This work was funded by the German Ministry of Defense (Grant No. M-SAB1-6-A009).

다음 프로토콜은 초기 내피 세포 이동의 조사 방법을 설명합니다. 혈관 내피 세포의 적절한 재배 내피 표현형의 적절한 증식과 유지 보수를 보장하기 위해 젤라틴과 세포 배양 플라스크의 사전 코팅이 필요합니다. 세포 배양 플라스크 1. 사전 코팅 <ol><li> 0.1 %의 최종 농도 0.1 M PBS에 젤라틴을 녹인다. </li><li> (자세한 내용은 특정 오토 클레이브의 지침을 참조하십시오) 액체 고압 증기 멸균에 대한 매개 변수를 사용하여 솔루션을 압력솥. </li><li> 무균 세포 배양 플라스크 (T25 세포 배양 용 플라스크 예, 적어도 5 ㎖)을 오토 클레이브 젤라틴 용액의 충분한 양을 추가한다. </li><li> 인큐베이터로 플라스크로 이동 (37 ℃, 5 % CO 2는 필요하지 않지만 방해하지 않는) 적어도 30 분 동안. </li><li> 나머지 젤라틴 용액을 제거합니다. 이후 사전 코팅 된 플라스크를 사용하십시오 (세포 배양) 또는 S사용할 때까지 무균 상태에서 찢었다. </li></ol> 초기 내피 세포의 2. 세포 배양 주 : 앞서 설명 된 바와 같이 10, 11, 배아 줄기 세포 유래의 초기 내피 세포 (EEC)를 PECAM-1 양성 세포 분획의 자기 활성화 세포 정렬하여 차별화 뮤린 배양체로부터 수득 하였다. <ol><li> DMEM에서 젤라틴 코팅 된 세포 배양 접시에 배양 EEC 15 % FCS, 50 U / ㎖ 페니실린, 50 U로 보충 / ㎖ 스트렙토 마이신, 200 μM L- 글루타민, 100 μM의 ß 머 캅토 에탄올, 1 % 비 필수 아미노산. 멸균 조건에서 세포를 처리합니다. 37 ° C에서 5 % CO 2 세포를 배양하고, 95 % 습도의 합류 부 (최대. 80 %)까지. </li><li> 5 비율 : 하위 합류, 1에서 세포를 분리. 참고 : 내피 세포의 박리가 중요한 단계입니다. <ol><li> RT의 accutase와 세포를 수확. 용지를 제거 PBS로 씻어 25cm 당 accutase 1 ㎖를 추가 <sup&gt; 2. </li><li> 세포가 분리 될 때까지 2 내지 10 분 동안 실온에서 플라스크를 인큐베이션. 세포를 분산하고 원하는 응용 프로그램으로 전송합니다. 참고 : accutase의 화학적 중화가 시드 세포는 37 ° C에서 인큐베이터에 저장됩니다 때 발생으로 필요하지 않습니다. 그러나 accutase 활동도 FCS 함유 DMEM을 첨가함으로써 감소 될 수있다. </li></ol></li></ol> 3. 보이든 상공 회의소 주 : 보이든 챔버 분석은 8 ㎛의 공경을 갖는 광 불 투과 폴리에틸렌 테레 프탈레이트 삽입 시스템을 사용하여 수행된다. <ol><li> 프리 코트를 적어도 30 분 동안 0.1 M PBS에 용해시킨 0.1 % 젤라틴의 500 μl를 첨가하여 필터 인서트 (따라서 보이 덴 챔버를 생성하는 세포 배양 웰 내부 그 착용감). </li><li> 세포 독성 화학 물질에 노출 될 경우, 세포를 수확하기 전에 특정 실험 디자인에 따라 노출. 주 : 세포 / ㎖ DMEM 12.5 μg의 클로 노출시켰다24 시간 동안. 특정 실험 설계에 관해서는, 지침이 다를 수 있습니다. </li><li> 수확 EEC는 카운팅 셀 챔버를 이용하여 세포 수를 확인하고. 참고 : 자동 계산 장치를 사용할 수 있지만,주의하여 사용되어야한다 : 수동 세포 계수가 더 정확하며 강력히 추천된다. </li><li> 보이든 챔버의 하부 챔버 구획에 500 μL 세포 배양 배지를 추가합니다. </li><li> 상부 챔버 구획에 필터를 삽입 당 500 μL 세포 배양 배지에서 정확히 10 4 EEC를 추가합니다. 거품을 제거합니다. </li><li> 정확히 8 시간 동안 인큐베이터에서 필터 삽입을 품어. </li><li> PBS로 한번 씻어 세포 고정 용 25 분 동안 두 구획에 0.5 ml의 4 % 파라 포름 알데히드와 매체를 교체합니다. 광범위하게 필터를 세척하지만 0.1 M PBS로 3 회 이상. </li><li> 메스와 점막을 절제. </li><li> 핵 stainin에 대한 DAPI를 포함하는 설치 매체와 함께 두 개의 유리 커버 전표 사이의 막 마운트G. 방향에주의를 기울이십시오. 멤브레인의 낮은 구획쪽으로 마이그레이션 만 세포가 계산되어 있는지 확인합니다. </li><li> 400X 배율 형광 현미경으로 막의 하부 구획실쪽으로 이주 셀 개수. 마이그레이션 세포 (그림 1A, 1B)와 막 모공을 혼동하지 마십시오. 생물 복제의 적절한 수 (조건 당 적어도 3 생물 복제)을 조사합니다. </li></ol> 4. 상처 치유 분석 <ol><li> DIC 현미경을 사용하면, 플라스틱 표면을 기초 디쉬 또는 웰 플레이트를 피하는 대신 유리 기반의 장치를 사용 가능한 장비에 따라 신중 세포 배양 접시 나 판을 선택한다. 주 : 위상차 현미경을 사용하는 경우, 비닐 계 요리를 사용할 수도있다. </li><li> 라이브 세포 이미징에 적합한 세포 배양 장치에 EEC 육성 (예를 들어, 4cm의 유리 바닥 배양 접시에 적합) 80 %의 합류까지. 중요 : 합류를 완료하기 위해 세포를 배양하지 않습니다. </li><li> 멸균 10 μL 피펫 팁 단일 층을 긁어. 