Name: chitosan/interfering rna nanoparticle mediated gene silencing in disease vector mosquito larvae
Uploaded: 2015-03-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
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Funding from the Kansas Agricultural Experiment Station and K-State Arthropod Genomics Center to KYZ supported the original development of chitosan/dsRNA-mediated gene silencing in A. gambiae19.The A. gambiae work described here was supported in part by R01-AI095842 from NIH/NIAID to KM. Development of chitosan/siRNA-mediated gene silencing in A. aegypti20,21 was supported by NIH/NIAID Award R01-AI081795 to MDS. The contents of this study are solely the responsibility of the authors and do not necessarily represent the official views of the NIH.

1. 모기 종과 양육을 <ol><li> A. 유지 gambiae의 G3와 A. aegypti 리버풀 IB12의 (아래의 대표 연구에 사용) 균주 또는 표준 실험실 연습에 또는 이전에 23, 24 설명한대로 따라 관심의 다른 균주. </li></ol> 2. dsRNA를하고 siRNA를 디자인 및 제작 <ol><li> 디자인 프라이머는 관심의 유전자에 특정 긴 dsRNA를 템플릿을 구성합니다. E-RNAi의 도구 (25)를 사용합니다. 같은 또는 선택의 방법에 따른 dsRNA를 생산 이전에 설명 19. <ol><li> 음성 대조군의 경우, 녹색 형광 단백질 (GFP), β - 갈 락토시다 제 (β-GAL), 또는 모기로 표현하지 다른 유전자의 서열에 해당하는 dsRNA (19)를 합성. 목적한다면, 다음과 같이 요약 대표적인 결과를 생성하기 위해 이용 된 dsRNA (19)은 양성 대조군으로 사용할 수있다. 스토어 dsRNA를 -80 °에서 RNAse가없는 물에 용해 된; C가 필요할 때까지. </li></ol></li><li> 또한, 디자인 유전자 특이 적 siRNA를 표준 실험실 관행에 따라 또는 이전 10 설명했다. 모든 모기 유전자에 대응하지 않는 음성 대조군 siRNA의 설계를 최저의 siRNA 시퀀스를 스크램블링. 신뢰할 수있는 공급 업체의 숫자를 통해 사용할 수있는 사용자 정의 된 siRNA를 구입합니다. <ol><li> 목적한다면, 다음과 같이 요약 대표적인 결과를 얻기 위해 이용 된 siRNA (20, 21)은 양성 대조군으로 사용할 수있다. 필요할 때까지 보관 된 siRNA는 -80 ° C에 RNAse가없는 물에 용해시켰다. </li></ol></li></ol> 3. R​​NA 나노 입자를 방해 / 키토산 준비 <ol><li> 미리 만들어진 RT 100 mM 염화나트륨, 황산 수집 (탈 H 2 O 100mm의 나 2 SO 4), 0.1 M 아세트산 나트륨 (탈 H 2 O 중 0.1 M NAC 2 H 3 O 2 -0.1 M 아세트산, pH를 4.5) 버퍼. </li><li> 키토산을 용해 (≥75 %탈 아세틸) 0.1 M 아세트산 나트륨 완충액 () V / w 작업 용액 0.02 %를 만들기 위해 사용하기 전에 실온에서 용액을 유지한다. </li><li> H 2 O 탈 50 μL에서의 dsRNA 또는 siRNA에 용해시키고 50 mM 염화나트륨, 황산 100 ㎕ 당하는 dsRNA / siRNA를 32 μg의의 100 μL 용액을 만들기 위해 100 mM의 황산 나트륨 버퍼에 추가한다. </li><li> dsRNA에 / siRNA의 용액에 키토산 용액 100 μl를 첨가하고, 그 다음 1 분 동안 55 ℃에서 수욕에서 혼합물을 가열한다. 키토산 용액 100 ㎕ 50 mM 염화나트륨, 황산 100 ㎕를 첨가함으로써 제어를 설정하고 동일한 절차를 따른다. </li><li> 나노 입자의 형성을 촉진하기 위해 RT에서 고속 텍싱 30 초 동안 즉시 용액을 섞는다. </li><li> 펠릿 볼 수 있어야 그 이후 실온에서 10 분 동안 13,000 XG에서 혼합물을 원심 분리기. 새로운 1.5 ML 튜브에 뜨는을 전송합니다. 모기 음식을 준비하기 위해 그것을 사용하기 전에 실온에서 ≈10 분 펠렛을 공기 - 건조. </li><li> M상청액에 남아하는 dsRNA / siRNA와의 총량을 계산하는 블랭크로서 대조군 (3.5 참조)를 사용하여 상등액 상등액의 dsRNA /의 siRNA 농도를 easure. 초기의 dsRNA / siRNA의 양 및 나노 입자에 포획 된 dsRNA / siRNA의 백분율을 계산하는 상청액에 남아있는 양의 차이를 사용한다. 이 적재 효율은 일반적으로 90 % 이상이다. </li><li> 나노 입자가 더 필요한 경우 동일한 절차를 반복한다. 즉시 건조 된 나노 입자를 사용합니다. 사용하기 전에 입자의 저온 저장의 영향은 평가되지 않았다. </li></ol> 4. 모기 음식 RNA 나노 입자를 방해 / 키토산을 포함하는 시스템 준비 <ol><li> 증류수에 아가 로스를 용융 (V / w) 아가로 오스 2 % 용액 1 ㎖를 제조하고, 사용 전에 55 C 수욕에서 용융 아가로 오스 용액을 유지한다. </li><li> 물고기 음식 부스러기를 혼합 (47 % 조단백질, 분. 조지방 10 %, 최대. 조섬유 3 %)에서 건조 효모(w / w) 1 : 2의 비율. 박격포와 유 봉 (50 위 미국 표준 시험 체를 통해 무난)와 작은 입자의 혼합물을 갈기. 중 즉시, 색상 갈색이어야한다 분쇄 된 음식물을 사용하거나 몇 주 동안 4 ℃에서 밀봉 된 용기에 보관하십시오. </li><li> 1.5 ML 튜브에서, 이쑤시개와 3.7 절에서 건조 된 나노 입자로 분쇄 된 음식물의 6 mg의 혼합. </li><li> 식품 나노 입자 혼합물을 2 % 예비 용융 아가 로스 겔 용액 30 μL를 추가; 이쑤시개 또는 피펫 팁을 사용하여 즉시 철저하게 약동하십시오. </li><li> 바로 모기 유충을 공급하는 음식과 나노 입자를 포함하는 겔을 사용합니다. 젤이 완전히 실온에서 응고되면 다른 방법으로, 4 ° C에서 젤을 저장하고 사용 다음날, 또는 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서. </li></ol> 5. 식품 RNA 나노 입자를 방해 / 키토산을 함유 모기 유충을 먹이 <ol><li> 수유 A. gambiae 모기 유충 : <ol><li> 시 제거이쑤시개를 사용하여 깨끗한 면도날이나 이쑤시개를 사용하여 6 동등한 조각으로 잘라 1.5 ML 튜브에서 ngle 젤 펠릿. </li><li> 100 ml의 탈 이온수를 함유하는 500 ml의 배양 접시에 20 번째 전송 령 유충. </li><li> 페트리 접시에 한 번 사일을위한 하루 겔 펠렛 (미세하게 작은 조각으로 잘게) 한 조각을 추가하여 모기 유충을 먹이. 크게 크기가 감소 또는 다음날에 의해 완전히 결석해야 펠릿에 애벌레 먹이를 준수해야합니다. 시간이 지나면 모기 늦게 넷째 령 애벌레로 발전 할 것이다. </li><li> 실험 기간 동안 눈에 보이는 표현형의 변화를 기록한다. 네 일의 기간이 종료 6 절에 설명 된대로 성적 수준과 다른 표현형의 변화를 검사합니다. </li></ol></li><li> 수유 A. aegypti 모기 유충 : <ol><li> 깨끗한 면도날이나 이쑤시개를 사용하여 6 동등한 조각으로 젤 펠렛을 잘라. </li><li> 달걀 부화 Fi를 한 후 50 세 동기 24 시간 배치탈 이온수 ≈40 용액에 배양 접시에 첫 령 유충. </li><li> 하루 중 나머지 1 접지 물고기 음식 부스러기와 건조 효모 : 다음이 정기적으로 애벌레 다이어트로 다시 유충을 전송, 4 시간 / 일에 대한 페트리 접시 당 유충 한 조각을 넣습니다. 매일 네 령 유충에 걸쳐 절차를 반복합니다. </li><li> 원하는 발달 시점에서 6 절에 설명 된대로 성적 수준과 다른 표현형의 변화를 검사합니다. </li></ol></li></ol> 유전자 넉다운 6. 확인 <ol><li> A.에 QRT-PCR에 의해 상대 성적 증명서 정량 aegypti 및 A. gambiae 애벌레. <ol><li> 수행하고 11,19,20 설명, 또는 표준 실험실 절차에 따라 같은 실험 유충 대 이상 10 풀링 제어 세 생물학적 복제물에 QRT-PCR 분석을 분석 할 수 있습니다. 대표 결과가 들어 있습니다. </li><li> 특정 조직 유형 / 신체 일부 (예., 뇌 또는 안테나), PERFO의 분석을 위해관심있는 조직을 복구하기 위해 다음의 6.1.1에 기재된 바와 같이 절개 RM QRT-PCR은 (예를 들면, 소르 등. 21). </li></ol></li><li> 현장 하이브리드 화에 의한 최저의 확인 <ol><li> digoxygenin 표지 안티센스를 합성 표준 실험실 연습에 또는 26 설명 된대로 따라 제어 리보 프로브를 감지. </li><li> 이전에 11,20을 설명하고 아래의 대표적인 결과 섹션에서 논의 된 바와 같이 최저의 확인을 위해 저자 Haugen 등. (27) 프로토콜에 따라 현장 하이브리드에 실행합니다. </li></ol></li><li> 면역 조직 화학 염색에 의한 최저의 확인 <ol><li> 표적 유전자의 단백질 생성물에 대한 항체를 사용할 수있는 경우 이전에 기술 된 바와 같이 28, representati에 예시 된 바와 같은 표현형 분석에서 20 녹다운의 최대 수준의 개인 식별을 용이하게, 면역 조직 화학 법을 수행아래의 결과 섹션을했습니다. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

