This work was supported by a Project for Private Universities: matching fund subsidy from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT) of Japan (T.I.) and Grants-in-Aid for Scientific Research (C) from MEXT (S.T. and K.N).

프로토콜과 실험 동물의 사용은 야마나시와 와세다 대학의 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다. 동물 관리 기관은 지침에 따라 수행 하였다. 1. CPEC 준비 <ol><li> 다음 장치 및 재료 준비 : 바닥에서 조명을 전송하는 것이 바람직 할 수있는 스테레오 현미경,; 시계 포셉 한 쌍의 (뒤몽 # 3, # 4), 화염 멸균, 직선 운영 가위, 화염 멸균; 20 ml의 얼음처럼 차가운 Leibovitz L-15 미디어를 포함하는 두 멸균 10cm 플라스틱 접시; 2 ml의 RT Leibovitz L-15 매체를 포함하는 35mm의 유리 바닥 요리; 70 % 에탄올을 함유하는 100 ml의 비이커; 신생아 마우스 새끼. </li><li> 간단히 70 % 에탄올에 신생아 마우스를 담그고 운영 가위를 사용하여 잘린 빠르게 안락사. </li><li> 멸균 10cm 디에 얼음처럼 차가운 Leibovitz L-15 배지에서 즉시 머리를 배치SH. </li><li> 뇌를 노출하기 위해 두개골을 열 절단, 시계 포셉의 쌍을 사용하여 덮개 뼈의 피부를 제거하고 뇌 전체를 분리 두개골 신경을 잘라. </li><li> 얼음처럼 차가운 Leibovitz L-15 미디어를 포함하는 새 접시에 두뇌를 전송하고 뇌가 완전히 매체에 몰입되어 있는지 확인하고, 스테레오 현미경으로 관찰한다. </li><li> 이 위를 향하도록 뇌의 등 부분을 설정하고 후각 전구 (오른 손잡이 인 경우) 세시 방향에 상주하도록 뇌의 방향. 왼쪽 손에 집게로 부드럽게 뇌를 잡습니다. </li><li> 미세 해부 포셉 (뒤몽 # 3, # 4) 오른쪽 손을 사용하여, 대뇌의 종 방향 균열을 따라 대뇌 반구를 연결하는 뇌량과 실질 아래를 잘라. </li><li> 부드럽게 멀리 측면에 대뇌 반구를 밀어 가로 대뇌 균열을 노출. </li><li> 일을 곤란하게하여 반구를 분리반구과 시상 사이의 전자 실질. </li><li> 조심스럽게 라미 affixa에 의해 해마의 측면에 부착 된 측면 심실 맥락총을 잡아 당깁니다. </li><li> 신선한 Leibovitz L-15 매체를 포함하는 35mm의 유리 바닥 접시에 고립 된 맥락총 이동, 중량 (자료 목록) 조심스럽게 제자리에 조직을 유지하는 오버레이. </li></ol> CPEC 섬모 2. 라이브 영상 <ol><li> 400 nm 내지 이상 700 nm의, 그 감광 (ND) 필터 (25 %, 6 %)보다 짧은 광 광로에 삽입 차단하는 적절한 자외선 (UV) 및 추론 (IR) 차단 필터 (들)를 확인 거꾸로 현미경의. </li><li> 거의 눈에 의해 대물 렌즈의 초점을 조절하고, 중심 및 포커스 쾰러 조명에 적합 할 수 있도록 한 다음 콘덴서를 조정한다. 적절한 미분 간섭 대비를 삽입 (DIC) 프리즘, 리튬의 DIC 요소뿐만 아니라, 분석 및 편광판 요소GHT 경로는 DIC 광학을 준수합니다. </li><li> 조직 표면의 구조가 가장 인식되도록 DIC 프리즘 위치하여 뷰의 콘트라스트를 조정한다. 표적 세포의 운동성 모든 속눈썹이 경우, 운동성 섬모의 클리어 뷰 인해 안구 운동에 의해 얻을 수 없다. </li><li> 비디오 카메라에 빛의 경로를 변경하고, 광 전력을 증가시키는 ND 필터를 제거한다. </li><li> 보기와 초점 분야를 조정 초점 모드에서 카메라를 사용합니다. 하는 영상이 모니터에 실시간으로 표시됩니다, 집중하는 동안, 운동성 섬모의 밝은 전망을 사용할 수 없습니다. </li><li> 원하는 기간 (분 초) 0.1 밀리의 노출 시간 200 Hz에서 카메라를 사용합니다. 이미지 스택의 취득 후, 하나의 프레임은 분명 섬모 구조를 표시합니다. 섬모 가장자리 흐리게 경우, 프레임 레이트를 증가 시키거나 더 짧은 노출 시간을 사용한다. </li><li> Leibovitz의 안락사 후 25-60 분 이내에 CPEC의 섬모의 움직임을 기록L-15 매체. </li></ol> 섬모 운동 3. 분석 <ol><li> 수동으로 컴퓨터 모니터에 각각의 섬모의 패턴을 치고 추적 할 수 있습니다. 각각의 섬모의 궤적 정보 조립 마우스 포인터, 각 프레임의 표시 모양체 선단 위치. 어느 쪽의 추가 분석을 위해 다른 일반적인 응용 프로그램에 동일한 소프트웨어 또는 내보내기를 사용하여 궤도 정보를 분석 할 수 있습니다. 이러한 분석 단계의 효율의 논의에서 설명된다. </li><li> 눈으로 운동의 두 가지 모드, 앞뒤로 또는 회전으로 ​​궤도를 분류. </li><li> 다음 식을 사용 모양체 비팅 주파수 (CBF)를 계산 : [CBF = (초당 프레임 수) / (하나의 비트에 대한 프레임의 평균 개수)] 모양체 팁 움직임도 얻을 수있다 (14) (도 3 ). 