접시 표면에 너무 많은 압력없이 부드럽게 끝을 누르고 분리 된 세포를 제거하기 위해 0.1 M PBS로 세포를 두 번 other.Wash 한 측에서 원활하게 직선으로 이동합니다. </li><li> 배양 접시에 매체의 충분한 볼륨을 추가합니다. 해당되는 경우, 조사해야 화합물을 추가합니다. 주 : 1.5 mL를 함유하는 배지 15 NG / ㎖ 알파 리놀렌산을 첨가 하였다. </li><li> 라이브 세포 이미징 할 수있는 현미경으로 배양 접시를 탑재합니다. 이산화탄소 5 %, 37 ° C와 가습 분위기를 확인합니다. 주 : 가습 매체 증발을 방지하는 것이 특히 중요하다. </li><li> 10 분 간격으로 24 시간 동안 시간 경과 이미지를 획득. 큰 파일 크기에 대한 계획. 주 : 512 X 512 픽셀의 해상도가 충분합니다; 그러나, 우리는 적어도 1,024 X 1,0의 이미지를 사용하는 것이 좋습니다(24). </li><li> 오픈 소스 소프트웨어 (예를 ImageJ에) 현미경 구비 길이 소프트웨어 도구를 사용 = 24 시간 t = 0에서 시간 t와의 갭 폭을 측정하거나 사용한다. 참고 : 일반적으로 특정 이미지 수집 및 분석 소프트웨어의 제조업체에서 제공합니다. 따라서, 소프트웨어의 사용에 대한 기술적 인 세부 사항은 설명서를 참조하십시오. </li></ol> 5. 셀 추적 <ol><li> DIC 현미경을 사용하면, 플라스틱 표면을 기초 디쉬 또는 웰 플레이트를 피하는 대신 유리 기반의 장치를 사용 가능한 장비에 따라 신중 세포 배양 접시 나 판을 선택한다. 주 : 위상차 현미경을 사용하는 경우, 비닐 계 요리를 사용할 수도있다. </li><li> 적합한 세포 배양 장치에 보충 DMEM에 5 × 104 EEC 시드 (예, 24 멀티 웰 플레이트), 37 ° C, 1-2 일 동안 95 %의 습도에서 5 % CO 2 세포를 배양. </li><li> 세포는 80까지 성장하는 경우%의 합류는, 각각의 시험 물질의 존재의 미디어와 문화를 새로운 매체를 사용하여 세포를 제거 (예를 들어, 12.5 μg의 클로 람 부실 / ㎖ DMEM). 항상 (개별 분석 시스템에 따라 24 시간)에서 일정 시간 동안 37 ° C에서 (용매, 예를 들면, 에탄올로 처리) 대조군 세포를 포함한다. </li><li> 라이브 세포 이미징 (37 ° C, 5 % CO 2, 95 % 습도) 가능한 현미경 배양 접시를 탑재. 미리 정의 된 간격으로 24 시간 동안 시간 경과 이미지를 획득. 10 분 간격으로 화상을 취득. </li><li> ImageJ에 플러그인 MTrackJ를 사용하여 수동으로 EEC의 추적을 수행합니다. 시야에서 무작위로 10 셀을 선택하고이 MTrackJ의 명령을 &quot;추가&quot;를 사용하여 시간에 포인트 당 데이터 포인트를 추가하여 그들의 움직임을 추적 할 수 있습니다. </li></ol> [. Meijering, Mtrackj &quot;http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/&quot;] MTrackJ가에서 무료로 사용할 수 있습니다 및 ImageJ에는 availab입니다 참고 :[Rasband, ImageJ에. &quot;http://rsbweb.nih.gov/ij/&quot;]에서 제작 :. MTrackJ 플러그인에 대한 상세한 매뉴얼은 &quot;http://www.imagescience.org&quot;에서 확인할 수있다. 6. 라이브 세포 이미징 / 미토콘드리아 막의 평가 가능성 <ol><li> 적절한 세포 배양 장치에 EEC 육성 (예를 들어, 라이브 세포 이미징에 적합한 4cm의 유리 바닥 페트리 접시) 80 %의 합류까지. 중요 : 합류를 완료하기 위해 세포를 배양하지 마십시오. </li><li> 해당되는 경우, 화학 물질로 세포를 노출. 참고 : 세포는 24 시간 동안 12.5 μg의 / ㎖의 클로 람 부실에 노출되었다. 특정 실험 설계에 관해서는, 지침이 다를 수 있습니다. </li><li> 테트라 메틸에 DMSO (TMRM)의 10 mM 스톡 용액을 준비한다. 빛으로부터 보호합니다. 주 : 원액 -20 ℃에서 저장 될 수있다. </li><li> (: 1000 희석 1) 10 μM의 농도로 작동 용액 세포 배양 배지에 원액을 희석. 빛으로부터 보호가능한 한 빨리 사용한다. 주 : 작업 용액은 몇 시간 (&gt; 1 시간) 동안 실온에서 유지 될 수 있지만, 새로운 작동 용액의 조제 추천된다. </li><li> 1ml의 신선한 세포 배양 배지 (로딩 용액)로 작동 용액 2 μl를 추가. </li><li> 로딩 용액으로 세포 배양 배지로 대체하여 세포를로드. 37 ° C, 5 % CO 2 및 가습 분위기 (배양기)에서 15 분 동안 인큐베이션. 주의 : 거의 모든 형광 지표는 시간이 지남에 살아있는 세포 내 보낸; 따라서 오랜 로딩 또는 지연 분석을 피하십시오. </li><li> 세척하지 않고, 살아있는 세포 이미징에 적합한 현미경으로 접시를 놓습니다. 중요 : 형광 지표 따라서, 불필요한 빛 노출을 방지, 빛에 매우 민감하다. </li><li> 다른 이미지 사이의 비교를 위해 획득 파라미터를 변경하지 않고 이미지를 획득. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