본원에 기술 된 키토산 / RNA 간섭 나노 방법론 효과적으로 A.에서 유생 중에 유전자를 대상으로 사용되어왔다 gambiae (도 2, 3) 및 A. aegypti (도 4, 5, 6, 표 1, 2). 키토산 나노 입자는 본원에 기재된 대표적인 결과에 의해 입증되는 바와 같이 모기에서 성공적으로 사용되어왔다 둘 또는 긴 dsRNA에 siRNA를, 어느 제조 될 수있다. dsRNA에의 합성 siRNA를 구매보다 저렴하지만, 더 노동 집약적이다. 키토산 / siRNA를 사용하는 경우, 표현형 폭로 표현형 오프 사이트에 의한 타겟팅 아니라고 더 확신을 허용 다중 siRNA를 함께 확인할 수있다. 또한, siRNA를 한꺼번에의 상업 생산은 더 나은 분야에 종 특이 모기 제어 RNA 침묵을 방해 / 키토산의 확장을 용이하게 할 수있다. 이것은 물론 obsta 극복 필요이러한 비용 및 배달과 같은 사이클 사용. 우리는이 프로토콜을 사용하여 좋은 성공을 즐기고 있지만, 방법은 각각의 유전자에 최적화해야합니다. 이러한 이유로, 우리는 새로운 프로젝트의 시작에, 아마도 하나의 siRNA와 긴 dsRNA를 여러 siRNA를 테스트하거나 권장합니다. 표현형이 식별 및 적어도 두 가지의 siRNA가 관심 유전자에 대응 확정되면, 표현형 투과도를 증가시키는 이러한 siRNA는 (도 4)에 결합하는 것이 유용 할 수있다. 타이밍과 같은 RNA 공급 시간을 간섭 키토산의 지속 기간 / 각 연구를 위해 최적화 될 수있다. A. 여기에 설명 된 바와 같이 RNA 음식을 방해 / 만 키토산이 공급 될 때 gambiae 번창. 그러나, 실험에서 우리는 날짜, A.에 수행 한 aegypti는, 보충 영양없이 잘 우리가 RNA 공급을 방해 / 키토산의 4 시간 후 정상 음식 다이어트로 전송하여 극복 문제를 지냈다하지 않았습니다. / 키토산 실험을 방해다른 음식 기판에서 RNA 배달, 우리가 아직 시도하지 않은 한,이 문제를 회피 할 수있다. 우리는 몇 일에 걸쳐 4 시간 매일 먹이가 최저 적절한 영양 사이의 균형이 발생할 것을 발견했다,하지만 수유 기간의 변경은 더 원하는대로 추진 될 수있다. 또한, 키토산 / RNA 간섭 나노 입자가 공급 / 계속 개시되는 령 유충은 유전자 기능이이 프로토콜의 주요한 이점을 검사하는 중요한 발달주기에 따라서 각각의 실험에 대해 맞춰질 수있다. 최저의 검증은 중요한 물론이지만, 또한 문제 해결을 요구할 수있다. 이러한 이유 때문에, 최저 효율이 평가되는 바와 같이 관심 표현형이 생성되는 경우를 동시에 점검하는 것이 유용 할 수있다. QRT-PCR 검증 실험의 경우, 프라이머 및 PCR 조건을 최적화하는 것이 중요합니다. 또한, 동물 발달하는 것이 중요일부 사체의 발현이 매우 개발하는 동안 동적으로 인한 일주기 리듬 (29)에 수있는 바와 같이, 실험의 시작에 동기화. 이 기술은 명확하게 장 이상으로 최저를 생성하는 동안 또한, 우리는이 기술이 효과가있는 조직을 평가하기 시작,이 종에 따라 다를 수 있습니다. 따라서 현장 하이브리드에 통해 QRT-PCR 분석 또는 무단 동물에서 관심의 조직을 해부함으로써 달성 될 수있다 특정 조직 (그림 4-6) (20, 21)과 면역 조직 화학 (그림 4) (20)에 최저를 측정하는 데 유용 할 것입니다 분석 (이러한 프로토콜 문제 해결을위한 각각 저자 Haugen 등. (27)와 클 레몬 스 등. 28 참조). 최저 개인차 변화하기 때문에, (Figu 최저 수준과 조합 표현형을 평가하기 위해 이중 라벨링 세이를 수행하는 것이 도움이된다크게 표현형 특성을 용이하게하는, 4) (20)를 다시. 행동 연구의 경우, 각각의 동물에 최저 수준은 자신의 행동 성능 (표 2) (20, 21)과 상관 될 수있다. A.에 RNA 전달을 방해 키토산 매개 다음 aegypti 유충, 유전자 발현 감소는 번데기 발전을 24 시간 (도 4, 6) (20, 21)에서 검출된다. 유전자 발현의 수준은 아직 개발이 시점 이후 상세하게 평가되지 않았지만, 유전자 발현의 감소 된 수준은 모두 48 및 72 시간의 A.에서 검출 된 aegypti의 번데기 (KM, 미 출판). 그것은 A의 여러 단계에서 최저 수준의 자세한 분석을 추구하는 것이 유용 할 것 aegypti 번데기 개발과 또한 A.을 평가하기 gambiae의 번데기. 또한 최저은 성인의 지속 여부를 결정하는 것은 흥미로울 수있을 것이다과에서 나노 입자 매개 탐구성인 모기 RNA 전달 전략을 terfering. 접근을 대상으로 사이트 별 클레아 제 유전자는 최근 A에 소개되었다 aegypti 및 A. gambiae 및 모기 및 기타 비 유전자 모델 생물 30, 31에서 대상, 유전 돌연변이의 생성을 허용하고 있습니다. 이러한 접근법의 사용은 기능 표현형의 더욱 균일 한 손실을 허용되지만 분석 관심 돌연변이 스크리닝의 RNAi 방법보다 이점은, 여전히 꽤 시간 소모적이고 노동 집약적이다. 기능 연구의 RNAi의 손실은 야생형 균주의 유지 보수를 필요로하지만, 또한, 돌연변이 모기 균주를 개별적으로 양육해야합니다. 열성 치사 또는 성인 멸균 돌연변이의 유지 보수는 현재 모기에 표시된 평형의 현재 부족을 주어진 도전하고있다. 부위 - 특이 적 접근법을 표적 유전자 클레아 빠르게 인기를 얻고있는 동안 따라서, 키토산 / 최적 일 수있다 표적 RNA 간섭모기 긴장을 유지하기 위해 장착되지 실험실 및 경우에 선택하는 개발하는 동안 유전자 기능의 손실이 균주의 생존과 호환되지 않습니다. 우리의 연구 결과를 바탕으로, 우리는 키토산 / 간섭 RNA는 A의 개발 과정에서 많은 다른 유전자의 최저 위해 광범위하게 사용될 수 있음을 예상 gambiae, A. aegypti 용뿐만 아니라 다른 곤충, 및 잠재적으로 다른 비유 전적 유기체 모델. 키토산 성공적인 유전자 침묵은 / 간섭 RNA는 홍 다리 얼룩 새우 (새우) (32)를 포함하여 다른 절지 동물 종에서보고되었다. 최근의 연구는 나노 입자의 dsRNA의 흡수를 용이하게하고, 따라서 농업 해충을 대상으로이 기술을 사용하기위한 가능성을 강조 아시아 cornborer 33에서 dsRNA를 직접 공급에 비해 최저 효율을 향상하는 것이 보였다. 인간의 치료제로의 siRNA-나노 입자의 가능한 사용은 많은 O를 끌고있다의료 사회에서 F의 관심. Giljohann 등. (34)의 dsRNA를 무료로 비교에서 더 이상 반감기를 여섯 배 가지고 쉽게 세포를 입력 다가 RNA - 금 나노 입자 복합체의 합성 및 특성을 설명했다. 데이비스 등. (35)은 고형 종양을 갖는 환자에게 나노 입자 전달 시스템을 사용하여 siRNA 전신 투여를 포함하는 제 인간 임상 시험, 최근 36를 평가 한 키토산 / siRNA의 치료제를 사용할 수있는 가능성을 설명했다. 따라서, 키토산 / 기술을 대상으로 RNA 유전자를 방해하는 광범위한 애플리케이션을위한 잠재력을 가진 귀중한 실험실 기술이다. 미래의 연구는이 기술에 대한 추가 응용 프로그램을 모색 할 것입니다. 또한, 키토산 등의 고분자, 연구의 활성 영역의 화학적 변형은, 간섭 RNA 전달의 효율을 증가 또는 특정 조직 (37)에 표적 전달을 허용 할 수있다.