동일한 셀에 다른 섬모 각 ciliu의 움직임을 방해 할 수 있기 때문에, 다수의 섬모 박동주기위한이 계산을 반복M, 불규칙성의 결과. </li><li> 단일 셀 내에서 축 치고 섬모의 각도 균일 성을 분석하기 위해, 각각의 궤도 (그림 4)의 박동 각도 θ를 정의합니다. 전후 궤적 들어 직선 섬모 팁의 위치 맞춤, 및 X 선을 이동시킴으로써 행한다과 이루는 각도가 θ를 정의한다. 회전 궤도를 들어, 타원에 위치를 맞춘 타원의 장축이 X시킴으로써 행한다과 이루는 각도가 θ를 정의한다. 피팅의 세부 사항은 대표 결과 섹션에 설명되어 있습니다. </li><li> 각 궤도의 정량적 설명은 일반화 종횡비 AR을 계산한다. 간단히에 의해 궤도를 회전 - θ과 X를 따라 분포의 폭 사이의 비율로 AR을 정의 -와 y -axes (그림 4B). 세부 사항은 대표 결과 섹션에 표시하고, 해석된다유의성은, 상기 매개 변수의 제한은 논의에서 설명된다. </li></ol> SEM 4. 샘플 준비 주 : SEM이 종합적으로 CPECs상의 섬모의 상태를 평가하는 중요한 방법이다. 현미경에 대한 표본을 준비하기 위해, 표준 절차는 이전에 (15)는 약간의 수정으로 사용된다보고했다. <ol><li> 뇌로부터 조직을 절개하기 전에, 폴리에틸렌 캡 5 mL 유리 바이알에 정착액을 준비한다. 정착은 2 % 파라 포름 알데히드, 0.1 M 인산 완충액, pH가 7.4에서 2.5 % 글루 타르 알데히드 (반 Karnovsky의 솔루션 16)로 구성되어 있습니다. </li><li> 단계 1에 기재된 바와 같이 뇌로부터 조직을 해부. </li><li> 간단히 새로운 접시에 행크 평형 염 용액 (HBSS)으로 격리 된 조직을 린스 한 다음, 실온에서 1 시간 동안 유리 바이알에 정착액의 조직을 고정한다. 일회용 전송 피펫을 사용하여 표본 GE를 처리ntly. HBSS로 세척 후 조직 접착된다. <ol><li> 정착액 용액에 시편을 전송하기 위해 천천히 방울로 전달 피펫 조직을 함유하는 용액을 소량 배출 및 고정액에 추가. </li></ol></li><li> 정착 후, 고정액을 폐기하고 인산 완충액으로 세 번 조직을 헹군다. </li><li> 나머지 알데히드를 씻어 10 % 자당 용액에 조직을 담근다. 알데히드를 완전히 제거되도록 10 분 동안 용액에 샘플이 담궈하고 신선한 10 % 수크로오스로 두 번 반복한다. 이 단계는 후속 단계에 적절한 포스트 고정을 달성하는 것이 중요하다. </li><li> 30 분 동안 인산염 완충액 1 % 오스뮴 테트 록 사이드의 용액에 담가 조직하고 이후 정용 얼음 위에 놓는다. 샘플에 의한 색 osmification 정도 판사 : 알데히드가 완전히 제거 될 때, 샘플은 흑색이다. </li><li> 더블 distille 광범위 후 고정 조직 샘플을 씻으십시오D 물을 여러 번. </li><li> 에탄올의 농도 구배에 의해 샘플을 침지 탈수, 보통 65 %, 75 %, 85 %, 95 %, 99 %, 100 %, 10 분마다. 새로 구입 한 병에서 99.5 %의 에탄올로 분 자체를 배치하여 무수 에탄올을 얻습니다. 무수 에탄올로 3 회 탈수를 반복합니다. </li><li> 10 분 동안, 이소 아밀 아세테이트, 임계점 건조를위한 대체 시약으로 탈수 샘플을 놓습니다. 두 번이 단계를 반복합니다. 이 시약은 급속히 증발 샘플은 표면 장력에 의해 파괴의 결과로 건조 될 수있다. 따라서, 완전히 샘플을 건조하지 않습니다. </li><li> 이소 아밀 아세테이트의 최종 교환 후, 바로, 용매의 대부분을 제거 알루미늄 호일로 열려있는 유리 병을 포장하고, 드라이 아이스에 병을 놓습니다. 액체 이산화탄소가 임계점 건조기에서 유리 병에 쉽게 흐르도록 바늘 또는 미세 집게를 사용하여, 유리 병의 입구를 덮고있는 호일에 여러 구멍을 확인합니다. 다음 단계로 진행가능한 한 빨리. </li><li> 이 단계에서, 건조기의 챔버로 이소 아밀 아세테이트 이월을 최소화하지만, 시료가 완전히 임계점 건조 전에 건조시키지 않는다. 또한, 유리 병에 서리의 형성을 피하기 위해 불필요하게 오랜 시간 동안 드라이 아이스에 샘플을 두지 마십시오. </li><li> 물 제거는 조직에 포함되는 동안 조직의 표면 구조는 그대로 남아 있도록 임계점 건조기로 조직 샘플을 함유하는 호일 - 래핑 유리 바이알을 전송. 임계점 건조기를 동작에 대한 자세한 정보는 제조업체의 지침에서 얻을 수있다. </li><li> 신중하게 기계적 손상을 최소화하기 위해 이쑤시개를 사용하여 샘​​플을 처리합니다. 그 결과 건조 조직 샘플은 약합니다. 이온 스퍼터를 이용하여 금 - 팔라듐 금속 스텁과 코트에 샘플을 탑재합니다. </li></ol> SEM 5. 관측 <ol><li> SEM에 의해 관찰하고, 디지털 카메라로 화상을 기록주사 전자 현미경에 장착. </li><li> 분석을 위해 PC에 디지털 화상 데이터를 전송. </li></ol>

