Name: the use of the ex vivo chandler loop apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits
Uploaded: 2014-08-20T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
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recCD47 1. 수정 고분자 표면 NOTE :. 프로토콜은도 1에 개략적으로 요약은도 1a는 티올 반응성 중합체 표면의 생성을 도시 한도 1b는 티올 반응성 recCD47의 생성을 도시한다.. <ol><li> 1 일 <ol><li> 멸균 수에 PDT-BzPh의 용액 (1 ㎎ / ㎖)과 탄산 수소 칼륨 (KHCO 3) (0.7 ㎎ / ㎖)을 준비한다. 4 ° C (빛으로부터 보호)에서 밤새 교반한다. </li></ol></li><li> 2 일 <ol><li> (회전 바퀴 주위에 맞게 충분히) 40cm 길이의 조각으로 고분자 튜브를 잘라. </li><li> 통이나 챈들러 루프 장치에 실온에서 90 분 동안 hexacylpyridinium의 0.1 % 수용액에 튜브를 만끽. 90 분 담근 후 멸균 수의 3 배와 튜브를 씻어. </li><li> (15 % 수성 칼륨 인산을 첨가하여 1 일부터 PDT-BzPh의 용액을 산성화 KH 2 </suB&gt; PO 4). 흐린 미셀 솔루션을 형성 PDT-BzPh의 ML 당 50 μL KH 2 PO 4를 추가합니다. </li><li> 진탕 또는 장치 상에 실온에서 40 분 동안 산성화 PDT-BzPh 용액 튜브를 담근다. </li><li> 한 번 : 묽은 초산 (1000 일)와 튜브를 씻어. </li><li> 60 분의 전체 지속 시간 동안 UV 조사에 튜브를 노출. 전체 면적을 조사하기 위해 15 분마다 차례 ¼ 튜브를 회전합니다. </li><li> 쉐이커 또는 장치에 실온에서 20 분 동안 20 ㎎ / ㎖의 탄산 칼륨의 수용액 (KHCO 3)에서 튜브를 담근다. </li><li> 멸균 수에 4 ° C에서 멸균의 3 배 및 저장소와 튜브를 씻어. </li></ol></li><li> 3 일 <ol><li> (: 흄 후드에서 수행주의) 200 ㎕의 디메틸 포름 아미드 (DMF)에 5 mg의 설포-SMCC을 녹인다. </li><li> recCD47 폴리 라이신 용액을 0.1 ㎎ / ㎖에 1 단계에서 제조 된 설포-SMCC 용액 50 μl를 추가하고, RO에서 60 분 동안 교반톰 온도. </li><li> 60 분 교반하는 동안, 가스 제거는 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수 (DPBS)와 따로 멸균. </li><li> 정화 설포-SMCC는 제조업체의 지침에 따라 7K 분자량 컷 - 오프 스핀 탈염 컬럼을 사용하여 recCD47을 반응. 최종 관류 (고품질 티올 반응성 recCD47)를 모아서 코트 DPBS와 관의 내부에 필요한 볼륨으로 희석한다. </li><li> 멸균과 일이에서 튜브를 씻어 DPBS 배는 탈기. </li><li> 이하 2 분간 탈기 DPBS 20 ㎎ / ㎖와 트리스 (2 - 카르복시 에틸) 포스 핀 히드로 클로라이드 (TCEP)의 용액으로 튜브의 표면 개질 반응. 멸균 탈기 DPBS 배와 튜브를 씻어. </li><li> 튜브에 설포-SMCC-반응 recCD47를 추가하고 통 또는 장치에 4 ° C에서 하룻밤 배양한다. </li></ol></li></ol> 수정 된 표면에 recCD47의 2 면역 정량 <ol><li> 수정 된 튜브를 씻어하는 3 일 기지에서 정량시간 DPBS 배. 저장 튜브는 4 ° C에서 DPBS에 정량을 사용하지. </li><li> 96 웰 플레이트의 우물에서 생검 펀치를 중복 튜브 샘플을 만들 수 및 배치 4mm 생검 펀치를 사용합니다. </li><li> 검출 항체로 처리하지 변성 샘플 튜브로 이루어지는 음성 대조군을 준비한다. 검출 항체 처리 변성 샘플 튜브로 이루어진 항체 제어를 준비한다. 검출 항체 처리 변성 튜브 시험 샘플을 준비한다. </li><li> 진탕 기에서 실온에서 60 분 동안 DPBS에서 0.4 % 소 혈청 알부민 (BSA)으로 차단 샘플. </li><li> 차단 대기음 BSA 트리스 완충 식염수 플러스 1 % 트윈 20 (TBST) 3 배, 통에 10 분 각 씻어 후. </li><li> 면역에 대한 제조업체의 권장 희석에 따라 0.4 %의 BSA에 항체의 희석 작업을 준비합니다. 인간 CD47 항체 B6H12-FITC 일을 희석 : (100) 0.4 %의 BSA에. </li><li> 적절한 우물에 항체 희석 200 μl를 추가합니다. Incuba0.4 %의 BSA 만과 테 부정적인 제어합니다. 쉐이커에 60 분 (빛으로부터 보호)을 실온에서 품어. </li><li> TBST 배, 10 분 쉐이커 각 씻어. 