독성 화학 물질에 대한 피부 노출은 종종 심한 상처 치유에 장애를 초래한다. 기본 메커니즘은 크게 알려져 있지 않다. 상처 치유는 서로 다른 단계 (지혈, 염증, 증식 및 리모델링)로 구성된 복잡한 과정이다. 세포 이동은 그러나, 육아 조직의 형성에 가장 중요하고, 모든 단계에 관여한다. 여기서, 새로운 혈관은 혈관 형성 또는 angio- 의해 하나 형성된다. 두 과정은 전구체 및 초기 내피 세포의 영향을받지 이동이 필요합니다. 세포 이동 및 방해 세포의 이동에 대한 기본 메커니즘을 명확히의 평가는 독성 물질에 의한 상처 치유 질환에 대한 새로운 치료 전략을 개발하기 위해 매우 관련이있다. 세포 이동은 다른 방법에 의해 평가 될 수있다. 일반적으로 사용되는 기술은 원래 항체 antig를 분석 도입 된 Boyden 챔버 에세이 인EN은 백혈구 (13)에 화성을 일으키는 원인이되었다. 이 분석은 화학 유인 물질에 응답하여 상기 하부 구획 트랜스 웰 인서트의 상부 구획으로부터 세포의 침윤 능력을 반영 정량 종점 분석법이다. 본 명세서에 기재된 기술에서, 어떠한 화학 유인 물질은 하부 챔버에 첨가하지 않았다. 제어 조건 하에서 또는 클로 람 부실에 응답 EEC에 따라서 chemokinesis (특정 화학 유인 물질없이 임의 마이그레이션)을 조사 하였다. 인서트는 멤브레인의 기공을 통해 삼차원 세포 이동을 허용 다공성 막으로 구성. 모든 세포의 척추 브레이스 통과를 허용한다 너무 큰 기공 완전히 세포의 이동을 방지 할 너무 작은 기공 : 막의 기공 크기는 셀 크기에 관하여 선택되어야한다. 초기 내피 세포의 경우, 8 ㎛의 공극 크기를 권장합니다. 부적절한 기공 크기의 사용은 재생 불가능한 결과를 초래할 것이다. 순으로 하였다R, 우리는 핵보다 큰 기공 크기로 시작 권장 EEC 같은 상이한 특성을 갖는 세포 프로토콜을 적용하고, 필요한 경우 세공 직경을 단계별로 증가한다. 예를 들어, 백혈구 같은 작은 세포 3 ㎛의 기공 크기를 권장합니다. 중요한 문제가 분석 될 때까지 배양 시간의 판정이다. 시간이 지남에 따라, (적어도 제어 그룹) 세포 증식이 일어날 것이다. 차례로 이것은 잠재적 방법의 민감도를 감소 막을 통해 침투 할 셀의 수를 증폭한다 : 조금이라도 손상 이동성 능력을 가진 세포은 장시간 이주 할 수있다. 따라서, 오랜 기간 (예 : 24 시간)은 내피 세포하지 않는 것이 좋습니다. 배양 세포 파종 후 너무 짧으면 한편, 세포의 소량 만이 막을 통과한다. 8 시간 배양 최적의 발견되었다. 8 시간의 정의 배양 시간 후, 세포다시, 고정 스테인드 수동었다. (마이그레이션하지 않은) 멤브레인의 상단에 (1) 세포를 면봉으로 제거됩니다 분석을위한 세 가지 접근 방법이있다. 이어서 막 (마이그레이션 세포)의 바닥면에 세포를 염색하거나 세포 학적 (예, 헤 마톡 실린), 또는 형광 색소 (예를 들어, DAPI)와 함께 계산된다. (2) 선택적으로, 하단 측의 셀은 제 형광 염료로 염색 될 수 있고 (예, 트립신을 이용하여) 이후에 분리된다. 이어서 형광 형광 판독기를 사용하여 정량화된다. (3) 우리는 이에 이주되지 않은 세포 (세포 막 위에) 및 마이그레이션 세포 (멤브레인의 바닥)의 분화를 허용하는 광 전송을 차단 어두운 색의 다공성 멤브레인을 사용하는 것이 좋습니다. 바닥면에 세포가 형광 현미경을 이용하여 카운트 형광 염색 후 (세포학 염료가 사용될 수 없음). 그것은 C에 중요하지 않다멤브레인 배향 onfound. 불투명 한 막을 사용하는 것은 이주되지 않은 세포를 제거 할 필요성을 제거한다. 불투명 막, 형광 염색 및 수동 세포 계수의 사용은 다른 방법보다 우수한 밝혀졌다. 일반적으로, 보이든 챔버 분석은 취급이 용이하며, 따라서 분석 또한 세포 이동의 평가를 위해 자주 사용되는 분석법이다. (1) 보이든 챔버 분석 엔드 포인트 분석이다 : 그러나, 두 가지 주요 단점이있다. 분석 시점이 정확하지 않으면 그 방법은, 결과는 잘못 될 수있다. (2) 분석은 자동화하는 것이 용이하지 않다. 