Anopheline과 Aedine 장군의 혈액 공급 벡터 모기는 인류 최악의 재앙의 몇 가지에 대한 책임 질병을 유발하는 에이전트를 전송합니다. 추정 34억명는 매년 전 세계에 걸쳐 절반 만 죽음에 대한 책임이 말라리아, 계약에 대한 위험이 있습니다. 말라리아 특검팀에 의해 감염 말라리아 결과. 주요 아프리카 벡터과 아노 펠 레스 gambiae (를 포함하여 얼룩 날개 속의 감염된 모기의 물린 상처를 통해 사람에게 전송되는 기생충, <a href="http://www.who.int/topics/malaria/en/">http://www.who.int/topics/malaria/en/</a> 2014) 1. Aedes aegypti는 뎅기열, 세계에서 가장 광범위하고 중요한 arboviral 질병 비특이적 열성 질환을 일으키는 뎅기 바이러스에 대한 기본 모기 벡터이다. 뎅기열 바이러스는 매년 inciden으로, 현재 열대&gt; 25억명에 대한 위협이다24,000 사망자 매년 ~의 결과로 약 5천만가지 경우의 CE ( <a href="http://www.cdc.gov/dengue/">http://www.cdc.gov/dengue/</a> 2014) 2. 인간의 건강에 모기 매개 질병의 파괴적인 글로벌 충격에도 불구하고, 예방 및 질병 치료의 효과적인 수단이 부족하다. 모기 제어는 현재 질병 예방의 가장 좋은 방법입니다. 벡터 곤충의 유전자 조작에 의해 절지 동물 매개 질병을 제어하기위한 잠재력은 지난 4 년간 3 인정을 받고있다. A.의 형질 전환 균주 최근 형질 전환 벡터 제어 전략을 현실로 4-6를 사용하기위한 가능성을 만든 aegypti repressible 여성 고유의 날지 표현형을 가지고 설계. 이러한 발전은 벡터 및 벡터 제어 모기 유전자 기능을 조작하기위한 수단을 추가로 신규 한 유전자 표적을 식별하기 위해 연구에 도전했다. 유전자 발현 (D)의 변경을여성이 날지 모기 4의 경우가 있다는 uring 개발, 새로운 벡터 제어 전략의 해명을 촉진 할 수있다. 그러나, 대부분 기술적 과제를 극소수의 유전자 기능의 개발 과정 A. 특성화되었다 gambiae, A. aegypti의, 또는 다른 모기 종. C.에서의 발견 이후 엘레 7은, 동물, 식물, 미생물에 보존되는 RNA 간섭 (RNAi에)는, 광범위 곤충 8,9 포함한 생물체의 다양한, 기능성 유전 연구에서 사용되어왔다. RNAi의 경로는 순서 특정 간섭 RNA의 기능을 짧은 20 ~ 25 염기 길이의 siRNA를로 다이 서 (Dicer), 절단 긴 dsRNA에 의해 시작됩니다. 성적 증명서 회전율, 분열, 번역 (9)의 중단을 촉진하여 순서에 상보적인 siRNA를 침묵 유전자. particula을 대상으로 긴 dsRNA를 분자 (일반적으로 300 ~ 600 BP) 또는 사용자 정의 된 siRNAR 열은 임의의 관심있는 유전자 사일런 싱에 대한 연구 실험실에서 사용될 수있다. RNA가 전달을 방해 할 때 관리함으로써, 연구진은 유전자에 동수를 침묵 시간을 제어 할 수 있습니다. 그것은 생산과 유전적인 돌연변이, 아직 모든 곤충 종에 존재하지 않는 비용과 노동 집약적 인 프로세스를 베어링 균주의 유지를 방해 할 수 있습니다 이러한 발달 치사 또는 불임 등의 문제를 극복하는 데 사용할 수있는 이러한 장점에 유용합니다. RNAi에 의한 유전자 침묵의 과정은 동물에게 유전자를 조직의 조직 및 동물 유전자에서 달라질 수 있지만, RNAi를 널리 모기 및 다른 곤충 8,9에서 유전자의 기능 분석을 위해 사용된다. 세 간섭 RNA 배달 전략은 모기에 사용되었습니다 미세 주사, 전신 / 국소 응용 프로그램 및 섭취. 자세한 역사와 곤충이 세 가지 기술의 사용의 비교를 위해, 유 등의 알 8을 참조하시기 바랍니다. WE 성공적 A.에서 발달 유전자를 표적으로 siRNA를 전달하는 수단으로서 마이크로 인젝션 10을 사용한 aegypti 배아, 유충, 번데기 11-14. 그러나이 노동 집약적 인 배달 전략은 미세 주사 설정 및 숙련 된 손 모두를 필요로한다. 또한, 미세 주입은 행동 표현형이 부과됩니다 특히, 생물, 교란 요인에 스트레스. 마지막으로, 마이크로 인젝션 배달 벡터 제어를위한 필드로 확장 될 수 없다. 편리하고 작은 장비 또는 노동을 필요로하는 대신, RNA 간섭을 용액에 담그는 유기체 또한, 유전자 침묵을 유도하는 인기 수단이되었다. 잠기기는 주로 곤충 세포 라인에 적용된 것은 8을 연구하지만, 최근의 연구에서, 최저는 A에 달성되었다 aegypti 유충 동물이 섭취하는 dsRNA 것으로 나타났다 (15)의 용액에 침지. 그러나, 여러 experimenta의 분석과 관련된 연구L 그룹이나 표현형은 몸을 담근 채 오히려 비용이 많이 든다. 로페즈 마르티네스 등. 16의 RNAi, RNA 간섭을 함유하는 물을 한 방울과 식염수 탈수 재수 관련된 RNA 전달을 방해하기위한 새로운 접근 방식을 재수 구동을 설명했다. 이 접근법은 전체 동물의 침지와 관련된 비용을 절감하지만 미세 주입보다 더 비싼 높은 삼투압을 허용 할 수있는 종의 적용이 제한 될 수있다 않는다. 또한, 침지 또는 탈수 / 재수 침지 방법이 필드 벡터 제어하도록 적응 될 수있는 방법을 구상하는 것이 곤란하다. 이런 이유로, 이후의 배아 연구를 들면 음식 섭취 RNA 간섭의 배달 대안 전략이다. 섭취 기반 전략이 모든 종의 곤충, 아마도 특히 초파리에서 작동하지 않지만, 음식과 혼합 RNA 간섭의 구두 전달은 유전자의시를 승진시켰다곤충 8,17의 다양한 lencing 포함 A. aegypti 성인 18. 우리는 A에 키토산 나노 입자 매개 RNAi의 설명 gambiae 유충 (19) 성공적으로 A의 유전자 발현의 감소를위한이 방법을 적용했습니다 aegypti 애벌레 (20, 21). 여기서, 고분자 키토산 RNA 간섭의 포획이 포함 RNAi의 절차를위한 방법은, 상세하다. 키토산 / 간섭 RNA 나노 입자 키토산의 아미노기의 양전하와 RNA 19 간섭의 백본에 인산기에 의해지지 마이너스 전하 사이의 정전기력을 통해 RNA 간섭과 폴리 양이온의 자기 조립에 의해 형성된다. 설명 된 절차는 긴 dsRNA를 분자 (이하의 siRNA로 지칭)을 가닥의 siRNA (이하 dsRNA를 라 함) 또는 이중 모두와 호환된다. 다음 합성, 키토산 / 간섭 RNA 나노 입자는 애벌레 음식과 혼합에게 전달됩니다경구 섭취를 통해 유충. 이 방법론은, 비교적 저렴 작은 장비 및 인력 (19)이 필요하며, 동작 (20, 21)의 분석을 포함하는 다수의 표현형의 높은 처리량 분석을 용이하게한다. 다른 질병 벡터 및 곤충 농업 ​​해충 포함한 다른 곤충에서 유전자 침묵 과정에 대해 적응 될 수있다이 방법은, 잠재적으로 다른 동물 종의 다양한 유전자 침묵을 위해 사용될 수있다. 또한, 키토산, 저렴 무독성 생분해 성 고분자 (22)는 잠재적으로 종 특이 모기 제어를위한 분야에서 이용 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>0.02 ml pipetteman</td><td>Rainin</td><td>PR20</td><td>for resuspension of interfering RNA</td></tr><tr><td>0.2 ml pipetteman</td><td>Rainin</td><td>PR200</td><td>for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles</td></tr><tr><td>0.5 ml graduated tube&amp;nbsp;</td><td>Fischer Scientific</td><td>05-408-120</td><td>for aliquoting resuspended interfering RNA</td></tr><tr><td>1 ml pipetteman</td><td>Rainin</td><td>PR1000</td><td>for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles</td></tr><tr><td>1.5 ml graduated tube&amp;nbsp;</td><td>Fischer Scientific</td><td>05-408-046</td><td>for preparation of interfering RNA/nanoparticles</td></tr><tr><td>1M Sodium Acetate, pH 4.5</td><td>TEKnova</td><td>S0299</td><td>to prepare sodium acetate buffer</td></tr><tr><td>Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade</td><td>BDH</td><td>VWR BDH3092-500MLP</td><td>to prepare sodium acetate buffer</td></tr><tr><td>Agarose Genetic Technology Grade</td><td>MP Biomedicals LLC.</td><td>800668</td><td>to coat prepared interfering RNA/nanoparticles</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf AG</td><td>5415D</td><td>to pellet interfering RNA/nanoparticles</td></tr><tr><td>Chitosan, from shrimp shells</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3646-25G</td><td>to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles</td></tr><tr><td>Dry Yeast</td><td>Universal Food Corp</td><td>NA</td><td>to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles</td></tr><tr><td>E-RNAi tool</td><td>German Cancer Research Center</td><td>NA</td><td>for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//</td></tr><tr><td>goldfish food</td><td>Wardley</td><td>Goldfish FLAKE FOOD</td><td>to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles</td></tr><tr><td>Heated water bath</td><td>Thermo Scientific</td><td>51221048</td><td>to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55&lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C</td></tr><tr><td>Ice</td><td>not applicable</td><td>not applicable</td><td>for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Ice bucket</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-591-44</td><td>for storage of ice used during the procedure</td></tr><tr><td>liver powder</td><td>MP Biomedicals LLC.</td><td>900396</td><td>to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment</td></tr><tr><td>Microwave oven</td><td>A variety of vendors</td><td>not applicable</td><td>to prepare 2% agarose solution</td></tr><tr><td>petridish (100 x 15 mm)</td><td>Fischer Scientific</td><td>875713</td><td>interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae</td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Mettler Toledo</td><td>S220</td><td>for preparation of buffers</td></tr><tr><td>Razor blade</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-640</td><td>to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings</td></tr><tr><td>siRNA</td><td>Thermo Scientific/Dharmacon</td><td>custom</td><td>for preparation of siRNA/nanoparticles</td></tr><tr><td>Sodium Sulfate, Anhydrous (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>BDH/distributed by VWR</td><td>VWR BDH0302-500G</td><td>to prepare 50 mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended</td></tr><tr><td>Thermometer</td><td>VWR</td><td>61066-046</td><td>to measure the water bath temperature</td></tr><tr><td>Tooth picks</td><td>VWR</td><td>470146-908</td><td>for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets</td></tr><tr><td>Ultralow freezer</td><td>A variety of vendors</td><td>not applicable</td><td>for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80&lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C</td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Fischer Scientific</td><td>02-216-108</td><td>for preparation of chitosan/interfering RNA</td></tr><tr><td>Weight paper</td><td>Fischer Scientific</td><td>NC9798735</td><td>to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings</td></tr></tbody></table>