마지막 TBST 린스를 대기음 및 튜브 샘플 웰에 200 μL의 DPBS를 추가합니다. </li><li> 최종 관류 고품질 티올 반응성 재조합 CD47이다 모아서 코트 DPBS와 튜브의 내부에 필요한 양으로 희석한다. </li><li> FITC 여기 (485 나노 미터) 및 배출 (538 나노 미터) 설정을 사용하여 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 FITC 신호 강도를 읽으십시오. </li><li> 계산 recCD47 자동 형광 및 비특이적 항체는 대조 샘플에서 바인딩 차지 표준 값을 기초로 중합체 표면에 결합. </li></ol> 3 챈들러 루프 장치 프로토콜 혈액 수집 프로토콜의 임상 시험 심사위원회 (IRB) 승인 및 동의서 서류 이전에 인간의 혈액 샘플 수집을 시작하기를 추구합니다. 정보를 얻rmed 인간의 혈액 기증자의 동의. 참고 : 장치를 묘사 한 그림이 그림 2에 나타나있다. <ol><li> 약 2 직경 바퀴의 때까지 증류수로 수조를 작성하는 침수된다. 10 % 표백제 솔루션을 만들기 위해 물을 욕조에 충분히 표백제를 추가합니다. 설정 물 37 ° C에 욕조와 온도가 평형을 할 수 있습니다. </li><li> 금속 (도 1b에 도시) 어댑터, 미 변성 및 변성 튜브 튜브를 수집하고,도 1c에 도시 된 바와 같이, 장치를 바퀴 주위에 조립한다. 그 튜브가 제자리에 금속 어댑터 바퀴 snuggly 주위에 적합해야합니다. </li><li> 구연산이나 다른 항응고제의 2 ㎖로 채워져 유리 병에, IRB 승인 프로토콜을 사용하여 30 ml의 혈액 샘플을 확보하고, 시료가 수집 된 후 응고 방지하기 위해 반전으로 섞는다. </li><li> 튜브에 약간의 공기를 떠나, 금속 밸브와 주사기를 사용하여 각 튜브에 혈액의 약 10 ML을 추가합니다. 밸브 캡과 연구를 고정3 시간 동안 otate. </li><li> 10 % 표백제 용액으로 처리 폐기물 비커에 혈액을 배출 (또는 기관 정책 필요). </li><li> 부드럽게 혈액의 모든 흔적을 제거하는 DPBS와 튜브 내부를 씻어. 흐름을 통해 폐기물 비커를 수집합니다. 기관의 정책에 따라 혈액 폐기하십시오. </li><li> 장치 및 표면 10 % 표백제 용액을 사용하거나 기관 방침에 따라 접촉하는 혈액 소독. </li><li> 형광 현미경 또는 주사 전자 현미경을위한 프로세스 샘플 후술. </li></ol> 4 형광 현미경과 세포 계수 <ol><li> 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 용액 (주의 : 흄 후드에서 수행)을 준비. </li><li> 4 ° C에서 하룻밤 4 % PFA 용액에 튜브를 품어. </li><li> 하룻밤 배양 후, 4 % PFA를 제거하고 DPBS 매우 부드럽게 영화를 씻어. </li><li> 염색에 대한 루멘 표면을 노출하는 섹션으로 튜브를 잘라. </li><li> 얼룩실온에서 30 분 동안 4 &#39;, 6-diamidino-2-페닐 인돌 (DAPI)로 미디어를 장착 몇 방울의 튜브 섹션 (광으로부터 보호). 염색 후, DAPI 배경 신호를 감소시키기 DPBS로 매우 조심스럽게 튜브를 헹군다. </li><li> DAPI 필터 및 디지털 카메라가 장착 된 형광 현미경을 사용하는 이미지 200X 배율 하에서 뷰 9 맹목적 선택된 분야에서 세포의 수를 계산한다. </li><li> 기록 셀은 시야 당 계산 및 결과의 통계적 유의성을 결정하기 위해 적절한 통계 분석을 수행합니다. </li></ol> (5) 주사 전자 현미경 <ol><li> 2 % 글루 타르 알데히드 용액 (주의 : 흄 후드에서 수행) 준비합니다. </li><li> 밤새 4 ° C에서 2 % 글루 타르 알데히드 용액 튜브를 품어. </li><li> 하룻밤 배양 후, 부드럽게 DPBS와 함께 호스의 3 배를 씻어. </li><li> 산화 오스뮴의 1 % 용액을 준비합니다 (주의 : 심각한 흡입 위험! ) 흄 후드에서 사용합니다. </li><li> 실온에서 15 분 동안 산화 오스뮴의 1 % 용액에서 배양 튜브. </li><li> 부드럽게 DPBS와 함께 호스의 3 배를 씻어. </li><li> 에탄올 농도의 시리즈 (25 %, 50 %, 75 %, 95 %, 100 % 에탄올)을 준비한다. </li><li> 에탄올 농도의 일련의 인큐베이션 튜브 탈수. 25 %, 50 %, 75 %, 20 분마다 95 % 에탄올에서 배양한다. 30 분 동안 100 % 에탄올에서 배양한다. </li><li> 초 임계 점은 모든 수분을 제거하고 45 분 동안 CO 2와 함께 호스를 건조. </li><li> 페이스트 또는 흑연 표본 스텁에 마운트 튜브 섹션. </li><li> 금 - 팔라듐의 12.5 nm의 코트 튜브 섹션. </li><li> 주사 전자 현미경으로 조사한다. </li></ol>