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저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다. 이 논문은 고립 된 맥락총 조직에서 섬모의 운동성을 관찰하는 자세한 방법을보고하는 것을 목적으로한다. 과학 참신는 이전의 연구 1,8에서보고되었다.

이 방법의 관점 여기에 설명 된 기술은 이전에 발행 된 방법보다 섬모의 더 상세한 분석을 제공하지 않지만,이 기술의 중요성은 쉽게 섬모 운동 생체의 종류를 선별에 적용 할 수있는 시스템 및 비용 효율성의 단순성에있다. 특히, TI 워크 벤치 관찰하고 더 쉽게 섬모의 운동성을 분석하는 연구를 할 수있는 간단하고 사용자 친화적 인 인터페이스를 제공합니다. 효과적인 자동화 된 추적 방법은 비디오 강화 된 반면-DIC의 흠없는 섬모의 낮은 대비 개체에 대한 개발되지 않았다. 섬모 운동을 추적하는 방법은, 수동이 기술되어 있지만, 섬모 운동 추적 분석 노력의 양은 최적 화상 분석을 위해 범용 소프트웨어 패키지를 사용하는 것과 비교하여 감소된다. 샘플 해부 전자를 준비하려면X 생체 CPEC 샘플, 신속하고 부드러운 조작은 섬모 생체의 운동성을 보장하는 조직의 생존 능력을 유지하는 데 필요한. 적혈구에 의한 오염이 관찰 분야를 흐리게하기 때문에, 인산염 완충 식염수 해부 조직의 부드러운하지만 복잡한 세척이 좋습니다. 출혈을 방지하기 위해주의를 콜로이드 신경총의 affixa 얇은 판에 부착 된 눈에 잘 띄는 붉은 실 같은 구조로 식별 할 수있는 후방 맥락막 동맥 찢어지지 않도록 운동을해야합니다. 현미경 DIC 광학 및 고전력 전송 광원 장착 도립 현미경은이 방법을 위해 필수적이다. 수은 램프는 일반적으로 자주 스위칭 온 및 오프 능력이 있으므로, 램프 하우징의 전면에 셔터가 필요하다. 어느 수동 또는 전기 셔터는이 목적을 위해 사용될 수있다. 시험편과 관찰자의 눈을 보호하기 위해 FR옴 자외선 및 적외선 광은 광학 필터 만 가시 광선 (400-700 대역 통과 또는 UV와 IR 컷 필터의 조합)를 허용해야합니다. 비디오 카메라와 고속 저속 기록 포커싱, 눈으로 모니터링 : ND 필터는 또한 상황에 따라 상이 광 전력을 변경할 필요하다. 높은 개구 수를 가지는 대물 렌즈는 높은 해상도 필요하다. 커버 슬립의 상단 때문에 조직의 형태 및 두께의 초점 사이에 약간의 거리가있다. 따라서, 물에 침지 렌즈보다는 오일 침지 렌즈는 더 나은 이미지 품질에 바람직하다. 제진 안정된 화상 스택을 수득 할 필요가있다. 에어 댐퍼 타입의 테이블은 이러한 목적에 유용하지만,도 작동 할 수 정상 테이블 현미경베이스 아래 테니스 공을 삽입하여 현미경 간단 쿠션. 비디오 카메라 레아에서 가능한 CCD 카메라세인트 200 프레임 / 초는 섬모의 운동을 추적 할 필요가있다. 지난 십년 동안, 표준 비디오 레이트 (25 ~ 30 Hz로)보다 더 빠른 프레임 속도로 CCD 카메라는 훨씬 낮은 비용을 가능하게했다. 상기 프레임주기보다 짧은 노출 시간이 가능한 카메라 모델은 데이터 양을 증가시키지 않고 섬모의 운동으로 인해 블러 링 감소하는데 유용하다. 0.1 밀리의 노출 시간 5 밀리 초 프레임 간격 (200 Hz에서)이 충분한 품질 CPECs 섬모의 화상을 얻기 위해 최소한의 조건이다. 소프트웨어 각각의 섬모의 운동을 추적하는 분석은 이미지 분석을위한 범용 소프트웨어 패키지의 각각의 섬모 팁을 추적하는 데 사용되는 경우, 특히, 시간이 걸린다. 이러한 모니터 모양체 선단 위치에 마우스 클릭 등의 반복 작업의 단계를 줄이기 클릭 위치를 기록하는 메뉴를 선택하고, 버튼을 클릭하면, 다음 이미지 프레임에 상당한 재 결과를 이동시간과 노력의 duction. 본 연구에서는 특별한 루틴은 주문 제작 TI의 워크 벤치 소프트웨어에 추가되었습니다. TI 작업대 소프트웨어 모양체 추적 모드에서, 사용자는 다음과 같은 2 단계의 간단한 조작을 반복 계속 : 이동 요구하지 않는 프레임을 전진 섬모 팁에 마우스 포인터를 이동하여 키보드의 화살표 키를 누름 마우스 포인터 또는 사용자의 눈은 컴퓨터 화면에 모양체로부터 팁 (컴퓨터 화면에 메뉴와 버튼으로) 이동한다. 