramural Research Program at the National Institute on Drug Abuse. We thank Doug Howard, Chris Richie, Lowella Fortuno, and Josh Hinkle for their contributions to developing this method.

시험 관내 분석에서 1 : 안정 SH-SY5Y 세포주에서 감지 SERCaMP 출시 <ol><li> 플레이트 SH-SY5Y-GLuc - ASARTDL (SERCaMP) 조직 문화는 표면적 cm 2 당 150,000 세포에서 판을 처리 하였다. 96 웰 플레이트, 예를 들면, 세포를 웰 당 50,000 (도 1a)을 시드. DMEM (높은 포도당, 루타, 피루브산) + 10 % 소 성장 혈청 + 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신을 SH-SY5Y 세포를 성장. <ol><li> 15 배 (그림 1B)까지의 통로 세포. 높은 통로 수는 테스트되지 않았습니다. </li><li> 5.5 % CO 2, 37 ℃에서 가습 배양기에 세포를 반환하고 밤새 품어. </li></ol></li><li> 실험적 치료 (들) 전에 잘 불투명 배양 상등액 5 μl를 전송하여 각 기준 샘플 수집은 96 웰 플레이트 성벽. 수집하기 전에 부드럽게 모든면에 접시를 누르고 그라데이션 효과를 방지하기 위해 소용돌이 친다. 접착제의와 불투명 플레이트를 밀봉효소 분석의 시간까지 4 ° C에서 일링 시트 및 저장. 주 : 분비 GLuc-SERCaMP은 세포 배양 배지에서 매우 안정적이다. 우리는 이전에 GLuc 활동의 약 5-10 %가 (SH-SY5Y 세포에 배양) 37 ° C (12)에서 72 시간 배양 한 후 손실 된 보도했다. </li><li> 응급실 칼슘 고갈을 검토 할 필요에 따라 (예를 들면, 환경, 약물, 유전자 조작) 세포를 치료. 빠르게 대기 CO 2에서 발생 pH 변화로 (제어 인큐베이터의 외부) 주위 환경에 오래 노출을 피하십시오. 장기간 조작이 요구되는 경우에는, pH를 안정화시키기 위해 14, 20 밀리미터로 배양 배지에 HEPES를 추가한다. 배지 15 HEPES를 사용하는 경우 빛에 노출을 피하십시오. <ol><li> 긍정적 인 제어 : SH-SY5Y 세포에서 실험 4-6 시간 동안 100 나노 쌥시 가르 긴 (Tg)가 50 μm의 cyclopiazonic 산 (CPA)와 세포 치료. 다른 세포주에서 최대 반응은 이상 배양 또는 다른 concen 필요할 수 있습니다화합물의 trations. </li><li> 음성 대조군 : 부모 SH-SY5Y 세포에서 배양 배지를 수집. 우리의 경험에 의하면,이 분석의 배경 발광이 안정적 SH-SY5Y-GLuc-SERCaMP 기저 세포로부터 분비의 0.05 % 미만이다. </li></ol></li><li> 단계 1.2에 설명 된대로, 원하는 시점들에서 수집하고 에어컨 매체의 저장 5 μL 샘플. </li><li> 제 5 절에 설명 된대로 매체에 효소 활성을 평가합니다. </li><li> 면역 또는 발광 분석에 의한 세포 내 GLuc을 검사합니다. <ol><li> 50 mM 트리스 (PH 7.4), 150 mM의 염화나트륨, 0.25 % 나트륨 데 옥시 콜레이트, 1 mM의 EDTA, 1 % NP40을 함유하는 개질 된 RIPA 버퍼를 Lyse 세포, 및 프로테아제 억제제 : 면역 용. 0.20 μm의 PVDF 막에 SDS- 폴리 아크릴 아미드 겔 및 전송에 별도. (: 2,000 희석 1) 하룻밤 4 ℃에서 GLuc 항체로 막을 품어. 선택의 검출 시약에 대한 사용자 정의 된 프로토콜에 따라 차 항체 배양 및 막 세척을 수행합니다. </li><li> 용발광 분석 (그림 2) : 얼음에서 다음 단계를 수행하십시오 <ol><li> 조직 문화 판의 우물에서 모든 미디어를 제거하고 차가운 PBS 200 μL 씻어. </li><li> 각 웰에 50 mM 트리스 (PH 7.5), 150 mM의 NaCl을, 1 % NP40를 포함하는 용해 버퍼 및 단백질 분해 효소 억제제의 75 μl를 추가합니다. </li><li> 20 분 동안 4 ℃에서 진탕 기 (120 RPM)에 판을 돌립니다. </li><li> 부드럽게하고, 멀티 채널 피펫을 사용하여 기포를 피 파쇄물의 아래 피펫. 불투명 한 판에 해물의 5 μl를 전송하고 5 절에 설명 된대로 발광을 평가합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 시험 관내 분석 2. : SERCaMP와 불멸화 된 세포의 과도 형질 참고 : 우리는 일시적인 형질 전환 절차 세포 스트레스를 유도하고 이후 GLuc-SERCaMP 응답을 무디게 할 수 있음을 발견했다. 다음의 방법은 형질 전환 EFF을 최소화하기 위해 개발 된<html> SH-SY5Y 세포에서 ECTS. 다른 세포주 (트랜 스펙 션 시약의 선택을 포함)이 절차의 최적화가 요구 될 수있다. 가능하면, 그것은 각각 섹션 1과 3에 설명 된 안정적인 세포주 또는 바이러스 성 전달 방법을 사용하는 것이 좋습니다. <ol><li> 4 × 10 6 세포에서 100mm 접시에 플레이트 SH-SY5Y 세포. 이 요리는 형질 전환 절차에 따라 약 300 우물 (96 웰 플레이트 형식) 씨에게 다시하기에 충분합니다. </li><li> Xfect 플라스미드 DNA 20 μg의 (인코딩 GLuc-SERCaMP)를 사용하여 시약 및 시약 Xfect 6 μL와 형질 세포. 크거나 작은 문화 선박 따라 스케일 DNA와 Xfect 시약. </li><li> 48 시간 동안 인큐베이터 세포를 돌려줍니다. </li><li> 세포를 Trypsinize 잘 60,000 세포에서 96 웰 플레이트에 시드. 제 1 절에 설명 된 다음 단계를 수행합니다. </li></ol> 시험 관내 분석 3. :의 바이러스 성 벡터 중재 식 GLuc-SERCaMP 십t &quot;&gt; 참고 : 아데노 관련 바이러스 (AAV) 벡터 포장 (16) 정제 (12)와 렌티 바이러스 생산 (13)는 이전에보고 된 바있다. <ol><li> 역가 GLuc-SERCaMP AAV 다음 프라이머 및 프로브를 사용하여 : 정방향 프라이머, 5&#39;-CACGCCCAAGATGAAGAAGT-3 &#39;; 역방향 프라이머, 5&#39;-GAACCCAGGAATCTCAGGAATG-3 &#39;; 프로브 (5&#39;-6-FAM / 3&#39;- 라벨링 BHQ-1)에 대한 정량적 PCR, 5&#39;- TACGAAGGCGACAAAGAGTCCGC-3 &#39;. <ol><li> GLuc을 함유하는 플라스미드를 선형화하고 스핀 컬럼 (예 Machery-Nagel의 뉴 클레오 젤 및 정리 PCR)을 사용하여 DNA를 정제하여 표준 곡선을 준비한다. 질량 사다리와 함께 아가 로스 젤에서 분리하여 DNA를 정량. PBS에서 10 FG / ㎖에 ml의 100 페이지 /에서 DNA 1:10 희석을 준비합니다. 플라스미드의 분자량에 기초하여 각각의 농도에서 GLuc 플라스미드 DNA의 카피 / ㎖을 계산한다. </li><li> PBS에 AAV 주식 희석 (적절한 희석에 의존한다바이러스 제제의 매개 변수와) 경험적으로 결정. </li><li> 94 ° C 20 초 × 95 ° C × 5 분, 41 싸이클 60 ℃ × 1 분 : 다음과 같은 조건을 이용하여 실시간 PCR 시스템에서의 PCR 반응을 실행. mL의 표준 곡선을 사용하여 / 사본을 계산합니다. </li></ol></li><li> P24 렌티-X 빠른 역가 키트 역가의 렌티 바이러스. 얼음 렌티 바이러스 분취 량을 해동 및 SH-SY5Y 매체 P24 조절 단백질을 희석. <ol><li> 이 표준 곡선 (20,000 또는 1 : 100,000 예 1)에 떨어질 것 같은 것을 렌티 바이러스를 희석. 필요한 희석 배수는 렌티 바이러스 제제 파라미터들에 따라 달라질 것이고, 경험적으로 결정되어야한다. 이후의 모든 단계에 대한 제조업체의 지침을 따르십시오. </li></ol></li><li> 96 웰 플레이트에 플레이트 세포. SH-SY5Y 세포의 경우, 제 1 항에 명시된 도금 절차를 따라야 할 수 있습니다. 쥐 주 대뇌 피질의 뉴런은 세포를 분리하고 적절하게 코팅 된 플레이트를에 접종해야S는 이전 16 설명했다. 1X B27 500 μM의 L- 글루타민 보충로 Neurobasal 매체에 쥐 주 대뇌 피질의 뉴런을 유지한다. 매일 절반 매체 교환을 수행합니다. </li><li> 바이러스와 세포를 형질 도입. 루시퍼 Gaussia 강력한 신호를 제공로 바이러스 전달의 목표는, 낮은 수준의 발현을 달성하는 것이다. <ol><li> AAV 전달 SH-SY5Y 세포 : 도금 다음날 형질 도입. AAV 희석 버퍼 (PBS + 후 0.5mM의 MgCl 2) 6.0 × 10 7 VG / μL에 AAV를 희석. (대략 6,000의 MOI 3.0 × 10 8 VG) 96 웰 플레이트 (그림 3A)의 웰 당 희석 AAV의 5 μl를 추가합니다. 바이러스 성 벡터 폐기물을 불 활성화 10 % 표백제를 사용합니다. </li><li> 쥐 주 대뇌 피질의 뉴런의 AAV 전달은 : 도금 후 6-8일 형질 도입. AAV 희석 버퍼에 4.0 × 10 6 VG / μL에 AAV를 희석. 희석 AAV의 5 μl를 추가 (2.0 × 10 7 VG, 관성 모멘트를 약 350)의 잘 당96 웰 플레이트 (그림 3B). 최적 MOI가 다른 세포 유형에 대해 경험적으로 결정되어야한다. 바이러스 성 벡터 폐기물을 불 활성화 10 % 표백제를 사용합니다. </li><li> SH-SY5Y 세포의 렌티 바이러스 형질 도입은 : 도금 다음날 형질 도입. 행크의 균형 잡힌 염 용액 (농도 titering 키트를 사용하여 측정) 20 PG / μL의 P24에 렌티 바이러스를 희석. 100 μL 볼륨을 포함하는 96 웰 플레이트 (1,250,000 렌티 바이러스 입자에 해당하는 P24의 100 페이지, 또는 ~ 1,250 IFUs)도 당 희석 바이러스의 5μL를 추가합니다. 큰 포맷 따라 확장 할 수 있습니다. 