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이 책에서보고 된 연구는 국가의 수상 번호 T32 HL007915 (JBS와 RJL)에서 수상 번호 R21 EB015612 (SJS) 및 국립 심장, 폐, 혈액 연구소에서 바이오 메디컬 이미징 및 생물의 국립 연구소에 의해 지원되었다 건강 연구소.

(그림 1에 요약) photoactivation의 화학에 대한 PDT-BzPh 첨부 및 후속 UV 조사 용이하게하기 위해 충분한 탄화수소가 거의 모든 고분자 표면의 수정을 허용 PDT-BzPh을 사진을 활성화. 반응성 티올 그룹과 고분자 표면을 기능화하는 것은 관심의 검증 가능한 분자의 범위의 후속 첨부 할 수 있습니다. 우리의 특정 연구에서 우리는 재조합 CD47 11 ~ 13을 선택했다. 우리는 이관 능성 가교 링커 SMCC 11-13와 단백질의 아민 기의 반응에 관여 사용 된 특정 공액 화학. 이렇게 티올 화 중합체 표면과 후속 반응에 티올 반응성 recCD47 제공. 최종 생성물은 중합체에 공유 결합 recCD47 모노 설파이드 결합이었다. CD47의 아미노산 중 아민 기가 반응에 사용되지 않았 음을 확인시켜 효능을 완화하는 데 도움고정화 CD47, 우리는 상기 단백질의 C-말단에 폴리 리신 태그를 삽입함으로써 수정 recCD47. 유사한 분자량이 다른 단백질 전략이 적용될 수 있음이 가능하다. 따라서 공액은 여기에 제시된 화학 및 다른 곳에서 11-13 합성 표면에 생체 적합성을 부여하기위한 잠재적 치료 분자의 능력을 평가하는 중요한 기회를 제공한다. 이 프로토콜에 대한 단점은 UV 조사의 연장 된 기간에 폴리 우레탄과 같은 고분자의 특정 유형, 노출하면 변색 될 수 있다는 것입니다. 이것은 PDT-BzPh photoactivati​​on의 방해없이 중합체의 변색을 방지하기 위해 (일반적으로 조직 배양에 사용 된) 폴리스티렌 접시에 중합체를 위치시킴으로써 회피 될 수있다. 이 프로토콜에서 사용되는 UV 광의 파장은 302 ㎚이다; 이 파장에서 편차는 PDT-BzPh의 비효율적 사진 활성화 될 수 있습니다. 다른 파장을 사용하는 경우UV 광은, UV 노출 시간의 최적화는 상당한 광 활성화를 보장 할 필요가있다. 이 프로토콜을 수행하면 이물 반응을 방지하기 위해 폴리머 표면에 면역 회피 및 반송 &quot;자기&quot;상태의 목적을 위해, 중합체 표면에 recCD47의 부착을 허용한다. 표면에 추가 recCD47 정량은 면역 형광 현미경 (도 3)를 이용하여 CD47의 IG 도메인으로 FITC 표지 된 항체를 사용하여 완성된다. 이 방법은 항체의 가용성을 가정 고분자 표면에 첨부 된 다른 단백질에 적용 할 수 있습니다. recCD47 (또는 다른 단백질)의 상당한 부속물을 얻기 실패 PDT-BzPh을 photoactivate 실패, 중합체 표면에 충분한 여유 탄화수소, 고분자 표면의 소수성을 포함 인해 다양한 요인으로되거나, 중합체가 너무 두꺼워 지거나 빛이 충분한 quantific에 통과 할 수 있도록 불투명ation. 이러한 모든 변수들은 실험적 테스트를 특정 중합체에 대해 최적화 될 수있다. 챈들러 루프 장치는 중합체 표면 전체 인간 혈액 노출의 생체 외 분석을위한 유일한 도구이다. 이 시스템은 밀접 혈액 접촉면과 연관된 많은 생리적 끝점의 분석을 가능하게 다양한 의료 절차에 사용되는 임상 적 혈액 도관을 통해 혈액의 관류를 닮았다. 고분자 표면에 recCD47의 부속물 생리 종점으로, DAPI 염색 (도 4) 및 주사 전자 현미경 (도 5)를 이용하여 세포 수를 사용 하였다. 다른 엔드 포인트는 또한 예를 들어, 세포 수 및 중합체 전에 혈액 도관을 통해 혈액 관류 후도 사용될 수, 장비 이용 가능성에 따라, 사용될 수있다. 에 관계없이, recCD47가 수정 된 표면은 수정되지 않은 제어 표면에 비해 훨씬 적은 부착 된 세포를 보였다. 이러한 다TA는 recCD47이 고분자 표면에 생체 적합성을 전달하고 잠재적으로 고분자 혈액 도관을 사용하여 임상 절차 FBR을 방지하기 위해 사용 될 수있을 것으로 내다보고있다. 이것은 널리 혈액 관류 연구 시험 관내 모델에서 사용되지만, 그것은 어떤면에서 제한적이다. 이 방법의 두 가지 주요 단점은 혈액 샘플 튜브에 공기를 포함하도록 요구로부터 발생한다. 공기와 잦은 혈액 상호 작용은 특정 엔드 포인트에 방해가 될 수 백혈구 및 혈소판 응집과 단백질 변성 16-18가 발생할 수 있습니다. 둘째, 공기가 혈액 순환 (19)의 속도를 제한하는, 회로의 가장 높은 지점에 남아있다. 이러한 방법의 명백한 한계에도 불구하고, 19 경쟁 방식보다 적은 혈액의 손상을 유도하고 중합체 혈액 도관에 잠재적 생체 분자의 생체 적합성을 선별하는 방법으로서 역할을한다. 후보 생체 분자를 통해 확인되면이 방법은, 상기 분석은 생체 내 동물 모델을 통해 얻을 수있다. 궁극적으로, 개질 중합체의 생체 적합성은 생체 내 모델 시스템을 이용하여 적합한 확인 될 필요가있다.