chitosan/interfering rna nanoparticle mediated gene silencing in disease vector mosquito larvae

벡터 모기는 다른 생물보다 더 인간의 고통을 입힐 - 이상 백만명 매년 죽인다. 모기 게놈 프로젝트는 기본 아프리카 말라리아 벡터과 아노 펠 레스 gambiae 및 뎅기열과 황열병 벡터 Aedes aegypti의 유전학적인 연구를 포함하여 모기 생물학의 새로운 측면에서 연구를 촉진. RNA 간섭 - (RNAi-) 매개 유전자 침묵은 이러한 질병 벡터 모기 종 모두에 대한 관심의 유전자를 대상으로 사용되어왔다. 여기서는 음식 합하고 유충 섭취 RNA 간섭 나노 입자 / 키토산의 제조 과정을 설명한다. 긴 이중 가닥 RNA (dsRNA에) 또는 작은 간섭 RNA (siRNA의) 분자와 호환이 기술적으로 간단 높은 처리량 및 비교적 저렴한 방법은, A. 다른 유전자의 숫자의 성공적인 최저 사용되어왔다 gambiae 및 A. aegyptiQRT-PCR을 통해 또는 현장 하이브리드에 확인 유충. 애벌레의 먹이에 따라, 최저는, 적어도 후반 번데기를 유지할 수 있습니다. 이 방법론은 모기 및 농업 해충 곤충을 포함하는 다른 종의 다양한뿐만 아니라 다른 비 유기체 모델에 적용될 수있다. 연구 실험실에서 유용성 외에도 향후, 키토산, 저렴하고, 비 독성 및 생분해 성 중합체, 잠재적 분야에서 이용 될 수있다.