바이러스 성 폐기물을 비활성화하는 10 % 표백제를 사용합니다. </li></ol></li><li> 매체의 전처리 샘플을 수집하고 실험적인 치료 48 시간 (SH-SY5Y) 또는 전달 후 5-7일 (쥐 주 대뇌 피질의 신경 세포)를 시작합니다. </li></ol> 생체 SERCaMP 분석 4. 주 : 동물의 절차는 교육 기관을 통해 적절한 승인을 받아야하십시오 수행하기 전에. 모든생존 수술은 적절한 마취와 무균 조건 하에서 수행되어야한다. 아래에 설명 된 모든 절차 승인 및 NIH ACUC 지침을 준수하고 있습니다. <ol><li> 오토 클레이브 수술 도구 수술의 시작에 앞서 (121 ° C, 30 분 살균, 20 분 건조 시간). 즉시 모든 절차 전에 고압 증기 멸균에 다음 초음파의 모든 악기를 청소합니다. 생존 수술시 무균 조건을 유지한다. 여러 동물을 필요로하는 수술의 경우, 70 % 알코올, 초음파 처리 및 비드 쥐 사이에 소독과 수술 도구를 닦으십시오. 필요한 악기에 대한 자료 목록을 참조하십시오. </li><li> 수술을 위해 쥐를 준비합니다. 여기에서 우리는 남성의 Sprague-Dawley 계 (180-200g)를 사용합니다. <ol><li> 자일 라진 (8 ㎎ / ㎏) 및 케타민 (/ kg 80 mg)을 복강 내 주사 한 다음 3 분 (4-5 %의 아이소 플루 란 1000 CC / 분으로 전달)을 위해 가스를 사용하여 이소 플루 란 마취 래트. 건조로부터 각막을 보호하기 위해 안과 연고를 적용합니다. (B)꼬리 또는 발 핀치 다음 철수 반사의 부족에 의해 입증 된 바와 같이 쥐 한 번 egin 수술은​​ 깊이 마취입니다. </li><li> 약간 중반 복부에 갈비뼈 (낮은 흉부 지역) 아래 복부의 영역을 면도. 외과 영역 70 % 알코올과 Betadine 스크럽 교대 세 번, 스크럽. 무균 수술 드레이프와 무균 수술 영역에 앙와위에서 쥐를 놓습니다. </li></ol></li><li> 7.6 × 10 9 VG / ㎖ (최종 농도)에 AAV-GLuc-SERCaMP 희석. 튜브를 반전하여 잘 섞는다. 참고 : 바이러스 농도 범위 (그림 4) 다를 수 있습니다. <ol><li> 피펫 멸균 접시에 희석 AAV의 105 μL. 주사기로 바이러스를 수집하기 위해 30 게이지 바늘을 사용합니다. </li></ol></li><li> AAV-GLuc-SERCaMP을 간을 노출하고 주입하는 수술을 수행합니다. <ol><li> 이전 복부에 절개를 만들기 위해, 절개 영역에 0.25 % bupivacaine을 적용 할 수 있습니다. 메스를 사용하면, 갈비뼈 아래에 수평 절개 (AP합니다근접하여 2 ~ 3 센티미터). 하피에서 결합 조직을 분리 해부 무딘. </li><li> 간의 오른쪽 중간 엽을 노출, 복부 근육을 잘라. 주 : 추가 로브는 최종 애플리케이션을 기반으로 주입 될 수있다. </li><li> 수술 현미경으로 동물을 놓고 시야에서 간 오른쪽 중간 엽을 얻기 위해 조정합니다. 중간 엽의 실질에 바이러스를 주입; 3 별도의 사이트, 사이트 당 약 33 μL. 참고 : 전체 주입량의 배달을 보장하기 위해 주입에 따라 5 ~ 10 초 동안 조직에 바늘을 둡니다. </li><li> 개별적으로 복부 근육과 피부를 봉합하고면 팁 어플리케이터를 사용하여 Neosporin를 추가합니다. 의식을 회복하고 쥐가 수직 위치를 유지 할 수 있습니다 때까지 복구 실에서 쥐를 놓습니다. 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 쥐 (들) 무인 두지 마십시오. 하우스는 단독으로 절개가 치유 될 때까지 봉합 (7-14 일간) 제거되었습니다. <br/&gt; 참고 : NIH 수술 후 지침에 따라로서, 수술 기록을 유지한다. 절차, 날짜, 실험 식별자, 체중, 및 수술의 일와 케이지 카드 주석. 통증 / 조난, 대변 생산 활동, 음식 및 물 소비를 모니터링 3 일 후 - 수술 기록하여야한다. 우리가 일반적으로 수술 후 통증이나 고통의 징후를 관찰하지는 않지만 수술 후 통증은 식수 (450 밀리그램 / 100 CC)에 아세트 아미노펜을 추가하여 제공됩니다. </li></ol></li><li> 4~7일 주사 후 꼬리 혈액 수집을 시작합니다. 라벨 및 사전 무게에 의해 혈액 수집 튜브를 준비합니다. 각각의 튜브에 50 μL 헤파린 (1,000 U / ㎖)를 추가합니다. </li><li> (1,000 CC / min으로 전달 4~5% 아이소 플루 란) 3 분 이소 플루 란 마취 실에 넣어 쥐. (500 CC / min으로 전달 2~3% 아이소 플루 란) 코 콘에서 챔버와 장소에서 쥐를 제거합니다. 꼬리 파이를 다음과 철수 반사의 부족에 의해 입증 된 바와 같이 혈액 수집은 쥐가 깊이 마취되면 시작할 수 있습니다NCH​​. <ol><li> 멸균 가위 꼬리 (1~2mm)의 절단 팁을 사용하고 프리 필드 헤파린 튜브에 드롭 현명한 피를 수집합니다. 헤파린 비 (&gt; 100 ㎕의 혈액 / 50 μL 헤파린)을 혈액 1 : 볼륨 (2)보다 클 때까지 혈액을 수집한다. 채혈 볼륨은 실험 설계에 기초하여 조절 될 수있다. 출혈을 멈추게하기 위해 꼬리에 지혈제 가루를 적용 할 젖은면 주걱을 사용합니다. </li><li> 4 ℃에서 보관 혈액 튜브는 이후의 샘플을 수집합니다. 컬렉션 사이에 소독 에탄올 패드​​와 구슬과 가위를 닦습니다. </li><li> 수집 튜브의 무게를 측정하고 2 얻기 위해 헤파린 조정 : 1의 비율 (혈액 : 헤파린). 이 단계는 각각의 샘플 (표 1)에 헤파린의 양을 표준화한다. </li><li> 원심 분리기 튜브 4 ℃에서 5 분 2,000 XG에. 루시 페라 제 분석 (섹션 5)의 시간이 될 때까지 -80 ° C에서 신선한 튜브 및 저장소에 뜨는 (플라즈마)를 전송합니다. 참고 : 72 시간까지 이전 효소 분석에 4 ° C에서 샘플의 보관 M이발광 (그림 5A)에 inimal 효과. 플라즈마 샘플의 3까지 동결 해동 사이클은 발광에 영향 (그림 5B)가 없습니다. </li></ol></li><li> 쌥시 가르 긴 관리 (양성 대조군) : <ol><li> 2.5 mg / ml의 최종 농도로 희석 한 에탄올 쌥시 가르 긴 준비한다. 하복부에 1 ㎎ / ㎏ IP에서 쌥시 가르 긴 주입한다. 참고 : 쌥시 가르 긴이 트롬빈에 의한 혈소판 응집 (17)을 증가시키고 더 어려운 꼬리에서 채혈을 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> Gaussia 루시 페라 제 분석 : <ol><li> 얼음에 혈장 샘플을 해동. 종 방향 연구, 해동 및 (기판의 하나의 준비를 사용하여) 같은 날에 모든 평가시기 샘플에 대한 발광 분석을 수행합니다. </li><li> 불투명 한 벽 플레이트로 전송 플라즈마의 10 μl를하고 섹션의 각 혈장 샘플 5. 실행 3-4 기술 복제를 설명한 바와 같이 효소 활성을 측정합니다. </li></ol></li><li> Euthanasi 주 : SERCaMP 기술의 장점은 모니터 ER 칼슘 종 할 수있는 능력이다. 실험 매개 변수와 엔드 포인트 분석에 따라, 동물 엔드 포인트 분석에 적절한 기관 ACUC 지침에 따라 조치에 의해 안락사되어야한다. </li></ol> 5. 발광 분석 <ol><li> 20 mM의 메탄올 (3 ㎖, 10 N HCl을 30 μL)을 산성화 메탄올 화합물을 희석하여 코 엘렌 테라 진 (CTZ) 스톡 용액을 준비한다. -80 ° C에서 단일 사용 씩 저장을 준비합니다. </li><li> 분석의 날에 작업 기판을 준비합니다. <ol><li> 체외 분석의 경우, 예를 들어, PBS에 8 μm의에 코 엘렌 테라 희석 PBS의 25 ml의 20 mM의 CTZ 주식의 10 μl를 추가합니다 (그림 6A, B). </li><li> 생체 내 분석을 위해, PBS 100 μM, 500 mM의 아스코르브 산, 5 mM의 NaCl을 엘렌 테라로 희석. </li></ol></li><li> 적어도 30 분 동안 준비 CTZ을 품어분석을 시작하기 전에 실온에서 첨가 하였다. 참고 : 준비 후 처음 30 분 동안 빠른 기판 붕괴의보고 있기 때문에이 단계는 종종 Gaussia 루시 페라 제 분석에 포함되어 있습니다. 우리는 우리의 시스템 (그림 6C)에서이 효과를 관찰하지 않은; 우리가 분석에 부정적인 영향을 발견했다 그러나, 우리는 종종 배양 단계를 포함한다. </li><li> 모니터링 생물 발광 할 수있는 및 기판 인젝터가 장착되어 플레이트 리더를 사용합니다. 기판과 프라임 라인. 참고 : 라인을 통해 초기 기판이 저하하는 경향이 될 수 있습니다. 초기 샘플 인위적으로 낮게 측정을 방지하기 위해 실험 샘플을 측정하기 전에 (독자에 빈 접시를로드) 20 ~ 30 빈 우물을 주입. </li><li> 잘으로 기판의 100 μl를 주입 5 초 동안 중간 속도를 흔들어 발광을 측정한다. Biotek 시너지 II 플레이트 리더를 들면, (0.5 초 이상 (체외 샘플)과 5 초 발광 통합판독 단계의 생체 시료). 이상적인 분석 성능 플레이트 리더 매개 변수를 최적화 할 수 있습니다. 참고 : (다른 루시페라아제 관찰 반응 속도를 빛에 비해) 빠른 신호 감쇠와 Gaussia 루시 페라 전시 플래시 속도론. GLuc의 플래시 동력학은 샘플에 걸쳐 배지 조성물에 대한 제어의 중요성을 강조하는, 세포 배양 배지 (도 7A)에 혈청에 의해 영향을 받는다. 때문에 기판 (플래시 역학)를 추가 한 후 발광의 급속한 붕괴, 주입 한 모든 샘플에 대한 균일해야합니다 단계를 읽어 사이의 시간에. 플레이트 리더는 (우리가 5 초 흔들림 단계를 사용 예), 그리고 잘 읽어 고정 대기 시간을 잘으로 기판을 주입하는 설정해야합니다. 기판은 동시에 모든 웰에 첨가 할 수없는 읽기 전에 전체 판에 기판을 추가하는 것은 상당한 도전을 포즈. 주사기를 사용할 수없는 경우, 문제가 부분적으로 기판 사이 ADDI 10 분 동안 플레이트를 항온 처리에 의해 회피 될 수있다기 및 측정 (도 7b) (따라서 감쇠 곡선의 가파른 부분을 피하고). </li><li> , 주사를 반복 대기 시간, 잘 접시에 각 단계를 참조하십시오. </li></ol>