소프트웨어는 섬모 팁의 위치를​​ 추적 사용자를 돕기 위해 기록 된 궤적을 표시하고, 추가 분석을 위해 모양체 움직임 정보의 테이블을 생성한다. 이미지 분석을위한 대부분의 범용 소프트웨어는 반복 작업의 배치 프로세싱을 위해 매크로 프로그래밍을 허용한다. 반복 단계를 줄이기 위해 이러한 사용자 지정 프로그래밍을하는 것이 좋습니다. 궤도의 분석 trajectori의 추출전술 한 바와 같이 ES, 주문품 TI 작업대 소프트웨어를 사용하여 수행 하였다. 비교적 간단한 분석 및 화상 처리도 동일한 소프트웨어를 사용하여 수행 하였다. 피팅 분석의 경우, 각각의 섬모의 선단부의 궤적은 이고르 Pro 소프트웨어로 옮겼다. 예컨대 MATLAB 같은 다른 고급 분석 소프트웨어는 또한이 목적을 위해 사용될 수있다. 현재의 연구에서 앞뒤로 또는 회전 궤도로 궤도 분류에 어려움 때문에, 궤도는 일관성있는 분류의 결과로, 또 다른 관찰자에 의해 확인되었다 눈을 멀게 패션에 눈으로 분류되었다. 그럼에도 불구하고, 가능한 모든 독단하지 않고 궤도를 분류하는 더 수학적으로 엄격한 조치가 바람직 할 것이다. 궤적의 피팅 전후 및 회전 운동 양자 모두에 장착 타원 ()의 종횡비로 타원율의 정도를 수치화 할 수있는 것으로 보인다 이상적인 타원. 그러나분류를위한 임계 값을 정의하는 화면 비율의 분포를 사용하는 시도가 비효율적이었다. 자주 앞뒤로 궤도에 실패했습니다 피팅, 매개 변수가 자주 수렴에 실패하고, 통합 피팅 분명히 착각이었다. 따라서, 타원 피팅 자동 궤도를 분류 또는 각 궤도의 타원율을 수치화하기 위해 채택되지 않았다. 피팅 장착 타원의 장축과 같은 회전 이동형 팁 비팅 방향 추출을 행했다. 현재 연구에서, AR은 궤도가 이상적인 선형 왕복 이동 일탈 정도를 정량화하기 위해 제안되었다. 파라미터는 수직 방향을 따른 것과 비팅 방향 분포의 폭의 비율이다. 궤적 위에서 언급 한 타원의 종횡비를 닮은 원형 때 궤적 한 직선이며, 경우에 값은 0이어야한다. 고해시킴으로써 행한다 X 방향 (도 4b)에 평행이되도록 실제적으로, AR 값을 획득하는 단계, 회전 궤적을 비교적 쉽게 할 수있다. 이 정량화 파라미터의 잠재적 사용하는 각 궤도의 특성을 정량화하기 위해,뿐만 아니라, 더 엄격한 궤적을 분류 할뿐만 아니라 제안 운동 두 모드에 대한 고유 값에 상당히 리드. 그러나, 비팅 방향 자체가 이미 현재에있어서 두 가지 모드에 대한 고유 피팅 프로세스의 결과임을 주목해야한다. 분석의 추가의 개선은, 이러한 고급 피팅 알고리즘도 가능 임의성의 문제를 해결할 수있다. 궤적의 타원율 관한 태양은 각각의 섬모의 CPEC 구타 X 엄격 수직 인 평면에서 일어나는되지 않을 수 있다는 것이다 - Y </EM&gt; 관찰면. 사실, 현미경 영상의 결과는 CPEC의 섬모가 종종 기울어 져 있음을 암시하고, 경사는 명백한 타원 또는 궤도의 이방성 발생할 수 있습니다. SEM 준비 SEM 관찰을위한 제조시, 높은 품질의 이미지의 취득을 위해 몇 가지 중요한 점이있다. 첫째, 산화 오스뮴으로 후 고정은 10 % 자당 용액으로 미리 세척을 포함,주의 깊게 수행해야합니다. osmification 절차에 의해 적절한 고정없이 후속 단계는 제제의 낮은 품질로 이어지는 유지하거나 시험편의 상태를 복원 할 수 없다. 알데히드 고정 제 환원제되므로 시료 내의 잔존 알데히드는 산화 오스뮴, 강산 화제의 활성을 억제한다. 표본에서 불필요한 알데히드의 제거를 보장하기 위해, 자당 용액에주의 세척은 필수적이다. 최적의 PO 경우세인트 고정은 시편의 색상은 갈색에서 검은 색으로 변경되지 않습니다. 둘째, 산화 오스뮴의 체적은 적어도 샘플보다 큰 50 배이어야한다. 그렇지 않은 경우, 충분한 정착 기대할 수 없다. 셋째, 특히 고순도의 에탄올과 이소 아밀 아세테이트를 이용하는 탈수 과정에서, 시험편의 완전한 건조를 방지하는 것이 중요하다. 시료의 건조 불량 화상 발생 등 섬모로 미세한 표면 구조를 파괴한다.