그러한 체외 순환 및 신장 투석과 같은 많은 임상 절차, 중합체 혈액 도관의 사용을 필요로하고 종종 시술 후 합병증 1과 연관된다. 혈액 관류 할 때,이 폴리머는 혈액 단백질 및 혈소판, 단핵구 / 대식 세포 접착의 흡착 결과, 이물 반응 (FBR)를 이끌어 낼, 그리고 할 시술 후 합병증에 기여 모두 염증성 사이토 카인의 방출 / 또는 장치 고장 2,3. 따라서, 이러한 문제를 해결하기위한 전략은 생체 재료 연구의 중요한 영역 및 지속적인 유지. 연구자들은 생리 활성 또는 생체 불활성 분자 4-6 혈액 접촉면을 수정하여이 문제를 해결하려고했습니다. 우리의 실험실에서 연구는 FBR을 완화하고 이들 물질의 효능을 증가시키기위한 전략으로 고분자 생체 재료에 재조합 CD47 (recCD47를) 추가에 초점을 맞추고있다. CD47는 재하 표현 transmembr입니다세포 7-10와 쇼를 표현하는시의 면역 회피의 알려진 역할 부여 &quot;자기&quot;상태 메탄 단백질은 고분자 표면에 11 ~ 13에 추가 할 때 생체 적합성을 부여에 약속드립니다. 신호 규제 단백질 알파 (SIRPα), CD47에 대한 동족 수용체 및 횡단 단백질의 가족을 함유 면역 수용체 티로신 기반의 억제 모티프 (ITIM)의 회원은 골수 기원 (14)의 세포에 표현된다. 우리는 이전에 CD47가 SIRPα 매개 세포 신호를 통해, 생체 외, 생체 ​​폴리 우레탄 (PU)와 폴리 염화 비닐 (PVC)에 대한 면역 반응을 하향 조정하고 생체 내 모델 11-13에 있음을 증명하고있다. 우리의 조사에 중앙 화학적으로 반응성 티올 그룹이 공유 다기능 고분자 (PDT-의 BZ와 튜브를 반응시켜 고분자 튜브에 추가되는 여기에 설명 된 비교적 새로운 photoactivati​​on 화학은있다2 - 피리 딜 디티 오 (PDT)로 이루어지는) 액, 광 반응성 페논 (BzPh) 및 카르복시 변성 폴리 알릴 11-13. 트리스 함께 공유 첨부 PDT기를 환원 (2 - 카르복시 에틸) 포스 핀 히드로 클로라이드 (TCEP)는 11 일 이후 일 수 티올 표면은 치료 잔기와 반응하여 산출한다. 본원 이전 상세한 12,13, 상기 C-말단 폴리 - 리신 12,13 꼬리의 첨가로 개질 recCD47는, Sulfosuccinimidyl - 4 - [N -maleimidomethyl] 시클로 헥산 카르 복실 레이트 1과 반응 (술포-SMCC) 1 시간 동안 튜브 (11) 사이 및 recCD47 우람 모노 설파이드 결합 형성을 허용 티올 반응성기를 생성한다. CD47의 표면 기능화 항염증제 용량은 원래 응고 혈전 (15)의 시험 관내 모델로서 1958 년에 설명 된 전체 인간 혈액과 챈들러 루프 장치를 이용하여, 전 비브 O, 시험 하였다. 장치에 의존밀폐 된 튜브 시스템은 부분적으로 공기 튜브 (15)를 통해 혈액을 순환하는 회전 모터 가득합니다. 이 실험 모델 수정 및 표면 개질시 혈액 노출의 효과뿐만 아니라, 혈액 세포의 생리학에 따라 그 표면 변형의 영향을 조사 할 수있는 기회를 제공한다. recCD47이 photoactivation 화학을 사용하여 중합체의 다양한 표면에 추가 될 수 있고, 그것의 항 염증 능력은 중합체 표면 (11, 12)를 통해 혈류를 흉내 임상 적으로 중요한 생체 모델을 이용하여 평가 될 수있다. 장치에서 인간의 혈액에 노출되었을 때 변성 중합체에 비해 recCD47 변성 임상 등급의 혈액 도관은 상당히 적은 혈소판과 염증 세포 부착을 보여준다. 본 변형 과정의 단계별 설명은 아래에 자세히 설명된다.

<table><tbody><tr><td>16% Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Thermo Scientific</td><td>58906</td><td>Caution! Use in fume hood</td></tr><tr><td>25% Glutaraldehyde</td><td>VWR</td><td>AAA17876-AP&amp;nbsp;</td><td>Caution! Use in fume hood</td></tr><tr><td>2-pyridyldithio,benzophenone (PDT-BzPH)</td><td>Synthesized in lab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A3059-100G</td><td></td></tr><tr><td>Citrate</td><td>Sigma</td><td>S5770-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Digital Camera</td><td>Leica</td><td>DC500</td><td>Out of production</td></tr><tr><td>Dimethylformamide (DMF)</td><td>Sigma</td><td>270547-100ML</td><td>Caution! Use in fume hood</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent Microscope</td><td>Nikon</td><td>TE300</td><td></td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-212</td><td>Caution! Use in fume hood</td></tr><tr><td>Human CD47 (B6H12) &amp;ndash; FITC Antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-12730</td><td></td></tr><tr><td>Osmium Tetroxide</td><td>Acros Organics</td><td>197450050</td><td>Caution! Use in fume hood</td></tr><tr><td>Potassium Bicarbonate (KHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>237205-100G</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Monobasic (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>P5655-100G</td><td></td></tr><tr><td>PVC Tubing (Cardiovascular Procedure Kit)</td><td>Terumo Cardiovascular Systems</td><td>60050</td><td>Most clinical-grade tubing will work</td></tr><tr><td>Scanning Electron Microscope</td><td>JEOL</td><td>JSM-T330A</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>Molecular Devices</td><td>Spectramax Gemini EM&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SMCC</td><td>Sigma</td><td>M6035-10MG</td><td>Moisture Sensitive!</td></tr><tr><td>tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP-HCl)</td><td>Thermo Scientific</td><td>20491</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6531</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield with DAPI</td><td>Fisher Scientific</td><td>H-1200</td><td>Light sensitive!</td></tr><tr><td>Zeba Spin Desalt Columns &amp;ndash; 7 K MWCO</td><td>Thermo Scientific</td><td>89891</td><td></td></tr></tbody></table>

the use of the ex vivo chandler loop apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits

합성 체 표면에 도입 될 때 이물 반응이 일어난다. 이 시술 후 합병증으로 이어지는, 혈액 단백질의 흡착 및 혈소판의 후속 부착 및 활성화, 단핵구 / 대 식세포 접착 및 염증 세포의 신호 이벤트에 의해 특징입니다. 챈들러 루프 장치 연구자들은 혈액의 많은 양이 고분자 도관을 통해 관류 때 발생하는 분자 및 세포의 상호 작용을 연구 할 수있는 실험 시스템입니다. 이를 위해, 본 장치는 다양한 중합체 표면 변형 항염의 평가를 허용하는 생체 외 모델로 사용되고있다. 우리 연구실은 공유 재조합 CD47와 photoactivati​​on 화학을 통해 수정 된 혈액 도관, 고분자 표면에 생체 적합성을 부여 할 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 고분자 표면에 CD47를 추가하는 것은 중합체 혈액 도관 효능을 촉진 할 수있는 효과적인 수단이 될 수있다. 그녀의EIN은 CD47 변성 및 제어 도관과 혈액의 상호 작용을 조사하는 임상 적으로 중요한 중합체 혈액 도관 및 생체 외 실험 모델로서 챈들러 루프의 사용 재조합 CD47을 추가하는 데 사용 photoactivation 화학 디테일 방법론이다.

SMCC를 사용하여 티올 - 반응성 recCD47 폴리 리신과 함께 PDT-BzPh 및 TCEP를 사용하여 티올 - 반응성 중합체 표면을 생성하는 것은 중합체 recCD47 표면에의 부착을 허용한다. 개질 방법은도 1에 개략적으로 요약된다. 본 변형 공정의 편의성이 단백질을 가정 할 아민 - 함유 리신과 같은 충분한 화학적 반응성기로 변성 될 수 있으며, 다양한 단백질 및 다양한 중합체 표면에인가 될 수 있다는 것이다 중합체 것이 충분히 가능한 탄화수소를 갖는다. 그것은 recCD47이 프로토콜을 이용하여 11-13 중합체 표면에 부가 될 수 있음을 이전에 입증되었다. 도 3a에 도시 된 바와 같이, 상당한 FITC 염색 DIC 촬상에 의해 나타낸 바와 같이 막에 특별히 지역화 CD47의 세포 외 영역 (IG), FITC로 접합 된 항체를 이용하여 볼 수있다 recCD47(그림 3B). 이러한 결과는 공유 recCD47 폴리 우레탄 필름에 부착 될 수 있다는 것을 보여준다. recCD47 바인딩 표면의 농도가 결정 형광 단위를 측정하여 표준 곡선과 비교. 우리는 recCD47 500 NG / ㎝ 2,11-13를 초과하는 수준에서 고분자 표면에 추가 될 수 있음을 보여 주었다. 이러한 결과는 본 티올 계 중합체 개질 프로토콜이 중합체 표면에 폴리 리신 개질 재조합 단백질을 추가하기 위해 사용될 수 있음을 확인한다. CD47은 염증 세포 부착 및 면역계 활성화 7-13 방지 &quot;자기&quot;의 마커로 표시되었다. 생체 외 환경에서 가능한 한 가깝게 생체 내 조건에서 모방하도록, 전체 인간 혈액 챈들러 루프 장치 내에 비 개질 및 개질 중합체 성 튜브를 통해 관류 될 수있다 (도 2에 도시). 튜브에 세포 부착 (DAPI 염색을 통해 평가 될 수있다 <strong&gt; 그림 4)와 SEM (그림 5). DAPI 염색을 통해 얻은 세포 수는 수정되지 않은 표면 (도 4A 및 4B)에 비해 세포 부착 recCD47을 현저하게 (P = 0.004)이 억제 첨부 된 것을 보여줍니다. DAPI의 세포 수는 수정되지 않은 및 recCD47 수정 표면에 세포 부착 (그림 5) 비슷한 수준을 보여, SEM에 의해 확인되었다. 이러한 데이터는 크게 혈액 관류의 생체 외 모델에서 염증 세포 부착을 억제, 본원에 기재된 프로토콜을 사용하여, recCD47의 부속을 나타낸다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/51871/51871fig1highres.jpg" /> 표면 개질의 그림 도식. A) 티올 고분자 표면과 TCEP. B) 광활성 가교제 PDT-BzPh 이후 감소 고분자 표면을 배양하여 생성 된 &lt;/ 강해&gt; SMCC이어서 recCD47 표면 기능화를 수득 티올 합성 표면과 반응시켜 티올 반응성 recCD47를 제조 하였다. <img alt="그림이" src="/files/ftp_upload/51871/51871fig2highres.jpg" /> 챈들러 루프 장치의 2도를 그림. A) 장치는 37 ° C 회전 모터에 부착 된 금속 기둥에 고정, 회전 바퀴로 가열 수조로 구성되어 있습니다. 이 금속 어댑터는 루프를 형성하는 튜브의 끝을 연결하는 데 사용됩니다)하여 튜브. B를 통해 37 ° C의 물을 욕조 및 혈액의 관류에 튜브의 일부를 담근다는, 바퀴를 설정하는 회전 모터를 허용 설정 회전 바퀴 중 하나의 주위에. 혈액은 일단 조립, 배관 및 밸브 금속 snuggly에 AR 맞아야 금속 밸브 포트를 통해 튜브에 첨가하고, 밸브 뚜껑. C)와 캡핑ound 빈 튜브를 다음과 같이 회전하는 바퀴. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/51871/51871fig3highres.jpg" /> 폴리 우레탄 필름에 recCD47의 3 양자화 그림. CD47의 IG 외부 도메인에 대해 지시 된 항체는 폴리 우레탄 막에 결합 recCD47의 양을 정량화하는 데 사용 하였다. 형광 현미경 이미지는 폴리 우레탄 (A)에 추가 recCD47의 FITC 검출을 보여주는 적절한 필터 세트와 함께 200 배 배율에서 촬영. (B) DIC 이미지는 FITC 신호가 폴리 우레탄 필름에 고유 한 것을 알 수있다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/51871/51871fig4highres.jpg" /> 수정되지 않은 및 recCD47 변성 폴리 우레탄에 그림 4 세포 접착. 전체 인간의 혈액을 수집하고 이상 관류 된 수정되지 않은 또는 recCD47는 변성3 시간 동안 PU 필름. 3 시간의 관류 후, 필름을 DPBS로 세척 한 후, 부착 세포는 39 ° C에서 하룻밤 4 % PFA로 고정시키고, DAPI 실온에서 30 분 동안 염색. DAPI 염색 세포를 200 배 확대와 적절한 필터 세트에서 형광 현미경을 이용하여 계산 하였다. (A)보기 9 무작위로 선택된 필드가 변경 될 때마다 계산 하였다. (B) 데이터보기의 9 분야의 대표이며, 평균 ± 표준 오차 (P = 0.004)로 표시됩니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/51871/51871fig5highres.jpg" /> recCD47도 5의 SEM 분석은 수정 된 제어 표면은 생체 외 분석을 다음. 전체 인간의 혈액을 수집하고 3 시간 동안 수정되지 않은 또는 recCD47 변성 PVC 튜브를 통해 관류 하였다. 대표 이미지는 unmodifi하는 중요한 세포 부착을 보여recCD47 수정 된 표면은 가끔 부착 된 셀을 표시하는 동안 에드 표면.