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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesencephalic+astrocyte-derived+neurotrophic+factor+(MANF)+secretion+and+cell+surface+binding+are+modulated+by+KDEL+receptors.">Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF) secretion and cell surface binding are modulated by KDEL receptors.</a> J Biol Chem. 288 (6), 4209-4225 (2013).</li><li>Shipman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine&#235;thanesulfonic+acid+(HEPES)+as+a+tissue+culture+buffer.">Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine&#235;thanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer.</a> Proc Soc Exp Biol Med. 130 (1), 305-310 (1969).</li><li>Zigler, J. S., Lepe-Zuniga, J. L., Vistica, B., Gery, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+cytotoxic+effects+of+light-exposed+HEPES-containing+culture+medium.">Analysis of the cytotoxic effects of light-exposed HEPES-containing culture medium.</a> In Vitro Cell Dev Biol. 21 (5), 282-287 (1985).</li><li>Howard, D. B., Powers, K., Wang, Y., Harvey, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropism+and+toxicity+of+adeno-associated+viral+vector+serotypes+1,+2,+5,+6,+7,+8,+and+9+in+rat+neurons+and+glia+in+vitro.">Tropism and toxicity of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 6, 7, 8, and 9 in rat neurons and glia in vitro.</a> Virology. 372 (1), 24-34 (2008).</li><li>Smeets, E. F., Heemskerk, J. W., Comfurius, P., Bevers, E. M., Zwaal, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thapsigargin+amplifies+the+platelet+procoagulant+response+caused+by+thrombin.">Thapsigargin amplifies the platelet procoagulant response caused by thrombin.</a> Thromb Haemost. 70 (6), 1024-1029 (1993).</li><li>Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+monitoring+biological+processes+in+culture+and+in+vivo.">Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (4), 582-591 (2009).</li><li>Sobrevals, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+vectors+transduce+hepatocytes+in+vivo+as+efficiently+in+cirrhotic+as+in+healthy+rat+livers.">AAV vectors transduce hepatocytes in vivo as efficiently in cirrhotic as in healthy rat livers.</a> Gene Ther. 19 (4), 411-417 (2012).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+highly+efficient+transduction+by+double-stranded+adeno-associated+virus+vectors+in+vitro+and+in+vivo.">Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo.</a> Gene Ther. 10 (26), 2105-2111 (2003).</li><li>Seppen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+serotypes+mediate+sustained+correction+of+bilirubin+UDP+glucuronosyltransferase+deficiency+in+rats.">Adeno-associated virus vector serotypes mediate sustained correction of bilirubin UDP glucuronosyltransferase deficiency in rats.</a> Mol Ther. 13 (6), 1085-1092 (2006).</li><li>Hareendran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+vectors+in+gene+therapy:+immune+challenges+and+strategies+to+circumvent+them.">Adeno-associated virus (AAV) vectors in gene therapy: immune challenges and strategies to circumvent them.</a> Rev Med Virol. 23 (6), 399-413 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