Cilia are hair-like projections on the surface of most vertebrate cells, which have attracted attention by medical researchers because of a class of diseases termed ciliopathies2&#8211;4. Despite the ubiquitous expression of the organelle, a wide variety of ciliary functions have been reported, including motility and biosensing. For example, motile cilia on the mucoepithelial surface transport mucus5 and epithelial debris to the outlet of tracts, thereby preventing disease by clearing the surface of epithelia. Moreover, during early developmental periods and embryonic stages, cilia regulate the proliferation of stem cells6, and are involved in the determination of left&#8211;right asymmetry of the vertebrate body7. 
Choroid plexus epithelial cells (CPECs) are derivatives of neuroepithelial cells that cover the surface of the choroid plexus tissue in the brain, which play important roles in maintaining homeostasis of the intracranial environment by production of cerebrospinal fluid (CSF). It has been previously demonstrated that CPECs have multiple non-motile cilia that regulate the production of CSF through G-protein-coupled receptors that are specifically concentrated on the cilia8. Although these cilia had been regarded as quiescent non-motile cilia, it was discovered that some CPEC cilia exhibit transient motility during the neonatal period1. This finding was quite important because it revealed that so-called non-motile cilia are not necessarily immotile from the beginning of development and might display transient motility during specific time windows, possibly in response to specific physiological demands and functions9. To precisely describe the motile nature of CPEC cilia, it is necessary to develop an ex vivo observation system that encompasses analysis of the kinetic profiles unique to CPEC cilia. 
With respect to motility, although several technical reports have described observations of the motile cilia of the tracheal epithelium5,10, motile single-cell flagella11, so-called conventional motile cilia12, and nodal cilia13, detailed analytical methods applicable to relatively undulated structures such as the choroid plexus have not been well documented so far. Moreover, a high time resolution is required to analyze the ciliary movement of CPECs, in which expensive high-speed cameras are indispensable. To circumvent this necessity and simplify monitoring the ciliary motility of various cell types, a low cost, high-speed camera has been introduced, and an easily accessible and convenient method to record the motility of motile cilia, especially to describe the speed and pattern of motion of each cilium, has been developed1. Moreover, original image analysis software &#8220;TI Workbench&#8221; has been used here to facilitate detailed analysis of motility. Collectively, this method provides a new concise strategy to analyze ciliary motion together with correlative scanning electron microscopy (SEM), which can be adopted in a wide range of cilium research.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>for both live imaging and SEM preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereo microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flat paper towel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#934;10-cm plastic dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mL beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>straight operating scissors</td>
			<td>Sansyo</td>
			<td>S-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>watchmaker forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>No.DU-3 or -4, INOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>for live cell imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass bottom dish</td>
			<td>Matsunami Glass</td>
			<td>D110300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>for SEM preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alminum foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-mL glass vial with a polyethylene cap</td>
			<td>Nichiden Rika-Glass</td>
			<td>PS-5A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transfer pipette</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>SM251-1S</td>
			<td>for specimen tranfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>toothpick</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for specimen transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ion sputter with gold-palladium</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>E-1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>critical point dryer</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>HCP-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>for live cell imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 W mercury lump housing and power supply</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-ULH and BH2-RFL-T3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 W mercury lamp</td>
			<td>Ushio</td>
			<td>USH103D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIC condenser, n.a. 0.55</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX-LWUCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrrical shutter</td>
			<td>Vincent Associates</td>
			<td>VS35S22M1R3-24 and VMM-D1</td>
			<td>manual shutter can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band-pass filter (400-700 nm, &#934;45 mm)</td>
			<td>Koshin Kagaku</td>
			<td>C10-110621-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ND filter (&#934;45 mm)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>45ND6, 45ND25</td>
			<td>combination of 25% and 6% ND filters are used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>objective lens (water immersion) with DIC element</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UApo 40XW/340, n.a., 1.15 with IX-DPAO40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-speed video camera</td>
			<td>Allied Vision Technologies</td>
			<td>GE680</td>
			<td>&#62;= 200 Hz frame rate and 1 msec expose time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image acquisition / analysis software</td>
			<td>in-hous software</td>
			<td>TI Workbench</td>
			<td>capable of acquisition at high frame rates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC for camera control / analysis</td>
			<td>Apple</td>
			<td>Mac Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibration isolation table</td>
			<td>Meiritsu Seiki</td>
			<td>AD0806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>weight for tissue</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>slice anchor kits</td>
			<td>It can be made with nylon mesh glued to a U-shape squashed &#934;0.5mm platinum wire.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>for SEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scanning electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JSM-6510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>for live cell imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol&#160;</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td>057-00456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz L-15 medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11415-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>for SEM preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol&#160;</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td>057-00456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14170112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1040051000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutaraldehyde&#160;</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>17003-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoamyl acetate</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>02710-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Sieves 4A 1/8&#160;</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td>130-08655</td>
			<td>for preparation of anhydrous ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffer saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffer, 0.1 M</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To make 100 ml, mix 19.0 ml of 0.1 M NaH2PO4 and 81.0 ml of 0.1 M Na2HPO4&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monosodium phosphate (dihydrate)</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>31718-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disodium phosphate (anhydrous)</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>31801-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suclose</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>30406-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>osmium tetroxide</td>
			<td>Nisshin EM</td>
			<td align="right">300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dry ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