그럼에도 불구하고,이 분석은 세포 이동의 평가를위한 가장 중요한 도구 중 하나입니다. 고정 된 Boyden 챔버 에세이 달리 분석 상처 치유 (라고도 갭 고정 분석법 또는 스크래치 시험이라고 함)을 실시간으로 동적 분석이다. 그것은 세 가지 차원 세포 침공의 움직임이없는 두 차원 마이그레이션 분석입니다. 피펫 팁 세포층 &quot;상처&quot;후에, 세포는 갭 내로 이동한다. 분석은 실시가 간단하고 엔드 정적 분석의 문제를 피할 수있다. (1) 라이브 세포 이미징 현미경 시스템 (37 ℃, 습한 분위기와 5 % CO 2)가 필요합니다 : 그러나, 분석은 몇 가지 문제가있다. 세포 배양 접시가 건조하지 않도록해야합니다. (2) 시간 경과 영상 획득이 사용되는 매개 변수 (해상도, 간격)에 따라 대용량 데이터 파일에 발생합니다. (3) 피펫 팁으로 전지 층을 긁는 것은 초기에 나타나는 것처럼 쉽지 않다. 유물이 발생할 수 있습니다 접시 표면이 손상 너무 많은 압력. 또한, 상기 갭 폭은 다를 수 내 스크래치 및 다른 연구자마다 다를 수있다. 경험이 풍부한 연구자를 권장합니다. (4) 병렬로 실행할 수있는 샘플의 수는 장치에 의해 제한된다. 그럼에도 불구하고, 분석을 치유 상처는 양적 QUAL 또 다른 유용한 도구입니다세포 이동의 itative 평가. 이동 속도, 이동 거리에 대한 정보는, 감독 마이그레이션은 하나의 실험 장치에서 수집 할 수 있습니다. 두 차원 시스템의 셀 추적은 매우 어려운 일이 아니다 오픈 소스 소프트웨어 (예를 들어, ImageJ에와 MTrackJ)을 수행 할 수 있습니다. 세포 배양 접시 코팅은 세포 부착에 대해서만 중요하지 않지만 이주에 대해서는 세포 기능에 중요한 영향을 끼친다. 내피 세포는 일상적으로 0.1 % 젤라틴 코팅 표면에 배양한다. 무 코팅 내피 세포 배양을위한 표면의 사용은 감소 된 증식 14 결과. 기타 코팅 (예, 피브로넥틴)는 ​​단기 배양에도 적합 발견하지만, 젤라틴 코팅은 장기 배양 실험 15에서 우수한 성능을 나타내었다. 라이브 세포 이미징 시장에 다수의 형광 염료가있다. 우리는 마치 한센 TMRM는 미토콘드리아 막 잠재력을 조사합니다. 많은 다른 염료 (예, JC-1, TMRE)는 유사한 성능을 나타낸다. 단색 프로브 (TMRM, TMRE)와 대조적으로, 미토콘드리아 축적 후 녹색에서 적색 JC-1 형광 이행한다. 이 16 (예를 들어, 추적 염료를 이용하여 미토콘드리아를 식별하기 위해) 미토콘드리아 편광 상태의 비율 적 반 정량 분석이 가능하지만, 듀얼 염색 실험을 방해한다. 실험 설계, 세포 처리 및 인수 도전 훨씬 더 많은 관심을 필요로하는 반면 우리의 경험에서 염료 자체가 실험 덜 중요하다. 거의 모든 형광 염료는 민감한 빛입니다. 따라서, 셀 로딩은 어둠 속에서 수행해야합니다. 셀 로딩은 15 ~ 30 분을 필요로한다. 장기간 로딩 시간이 증가 신호가 발생하지 않으며, 사용하지 않는 것이 좋습니다. 특정 신호가 긴 로딩 기간 후에 검출 될 수 있지만, 색소 세포 내 축적 COMPART 수도사항 또는 심지어 세포에서 배출 될 수 있습니다. 결과적으로, 세포를 실험의 시작 전에 분석하고 반드시 바로 로딩되어야한다. 염료 로딩 농도는 통상 10 μM의 범위이다. 그러나, TMRM 훨씬 낮은 농도 (20 ㎚)는 라벨에 대한 충분한 발견하고 여전히 합리적인 결과를 제공 하였다. 그림에 나타낸 바와 같이 3 라벨 24 시간 후 클로 람 부실 노출은 미토콘드리아 막 전위의 별개의 손실의 결과. ROS-거제 초기 노출 후 24 시간에서의 미토콘드리아 막 전위를 유지할 수 있었다로 클로 람의 치료 EEC를 노출. 요약, 보이든 챔버 분석에서, 성적에 관한 정량적 측면 마이그레이션 동작을 평가하기 위해 단일 ​​세포 트랙 분석과 함께 가치있는 도구를 분석을하고 있습니다 상처 치유. TMRM와 미토콘드리아 가능성의 레이블은 기본 메커니즘을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.