<html> A. gambiae : 키토산 / 나노 dsRNA에 의한 키토산의 아미노기와의 dsRNA의 인산기 간의 정전 상호 작용으로 형성된다. 용액으로부터의 dsRNA의 고갈에 의해 측정하는 나노 입자에 혼입하는 dsRNA의 효율은 일반적으로 90 % 이상입니다. 원자력 현미경 이미지 표시하는지 100-200 nm의 (도 1)에 이르는 직경 키토산 dsRNA에 입도 140 nm의 평균. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52523/52523fig1.jpg" /> 키토산 및 RNA 간섭에 의해도 1의 나노 입자 형성. 키토산 / dsRNA를 나노 입자 (A) 또는 dsRNA를 (B)의 첨가없이 키토산 용액의 원 자간 력 현미경 이미지. 이미지의 크기는 1.0 × 1.0 ㎛의 ㎛,. 스케일 바 = 250 nm의.e.com/files/ftp_upload/52523/52523fig1large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 표준 애벌레 음식과 결합 아가 로스에 통합이 입자의 먹이 정상적인 유생의 개발을 지원합니다. 중요한 것은, 외배엽 유래 AgCHS1 성적의 특정 최저뿐만 아니라 중장 별 AgCHS2 (그림 2)는 dsRNA를 나노 입자의 섭취를 통해 찍은 것으로 보여, 19 가능한 중장 이상 RNAi의를 시작합니다. ≈40-60 % 최저 효율 (예., 그림 2) 관찰 및 성적 증명서 사이에서 변화되었다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52523/52523fig2.jpg" /> 에 dsRNA를 섭취 후 키틴 합성 효소 2 (AgCHS2) 그림 2. 전사 수준 &lt;EM&gt; A. gambiae 유충. DS AgCHS2 또는 제어 DS GFP와 나노 입자에 공급 유충에 AgCHS2의 상대 mRNA 수준. 데이터는 3 개의 독립적 인 생물 반복 실험에서 평균 ± SD으로 표시하고 있습니다. 막대에 다른 문자 쌍 t 테스트 (P = 0.003)에 따라 유의 한 차이를 나타냅니다. AgCHS1의 넉다운 크게 넷째 령 유충의 총 키틴 함량을 감소 키틴 합성 억제제 살충제에 대한 감수성 증가, 19 diflubenzuron, AgCHS2의 넉다운 크게 백색 CALCOFLUOR의 효과를 증가시키고 제 령기에 peritrophic 매트릭스 (PM)을 파괴하는 디티 유충 사망률 증가 (17)의 결과 (그림 3). <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52523/52523fig3.jpg" /> <stroNG&gt; 키토산 / DS 그림 3. 영향 AgCHS2는 A에 나노 입자를 섭취 gambiae peritrophic 매트릭스 (PM) 투과성. CALCOFLUOR 흰색 또는 DTT 처리가 A의 PM을 방해 더 키토산의 섭취를 통해 AgCHS2 최저로 exuberated됩니다 gambiae 유충 / dsRNA를 19 나노 입자. 그대로 오후에 (A) 모기. 중단 오후와 (B) 모기, 블루 덱스 트란은 위 ceacae에 유출. A. aegypti의 : 키토산 /의 siRNA 나노 입자는 A. 동안 축삭 유도 유전자 semaphorin-1A (sema1a)를 대상으로 하였다 aegypti 유생 (20). sema1a의 최저은 애벌레 두뇌 엉덩이의 ≈60 %에 sema1a의 수준을 감소 검출 된 현장 하이브리드에 통해 확인되었다ESSID와은과 최저 동물 뇌의 ≈40 %에 sema1a 표현을 감지하는 데 실패 (B 대 그림 4C, 노란색 화살표가 더듬이 엽을 나타냅니다). (제어 나노 공급 동물에 비해 풀링 전체 동물에서 수행 QRT-PCR 분석은이 기술 sema1a 사체 32 ± 10 % 감소 결과 밝혀도 4A, 짝 t 테스트에 기초하여 P &lt;0.01, N = 5, N 생물학적 복제물의 수)이다. 유충 및 번데기 후각 표현형 분석 중에 상당한 녹다운으로 동물을 식별하기 위해 사용 된 항 - Sema1a 항체 식 (D1 대도 4E1)의 손실에 의해 입증되는 바와 같이 뇌 녹다운, 번데기 개발 중 적어도 24 시간을 통해 지속되었다. (표 1에 정량) 애벌레와 번데기 더듬이 로브 결함이 sema1a 넉다운 유충과 번데기에서 검출되었다 (그림 4E2, E3 대 <strong&gt; D2, D3). Sema1a 표현의 손실 변형 사구체 결과 (mAbnc82 가시화 D2 대 그림 4E2을, 두 신호의 오버레이는 그림 4D3, E3에 나와 있습니다). 필적 표현형 관찰 결함이 하나의 siRNA 타겟팅 오프 사이트의 결과가되지 않았 음을 확인하는 데 도움이 두 개의 분리 된 sema1a 넉다운 된 siRNA, 생성되었다. siRNA가 결합되었을 때 최저의 최고 수준 (자세한 내용 소르 외. 20 참조), 최저 효율을 증가 시키는데 사용될 수있는 전략을 생성 하였다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52523/52523fig4.jpg" /> 그림 4. 키토산 /의 siRNA는 A의 개발 후각 시스템에 sema1a의 최저 유도 aegypti. QRT-PCR (A) 및 계내 혼성화는 (B는 C) 분석법 유충 sema1a의 녹다운을 확인 siRNA와 890 및 siRNA를 제어하는 나노 입자 대 1198 키토산 / 간섭 RNA 나노 입자를 표적 sema1a의 혼합물을 공급. Sema1a 표현의 손실 (D1-3 대 E1-3)를 변형 사구체 결과. 자세한 내용은 텍스트를 참조하십시오. 등쪽은 모든 패널에 있습니다. 스케일 바는 25 μm의 =. 이 그림은 원래 마이소르 등 (20)에 출연했다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52523/52523fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 애벌레 </td><td colspan="2"></td><td> 번데기 </td><td colspan="2"></td></tr><tr><td> siRNA를 </td><td> N </td><td> &lt;강한&gt; 야생형 </td><td> AL 결함 </td><td> N </td><td> 야생형 </td><td> AL 결함 </td></tr><tr><td> 제어 </td><td> 69 </td><td> 69 (100 %) </td><td> 0 (0 %) </td><td> (68) </td><td> 68 (100 %) </td><td> 0 (0 %) </td></tr><tr><td> sema1a KD </td><td> 77 </td><td> 42 (54.5 %) </td><td> 35 (44 %) * </td><td> (75) </td><td> 51 (68 %) </td><td> 24 (32 %) * </td></tr></tbody></table> sema1a 최저 다음 더듬이 엽 결함 표 1. 정량화. 제어 얻어진 결과의 컴파일 요약 siRNA의 대 sema1a 최저 (KD)의 siRNA 890 + 모두 유충에서 수행 여덟 복제 실험에 총 1,198 키토산 나노 입자 먹이 동물의 siRNA ( 왼쪽)와 번데기 (오른쪽) 표시됩니다. 