observation of the ciliary movement of choroid plexus epithelial cells ex vivo

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. Choroid plexus epithelial cells (CPECs) covering the surface of choroid plexus tissue harbor multiple unique cilia, but most of the functions of these cilia remain to be investigated. To uncover the function of CPEC cilia with particular reference to their motility, an ex vivo observation system was developed to monitor ciliary motility during embryonic, perinatal and postnatal periods. The choroid plexus was dissected out of the brain ventricle and observed under a video-enhanced contrast microscope equipped with differential interference contrast optics. Under this condition, a simple and quantitative method was developed to analyze the motile profiles of CPEC cilia for several hours ex vivo. Next, the morphological changes of cilia during development were observed by scanning electron microscopy to elucidate the relationship between the morphological maturity of cilia and motility. Interestingly, this method could delineate changes in the number and length of cilia, which peaked at postnatal day (P) 2, while the beating frequency reached a maximum at P10, followed by abrupt cessation at P14. These techniques will enable elucidation of the functions of cilia in various tissues. While related techniques have been published in a previous report1, the current study focuses on detailed techniques to observe the motility and morphology of CPEC cilia ex vivo.

흐름의 개요는 이미지 장치를 포함하여,도 1에 도시된다. CPECs의 라이브 모션 관측 영화 1 산기 마우스로부터 단리 CPECs의 동영상을 도시하고, 동영상이 동영상 1 이미지의 확대도를 도시한다. 그것은 개별 섬모 팁 영화와 비교 정지 화상 불명확하다는 것을 알아야한다.이 프로그램을도 동영상 1 및도 2에 도시 된 데이터로부터 움직임의 다른 모드, 전후 및 회전 운동 두 섬모 운동 추적.도 3은 섬모의 궤적의 간단한 분석을 보여주는 위상차 두 좌표 회전 운동에 명백하다. CPEC 섬모 팁 궤적의 분석 드<html> 정량적 각 궤도를 분석하는 방법은 꼬리 치는 각도 θ의 정의 (A) 및 대표 결과 (B)를 분석하는 흐름도의 개략도로,도 4에 도시되어있다. , 전후 궤도 대 박동 각도 θ를 정의 직선 Y = AX + B에 여러 사이클 동안 모양체 팁의 위치를 맞춘 피팅 된 선을 따라 것과 비팅 방향을 정의한다. θ가 아크 탄 = 여기 박동 각도를 정의합니다. 종종 라인 피팅은, 회전 운동의 경우에 방향을 추출 타원의 회전 궤적을 맞춘 피팅 타원의 장축을 따라 것과 같은 방향을 정의하는데 실패하기 때문에. 보다 구체적으로, 다수의 매질 사이클 동안 팁의 위치 (X, Y)는 아래 함수에 장착된다. 1.JPG &quot;폭 =&quot;310 &quot;/&gt; 어디에 <img alt="식 (2)" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52991/52991eq2.JPG" width="200" /> X 0, 0, Y, A, B, 및 θ : 타원 피팅 다섯 피팅 파라미터들을 포함한다. X - 타원의 중심의 Y 좌표 -spatial는 각각 X 및 Y 0 0이다. 타원의 크고 작은 반경은 각각 A 및 B이다. 각도 θ는 장축 X시킴으로써 행한다 또는 비팅 각도 만드는 각도이다. 이러한 파라미터의 개략도는도 4a의 우측 패널에 도시되어있다. 피팅은 전술 명시 함수를 정의하여 이고르 프로 소프트웨어를 사용하여 수행된다. 그런 다음, 모든 속눈썹에 대한 각도 (θ)를 꺾고의 히스토그램 관찰같은 셀 D는 (나리타 등의 알 그림 2. 8) 원형 막대 그래프로 그려집니다. 주파수 분석 섬모 팁의 개수로 표준화된다. 그것은 각각의 섬모가 원형 히스토그램에서 두 θ 값을 갖는 것으로 해석되는 것을주의해야한다 예를 들어 π / 4 / 4 3π, 방향의 대칭 분포 선도. θ (도 4b) - 일반화 된 애스펙트 비 AR을 정의하기 위해, 다수의 사이클 동안 모양체의 선단 위치가 회전된다. 회전에 따라, 전후 및되어 회전 궤적 모두 X시킴으로써 행한다, X 축 및 Y 축을 따라 분배와 B의 폭이, 각각의 절반으로 정의되는 대략 평행 분산 최대 및 최소 사이의 차이. 따라서, 이들 파라미터는 타원, 및 (B)의 크고 작은 반경에 더 적합하다. 다음 AR AR = B / A에 의해 간의 비율 및 B로 정의된다. SEM으로 맥락막 신경총 상피 세포의 관찰 현미경은 시료의 미세 표면 구조를 관찰 할 수 있습니다. CPECs상의 섬모의 존재는 발달 시간 과정을 통해 확인된다. CPECs 여러 섬모의 출현은 맥락막 신경총 개발 E11 주위의 측면 심실에서 시작 직후, 배아 일 (E) (13)에 의해 관찰된다. 이 단계에서 세포는 성숙 가변 외관 작으며 섬모 팁 여러 방향을 향하고있다. E15에서, 다수의 섬모의 술은 주변의 미세 융모에서 밖으로 서있는 선 단면의 상부에 설치된다. 출생 후 하루 (P)이, 많은 섬모는 라이브 영상으로 관찰 섬모의 운동성을 반영, 구부러진 위치에 고정되어있다. P14에서, 대부분의 세포는 여러 비 운동성이있는 섬모뿐만 아니라 미세 융모 승을 가지고<html> i 번째 초기 단계에 비해 미세한 텍스처. 5이 단계에서 섬모와 CPECs의 SEM 이미지를 보여줍니다. 도 1에 도시 한 동영상 영화에 기초하여, 운동성 섬모 쉽게 라이브 영상으로 인식되는 것은 명백하다. 그러나, DIC 현미경으로 비 - 운동성 섬모를 구별하기 어렵다. 따라서, SEM 전체 섬모 상태를 이해하는 것이 필수적이다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52991/52991fig1.jpg" /> 그림 1 :. 워크 플로우의 개요 () 스테레오 현미경. 청구 결합 소자 (CCD) 카메라를 갖춘 (b) 거꾸로 현미경. 분석 기간 동안 (C) 컴퓨터 화면. (D) 이온 스퍼터. SEM (마) 표본. (f)의 주 사형 전자 현미경. 영화 1.PLOAD / 52991 / Figure_2.mov &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt; CPECs의 평면도 및 고속 비디오 현미경 P2 마우스 강아지의 섬모의 영화. 맥락막 신경총 조직의 불규칙한 표면이 스냅 샷이 포함되어 있기 때문에 . 모두 초점과 초점이 맞지 평면 상자의 영역이 확장되고, 영화 2 규모 표시 줄에 표시 :. 2 μm의. 영화 2. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52991/Figure_3.mov" target="_blank">영화 1.의 조직 샘플의 확대도의 영화</a> 섬모 잔은 회전 또는 전후 어느 움직임을 보였다. 스케일 바 : 1 μm의. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52991/52991fig4.jpg" /> 그림 2 :. 앞뒤로 이동 (위)과 회전 운동 (아래)와 영화 2 시간 경과 이미지 CPEC의 섬모의 궤도에서 재구성 (A) 섬모. DIC<html> 동영상 데이터의 이미지는 50 밀리 초 간격으로 (1 μm의 1-8, 스케일 바)에서 발표된다. 대상 섬모의 끝의 위치는 화살표로 표시됩니다. (나) 궤도 (파선)과 이미지에 표시된 섬모 팁 (컬러 원)의 위치가 중첩되어있다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52991/52991fig5.jpg" /> 그림 3 :. 동영상 데이터에서 재구성 CPEC의 섬모 팁 운동의 2 가지 모드를 여러 회에 걸쳐 대표 섬모의 끝의 움직임, 전후 운동 (A)와 회전 운동 (B)는, 궤도 (최고, 스케일 바 형식으로 표시하고 있습니다 : 0.5 μm의). x 축과 끝 위치의 y 좌표의 시간 코스는 각각 (가운데)를 그려. 두 좌표 사이의 위상 변화를 설명하기 위해, x 축과 y 좌표는 [-1,1]로 정규화 있었다 (각각 빨간색과 파란색 라인을 아래) 입혔다. igure 6 &quot;SRC =&quot;/ 파일 / ftp_upload / 52991 / 52991fig6.jpg &quot;/&gt; 그림 4 : 섬모 팁 궤적의 분석을 설명하는 개략도 전후 (왼쪽 패널) 및 회전 (오른쪽 패널) 궤도의 박동 각도 θ의 () 정의.. 장착 타원, A, B, X 0, 0 및 y를 설명 식 파라미터, 우측 패널에 도시되어있다. (B) 박동 각도 (θ)와 AR을 정의하는 궤적의 피팅 분석의 차트 흐름. 대표 궤도의 피팅의 실제 결과는 오른쪽 패널에 표시됩니다. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/52991/52991fig7.jpg" /> 그림 5 : 섬모의 전자 현미경 사진. E13, E15, P2 및 P14에서 CPECs의 대표적인 SEM 현미경 사진. 시간 경과 중에 CPECs는 크기가 증가하고 microvi 개발LLI과 혀끝의 표면에 섬모. E13에서 섬모의 술은 운동성을 획득 아직. 섬모 운동과의 비율이 가장 높은 지점에 도달 P2에서, 많은 굴곡 섬모가 관찰된다. P14에서, 섬모 운동을 잃게됩니다. 스케일 바 : 5 μm의.

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Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

In this study, a detailed light microscopic technique was optimized for real-time observation and analysis of the motion of CPEC cilia ex vivo together with an electron microscopic method for ultrastructural analysis.

맥락총 상피 세포의 섬모 운동의 관측<em&gt; 전의 VIVO</em

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. ...

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Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

12.1K 조회수.  Waseda University. In this study, a detailed light microscopic technique was optimized for real-time observation and analysis of the motion of CPEC cilia ex vivo together with an electron microscopic method for ultrastructural analysis.