세포 이동은 피부 손상 후 개발, 각종 질병 및 상처 치유 등 많은 생리 및 병리 생리 학적 과정에 중요하다. 피부 손상에 따라, 염증은 손상 또는 괴사 조직과 육아 드라이브를 예비 상처 봉합을 제거하고 혈관 생성을 통해 새로운 모세 혈관의 네트워크 형성 (소설 형성) 또는 혈관 신생 (기존 소포의 발아) 1-3 수 있습니다. 모두 vasculo- 및 혈관 내피 세포의 이동을 필요로한다. 혈관의 네트워크가 증가하는 궁극적 각질화를 받아야 각질 세포 증식에​​ 산소와 영양분을 운반하는 것이 필수적이며, 새로운 상피를 형성하고 상처 봉합을 제공한다. 내피 세포의 손상 마이그레이션 장애 4,5 상처 치유의 근본 원인이다. 초기 내피 세포의 따라서, 방법을 평가하기 위해 마이그레이션 pathophysiol을 탐구하는 데 필요한세포 이동이 ogy 질환 및 치료 개입을위한 새로운 전략을 확인한다. 알킬화제 (예를 들면, 황 및 질소 머스타드)에 피부 노출 장애 (6) 상처 치유됩니다. 이러한 화합물로 인해 정치적으로 불안정한 지역과 비교적 간단한 합성의 기존 비축에 강한 우려에 대한 이유를 20 세기에 여러 갈등 화학 전쟁 에이전트로 사용 남아 있었다. 황 머스타드 먼저 1822 년 합성되었지만, SM 노출의 분자량과 임상 병리학 상세히 이해되지 않고 SM 노광용 해독제가 확인되지 않았다. 몇몇 연구는 이해하고 SM 노광 후에 손상된 상처 치유를 모델링하고 그 효과를 확보 할 수있는 잠재적 후보 화합물을 시험하기 위해 수행되었다. 슈미트 외. (2009) 클로 람 부실의 영향, 양해 각서 (MOU)에 SM과 유사한 특성을 가진 알킬화 화합물을 테스트SE 배아 체 모델 및 혈관 형성 7 극적인, 때때로 99 % 이상의 감소를 알았다. 이 부작용은 대부분, 생리 학적 조건 하에서, 증식 및 혈관 내피 전구 세포의 이동에 의해 지배된다 개발 단계에서 두드러졌다. 따라서, 이들 세포는 알킬화제에 특히 민감한 것으로 확인되었다. Steinritz 외. (2010)에, 마우스 배아 체 모델에서 특히 SM 독성을 감소시키는 그들의 능력에 대하여 특히, N- 아세틸 시스테인 (NAC)과 알파 리놀렌산 (ALA)에서 반응성 산소 종 (ROS)의 청소부 테스트 혈관 형성 (8)를 복원합니다. 임시 보호 효과는 과도한 활성 산소의 형성은 상처 치유에 SM의 부작용에 ​​기여할 가능성이되었음을 나타내는, 관찰되었다. 이러한 효과는 영구 없었고 두 후보 화합물은 장기 8에서 혈관 형성 및 상처 치유를 복원 할 수 없을 수도있다. HoweveR, 그 실험은 세포 이동의 조사를 허용했다 복잡한 3D 모델에서 실시 하였다. 따라서, 우리는 이후 용기 (9)의 형성 과정에서 중요한 역할을 EEC의 세포 이동에 대한 유익한 효과에 대한 ALA NAC 및 시험. 또한, 셀 극성 세포 이동을 위해 필요하다는 증거가있다. ROS의 형성으로 이어지는 미토콘드리아 기능 장애 세포 극성을 저해하는 것으로하고, 따라서 악영향 세포 이동에 영향을 미칠 수있다. 따라서, 미토콘드리아 기능에 관한 라이브 세포 이미징을 수행하고, ROS 제거제의 효과를 조사 하였다. 다음 프로토콜은 EEC, 보이든 챔버 분석, 세포 추적 분석 및 세부에서 미토콘드리아 기능의 평가 TMRM의 사용을 포함하여 분석 상처 치유의 재배에 대한 일반 요구 사항에 대해 설명합니다. EEC 재배 및 마이그레이션을위한 실험 프로토콜의 중요한 측면이 강조된다.