이 프로토콜은 시험관을 하이라이트 GLuc-SERCaMP 생체 유틸리티 ER 칼슘 고갈를 모니터링. SERCaMP를 생성하는 단백질 수정 다른 기자 단백질 (12)에 일반화 보이지만, 우리는 다른 루시페라아제 (18)에 비해 견고한 (200 ~ 배 이상) 생물 발광에 대한 Gaussia 루시 페라 제를 선택했다. 우리는 일차 래트 피질 뉴런, SH-SY5Y 세포 및 쥐의 간으로 전달 GLuc-SERCaMP 바이러스의 100 배의 용량 범위에 걸쳐 검출 쌥시 가르 긴 유도 GLuc-SERCaMP 릴리스 보여 (도 3 및도 4). 우리는 이전에 GLuc-ASARTDL를 안정적으로 발현하는 형질 전환 된 세포주의 생성을 설명하고 5 × 104 표지 된 세포 집단에서와 같이 소수의 20 12 세포 반응을 유도 쌥시 가르 긴를보고 할 수 있음을 입증 하였다. 여기에서 우리는 안정된 세포주가 지속적으로 15 구절, 가장 analyz에게 TG-유도 반응을보고 할 수 있음을 보여시간에 기자의 지속적인 표현 능력에 영향을주지 않음을 나타내는 ED는 응급실 칼슘 고갈에 대응하여 (그림 1)에 출시한다. 우리의 데이타는이 분비 될 때 GLuc-SERCaMP 주로 ER 칼슘 고갈 될 때까지 세포의 ER 내에 유지되는 것을 나타낸다. &quot;정상&quot;상태에서는 기준 ER 칼슘 항상성 (12)의 설치를 허용하는 낮은 기저 분비있다. 쌥시 가르 긴 의해 ER 칼슘 고갈 반대 방향으로 세포 내 및 세포 외 발광 변화의 수준을 다음과 같다. 이는 센서 (도 2)의 정상 상태 분포의 변화를 나타내는 비율로 표현 될 수있다. SERCaMP을 출시 KDEL 수용체 발현 (12)에 의해 변조된다로서 중요한, 분리의 크기는 세포 유형에 따라 달라질 수있다. 우리는 대체 KDEL 같은 카르복시 말단 시퀀스와 &#39;ASARTDL&#39;을 대체하는 맥시을 달성하는 데 필요한 될 수 있다는 구상특정 세포 또는 조직 유형에 말 SERCaMP 응답. 시험 관내 시험 법의 경우, 세포 외 GLuc-SERCaMP 수준으로 인해 분비 기자의 안정성에 시간이 지남에 축적됩니다; 우리는 72 시간 12 후 활동에 대략 5-10 %의 감소를보고했다. 따라서, ER 칼슘 항상성에 약물 또는 유전자 도전을 개시하기 전에 매체를 교환하는 센서 축적으로 인한 배경 신호를 감소시킬 필요가있을 수있다. 대조적으로, 생체 내에서 GLuc-SERCAMP의 반감기는 플라즈마 표시 신호 3.5에서 4.7까지 12 분 혈액 순환에 리포터의 최근 버전을 나타내는 것이다. 혈액이 체외 및 플라즈마 처리되면, 그러나, GLuc-SERCaMP (그림 5) 매우 안정적이다. 설명하는 방법은, 중간 또는 플라즈마는 효소 분석하기 전에 불투명 96 웰 플레이트로 전송됩니다. GLuc 기반 기자를 사용하는 경우 두 가지 중요한 요소는 고려S는 효소의 플래시 동력학 및 코 엘렌 테라 기판의 고장이다. 인젝터가 장착 플레이트 리더는 최고의 기판 추가 및 발광 측정 사이의 시간을 정상화 GLuc에게 효소 분석을 실행에 적합합니다. 코 엘렌 테라의 화학적 특성은 기판 준비 후 서로 다른 시간에 측정 된 원료 발광 값을 비교 배제 붕괴에이 경향합니다. 실험 기간 (도 9)를 통해 추적 될 제어 및 실험 샘플 사이의 상대적 차이를 허용하지만, 유지된다 (도 6)의 샘플들 사이의 차이를 접어. 진행성 질환을 조사 할 때 생체 내에서 ER 칼슘 변동을 모니터링하는 능력은 유익하다. 형광등 세포질 염료와 같은 다른 방법, 시험 관내 연구에서 급성 적합하지만, SERCaMP 기자 세로 응급실 칼슘 모니터링을 허용하는 첫 번째입니다. 오우R 프로토콜은 AAV-GLuc - SERCaMP 직접 간 주사를 설명합니다. 우리는 포스트 분사 오십육일에 대한 도전받지 동물의 순환 GLuc-SERCaMP의 안정적인 수준을 감지 (최신 평가시기는 지금까지 테스트) 및 이상 실험은 12 가능 예측했다. AAV 벡터는 직경이 약 20 nm의 측정, 작은 크기이고, 최소 요구 바이오 19 포즈. 이중 가닥 DNA와 AAV 단일 가닥 게놈의 전환을 회피하기 위해, AAV-SERCaMP는 AAV 혈청 형-1 이중 가닥 벡터 (20)로 포장되었다. AAV 혈청 형-1을 효과적으로 쥐의 간 (19, 21)를 형질 도입하는 것으로 나타났다; 그러나, 우리의 사출 기술의주의해야 할 점은 몸 전체에 다른 조직으로 이동하는 바이러스에 대한 가능성이다. 벡터 간 직접 주입했지만, 우리 제시된 방법론은 SERCaMP 방출 소스를 식별 할 수없고, 그러므로, 간 이외의 조직이 GLuc-SERC에 기여할 수있다앰프 신호. 미래의 유전자 조작은 조직 유형을 대상으로 식을 제한합니다. 예를 들어, 조직 - 특이 적 Cre 호텔 드라이버 라인은 플라즈마 샘플링 통한 ER 칼슘의 조직 - 특이 적 모니터링을 허용한다 Cre 호텔 의존 GLuc-SERCaMP 교차. 설명 생체 기술은 기자의 강력한 특성상 낮은 바이러스 역가를 사용합니다. GLuc-SERCaMP 자료는 7.6 × 10 9 VG (그림 4)에 7.6 × 10 7 VG의 바이러스 성 범위에서 검출 될 수있다. 이 범위는 간 (19)의 반딧불 루시 페라 기반의 바이러스 주사를 이용한 이전 연구에서보고 된 것보다 4-400 배 낮다. 더 높은 농도에서, 우리는 의한 트랜스 (22) 동물의 면역 반응 가능성있는 시간을 통해 검출 가능한 발현의 감소를 관찰 하였다. 바이러스의 높은 역가 가능하면 의한 신호 손실의 증가 가능성을 피해야한다. 선물보다 낮은 역가가되지 않은EN 테스트. 이 프로토콜은 간으로 AAV-GLuc - SERCaMP의 주사를 설명; 유사한 접근 방법이 다른 조직 유형에 대한 가능한 이론에 있습니다. 이러한 바이러스 농도와 혈청 형과 같은 매개 변수는 다른 조직에 충분한 표현에 최적화해야합니다. 때문에 기자의 강력한 특성, 혈액 (100-150 μL)의 작은 볼륨은 실험을 통해 반복 컬렉션을 허용, 꼬리를 잘라낸에서 수집 할 수 있습니다. 이것은 우리가 기준선 수준으로 복귀 한 다음 쌥시 가르 긴 관리 (그림 4) 후 높은 수준을 관찰 쌥시 가르 긴, 님의 질문에 GLuc-SERCaMP 릴리스의 종 특성에 유용했다. 채혈 다음 혈장 샘플의 적절한 처리가 중요하다. 따라서, 우리는 SERCaMP 전에 효소 분석 (그림 5)에 72 시간까지 4 ℃에서 보관 혈장 안정적인지 증명하고있다. 또한, 혈장 샘플는 적어도 3 냉동 / t를 겪을 수있다발광에 미치는 효과 (그림 5)와 산사 나무의 열매주기. 실제로, 우리는 -80 ° C에서 모든 시료는 효소 분석을 평가하기 전에 불필요한 동결 - 해동 사이클을 방지하고, 동시에 실험의 모든 샘플을 분석하여 저장한다. ER 칼슘 결핍은 다양한 질병의 병인에 연루되어있다. 그것은 종종 세포 기능을 방해하고 펼쳐진 단백질 응답 (UPR)의 활성화에 이르게 업스트림 이벤트가 될 것으로 생각된다. UPR은 항상성 조건 5을 다시 응급실에 의해 고용 적응 반응이다. ER 스트레스의 만성 상태는 궁극적으로 죽음을 셀에 선도, 항상성을 복원 할 UPR의 용량을 초과. ER 스트레스와 ER 칼슘 조절 곤란이 같은 1 형 당뇨병, 당뇨병 성 신증, 신경 퇴행성 질환과 심장 혈관 dieases 5 같은 질병에서 관찰된다. 칼슘 조절 장애 및 질환 발병 사이의 관계는, 그러나, diffic이고ULT는 묘사합니다. SERCaMP 기술은 따라서 질병 발생과 진행에 대한 통찰력을 제공하고, 동물의 수명 동안이 과정을 추적 할 수있는 잠재력을 가지고있다. 더욱이, 방지 또는 올바른 ER 칼슘 조절 곤란이 SERCaMP의 사용을 통해 평가 될 수 고안된 잠재적 치료제의 평가. 마지막으로, GLuc-SERCaMP 릴리스가 발생 질병을 식별하는 엔지니어와 질병 조절 유전자 치료의 수단으로 SERCaMPs으로 분비 치료 용 단백질이나 펩타이드를 채용 할 수있는 기회를 제공합니다.