총(N) 평가 개인과 더듬이 엽 (AL)의 결함 (후각 수용체 신경 세포 대상 결함, 결함 neuropil 및 사구체 형성) 대 야생형 형태를 표시하는 동물의 수 / 비율의 숫자가 표시됩니다. 넉다운가 가장 심각한 결함을 표시 동물 (15 유충 및 번데기 10)의 서브 세트에 안티 Sema1a 항체 면역 조직 염색법으로 확인 하였다 (*로 표시). 제어 먹인 동물 Sema1a 수준이 현저하게 변경되지 않은 상태에서이 방식으로 평가 모든 넉다운 동물, Sema1a 감소 된 수준의 것으로 밝혀졌다. 이 테이블은 원래 마이소르 등 (20)에 출연했다. 두 번째 조사에서 21, 키토산 /의 siRNA 나노 입자는 후각 시스템의 개발 기간 동안 단일 생각을 가진 전사 인자 (심)을 대상으로 하였다. 전체 동물 해부 풀링 두뇌와 QRT-PCR 분석은 시뮬레이션 최저 뇌가 평균 47 % reducti에 있다고 표시나노 입자에 먹인 대조군 동물에 비해 SIM 사체 (P = 0.005 짝 t 테스트에 기초하여). 대한 시뮬레이션 수준에서 평균 77 % 감소에 공개 안테나와 필적 분석은 동물 (P = 0.002 쌍 t 테스트에 따라)를 제어-공급합니다. 조직과 동물 사이에 최저의 수준에 약간의 변화에도 불구하고, 심 성적은 두 개의 서로 다른 최저 siRNA를 (그림 5B2, B3, C2 중 하나를 사용하여 다음과 같은 치료 최저 동물의 뇌 / 안테나의 ≈50 %에 현장 하이브리드에 통해 검출되지 않았다, C3 대를 B1, C1, 표 2). 효모에 매료 된 사람들이 매료되지 않은 동물 0의 점수를 부여하는 동안, 하나의 점수를 수여 시뮬레이션 (430)에 대한 평균 점수 또는 SIM 된 동안 효모 행동 분석에서 718 넉다운 동물 SI했다두 복제 실험에서 제어 먹이 동물보다 gnificantly 낮은 (그림 5A, 쌍을 이루는 t 테스트를 기반으로 P &lt;0.001). 결함 냄새 추적 행동 감소 안테나의 시뮬레이션 수준 (그림 5B2, B1 대 B3)과 뇌 (그림 5C2와 관련 (그림 5A), C3는 C1 대, 노란색 점은 더듬이 엽의 경계를 표시; 표 참조 이 결과의 정량). 여러 결함이 안테나 및 시뮬레이션 최저 동물의 더듬이 엽에서 확인되었다 (참조 마이소르 등. 21 자세한 내용). 예를 들어, 시뮬레이션 최저 유충과 번데기는 ORCO, 후각 수용체 뉴런 (그림 6)의 모든 후각 수용체에 대한 공동 수용체 의무적 인 표현이 부족. 감소 ORCO의 성적 수준은 시뮬레이션 430 (이 공급 개인 검출되었다 </em&gt; 그림 6A3, B3) 또는 (그림 6A4가, B4) 최저 (KD) 키토산 /의 siRNA 나노 입자 (그림 6A1, B1 야생 형 동물에 비교도 6A2에 키토산 /의 siRNA 나노 입자 먹이 동물, B2)를 제어 718 SIM. L4 유충 (그림 6A1-A4)에서 관찰 ORCO 식 표현형의 손실은 번데기 형성 (그림 6B1-B4) 후 최소 24 시간을 통해 지속되었다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52523/52523fig5.jpg" /> 그림 5. 시뮬레이션 녹다운 유충 쇼 결함 냄새 유인 행위. 현장 하이브리드에서 안테나의 시뮬레이션 RNA의 감소 수준을 계시 (B2, B3)과 시뮬레이션의 두뇌 (C2, C3) (430)과 7 SIM효모 후각 유인 (A)에 응답하지 못했습니다 18 최저 동물 (위해 비교, B1에서 제어 - 공급 C1). 자세한 내용은 텍스트를 참조하십시오. 안테나의 기단부는 B1-B3 위쪽으로 지향하고 있습니다. 지느러미 C1-C3 상방 배향된다. 스케일 바는 25 μm의 =. 이 그림은 원래 마이소르 등 (21)에 출연했다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52523/52523fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/52523/52523fig6.jpg" /> 개발 A.에 ORCO 식의 그림 6. 손실 시뮬레이션의 최저 다음 aegypti 안테나. ORCO 성적 증명서의 감소 된 수준은 개인의 철 검출되었다시뮬레이션 430 (A3, B3) 또는 (718) SIM와 D (A4는, B4) 최저 (KD) 키토산 /의 siRNA 나노 입자 (B1, A1에서 야생 형 동물에 비교하고 A2에서 키토산 /의 siRNA 나노 입자 먹이 동물, B2를 제어). 자세한 내용은 텍스트를 참조하십시오. 스케일 바는 25 μm의 =. 이 그림은 마이소르 등 21 년에 출판 이미지에서 컴파일. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52523/52523fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="4"> 유치 </td><td colspan="4"> 유치하지 않음 </td></tr><tr><td> siRNA를 </td><td> N </td><td> # 동물 </td><td> 표준 </str옹&gt; </td><td> 보통 </td><td> 널 </td><td> # 동물 </td><td> 표준 </td><td> 보통 </td><td> 널 </td></tr><tr><td> 제어 </td><td> (195) </td><td> 196 (100 %) </td><td> 196 (100 %) </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> (430) KD를 심 </td><td> (176) </td><td> 63 (35 %) </td><td> 48 (76 %) </td><td> 15 (24 %) </td><td> 0 </td><td> 113 (64 %) </td><td> 20 (18 %) </td><td> 12 (11 %) </td><td> 81 (71 %) </td></tr><tr><td> 718 KD를 심 </td><td> 177 </td><td> 66 (37 %) </td><td> 44 (66 %) </td><td> 22 (34 %) </td><td> 0 </td><td> 111 (63 %) </td><td> 20 (18 %) </td><td> (9) (8 %) </td><td> 82 (74 %) </td></tr></tbody></table> 표 2. 레벨시뮬레이션의 s는 효모 행동 분석에서 애벌레의 성능과 상관 관계. 네 효모 후각 유인에서 얻어진 결과의 컴파일 요약 실험을 복제 표시됩니다. 동물 (N)의 총 수는 이러한 행동 분석에서 시험 하였다 개별 유충의 수를 나타낸다. 개별 유충의 수 끌렸다 (# 동물) (왼쪽, 효모 펠렛을 감동과 1의 점수를 얻고 동물 (); 효모 펠렛을 터치하지 않은 동물을 0의 점수를받은 오른쪽) 여부는 매력 각각의 조건 (제어, 430 KD를 SIM, 또는 718 KD 키토산을 SIM /의 siRNA 나노 입자 공급)이 표시되어, 총 동물의 비율은 원시 숫자 다음이 포함되어 있습니다. 시뮬레이션의 최저은 뇌에서 현장 하이브리드에 통해 평가되었다 동물의 안테나 (왼쪽) 매력 또는 효모 (오른쪽) 끌리지 않는.원시 번호 / (심 성적 수준을 야생형 비교) 일반 개인의 비율, 널 (관찰되지 심 성적 증명서), 또는 보통 (감소하지만 야생 타입) 시뮬레이션 레벨이 표시됩니다. 시뮬레이션의 손실은 효모에 인력의 부족과 상관 관계. 이 테이블은 원래 마이소르 등 (21)에 출연했다.