<table><tbody><tr><td>Boyden Chamber&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 3 &amp;micro;m</td><td>Corning Incorporated</td><td>#351151</td><td></td></tr><tr><td>Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 8 &amp;micro;m</td><td>Life Sciences</td><td>#351152</td><td></td></tr><tr><td>(for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wound&amp;nbsp; healing assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom dishes</td><td>Word Precision Instruments, Inc.</td><td>#FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Assessment of mitochondrial potential</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester)</td><td>Life Technologies</td><td>#T669</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>PAA, Pasching, Austria</td><td># L11-007</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-Linolenic acid</td><td>Fluka (Sigma), Steinheim, Germany</td><td>&amp;nbsp;# L2376</td><td></td></tr><tr><td>Chlorambucil</td><td>Fluka (Sigma), Steinheim, Germany</td><td># 23125</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany</td><td># G2500-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of endothelial cell migration after exposure to toxic chemicals

(황 및 질소 겨자 등의 알킬화 화학 전쟁 에이전트 포함) 화학 물질에 노출되면 상처 치유 장애를 포함하여 임상 증상의 과다 발생합니다. 상처 치유의 생리 학적 과정은 매우 복잡하다. 어느 혈관 생성을 통한 (신규 형성) 또는 혈관 생성 (기존 용기의 돋) - 육아 조직의 형성은 예비 상처 봉합의 결과 및 새로운 모세 혈관의 네트워크가 제공하는이 과정에서 중요한 단계이다. 모두 vasculo- 및 혈관 내피 세포의 기능, 지시 마이그레이션을 필요로한다. 따라서, 초기 내피 세포 (EEC) 이전의 조사는 잠재적으로 치료 개입을위한 새로운 전략을 확인 장애를 치유 화학 물질에 의한 상처의 병태 생리를 이해하고하는 것이 중요하다. 우리는 에이전트 노출을 알킬화 후 손상된 상처 치유를 평가하고, TR에 대한 잠재적 인 후보 화합물을 테스트eatment. 우리는이 프로토콜에 설명 된 기법들을 사용 하였다. 수정 된 보이든 챔버는 정량적 EEC의 chemokinesis 설명한다보고자 하였다. 더욱이, 정 성적으로 마이그레이션을 평가하기 위해 트랙 분석과 조합하여 분석 상처 치유의 사용이 예시된다. 마지막으로, 우리는 교란 된 세포 이동의 기본 메커니즘을 식별하는 미토콘드리아 막전위의 조사 TMRM 형광 염료의 사용을 입증한다. 다음 프로토콜은 EEC의 조사를 위해 적응 된 기본 기술에 대해 설명합니다.

알킬화제에 대한 피부 노출은 홍반, 수포 형성 및 상처 치유 장애와 관련된 피부 궤양을 유발. 상처 치유는 내피 세포의 이동을 기반으로 angio- 및 혈관 생성을 필요로한다. 정량적 마이그레이션 된 Boyden 챔버 에세이를 사용하여 평가 될 수있다. 알킬화제 클로 람에 EEC의도 1c에 도시 한 바와 같이 노광시에 세포 이동 (9)에 상당한 감소 결과. 직접 24 시간 동안 클로 람 부실에 노출 된 후 활성 산소 폐품 알파 리놀렌산 (ALA)의 추가는 상당히 거의 제어 수준으로,이 표현형을 구출. 보이든 챔버 분석 마이그레이션 셀의 수 (양)를 평가하기에 적합한 도구이다. 그러나, 분석은 세포의 이동 동작에 대한 정보를 제공하지 않습니다.이 그림은 노출되지 않은 EEC 상처와 치유 엉덩이에 격차를 할 수 있는지 보여줍니다24 시간 9 내 님. 대조적으로, 알킬화제의 클로 람 부실에 노출 EEC는 분석 (9) 상처 치유의 격차를 할 수 없습니다. 또한, 하나의 EEC의 세포 추적 클로 람 부실 감독 운동의 영향을 받아 9 관찰되지 않았다 것으로 나타났습니다. ROS-제거제와 EEC의 치료는 직접 세포 이동 (9)을 복원 할 수 있었다. 미토콘드리아 활성 산소의 형성은 세포 이동 (12)의 손상과 관련이있다. 클로 람 부실에 EEC의 그림 3 노출에 나타낸 바와 같이 9 잠재적 인 미토콘드리아 막의 분석 결과. 활성 산소 폐품과 EEC의 치료는 미토콘드리아의 손상을 방지하고, 미토콘드리아 막 잠재력을 유지했다. 요약하면, 프로토콜 절에 설명 된 모든 방법은 세포 이동을 평가하기에 적합한 도구이다. V를 제공 할 수있다 미토콘드리아 막 전위의 손실 또는 보존에 대한 연구 결과손상된 세포 이동의 기본 분자 메커니즘에 관한 aluable 힌트. <img alt="그림 1AB" src="/files/ftp_upload/52768/52768fig1AB.jpg" /><img alt="그림 1C" src="/files/ftp_upload/52768/52768fig1C.jpg" /> 도 1 보이든 챔버 분석. (A) EEC는, 8 시간 동안 배양 된 Boyden 챔버 필터 인서트에 고정 시드 및 DAPI 염색 하였다. 별표는 EEC를 마이그레이션 나타냅니다. 표시 화상의 19 개의 셀들의 총 (도 1b) 계산 될 수있다. 빨간색 화살표 머리가 완전히 삽입을 통해 마이그레이션되지 또는 그 시야에서 완전히하지 않으며, 따라서 세포 계산에서 제외 된 한 세포를 나타냅니다. (B) 이미지 획득을위한 긴 노출 시간을 사용할 때 볼 수있게 막의 공극 (8 μm의). 마이그레이션 세포를 혼동하지 마십시오. 제어하에 (C)조건 막을 통해 이주 된 세포 (212)의 평균. 클로 람 부실 노출은 128 마이그레이션 세포의 결과. ROS 폐품 알파 리놀렌산 (ALA) 크게 구출 세포의 이동과 클로 람 부실에 노출 된 EEC의 치료. 기호는 하나의 필터 삽입에서 개별 결과를 나타냅니다. 검은 가로 바 (N = 4), 오차 막대는 SD 및 별표가 유의 한 차이를 나타내는 표시 수단을 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52768/52768fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2A" src="/files/ftp_upload/52768/52768fig2A.jpg" /><img alt="그림 2B" src="/files/ftp_upload/52768/52768fig2B.jpg" /> 그림 2. 상처 치유 분석 / 셀 추적. EEC는 (매체 교환) 처리 - 가짜 또는 12.5 μg의 / ㎖ 클로 람 부실에 노출했다. 세포 W를 긁적 후감수는 24 시간 동안 조사 하였다. () EEC는 EEC 노출 클로 람 부실 반면 24 시간 이내에 상처 치유 분석에서 격차를 할 수 격차를 할 수 없었다이었다. ALA와 치료는 세포 이동의 상당한 개선 결과. 그룹 당 5 기술 복제와 3 독립적 인 실험에서 각각 (B)의 평균 값은 (그룹 당 n = 15)이 표시됩니다. 오차 막대는 표준 편차 및 별표는 통계적으로 유의 한 차이 (일원 분산 분석, P &lt;0.05)를 나타냅니다. Steinritz 외. (2014) 9에서 수정. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52768/52768fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52768/52768fig3.jpg" /> 미토콘드리아 막 전위. EEC 그림 3. 평가 클로 람 부실 (12.5 μg의 / ㎖) 또는 chloramb에 노출, 가짜 처리했다UCIL 노광 및 ALA (15 NG / ml)로 처리 하였다. 24 시간 노출 후, 세포를 이미지화 바로 15 분 동안 TMRM 탑재 하였다. () 비노출 EEC는 손상되지 않은 미토콘드리아 막 잠재력을 나타내는 TMRM 라벨링 후 별개의 신호를 한 것으로 밝혀졌습니다. (B) 클로 노출 TMRM 신호의 상당한 감소 결과. ROS 폐품 알파 리놀렌산과 클로 람 부실 노출 EEC의 (C) 치료가 미토콘드리아 막 잠재력을 복원. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52768/52768fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