소포체 (ER) 1 시그널링 단백질 접힘, 분비 단백질, 지질 항상성, 세포 내 및 세포를 포함한 많은 용량으로 기능한다. 일반 응급실 ​​기능의 핵심은 ~ 5,000 시간에 내강 칼슘 농도 세포질 2-4에서 발견을 유지하고있다. 이 에너지 집약적 인 공정은 사코 / 소포체 칼슘 ATP 아제 (SERCA), ER에 칼슘 이온을 이동시키는 펌프에 의해 조절된다. 응급실에서 칼슘의 유출은 주로 ryanodine (RyR)과 이노시톨 인산염 (IP3R) 수용체에 의해 매개된다. 많은 ER 프로세스 칼슘에 따라 달라 지므로, 저장을 방해하는 것은 ER 스트레스 결국 세포 사멸을 초래할 수있다. ER 칼슘 조절 장애는, 심근 병증, 당뇨 알츠하이머 질환에서 관찰되었으며, 파킨슨 5. 이들 질환의 점진적 특성으로 인해, 그것은 인과 재 묘사하는 도전되었습니다ER 칼슘 저장소의 병인과 변화 사이 lationship. 기술의 숫자는 염료 및 유전자 인코딩 칼슘 지표 (GECIs)를 포함하여 ER 칼슘 역학, 우리의 이해에 상당한 발전을 허용했다. 칼슘 이온에 결합 될 때 형광 증가 선호도가 낮은 칼슘 염료, 칼슘 6 고농도 세포 내 구획을 조사하는 세포에로드 될 수있다. 이러한 D1ER 포수로 GECIs는, 세포 내 현지화 7-9의보다 정확한 제어와 칼슘 변동 모니터링 할 수 있습니다. 최근 GECIs의 다른 클래스라는 칼슘 측정 소기관 - 포획 단백질 지표 (CEPIA)가 10을 설명 하였다. 유전학과 결합 세 번째 방법 작은 분자의 화학입니다 대상 - 에스 테라 염료 로딩 에스테르 계 칼슘 염료 11 (ER을 대상으로) 유전자 인코딩 된 카르 복실를 활용 (TED)는. afor 동안ementioned 방법은 형광의 급성 측정을 통해 ER 칼슘 역학에 대한 귀중한 통찰력을 제공 할 수 있습니다, 고유의 강점과 약점을 가지고 있습니다. 그러나 이들은 종종 질병 진행을 조사하는 데 필요한 길이의 연구에 최적이 아니다. 장시간에 걸쳐 칼슘 역학을 모니터링하는 방법을 고안하기위한 목적으로, 우리는 식별되고 분비 ER 칼슘 모니터링 단백질 (SERCaMPs) (12)을 만드는 단백질 변형을 개발 하였다. SERCaMP 반복해서 ER 칼슘 저장소를 심문하는 최소 침습적 방법을 제공함으로써, 다른 방법론과 관련된 몇 가지 제한을 우회. 우리는 이전에 카복시 말단 펩티드 ASARTDL (알라닌 - 알라닌 - 세린 - 트레오닌 아르기닌 아스파라긴산 류신)는 ER 보존을 촉진하기에 충분한 것으로 증명; 그러나, ER 칼슘의 감소를 일으킬 조건 하에서, 단백질 서열은 더이상의 ER localizatio을 유지할 수 없다n 및 단백질 13 분비된다. SERCaMP 기술의 기초는 분비 된 단백질의 카르복시 말단 분비 따라서 ER 칼슘 조절 곤란 (12)의 견고한 리포터를 생성 ER 칼슘 고갈에 의해 트리거되도록 (예 Gaussia 루시페라아제 또는 GLuc)에 ASARTDL의 부속물이다. 형질 전환 방법을 통해 GLuc-SERCaMP의 발현은 ER 칼슘 항상성의 지표로 GLuc 활성의 변화를 분석 할 수있는 세포 배양 배지 및 혈장을 포함한 생물학적 유체를 가능하게한다. 이 방법은 시험 관내 및 생체 내 ER 칼슘 저장소의 누진 변화의 길이 연구 응용을 갖는다. 다음 프로토콜 ER 칼슘 항상성 공부 GLuc 기반 SERCaMP을 사용한 일반적인 윤곽으로 기록되지만, 프로토콜은 다른 리포터 SERCaMPs 대한 지침을 제공 할 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5mL tubes</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>02-682-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% NP-40 solution&#160;</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>28324</td>
			<td>for intracellular GLuc assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mL luer-lok syringes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-823-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200uL filter tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>RT-L200F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 surgical sutures</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9598192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30g needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-821-13A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive microplate sealing sheets</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>AB-0558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol prep pads</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-246-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Auto Flow System</td>
			<td>E-Z Anesthesia</td>
			<td>EZ-AF9000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal recovery chamber</td>
			<td>Lyon Vet</td>
			<td>ICU-912-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine solution</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9386574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine growth serum</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SH30541.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine, Native</td>
			<td>Regis Technologies</td>
			<td>1-361204-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tipped applicators</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>806-WC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutting needles 3/8 circle sutures</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital ultrasconic cleaner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FS60D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose, GlutaMAX, pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10569-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA mass ladder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10496-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gaussia luciferase (recombinant protein)</td>
			<td>Nanolight</td>
			<td>321-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gaussia luciferase antibody (for WB, ICC, or IHC)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E8023S</td>
			<td>1:2000 (WB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Germinator 500</td>
			<td>CellPoint Scientific</td>
			<td>DS-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluc assay plates (96 well, opaque)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-200-589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Allmedtech</td>
			<td>63323-276-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Butler Schein</td>
			<td>29404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>995-2949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik Stop Styptic powder</td>
			<td>Butler Schein</td>
			<td>5867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>a452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge 22R Centrifuge</td>
			<td>Bekman Colter</td>
			<td>368831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neosporin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>19-898-143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Stereoscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleospin Gel and PCR Cleanup</td>
			<td>Machery-Nagel</td>
			<td>740609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipet</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>L-200XLS+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p24 Lenti-X rapid titer kit</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR film seal</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AB0558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReFresh Charcoal Filter canister</td>
			<td>E-Z Anesthesia</td>
			<td>EZ-258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades, #10</td>
			<td>Fine Science tools Inc</td>
			<td>10010-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD rats 150-200g</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Rats</td>
			<td>rats ordered at 150-200g.&#160; Surgery 5 days after arrival</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal ear tags</td>
			<td>National Band and Tag co</td>
			<td>1005-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical drapes</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>SP-MPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy 2 plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4304437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thapsigargin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9033</td>
			<td>harmful to human health</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virapower lentiviral packaging mix</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K4975-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xfect Transfection reagent</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Valley Vet</td>
			<td>468RX</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring endoplasmic reticulum calcium homeostasis using a gaussia luciferase sercamp