비디오: Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

Ex Vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection

Herpes keratitis is one of the most severe pathologies associated with the herpes simplex virus-type 1 (HSV-1). Herpes keratitis is currently the leading cause of both cornea-derived and infection-associated blindness in the developed world. Typical presentation of herpes keratitis includes infection of the corneal epithelium and sometimes the deeper corneal stroma and endothelium, leading to such permanent corneal pathologies as scarring, thinning, and opacity 1.
Corneal HSV-1 infection is traditionally studied in two types of experimental models. The in vitro model, in which cultured monolayers of corneal epithelial cells are infected in a Petri dish, offers simplicity, high level of replicability, fast experiments, and relatively low costs. On the other hand, the in vivo model, in which animals such as rabbits or mice are inoculated directly in the cornea, offers a highly sophisticated physiological system, but has higher costs, longer experiments, necessary animal care, and a greater degree of variability. 
In this video article, we provide a detailed demonstration of a new ex vivo model of corneal epithelial HSV-1 infection, which combines the strengths of both the in vitro and the in vivo models. The ex vivo model utilizes intact corneas organotypically maintained in culture and infected with HSV-1. The use of the ex vivo model allows for highly physiologically-based conclusions, yet it is rather inexpensive and requires time commitment comparable to that of the in vitro model.

Ex Vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection

In this video article we describe the use of a new ex vivo model of acute herpes simplex virus type I corneal epithelial infection.

급성 상피 헤르페스의 예 VIVO Organotypic 각막 모델은 바이러스 종류 나 감염을 단순

Herpes keratitis is one of the most severe pathologies associated with the herpes simplex virus-type 1 (HSV-1).  Herpes keratitis is currently the leading ...

연구

신경과학

Rapid Determination of the Thermal Nociceptive Threshold in Diabetic Rats

Painful diabetic neuropathy (PDN) is characterized by hyperalgesia i.e., increased sensitivity to noxious stimulus, and allodynia i.e., hypersensitivity to normally innocuous stimuli1. Hyperalgesia and allodynia have been studied in many different rodent models of diabetes mellitus2. However, as stated by B&ouml;lcskei et al, determination of "pain" in animal models is challenging due to its subjective nature3. Moreover, the traditional methods used to determine behavioral responses to noxious thermal stimuli usually lack reproducibility and pharmacological sensitivity3. For instance, by using the hot-plate method of Ankier4, flinch, withdrawal and/or licking of either hind- and/or fore-paws is quantified as reflex latencies at constant high thermal stimuli (52-55 &deg;C). However, animals that are hyperalgesic to thermal stimulus do not reproducibly show differences in reflex latencies using those supra-threshold temperatures3,5. As the recently described method of B&ouml;lcskei et al.6, the procedures described here allows for the rapid, sensitive and reproducible determination of thermal nociceptive thresholds (TNTs) in mice and rats. The method uses slowly increasing thermal stimulus applied mostly to the skin of mouse/rat plantar surface. The method is particularly sensitive to study anti-nociception during hyperalgesic states such as PDN. The procedures described bellow are based on the ones published in detail by Alm&aacute;si et al 5 and B&ouml;lcskei et al 3. The procedures described here have been approved the Laboratory Animal Care and Use Committee (LACUC), Wright State University.

Here, we describe a rapid reliable and simple procedure to determine the lowest temperature at which rats or mice show nocifensive behavior, i.e. the thermal nociceptive threshold (TNT). This method applies a slowly increasing thermal stimulus allowing precise and reproducible estimation of TNTs with minimum, if any, stress to the animals.

당뇨병 쥐의 열전달 Nociceptive 본부 신속한 결정

Painful diabetic neuropathy (PDN) is characterized by hyperalgesia i.e., increased sensitivity to noxious stimulus, and allodynia i.e., hypersensitivity ...

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for investigating the cell biology and development of central brain structures by allowing acute pharmacological interventions and live imaging of cellular processes. As an example of the technique, prior work from our lab1 has shown that a previously unrecognized subcellular compartment lies between the axonal and somatodendritic compartments of axons of the Drosophila central brain. The development of this compartment, referred to as the axon initial segment (AIS)2, was shown genetically to depend on the neuron-specific cyclin-dependent kinase, Cdk5. We show here that ex vivo treatment of wild-type Drosophila larval brains with the Cdk5-specific pharmacological inhibitors roscovitine and olomoucine3 causes acute changes in actin organization, and in localization of the cell-surface protein Fasciclin 2, that mimic the changes seen in mutants that lack Cdk5 activity genetically.
A second example of the ex vivo culture technique is provided for remodeling of the connections of embryonic mushroom body (MB) gamma neurons during metamorphosis from larva to adult. The mushroom body is the center of olfactory learning and memory in the fly4, and these gamma neurons prune their axonal and dendritic branches during pupal development and then re-extend branches at a later timepoint to establish the adult innervation pattern5. Pruning of these neurons of the MB has been shown to occur via local degeneration of neurite branches6, by a mechanism that is triggered by ecdysone, a steroid hormone, acting at the ecdysone receptor B17, and that is dependent on the activity of the ubiquitin-proteasome system6. Our method of ex vivo culturing can be used to interrogate further the mechanism of developmental remodeling. We found that in the ex vivo culture setting, gamma neurons of the MB recapitulated the process of developmental pruning with a time course similar to that in vivo. It was essential, however, to wait until 1.5 hours after puparium formation before explanting the tissue in order for the cells to commit irreversibly to metamorphosis; dissection of animals at the onset of pupariation led to little or no metamorphosis in culture. Thus, with appropriate modification, the ex vivo culture approach can be applied to study dynamic as well as steady state aspects of central brain biology.

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

This article describes a method by which one can mimic in vivo development of the Drosophila mushroom body in an ex vivo culture system.