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The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

Blood exposure to polymeric blood conduits initiates the foreign body reaction that has been implicated in clinical complications. Here, the Chandler Loop Apparatus, an experimental tool mimicking blood perfusion through these conduits, is described. Appendage of recombinant CD47 results in decreased evidence of the foreign body reaction on these conduits.

사용<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 챈들러 루프 장치 수정 된 고분자 혈액 도관의 생체 적합성을 평가하기 위해

The foreign body reaction occurs when a synthetic surface is introduced to the body. It is characterized by adsorption of blood proteins and the ...

the-use-ex-vivo-chandler-loop-apparatus-to-assess-biocompatibility

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

11.5K 조회수.  The Children's Hospital of Philadelphia. Blood exposure to polymeric blood conduits initiates the foreign body reaction that has been implicated in clinical complications. Here, the Chandler Loop Apparatus, an experimental tool mimicking blood perfusion through these conduits, is described. Appendage of recombinant CD47 results in decreased evidence of the foreign body reaction on these conduits. 

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Autologous Endothelial Progenitor Cell-Seeding Technology and Biocompatibility Testing For Cardiovascular Devices in Large Animal Model

Implantable cardiovascular devices are manufactured from artificial materials (e.g. titanium (Ti), expanded polytetrafluoroethylene), which pose the risk of thromboemboli formation1,2,3. We have developed a method to line the inside surface of Ti tubes with autologous blood-derived human or porcine endothelial progenitor cells (EPCs)4. By implanting Ti tubes containing a confluent layer of porcine EPCs in the inferior vena cava (IVC) of pigs, we tested the improved biocompatibility of the cell-seeded surface in the prothrombotic environment of a large animal model and compared it to unmodified bare metal surfaces5,6,7 (Figure 1). This method can be used to endothelialize devices within minutes of implantation and test their antithrombotic function in vivo. 
Peripheral blood was obtained from 50 kg Yorkshire swine and its mononuclear cell fraction cultured to isolate EPCs4,8. Ti tubes (9.4 mm ID) were pre-cut into three 4.5 cm longitudinal sections and reassembled with heat-shrink tubing. A seeding device was built, which allows for slow rotation of the Ti tubes. 
We performed a laparotomy on the pigs and externalized the intestine and urinary bladder. Sharp and blunt dissection was used to skeletonize the IVC from its bifurcation distal to the right renal artery proximal. The Ti tubes were then filled with fluorescently-labeled autologous EPC suspension and rotated at 10 RPH x 30 min to achieve uniform cell-coating9. After administration of 100 USP/ kg heparin, both ends of the IVC and a lumbar vein were clamped. A 4 cm veinotomy was performed and the device inserted and filled with phosphate-buffered saline. As the veinotomy was closed with a 4-0 Prolene running suture, one clamp was removed to de-air the IVC. At the end of the procedure, the fascia was approximated with 0-PDS (polydioxanone suture), the subcutaneous space closed with 2-0 Vicryl and the skin stapled closed. 
After 3 - 21 days, pigs were euthanized, the device explanted en-block and fixed. The Ti tubes were disassembled and the inner surfaces imaged with a fluorescent microscope.
We found that the bare metal Ti tubes fully occluded whereas the EPC-seeded tubes remained patent. Further, we were able to demonstrate a confluent layer of EPCs on the inside blood-contacting surface.
Concluding, our technology can be used to endothelialize Ti tubes within minutes of implantation with autologous EPCs to prevent thrombosis of the device. Our surgical method allows for testing the improved biocompatibility of such modified devices with minimal blood loss and EPC-seeded surface disruption.