소포체 (ER)의 농도가 약 세포질 수준보다 5,000 배와, 세포 내 칼슘의 높은 수준을 포함​​하고 있습니다. ER 칼슘 통해 엄격한 제어는 단백질 접힘, 수정 및 인신 매매에 대한 필수적입니다. ER 칼슘에 섭동이 펼쳐진 단백질 응답, 3 구 ER 스트레스 반응기구의 활성화를 초래하고, 다양한 질병의 병인에 기여할 수있다. 질병의 발병과 진행하는 동안 응급실 칼슘 변경을 모니터링하는 기능은 실제로는 원칙적으로 중요한, 아직 도전이다. 칼슘 의존 형광 염료와 단백질과 같은 모니터링 응급실 칼슘 현재 가능한 방법은, 그러나 이러한 도구는 생체 내 연구에 적합하지 않은 세포에서 ER 칼슘 역학에 대한 통찰력을 제공하고 있습니다. 우리 연구소는 Gaussia 루시 페라 제의 카르복시 말단에 수정에 대한 응답으로 기자의 분비를 부여하는 것을 보여 주었다ER 칼슘 고갈. 시험 관내 및 생체 내 적용에서 루시페라아제 기초 분비 ER 칼슘 모니터링 단백질 (SERCaMP)를 사용하는 방법이 설명된다. 이 동영상은 응급실 칼슘의 종 모니터링 간 주사, GLuc-SERCaMP, 혈액 수집 및 처리의 약리 조작, 분석 매개 변수를 강조한다.