전체의 전의 생체내의 Culturing, 개발 Drosophila의 뇌는

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain proper, that support forebrain function. They are the cerebral surface (superficial) vasculature along with associated meninges (MAV) and the choroid plexus which are necessary for cerebral blood flow and cerebrospinal fluid (CSF) homeostasis. The tissue harvested is suitable for biochemical and physiological analysis, and the MAV has been shown to be sensitive to damage produced by amphetamine and hyperthermia 1,2. As well, the major and minor cerebral vasculatures harvested in MAV are of potentially high interest when investigating concussive types of head trauma. The MAV dissected in this presentation consists of the pial and some of the arachnoid membrane (less dura) of the meninges and the major and minor cerebral surface vasculature. The choroid plexus dissected is the structure that resides in the lateral ventricles as described by Oldfield and McKinley3,4,5,6. The methods used for harvesting these two tissues also facilitate the harvesting of regional cortical tissue devoid of meninges and larger cerebral surface vasculature, and is compatible with harvesting other brain tissues such as striatum, hypothalamus, hippocampus, etc. The dissection of the two tissues takes from 5 to 10 min total. The gene expression levels for the dissected MAV and choroid plexus, as shown and described in this presentation can be found at GSE23093 (MAV) and GSE29733 (choroid plexus) at the NCBI GEO repository. This data has been, and is being, used to help further understand the functioning of the MAV and choroid plexus and how neurotoxic events such as severe hyperthermia and AMPH adversely affect their function.

This video presentation shows a method of harvesting the two most important highly vascular structures that support forebrain function. They are the cerebral surface (superficial) vasculature along with associated meninges (MAV) and the choroid plexus which are necessary for cerebral blood flow and cerebrospinal fluid (CSF) homeostasis.

쥐의 뇌에서 뇌 표면 Vasculature 및 관련 Meninges의 해부 및 맥락막 얼기의 시각적 설명

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

본래 Vomeronasal 기관 및 액세서리 후각 망울의 생체 준비

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the pathophysiological basis of these diseases, it is necessary to precisely characterize in which way the processing of information is disturbed between the different neuronal parts of the circuit. Using extracellular in vivo electrophysiological recordings, it is possible to accurately delineate neuronal activity within a neuronal network. The application of this method has several advantages over alternative techniques, e.g., functional magnetic resonance imaging and calcium imaging, as it allows a unique temporal and spatial resolution and does not rely on genetically engineered organisms. However, the use of extracellular in vivo recordings is limited since it is an invasive technique that cannot be universally applied. In this article, a simple and easy to use method is presented with which it is possible to simultaneously record extracellular potentials such as local field potentials and multiunit activity at multiple sites of a network. It is detailed how a precise targeting of subcortical nuclei can be achieved using a combination of stereotactic surgery and online analysis of multi-unit recordings. Thus, it is demonstrated, how a complete network such as the hyperdirect cortico-basal ganglia loop can be studied in anesthetized animals in vivo.

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

In this study, the methodology is presented on how to perform multi-site in vivo electrophysiological recordings from the hyperdirect pathway under urethane anesthesia.

심각한<em&gt; In Vivo</em&gt; 마취 된 래트에서의 Hyperdirect 경로로부터의 국소 장 전위 및 다중 단위 활성의 전기 생리 학적 기록

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.

전 비보 마우스 다이어 프 램의 같은 시 냅 스에서 신호 세포 특정 칼슘의 이미징

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

생체 내 마우스 열등올리브의 칼슘 이미징

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Ex Vivo Release of Calcitonin Gene-Related Peptide from the Trigeminovascular System in Rodents

Calcitonin gene-related peptide (CGRP) was first discovered in the 1980s as a splice variant from the calcitonin gene. Since its discovery, its role in migraine pathophysiology has been well established, first by its potent vasodilator properties and subsequently by its presence and function as a neurotransmitter in the sensory trigeminovascular system. The migraine-provoking ability of CGRP gave support to the pharma industry to develop monoclonal antibodies and antagonists inhibiting the effect of CGRP. A new treatment paradigm has proven effective in the prophylactic treatment of migraine. One of the useful tools to further understand migraine mechanisms is the ex vivo model of CGRP release from the trigeminovascular system. It is a relatively simple method that can be used with various pharmacological tools to achieve know-how to further develop new effective migraine treatments. The present protocol describes a CGRP release model and the technique to quantify the effect of pharmacological agents on the amount of CGRP released from the trigeminovascular system in rodents. A procedure describing the experimental approach from euthanasia to the measurement of protein levels is provided. The essential isolation of the trigeminal ganglion and the trigeminal nucleus caudalis from both mice and rats and the preparation of rat dura mater are described in detail. Furthermore, representative results from both species (rats and mice) are presented. The technique is a key tool to investigate the molecular mechanisms involved in migraine pathophysiology by using various pharmacological compounds and genetically modified animals.

Ex Vivo Release of Calcitonin Gene-Related Peptide from the Trigeminovascular System in Rodents

The present protocol describes the ex vivo calcitonin gene-related peptide (CGRP) release model and the strategy to quantify the effect of pharmacological agents on the amount of CGRP released from the trigeminovascular system in rodents.

생체 외 설치류의 삼차 혈관 시스템에서 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드의 방출

Calcitonin gene-related peptide (CGRP) was first discovered in the 1980s as a splice variant from the calcitonin gene. Since its discovery, its role in ...

Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

Ex vivo preparations enable the study of many neurophysiological processes in isolation from the rest of the body while preserving local tissue structure. This work describes the preparation of rat sciatic nerves for ex vivo neurophysiology, including buffer preparation, animal procedures, equipment setup and neurophysiological recording. This work provides an overview of the different types of experiments possible with this method. The outlined method aims to provide 6 h of stimulation and recording on extracted peripheral nerve tissue in tightly controlled conditions for optimal consistency in results. Results obtained using this method are A-fibre compound action potentials (CAP) with peak-to-peak amplitudes in the millivolt range over the entire duration of the experiment. CAP amplitudes and shapes are consistent and reliable, making them useful to test and compare new electrodes to existing models, or the effects of interventions on the tissue, such as the use of chemicals, surgical alterations, or neuromodulatory stimulation techniques. Both conventional commercially available cuff electrodes with platinum-iridium contacts and custom-made conductive elastomer electrodes were tested and gave similar results in terms of nerve stimulus strength-duration response.

Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

This protocol describes the preparation of rat whole sciatic nerve tissue for ex vivo electrophysiological stimulation and recording in an environmentally-regulated, two-compartment, perfused saline bath.

Ex Vivo 신경 생리학을위한 쥐 좌골 신경의 제조

Ex vivo preparations enable the study of many neurophysiological processes in isolation from the rest of the body while preserving local tissue structure. ...