유해 화학 물질에 노출 된 후 내피 세포 이동의 평가

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.6K 조회수.  Bundeswehr Institute of Pharmacology and Toxicology. Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

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Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration and invasion abilities to understand how cancer cells disseminate, with the aim of developing new treatment strategies. Analysis of the cellular and molecular basis of these abilities has led to the characterization of cell mobility and the physicochemical properties of the cytoskeleton and cellular microenvironment. For many years, the Boyden chamber assay and the scratch wound assay have been the standard techniques to study cell invasion and migration. However, these two techniques have limitations. The Boyden chamber assay is difficult and time consuming, and the scratch wound assay has low reproducibility. Development of modern technologies, especially in microscopy, has increased the reproducibility of the scratch wound assay. Using powerful analysis systems, an &#34;in-incubator&#34; video microscope can be used to provide automatic and real-time analysis of cell migration and invasion. The aim of this paper is to report and compare the two assays used to study cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and an optimized in vitro video microscope-based scratch wound assay.

This study reports two different methods for the analysis of cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and the in vitro video microscope-based wound-healing assay. The protocols for these two experiments are described, and their benefits and disadvantages are compared.

셀 침공 및 마이그레이션 프로세스의 평가: 비디오 현미경-기반 스크래치의 비교 분석 결과 및 Boyden 챔버 분석 결과 상처

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

연구

암 연구학

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

생리 흐름 조건에서 순환 세포의 케모카인 - 감독 넘쳐을 연구하는 소설 입체 흐름 챔버 장치

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

생체공학

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

세 가지 차원 콜라겐 매트릭스 내에서 세포의 이동 분석

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. During infection of the urinary bladder, polymorphonuclear leukocytes (PMN; neutrophils) migrate from the bloodstream and traverse the bladder epithelium. Failure to resolve infection in the absence of a neutrophilic response demonstrates the importance of PMN in bladder defense. To facilitate colonization of the bladder epithelium, uropathogenic Escherichia coli (UPEC), the causative agent of the majority of urinary tract infections (UTIs), dampen the acute inflammatory response using a variety of partially defined mechanisms. To further investigate the interplay between host and bacterial pathogen, we developed an in vitro model of this aspect of the innate immune response to UPEC. In the transuroepithelial neutrophil migration assay, a variation on the Boyden chamber, cultured bladder epithelial cells are grown to confluence on the underside of a permeable support. PMN are isolated from human venous blood and are applied to the basolateral side of the bladder epithelial cell layers. PMN migration representing the physiologically relevant basolateral-to-apical direction in response to bacterial infection or chemoattractant molecules is enumerated using a hemocytometer. This model can be used to investigate interactions between UPEC and eukaryotic cells as well as to interrogate the molecular requirements for the traversal of bladder epithelia by PMN. The transuroepithelial neutrophil migration model will further our understanding of the initial inflammatory response to UPEC in the bladder.