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Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

여기서 우리는 유충 섭취 RNA 나노 입자 / 키토산의 사용을 통해 질병 벡터 모기 유전자 기능을 억제 간섭하는 절차를 설명한다.

질병 벡터 모기 유충의 키토산 / 간섭 RNA 나노 입자 중재 유전자 음소거

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects ...

chitosaninterfering-rna-nanoparticle-mediated-gene-silencing-disease

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.3K 조회수.  Kansas State University.  여기서 우리는 유충 섭취 RNA 나노 입자 / 키토산의 사용을 통해 질병 벡터 모기 유전자 기능을 억제 간섭하는 절차를 설명한다. 

비디오: Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite.  The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite. The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

성인 모기 (A. gambiae)에서 RNAi의 Assays을위한 프로토콜

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

연구

생물학

Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran insects account for a number of economically substantial pests of plants that cause damage to crops by feeding on phloem sap. The brown marmorated stink bug (BMSB), Halyomorpha halys (Heteroptera: Pentatomidae) and the Asian citrus psyllid (ACP), Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae) are hemipteran insect pests introduced in North America, where they are an invasive agricultural pest of high-value specialty, row, and staple crops and citrus fruits, as well as a nuisance pest when they aggregate indoors. Insecticide resistance in many species has led to the development of alternate methods of pest management strategies. Double-stranded RNA (dsRNA)-mediated RNA interference (RNAi) is a gene silencing mechanism for functional genomic studies that has potential applications as a tool for the management of insect pests. Exogenously synthesized dsRNA or small interfering RNA (siRNA) can trigger highly efficient gene silencing through the degradation of endogenous RNA, which is homologous to that presented. Effective and environmental use of RNAi as molecular biopesticides for biocontrol of hemipteran insects requires the in vivo delivery of dsRNAs through feeding. Here we demonstrate methods for delivery of dsRNA to insects: loading of dsRNA into green beans by immersion, and absorbing of gene-specific dsRNA with oral delivery through ingestion. We have also outlined non-transgenic plant delivery approaches using foliar sprays, root drench, trunk injections as well as clay granules, all of which may be essential for sustained release of dsRNA. Efficient delivery by orally ingested dsRNA was confirmed as an effective dosage to induce a significant decrease in expression of targeted genes, such as juvenile hormone acid O-methyltransferase (JHAMT) and vitellogenin (Vg). These innovative methods represent strategies for delivery of dsRNA to use in crop protection and overcome environmental challenges for pest management.

This article demonstrates novel techniques developed for oral delivery of double-stranded RNA (dsRNA) through the vascular tissues of plants for RNA interference (RNAi) in phloem sap feeding insects.

체 관 부 식물 수액 공급 Hemipteran 곤충에 RNA 간섭을 유도 하 이중 가닥 RNA 구두 전달 방법

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran ...

환경과학

Reproducible dsRNA Microinjection and Oviposition Bioassay in Mosquitoes and House Flies

Synthetic dsRNAs, used to induce RNA interference, may have dose dependent phenotypic effects. These effects are difficult to define if the dsRNAs are delivered using a non-quantitative method. Accurate delivery of known quantities of nucleic acids or other chemicals is critical to measure the efficacy of the compound being tested and to allow reliable comparison between compounds.
Here we provide a reproducible, quantitative microinjection protocol that ensures accurate delivery of specific doses of dsRNA, reducing the mortality typically induced by injection injury. These modifications include the addition of Rhodamine B, a graduated injection needle, and an improved recovery method borrowed from Isoe and Collins. This method allows calculation of dose responses and facilitates comparisons between compounds. Versions of this method have been successfully used on three genera of mosquitoes as well as house flies to assess the reduction in fecundity resulting from gene silencing of ribosomal RNA transcripts.
This protocol provides strategies to reduce several challenges of small insect microinjection. Together, mechanical delivery of dsRNAs accompanied by visual verification, identification of effective locations for delivery, and inclusion of a post-injection recovery period ensure accurate dosing and low injury mortality. This protocol also describes an oviposition bioassay for uniform determination of effects on fecundity.

This protocol describes a microinjection methodology that we have standardized and used for several years to deliver specific quantities of nucleic acids directly to the hemolymph of mosquitoes and house flies. This protocol results in minimal injection mortality and allows dose correlated measurements of fecundity.

재현할 수 dsRNA Microinjection 및 산란 검정 집 파리 모기에

Synthetic dsRNAs, used to induce RNA interference, may have dose dependent phenotypic effects. These effects are difficult to define if the dsRNAs are ...

Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method requires a more technically demanding operation and involves complicated procedures, especially when used in larvae due to their small size, relatively thin and fragile cuticle, and high mortality, which limit its application. In contrast, viral vectors for gene delivery have been developed to surmount extracellular and intracellular barriers. These systems have the advantages of easy manipulation, high gene transduction efficiency, long-term maintenance of gene expression, and the ability to produce persistent effects in vivo. Mosquito densoviruses (MDVs) are mosquito-specific, small single-stranded DNA viruses that can effectively deliver foreign nucleic acids into mosquito cells; however, the replacement or insertion of foreign genes to create recombinant viruses typically causes a loss of packaging and/or replication abilities, which is a barrier to the development of these viruses as delivery vectors.
Herein, we report using an artificial intronic small-RNA expression strategy to develop a non-defective recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo delivery system. Detailed procedures for the construction, packaging and quantitative analysis of the rAaeDV vectors, and for larval infection are described.
This study demonstrates, for the first time, the feasibility of developing a non-defective recombinant MDV micro RNA (miRNA) expression system, and thus providing a powerful tool for the functional analysis of genes in mosquito and establishing a basis for the application of viral paratransgenesis for controlling mosquito-borne diseases. We demonstrated that Aedes albopictus 1st instar larvae could be easily and effectively infected by introducing the virus into the water body of the larvae breeding site and that the developed rAaeDVs could be used to overexpress or knock down the expression of a specific target gene in larvae, providing a tool for the functional analysis of mosquito genes.

We report using an artificial intronic small RNA expression strategy to develop a non-defective recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo delivery system. A detailed procedure for the construction, packaging, and quantitative analysis of the rAaeDV vectors as well as for larval infection is described.

모기 유 충에서 유전자의 기능 분석에 대 한 유전자 납품 벡터로 재조합 모기 Densovirus의 사용

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method ...

발생학

RNA Interference in Aquatic Beetles as a Powerful Tool for Manipulating Gene Expression at Specific Developmental Time Points

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is applicable to a wide variety of organisms and is highly efficient in the species-rich order Coleoptera (beetles). Here, we summarize the necessary steps for developing this technique in a novel organism and illustrate its application to the different developmental stages of the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus. Target gene sequences can be obtained cost-effectively through the assembly of transcriptomes against a close relative with known genomics or de novo. Candidate gene cloning utilizes a specific cloning vector (the pCR4-TOPO plasmid), which allows the synthesis of double-stranded RNA (dsRNA) for any gene with the use of a single common primer. The synthesized dsRNA can be injected into either embryos for early developmental processes or larvae for later developmental processes. We then illustrate how RNAi can be injected into aquatic larvae using immobilization in agarose. To demonstrate the technique, we provide several examples of RNAi experiments, generating specific knockdowns with predicted phenotypes. Specifically, RNAi for the tanning gene laccase2 leads to cuticle lightening in both larvae and adults, and RNAi for the eye pigmentation gene white produces a lightening/lack of pigmentation in eye tubes. In addition, the knockdown of a key lens protein leads to larvae with optical deficiencies and a reduced ability to hunt prey. Combined, these results exemplify the power of RNAi as a tool for investigating both morphological patterning and behavioral traits in organisms with only transcriptomic databases.