GLuc-SERCaMP 방법은 세포 외 체액을 샘플링하여 응급실 칼슘 항상성의 평가를 할 수 있습니다. 복수의 컨트롤이 결과 해석을 향상 실험 설계에 포함될 수있다. 우선, (C 말단 ASARTDL 또는 &quot;GLuc 아니 태그&quot;없이 예 GLuc) 구성 적 분비 리포터의 사용은 분비 경로 (글로벌 셀룰러 분비) 및 유전자 발현에 실험적 치료의 효과를 평가하기 위해 사용될 수있다. 예를 들어, GLuc-SERCaMP 및 GLuc 아니 태그 양의 세포 외 농도 증가는 모호한 결과로 간주된다. 또한, GLuc 아니 태그 응답의 대응 부족으로 GLuc - SERCaMP 분비의 증가는 응급실 칼슘 의존 이벤트 (그림 8)를 지원합니다. 용해가 필요로 이것은 하나의 평가시기에 한정되어 있지만 응급실 칼슘 고갈에 응답 GLuc - SERCaMP의 분비 또한, 세포 내 GLuc를 측정하여 평가 될 수있다. 지능<html> (각각의 웰에 대해 계산) 세포의 비율 (도 2B)를 증가시킬 것이다 : 그것은 점차적으로 분비 racellular GLuc-SERCaMP는 ER 칼슘 고갈에 반응하여 감소되며, 세포는. 세포 : 세포 내 비율은 유전자 발현의 변화를 제어하는​​ 데 유용합니다. ER 칼슘 저장소의 약리학 변조기 새로운 패러다임 SERCaMP 릴리스 ER 칼슘의 기여를 확인하는데 이용 될 수있다. 트롤 렌, RyR 길항제는 Tg를 감소 시키거나 (도 8b)에 응답 SERCaMP의 방출을 억제한다 ER 칼슘을 안정화하는 것으로 알려져있다. 그것은 ER 칼슘 플럭스 (예 Xestospongin C, 4- 클로로 m- 크레졸) SERCaMP을 사용하는 새로운 실험 패러다임에 영향을 미치는 추가 화합물을 테스트하기 위해, 가능하면 좋습니다. 이러한 연구들은 생체 내에서 도전되지만, 조직 배양 모델에 대응 가능한 수있다. &quot;&gt; GLuc 기반 SERCaMP를 사용하여 체외 연구를 들면, 제어 (들)을 기준으로 개별 접시에 응답을 계산하는 것이 좋습니다. &#39;처리에 의한&#39;응답 (제어에 비해 상대적으로 응답의 변화를 추적하여 timecourse을 통해 평가 될 수있다 사이 플레이트 비교). 그것은. 시점들 (그림 6C) 사이의 원시 값의 변화로 이어질 수 기판의 부패로 인해 접시 내에서 상대적인 비교를 여러 판에 걸쳐 원시 번호를 비교하지 않는 것이 좋습니다이 효과를 최소화 (도 6D). 관내 TG-SERCaMP 유도 방출 실험 데이터 분석의 예는도 9에 제시되어있다. GLuc-SERCaMP를 사용하여 생체 내 연구의 경우, 데이터는 자신의 &#39;전처리&#39;제어의 역할을 모든 동물, 각 동물에 대해 독립적으로 평가해야한다. 이것은 트랜스 델의 가변성을 고려하는 것이 필요하다ivery과 동물 (그림 4A) 사이의 식입니다. SERCaMP 응답의 크기는 셀의 초기 상태에 관련된 직접 조사자에 의해 제어 될 수있는 여러 다양한 요인의 영향을받을 것이다. 최대 SERCaMP 응답 들어, 기저 ER 칼슘 항상성을 선호 조건을 최적화하기 위해 필수적이다. 이 시딩 세포 최적의 밀도와 낮은 바이러스 역가를 사용하여 포함한다. 다른 세포와 조직 유형은 경험적으로 결정해야합니다 추가 요구 사항을 가질 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53199/53199fig1.jpg" /> 그림 1. 안정적 SH-SY5Y 세포 라인 파종 밀도 및 통로 번호 고려 사항 (A) SH-SY5Y-GLuc-SERCaMP 세포를 다양한 농도로 접종하고 40 시간 동안 배양 하였다. 분비 GLuc-SERCaMP 300 nm의 Tg는 O와 치료 후 4 시간을 측정 하였다R 차량 제어 (± 표준 편차 평균, N = 6). GLuc-SERCaMP 분비 쌥시 가르 긴 유도 증가는 각각의 세포 밀도에 대한 표시됩니다. 통로 번호 2 및도 15 (B) SH-SY5Y-GLuc-SERCaMP 세포 쌥시 가르 긴 유도 된 분비를 조사 하였다. 세포를 2 시간, 4 시간 동안 100 nM의 Tg를 처리하고, 비히클 처리 제어가 분비 GLuc 활성을 정상화 하였다 (평균 ± SD, N = 4, 통로 인자의 큰 영향, 2 웨이 ANOVA). 점선은 y는 1. = 나타내는 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53199/53199fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53199/53199fig2.jpg" /> 그림 2. 세포 GLuc-SERCaMP 측정하는 효소 분석 (A)는 세포 내 및 (B)의 외 GLuc 효소 활성은 래트에서 평가 일차 코르시켰다(AAV-GLuc-SERCaMP 형질 도입) 광 케이블 (optical) 뉴런. 엿새 동안 전달 후, 세포를 4 시간 동안 60 나노 쌥시 가르 긴 처리 하였다. GLuc-ASARTDL는 매질에 축적 된 바와 같이, 세포 수준에서의 대응 감소가 관찰된다. (C) 세포의 비율 GLuc 세포 내 활성은 각각의 웰에 대해 계산 될 수있다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53199/53199fig3.jpg" /> 그림 3 :. SH-SY5Y 세포 및 기본 대뇌 피질의 신경 세포를 쥐에 대한 쌥시 가르 긴 유발 반응 대 AAV-GLuc - ASARTDL 역가 (a)는 SH-SY5Y 세포는 잘 당 5 × 10 4 세포를 96 웰 플레이트에 접종하고 준수하는 것이 허용되었다 하룻밤. 세포는 48 시간 동안 배양 한 다음 300 nm의 Tg가 또는 비히클로 처리 감염 표시된 다수 (MOI)로 형질 도입 하였다. 발광 8 시간 후에 배지로 측정 (평균 ± SEM, N = 3)이었다. * P &lt;0.05, MUL여 러 T-테스트 (홀름 - Sidak 보정). (B) 쥐 주 대뇌 피질의 뉴런 (전달의 시간에 잘 근사 당 60,000 세포를 사용하여 계산) 표시 MOI에서 AAV-GLuc-ASARTDL와 DIV8에 형질 도입했다. (N = 평균 ± SEM 6) 다섯 일 형질 도입 후, 세포를 100 nM의 Tg를 처리 한 배지 또는 차량 제어와 발광 8 시간 후에 측정 하였다. * P &lt;0.05, 다수의 T-테스트 (홀름 - Sidak 보정). <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53199/53199fig4.jpg" /> 그림 4 :. 바이러스 역가의 범위에서 간내 주사 다음 혈액에 GLuc-SERCaMP 자료를 쌥시 가르 긴 유도 (A) 원시 발광 값을 쥐에서 (N = 8) intrahepatically 다른 AAV-GLuc - ASARTDL 역가 주입. 쌥시 가르 긴 (1 ㎎ / ㎏) 주입 (IP)은 제 피가 지정된 시점에서 수집하고, -80 #에 저장 하였다 일에 투여 하였다(176), 분석의 때까지 C. (B) 쥐 쌥시 가르 긴 유도 SERCaMP 응답 (N = 8) AAV-GLuc-ASARTDL 다양한 양의 표현을 보여주는 패널로부터 발광 정규화 값. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/53199/53199fig5.jpg" /> 도 5 :. 운반 (생체 내) GLuc-SERCaMP 플라즈마 샘플의 저장은 (A) 혈장, intrahepatically (N = 10) GLuc-SERCaMP 발현 래트로부터 수집 분주하고 분석시까지 -80 ℃에서 보관 하였다. 튜브는 -80 ° C에서 제거되고 종래의 발광 측정에 나타낸 회 4 ° C에서 저장 하였다 (평균 ± SD). GLuc 효소 활성에 혈장 샘플의 다수의 동결 / 해빙의 (B) 효과. 혈장 샘플은 수로 표시 하였다 (N = 10) intrahepatically AAV-GLuc-SERCaMP 발현 래트로부터 수집동결 - 해동 사이클과 발광에 대한 분석 (평균 ± SD). <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/53199/53199fig6.jpg" /> 도 6 :. GLuc-SERCaMP 분석법 코 엘렌 테라 기판을 준비 (A) 배양 배지를 5 시간 동안 300 nM의 Tg는 (또는 차량 제어) 처리 SH-SY5Y-GLuc-SERCaMP 세포주로부터 수집 하였다. 배지 GLuc 활성은 (평균 ± SD, N = 6)의 코 엘렌 테라 PBS + 각종 농도를 주입하여 측정 하였다. 차량 쌥시 가르 긴 - 유도 효과를 평가하기 위해, 각 기질 농도 제어 처리에 패널로부터의 (B) 발광의 값은 정규화 하였다. 몇 시간 이상 (C) 기판 붕괴. 재조합 GLuc (0.1 NG 0.02 NG)의 알​​려진 양의 발광은 SD (평균 ±, N = 4) 기판을 준비 후 몇 시간에 걸쳐 측정 하였다. (D) 중에 대한 재조합 생 발광GLuc이 붕괴 기판하기 때문에 시간이 지남에 따라 감소, 샘플의 배 차이 (발광에 의해 결정)를 유지 하였다. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/53199/53199fig7.jpg" /> 그림 7 :. GLuc / CTZ 반응의 반응 속도에 관한 GLuc-SERCaMP 분석을위한 고려 사항 (가) 문화 매체는 GLuc / CTZ 신호의 감쇠를 변경합니다. GLuc SERCaMP - 함유 상층 액의 5 μL은 PBS 및 배양액의 다양한 비율로 혼합 하였다. 기질 100 ㎕ (PBS + 500 mM의 아스 코르 빈산 15 μM C​​TZ)의 표에 요약 된 바와 같이 희석 샘플 50 ㎕를 첨가 하였다. 발광은 15 분에 걸쳐 모니터링 하였다. (B) 매체의 5 μL는 SH-SY5Y-GLuc - ASARTDL 세포와 100 μL 기판 (PBS + 5 mM의 NaCl을 8 μm의 CTZ)에서 수집 하였다. 발광이 위에 기판 (T = 0) 및 매 30 초를 첨가 한 직후 측정 한<html> 15 분 (± 표준 편차, N = 12)의 과정. 데이터 붕괴의 속도를 평가하기 이전에 30 초 간격으로 신호 퍼센트 상대로서 플롯된다. 삽입 된 원시 발광 데이터를 보여줍니다. <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/53199/53199fig8.jpg" /> 그림 8 :. GLuc 분비에 100 나노 쌥시 가르 긴의 응급실 칼슘 고갈의 약리학 적 확증 (A) 효과 GLuc-ASARTDL과 GLuc 아니 태그 제어 조사 (평균 ± SD, N = 6) 하였다. (B) 트롤 렌 (RyR 길항제)와 ER 칼슘을 안정화은 TG-유도 SERCaMP 방출을 억제한다. 세포는 30 분 또는 100 나노 쌥시 가르 긴의 추가 전에 16 시간 동안 트롤 렌의 표시 농도 사전 처리 하였다. 배지 GLuc 활성은 4 시간 후 (평균 ± SD, N = 6)을 측정 하였다. 99fig9.jpg &quot;/&gt; 그림 9 :. GLuc-SERCaMP 분석을위한 모의 대표 결과 (개별 판을 읽는 사이의 시간 간격에 따라 다름) 고장 기판에 의한 처리 값을 판 사이에 감소 할 수있다 차량을합니다. 이러한 영향을 고려하여, 특정한 치료 효과는 각 플레이트에 대해 독립적으로 계산되고,이 비율은 플레이트를 통해 비교된다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 날짜 </td><td> 쥐 </td><td> 튜브 질량 (mg)을 </td><td> 헤파린 볼륨 (ML) </td><td> 헤파린 밀도 (g / ㎖) </td><td> 헤파린 질량 (mg)을 </td><td> 튜브 + 헤파린 (mg)의​​ 질량 </td><td> 혈액 수집 후 총 질량 (mg)을 </td><td> 수집 된 혈액의 질량 (mg)을 </td><td> 혈액 농도 (g / ㎖) </td><td> 계산 된 혈액 용적 (UL) </td><td> 2에 필요한 헤파린의 볼륨 : 1의 비율로 </td><td> 스핀 전에 추가 추가 헤파린 ML </td></tr><tr><td> 01.01.15 </td><td> SD 남성 </td><td> 1135.9 </td><td> (50) </td><td> 1.117 </td><td> 55.83 </td><td> 1191.73 </td><td> 1317.70 </td><td> 125.97 </td><td> 1.05 </td><td> 119.97 </td><td> 59.98 </td><td> 9.98 </td></tr></tbody></table> 표 1. SERCaMP 연구를위한 혈액 수집 로그의 혈액 채취 테이블 예.