We developed an in vitro model that mimics an important component of the acute inflammatory response during infection of the bladder with uropathogenic Escherichia coli. The transuroepithelial neutrophil migration assay enables quantitative assessment of human neutrophil migration across bladder epithelia, cultured on permeable supports, in response to bacterial infection or chemoattractant substances.

교양 방광 상피 세포 간 인간 호중구 이주의 정량 평가

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

면역학 및 감염병학

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex vivo transmigration system. Group 2 innate lymphoid cells (ILC2) and CD4+ T helper cells were isolated from spleens and lungs of chicken egg ovalbumin (OVA)-challenged BALB/c mice. We confirmed the expression of CCR4 on both CD4+ T cells and ILC2, comparatively. CCL17 and CCL22 are the known ligands for CCR4; therefore, using this ex vivo transmigration method we examined CCL17- and CCL22-induced movement of CCR4+ lymphocytes. To establish chemokine gradients, CCL17 and CCL22 were placed in the bottom chamber of the transmigration system. Isolated lymphocytes were then added to top chambers and over a 48 h period the lymphocytes actively migrated through 3 &#181;m pores towards the chemokine in the bottom chamber. This is an effective system for determining the chemokinetics of lymphocytes, but, understandably, does not mimic the complexities found in the in vivo organ microenvironments. This is one limitation of the method that can be overcome by the addition of in situ imaging of the organ and lymphocytes under study. In contrast, the advantage of this method is that is can be performed by an entry-level technician at a much more cost-effective rate than live imaging. As therapeutic compounds become available to enhance migration, as in the case of tumor infiltrating cytotoxic immune cells, or to inhibit migration, perhaps in the case of autoimmune diseases where immunopathology is of concern, this method can be used as a screening tool. In general, the method is effective if the chemokine of interest is consistently generating chemokinetics at a statistically higher level than the media control. In such cases, the degree of inhibition/enhancement by a given compound can be determined as well.

In this protocol, lymphocytes are placed in the top chamber of a transmigration system, separated from the bottom chamber by a porous membrane. Chemokine is added to the bottom chamber, which induces active migration along a chemokine gradient. After 48 h, lymphocytes are counted in both chambers to quantitate transmigration.

Ex Vivo 트랜스이민 시스템에서 림프구 마이그레이션 평가

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

인간 줄기 세포 유래 내피 세포 및 GABAergic 뉴런에 대한 이동, 화학 적 매력 및 공동 배양 어세포

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

신경과학

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

체외 세포 이동 및 내습 분석 실험에서

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

생물학

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

내피 세포 접착 정량<em&gt; 체외</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

A Cost Effective and Adaptable Scratch Migration Assay

Cell migration is a key component in both physiological and pathological events. Normal cell migration is required for essential functions such as development and mounting an immune response. When a defect or alteration occurs with the cell migration process, it can have detrimental outcomes (i.e., cancer metastasis, wound healing, and scar formation). Due to the importance of cell migration, it is necessary to have access to a cell migration assay that is affordable, adaptable, and repeatable. Utilizing the common scratch migration assay, we have developed a new approach to analyzing cell migration that uses general laboratory equipment. The method described uses visual markers that allow for recapturing specific areas of interest without the use of time-lapse microscopy. In addition, it provides flexibility in the experimental design, ranging from altering the migration matrix substrate to the addition of pharmacological modifiers. Furthermore, this protocol outlines a way to account for the area of cell migration, which is not considered by several methods when examining cell migration. This new approach offers a scratch migration assay to a larger audience and will provide greater opportunity for researchers to examine the physiological and pathophysiological impact of cell migration.

We present a cost-effective method to the scratch migration assay that provides a new approach for determining cell migration without the use of equipment-intensive methods. While fibroblasts were used in this protocol, it can be adapted and utilized to study additional cell types and influences on cell migration.

비용 효과적이고 적응 가능한 스크래치 마이그레이션 분석

Cell migration is a key component in both physiological and pathological events. Normal cell migration is required for essential functions such as ...

An Introduction to Cell Motility and Migration

Cell motility and migration play important roles in both normal biology and in disease. On one hand, migration allows cells to generate complex tissues and organs during development, but on the other hand, the same mechanisms are used by tumor cells to move and spread in a process known as cancer metastasis. One of the primary cellular machineries that make cell movement possible is an intracellular network of myosin and actin molecules, together known as &#8220;actomyosin&#8221;, which creates a contractile force to pull a cell in different directions.In this video, JoVE presents a historical overview of the field of cell migration, noting how early work on muscle contraction led to the discovery of the actomyosin apparatus. We then explore some of the questions researchers are still asking about cell motility, and review techniques used to study different aspects of this phenomenon. Finally, we look at how researchers are currently studying cell migration, for example, to better understand metastasis.

Cell Motility and Migration, Cell Invasion and Chemo-attraction

세포 운동성 및 이동 소개

Cell motility and migration play important roles in both normal biology and in disease. On one hand, migration allows cells to generate complex tissues ...