RNA interference is a widely applicable, powerful technique for manipulating gene expression at specific developmental stages. Here, we describe the necessary steps for implementing this technique in the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus, from the acquisition of gene sequences to the knockdown of genes that affect structure or behavior.

특정 발달 시점에서 유전자 발현을 조작하기 위한 강력한 도구로 수생 딱정벌레의 RNA 간섭

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is ...

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion rate. This method can be used to obtain a better understanding of the process of diuresis in insects and is especially useful in the study of diuresis in blood-feeding arthropods that are able to take up huge amounts of liquid in a single blood meal. 
This RNAi-mediated gene knockdown combined with an in vivo diuresis assay was developed by the Hansen lab to study the effects of RNAi-mediated knockdown of aquaporin genes on Aedes aegypti mosquito diuresis1. 
The protocol is setup in two parts: the first demonstration illustrates how to construct a simple mosquito injection device and how to prepare and inject dsRNA into the thorax of mosquitoes for RNAi-mediated gene knockdown. The second demonstration illustrates how to determine excretion rates in mosquitoes using an in vivo bioassay.

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

In this protocol we combine RNAi-mediated gene silencing with an in vivo diuresis assay to study the effects knockdown of genes of interest has on mosquito fluid excretion.

RNAi - 중재 유전자 최저 및<em&gt; VIVO에서</em성인 여자의&gt; 이뇨 분석<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; 모기

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory for functional genomic studies. The ability to knockdown individual genes selectively via this reverse genetic technique has allowed many researchers to rapidly uncover the biological roles of numerous genes within many organisms, by evaluation of loss-of-function phenotypes. In the major human malaria vector Anopheles gambiae, the predominant method used to reduce the function of targeted genes involves injection of double-stranded (dsRNA) into the hemocoel of the adult mosquito. While this method has been successful, gene knockdown in adults excludes the functional assessment of genes that are expressed and potentially play roles during pre-adult stages, as well as genes that are expressed in limited numbers of cells in adult mosquitoes. We describe a method for the injection of Serine Protease Inhibitor 2 (SRPN2) dsRNA during the early pupal stage and validate SRPN2 protein knockdown by observing decreased target protein levels and the formation of melanotic pseudo-tumors in SRPN2 knockdown adult mosquitoes. This evident phenotype has been described previously for adult stage knockdown of SRPN2 function, and we have recapitulated this adult phenotype by SRPN2 knockdown initiated during pupal development. When used in conjunction with a dye-labeled dsRNA solution, this technique enables easy visualization by simple light microscopy of injection quality and distribution of dsRNA in the hemocoel.

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.

에 RNAi의 트리거 배달<em&gt; 아노 펠 레스 gambiae</em&gt; 번데기

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory ...

Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool operating by disruption of essential gene expression. Although different methods, such as injection, feeding, and soaking, have been reported for successful delivery of double-stranded RNA (dsRNA), the efficiency of RNAi through oral delivery of dsRNA is highly variable among different insect groups. The German cockroach, Blattella germanica, is highly sensitive to the injection of dsRNA, as shown by many studies published previously. The present study describes a method to demonstrate that the dsRNA encapsulated with liposome carriers is sufficient to retard the degradation of dsRNA by midgut juice. Notably, the continuous feeding of dsRNA encapsulated by liposomes significantly reduces the tubulin expression in the midgut, and led to the death of cockroaches. In conclusion, the formulation and utilization of dsRNA lipoplexes, which protect dsRNA against nucleases, could be a practical use of RNAi for insect pest control in the future.

This manuscript demonstrates the depletion of gene expression in the midgut of the German cockroach through oral ingestion of double-stranded RNA encapsulated in liposomes.

RNA 방해의 실용적인 사용: Liposome 캐리어 바퀴벌레에 대 한 이중 가닥 RNA의 구두 납품

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool ...

Effective Oral RNA Interference (RNAi) Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) administration has been accomplished primarily via injection, which requires significant time and is not suitable for field applications. To overcome these limitations, here we present a more efficient method for robust activation of RNAi by oral delivery of dsRNA to adult Anopheles gambiae. Long dsRNAs were produced in Escherichia coli strain HT115 (DE3), and a concentrated suspension of heat-killed dsRNA-containing bacteria in 10% sucrose was offered on cotton balls ad-libitum to adult mosquitoes. Cotton balls were replaced every 2 days for the duration of the treatment. Use of this method to target doublesex (a gene involved in sex differentiation) or fork head (which encodes a salivary gland transcription factor) resulted in reduced target gene expression and/or protein immunofluorescence signal, as measured by quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) or fluorescence confocal microscopy, respectively. Defects in salivary gland morphology were also observed. This highly flexible, user-friendly, low-cost, time-efficient method of dsRNA delivery could be broadly applicable to target genes important for insect vector physiology and beyond.

Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

The oral administration of dsRNA produced by bacteria, a delivery method for RNA interference (RNAi) that is routinely used in Caenorhabditis elegans, was successfully applied here to adult mosquitoes. Our method allows for robust reverse genetics studies and transmission-blocking vector studies without the use of injection.

성인 Anopheles 감비아 모기에 효과적인 경구 RNA 간섭 (RNAi) 투여

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) ...

<meta charset="utf8"></head><body>누에 유충의 유전자 침묵을 위한 나노입자 매개 dsRNA 섭식

Larval RNA Interference in Silkworm Bombyx mori through Chitosan/dsRNA Nanoparticle Delivery

The silkworm, Bombyx mori, is an important economic insect with thousands of years of history in China. Meanwhile, the silkworm is the model insect of Lepidoptera with a good accumulation of basic research. It is also the first insect in Lepidoptera with its complete genome sequenced and assembled, which provides a solid foundation for gene functional study. Although RNA interference (RNAi) is widely used in reverse gene functional study, it is refractory in silkworms and other Lepidopteran species. Previous successful RNAi-related research to deliver double-stranded RNA (dsRNA) was performed through injection only. Delivery of dsRNA through feeding is never reported. In this article, we describe step-by-step procedures to prepare the chitosan/dsRNA nanoparticles, which are fed to the silkworm larvae by ingestion. The protocol includes (i) selection of the proper stage of silkworm larvae, (ii) synthesis of dsRNA, (iii) preparation of the chitosan/dsRNA nanoparticles, and (iv) feeding the silkworm larvae with chitosan/dsRNA nanoparticles. Representative results, including gene transcript confirmation and phenotype observation, are presented. dsRNA feeding is a simple technique for RNAi in silkworm larvae. Since silkworm larvae are easy to rear and large enough to operate, it provides a good model to demonstrate larval RNAi in insects. In addition, the simplicity of this technique stimulates more student involvement in research, making silkworm larvae an ideal genetic system for use in a classroom setting.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 키토산 나노입자 공급을 통한 dsRNA 전달을 이용한 누에의 유전자 침묵 연구 발전

Presented here is a protocol for chitosan/dsRNA nanoparticle delivery in silkworm Bombyx mori larvae to induce gene silencing through ingestion.

키토산/dsRNA 나노입자 전달을 통한 누에 Bombyx mori 의 유충 RNA 간섭

The silkworm, Bombyx mori, is an important economic insect with thousands of years of history in China. Meanwhile, the silkworm is the model insect of ...

질병 벡터 모기 유충의 키토산 / 간섭 RNA 나노 입자 중재 유전자 음소거

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