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Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

사용 소포체 칼슘 항상성 모니터링<em&gt; Gaussia</em&gt; 루시 페라 제 SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

monitoring-endoplasmic-reticulum-calcium-homeostasis-using-gaussia

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

13.1K 조회수.  National Institutes of Health. Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

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Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane biogenesis occurs rapidly and in an inducible manner. We have found that phagocytosis of latex beads is practical for these purposes as cells rapidly synthesize membrane lipids to replenish membrane pools lost as  wrapping material  during particle engulfment. Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-Glo  Luciferase Assay System from Promega.

Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-GloTM Luciferase Assay System from Promega.

루시페라제 기반 리포터 유전자 분석과 함께 막 Biogenesis 유학

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

연구

생물학

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, differentiation, and apoptosis1. During apoptosis, calcium accumulation in mitochondria promotes the release of pro-apoptotic factors from the mitochondria into the cytosol2. It is therefore of interest to directly measure mitochondrial calcium in living cells in situ during apoptosis. High-resolution fluorescent imaging of cells loaded with dual-excitation ratiometric and non-ratiometric synthetic calcium indicator dyes has been proven to be a reliable and versatile tool to study various aspects of intracellular calcium signaling. Measuring cytosolic calcium fluxes using these techniques is relatively straightforward. However, measuring intramitochondrial calcium levels in intact cells using synthetic calcium indicators such as rhod-2 and rhod-FF is more challenging. Synthetic indicators targeted to mitochondria have blunted responses to repetitive increases in mitochondrial calcium, and disrupt mitochondrial morphology3. Additionally, synthetic indicators tend to leak out of mitochondria over several hours which makes them unsuitable for long-term experiments. Thus, genetically encoded calcium indicators based upon green fluorescent protein (GFP)4 or aequorin5 targeted to mitochondria have greatly facilitated measurement of mitochondrial calcium dynamics. Here, we describe a simple method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes in response to different stimuli. The method is based on fluorescence microscopy of 'ratiometric-pericam' which is selectively targeted to mitochondria. Ratiometric pericam is a calcium indicator based on a fusion of circularly permuted yellow fluorescent protein and calmodulin4. Binding of calcium to ratiometric pericam causes a shift of its excitation peak from 415 nm to 494 nm, while the emission spectrum, which peaks around 515 nm, remains unchanged. Ratiometric pericam binds a single calcium ion with a dissociation constant in vitro of ~1.7 &mu;M4. These properties of ratiometric pericam allow the quantification of rapid and long-term changes in mitochondrial calcium concentration. Furthermore, we describe adaptation of this methodology to a standard wide-field calcium imaging microscope with commonly available filter sets. Using two distinct agonists, the purinergic agonist ATP and apoptosis-inducing drug staurosporine, we demonstrate that this method is appropriate for monitoring changes in mitochondrial calcium concentration with a temporal resolution of seconds to hours. Furthermore, we also demonstrate that ratiometric pericam is also useful for measuring mitochondrial fission/fragmentation during apoptosis. Thus, ratiometric pericam is particularly well suited for continuous long-term measurement of mitochondrial calcium dynamics during apoptosis.

This protocol describes a method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes by fluorescent imaging. The method takes advantage of a circularly permutated YFP-based dual-excitation ratiometric calcium sensor (ratiometric pericam-mt) selectively expressed in mitochondria.

유전자 변형으로 인코딩된 칼슘 센서를 사용하여 Apoptosis 동안 Mitochondrial 칼슘 레벨에서 동적 변경 사항 모니터링

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

HELA 세포 Transfection 얹는 Gaussia의 루시페라제의 mRNA의 시험 관내 스크립트 작성 및 상한에

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks (reviewed1,2). The circadian time-keeping system is a hierarchical multi-oscillator network, with the central clock located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) synchronizing and coordinating extra-SCN and peripheral clocks elsewhere1,2. Individual cells are the functional units for generation and maintenance of circadian rhythms3,4, and these oscillators of different tissue types in the organism share a remarkably similar biochemical negative feedback mechanism. However, due to interactions at the neuronal network level in the SCN and through rhythmic, systemic cues at the organismal level, circadian rhythms at the organismal level are not necessarily cell-autonomous5-7. Compared to traditional studies of locomotor activity in vivo and SCN explants ex vivo, cell-based in vitro assays allow for discovery of cell-autonomous circadian defects5,8. Strategically, cell-based models are more experimentally tractable for phenotypic characterization and rapid discovery of basic clock mechanisms5,8-13.
Because circadian rhythms are dynamic, longitudinal measurements with high temporal resolution are needed to assess clock function. In recent years, real-time bioluminescence recording using firefly luciferase as a reporter has become a common technique for studying circadian rhythms in mammals14,15, as it allows for examination of the persistence and dynamics of molecular rhythms. To monitor cell-autonomous circadian rhythms of gene expression, luciferase reporters can be introduced into cells via transient transfection13,16,17 or stable transduction5,10,18,19. Here we describe a stable transduction protocol using lentivirus-mediated gene delivery. The lentiviral vector system is superior to traditional methods such as transient transfection and germline transmission because of its efficiency and versatility: it permits efficient delivery and stable integration into the host genome of both dividing and non-dividing cells20. Once a reporter cell line is established, the dynamics of clock function can be examined through bioluminescence recording. We first describe the generation of P(Per2)-dLuc reporter lines, and then present data from this and other circadian reporters. In these assays, 3T3 mouse fibroblasts and U2OS human osteosarcoma cells are used as cellular models. We also discuss various ways of using these clock models in circadian studies. Methods described here can be applied to a great variety of cell types to study the cellular and molecular basis of circadian clocks, and may prove useful in tackling problems in other biological systems.

Circadian clocks function within individual cells, i.e., they are cell-autonomous. Here, we describe methods for generating cell-autonomous clock models using non-invasive, luciferase-based real-time bioluminescence technology. Reporter cells provide tractable, functional model systems for studying circadian biology.

루시 페라 제 Bioluminescence 기자를 사용하여 유전자 발현의 셀 자치 Circadian 시계 리듬을 모니터링

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

포유류의 세포에서 Endoplasmic 소포체 현지화 mRNAs의 시각화

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석 실험을 사용하여 높은 처리량 기능 검사

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

사용<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt; 다세포 생물의 단백질 항상성을 연구하는 모델 시스템으로

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

배양 된 세포의 소포체 하위 도메인의 시각화

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency1, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.

Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell&#8217;s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.

루시퍼 라제 리포터 유전자 RAW264.7 세포를 형질

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

형광 표지 된 나노 입자를 사용하여 쥐, 인간과 돼지 유래의 살아있는 세포에서 세포 내 유전자 발현의 검출

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...