A method for seeding titanium blood-contacting biomaterials with autologous cells and testing biocompatibility is described. This method uses endothelial progenitor cells and titanium tubes, seeded within minutes of surgical implantation into porcine venae cavae. This technique is adaptable to many other implantable biomedical devices.

Autologous 내피 전구 세포 - 심는 기술 및 대형 동물 모델에서 순환기 장치에 대한 Biocompatibility 테스트

Implantable cardiovascular devices are manufactured from artificial materials (e.g. titanium (Ti), expanded polytetrafluoroethylene), which pose the risk ...

연구

생체공학

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of tri-leaflet polymer valve prostheses. However, identification of a protocol for initial assessment of polymer valve hydrodynamic functionality is paramount during the early stages of the design process. Traditional in vitro pulse duplicator systems are not configured to accommodate flexible tri-leaflet materials; in addition, assessment of polymer valve functionality needs to be made in a relative context to native and prosthetic heart valves under identical test conditions so that variability in measurements from different instruments can be avoided. Accordingly, we conducted hydrodynamic assessment of i) native (n = 4, mean diameter, D = 20 mm), ii) bi-leaflet mechanical (n= 2, D = 23 mm) and iii) polymer valves (n = 5, D = 22 mm) via the use of a commercially available pulse duplicator system (ViVitro Labs Inc, Victoria, BC) that was modified to accommodate tri-leaflet valve geometries. Tri-leaflet silicone valves developed at the University of Florida comprised the polymer valve group. A mixture in the ratio of 35:65 glycerin to water was used to mimic blood physical properties. Instantaneous flow rate was measured at the interface of the left ventricle and aortic units while pressure was recorded at the ventricular and aortic positions. Bi-leaflet and native valve data from the literature was used to validate flow and pressure readings. The following hydrodynamic metrics were reported: forward flow pressure drop, aortic root mean square forward flow rate, aortic closing, leakage&#160;and regurgitant volume, transaortic closing, leakage, and total energy losses. Representative results indicated that hydrodynamic metrics from the three valve groups could be successfully obtained by incorporating a custom-built assembly into a commercially available pulse duplicator system and subsequently, objectively compared to provide insights on functional aspects of polymer valve design.

There has been renewed interest in developing polymer valves. Here, the objectives are to demonstrate the feasibility of modifying a commercial pulse duplicator to accommodate tri-leaflet geometries and to define a protocol to present polymer valve hydrodynamic data in comparison to native and prosthetic valve data collected under near-identical conditions.

트라이 전단지 폴리머 밸브의 상대 유체 역학 평가를위한 프로토콜

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, and observation and quantification are very challenging. However, conventional in vitro microvessel assays have limitations when representing in vivo microvessels with respect to three-dimensional (3D) geometry and providing continuous fluid flow. Using a combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics, we have developed a multi-depth circular cross-sectional endothelialized microchannels-on-a-chip, which mimics the 3D geometry of in vivo microvessels and runs under controlled continuous perfusion flow. A positive reflowable photoresist was used to fabricate a master mold with a semicircular cross-sectional microchannel network. By the alignment and bonding of the two polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels replicated from the master mold, a cylindrical microchannel network was created. The diameters of the microchannels can be well controlled. In addition, primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) seeded inside the chip showed that the cells lined the inner surface of the microchannels under controlled perfusion lasting for a time period between 4 days to 2 weeks.

A microchannels-on-a-chip platform was developed by the combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics. The endothelialized microchannels platform mimics the three-dimensional (3D) geometry of in vivo microvessels, runs under controlled continuous perfusion flow, allows for high-quality and real-time imaging&#160;and can be applied for microvascular research.

멀티 깊이 원형 단면 Endothelialized 마이크로 채널 - 온 - 칩의 개발을위한 절차

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

생리 흐름 조건에서 순환 세포의 케모카인 - 감독 넘쳐을 연구하는 소설 입체 흐름 챔버 장치

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury leading to permanent pathological damage. Existing conventional assays allow the analysis of leukocyte adhesion molecules only after the extraction of leukocytes from the blood. This requires the blood to undergo several steps before peripheral blood leukocytes (PBLs) can be ready for analysis, which in turn can stimulate PBLs influencing the research findings. The autoperfused micro flow chamber assay, however, allows scientists to study early leukocytes functional dysregulation using the systemic flow of a live mouse while having the freedom of manipulating a coated chamber. Through a disease model, the functional expression of leukocyte adhesion molecules can be assessed and quantified in a micro-glass chamber coated with immobilized endothelial adhesion molecules ex vivo. In this model, the blood flows between the right common carotid artery and left external jugular vein of a live mouse under anesthesia, allowing the interaction of native PBLs in the chamber. Real-time experimental analysis is achieved with the assistance of an intravital microscope as well as a Harvard Apparatus pressure device. The application of a flow regulator at the input point of the glass chamber allows comparable physiological flow conditions amongst the experiments. Leukocyte rolling velocity is the main outcome and is measured using the National Institutes of Health open-access software ImageJ. In summary, the autoperfused micro flow chamber assay provides an optimal physiological environment to study leukocytes endothelial interaction and allows researchers to draw accurate conclusions when studying inflammation.

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Here, we present a protocol that allows the investigator to assess leukocyte recruitment dynamics ex vivo by connecting a chamber coated with endothelial-derived adhesion molecules to the circulatory system of a mouse. This method offers significant advantages since it allows for leukocyte assessment under relative biological conditions.

의 흐름 조건에서 백혈구 - 내피 상호 작용을 평가<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; Autoperfused 미세 흐름 (microflow) 상공 회의소의 분석

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart disease. When using prosthetic materials however, these grafts are susceptible to bacterial infections and various host responses.
Identification of bacterial and host factors that play a vital role in endovascular adherence of microorganisms is of importance to better understand the pathophysiology of the onset of infections such as infective endocarditis (IE) and to develop preventive strategies. Therefore, the development of competent models to investigate bacterial adhesion under physiological shear conditions is necessary. Here, we describe the use of a newly designed in vitro perfusion chamber based on parallel plates that allows the study of bacterial adherence to different components of graft tissues such as exposed extracellular matrix, endothelial cells and inert areas. This method combined with colony-forming unit (CFU) counting is adequate to evaluate the propensity of graft materials towards bacterial adhesion under flow. Further on, the flow chamber system might be used to investigate the role of blood components in bacterial adhesion under shear conditions. We demonstrated that the source of tissue, their surface morphology and bacterial species specificity are not the major determining factors in bacterial adherence to graft tissues by using our in-house designed in vitro perfusion model.

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

We describe an in-house designed in vitro flow chamber model, which allows the investigation of bacterial adherence to graft tissues.

연구 조직 이식에 세균성 부착을 병렬 플레이트 관류 시스템의 생체 외에서 모델

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

발생학

A Multi-Cue Bioreactor to Evaluate the Inflammatory and Regenerative Capacity of Biomaterials under Flow and Stretch

The use of resorbable biomaterials to induce regeneration directly in the body is an attractive strategy from a translational perspective. Such materials induce an inflammatory response upon implantation, which is the driver of subsequent resorption of the material and the regeneration of new tissue. This strategy, also known as in situ tissue engineering, is pursued to obtain cardiovascular replacements such as tissue-engineered vascular grafts. Both the inflammatory and the regenerative processes are determined by the local biomechanical cues on the scaffold (i.e., stretch and shear stress). Here, we describe in detail the use of a custom-developed bioreactor that uniquely enables the decoupling of stretch and shear stress on a tubular scaffold. This allows for the systematic and standardized evaluation of the inflammatory and regenerative capacity of tubular scaffolds under the influence of well-controlled mechanical loads, which we demonstrate on the basis of a dynamic co-culture experiment using human macrophages and myofibroblasts. The key practical steps in this approach&#8212;the construction and setting up of the bioreactor, preparation of the scaffolds and cell seeding, application and maintenance of stretch and shear flow, and sample harvesting for analysis&#8212;are discussed in detail.

The goal of this protocol is to execute a dynamic co-culture of human macrophages and myofibroblasts in tubular electrospun scaffolds to investigate material-driven tissue regeneration, using a bioreactor which enables the decoupling of shear stress and cyclic stretch.

유량 및 스트레치 하에서 생체 재료의 염증 및 재생 능력을 평가하는 다중 큐 생물 반응기

The use of resorbable biomaterials to induce regeneration directly in the body is an attractive strategy from a translational perspective. Such materials ...

공학

양의 정맥 순응도 평가를 위한 3D 혈관 조영술

Quantifying Inferior Vena Cava Compliance and Distensibility in an In Vivo Ovine Model Using 3D Angiography

Synthetic vascular grafts overcome some challenges of allografts, autografts, and xenografts but are often more rigid and less compliant than the native vessel into which they are implanted. Compliance matching with the native vessel is emerging as a key property for graft success. The current gold standard for assessing vessel compliance involves the vessel's excision and ex vivo biaxial mechanical testing. We developed an in vivo method to assess venous compliance and distensibility that better reflects natural physiology and takes into consideration the impact of a pressure change caused by flowing blood and by any morphologic changes present. 
This method is designed as a survival procedure, facilitating longitudinal studies while potentially reducing the need for animal use. Our method involves injecting a 20 mL/kg saline bolus into the venous vasculature, followed by the acquisition of pre and post bolus 3D angiograms to observe alterations induced by the bolus, concurrently with intravascular pressure measurements in target regions. We are then able to measure the circumference and the cross-sectional area of the vessel pre and post bolus. 
With these data and the intravascular pressure, we are able to calculate the compliance and distensibility with specific equations. This method was used to compare the inferior vena cava's compliance and distensibility in native unoperated sheep to the conduit of sheep implanted with a long-term expanded polytetrafluorethylene (PTFE) graft. The native vessel was found to be more compliant and distensible than the PTFE graft at all measured locations. We conclude that this method safely provides in vivo measurements of vein compliance and distensibility.

저자 스포트라이트: 선천성 심장 질환 연구에서 신생혈관 발달을 위한 향상된 이미징

This protocol allows for the in vivo quantification of venous compliance and distensibility using catheterization and 3D angiography as a survival procedure allowing for a variety of potential applications.

3D 혈관 조영술을 사용한 In vivo Ovine 모델에서 열대정맥 Cava 순응도 및 팽창성 정량화

Synthetic vascular grafts overcome some challenges of allografts, autografts, and xenografts but are often more rigid and less compliant than the native ...

사용

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의 흐름 조건에서 백혈구 - 내피 상호 작용을 평가

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