The authors would like to acknowledge Wensheng Liu for invaluable help with cell imaging. This work was supported by grants from the&#160;US National Institutes of Health (R01 CA182467), American Cancer Society (RSG-09-252-01-RMC), Lynn Sage Foundation, and A Sister&#8217;s Hope Foundation.

EMT 유도의 1 세포 배양 참고 : EMT는 TGFβ의 치료 또는 상피 세포에서 전사 인자 트위스트, 달팽이, 또는 Zeb1 / 2의 이소성 발현에 의해 유도 될 수있다. 불후의 인간의 유방 상피 세포 (HMLE / 트위스트 - ER 박사는 J 양의 선물, UCSD) 9,11,29의 트위스트 - ER 융합 단백질의 발현을 통해 유도 EMT 시스템은이 프로토콜에 설명한다. 4 hydroxytamoxifen (TAM) 처리시, 융합 단백질 트위스트-ER은 12-14일 9,11,29에 전체 EMT 전환에 전사 및 성과를 위해 핵 옭. 같은 HMLE / 달팽이-ER, HMLE / TGFβ 및 MCF10A / TGFβ 등의 추가 EMT 유도 시스템은 이전 출판물 11,30에서 찾을 수 있습니다. <ol><li> 5 % CO 2와 37 ° C 배양기에서 무 혈청 유방 상피 세포 성장 매체 (MEGM)에서 HMLE / 트위스트 - ER 세포를 유지한다. 통로 세포는 2-3 일마다 그들은 80 %의 합류에 도달하면. 5 % 혈청 / DMEM과 트립신을 비활성화 한 후 5 ~ 10 분 동안 37 ° C에서 0.15 % 트립신으로 세포를 품어합니다. 세포를 스핀 다운 및 MEGM에서 그들을 재현 탁. 1 내지 4의 비율로 새로운 조직 배양 접시에 접시 세포. </li><li> 200 μM 솔루션을 만들기 위해 에탄올에 TAM을 녹인다. -20 ° C에서 빛과 상점에서 TAM를 보호합니다. 20 nM의 TAM의 최종 농도를 희석하기 위해 10,000 : 사용 전에 갓 1에서 MEGM 매체를 추가로 TAM. </li><li> EMT의 유도를 들어, 중복에 10cm 조직 배양 접시에 1.6 × 10 6 HMLE / 트위스트 - ER 세포를 접시. 20 nM의 TAM 함유 MEGM 미디어와 문화 세포. </li><li> 중복에 10cm 접시에 플레이트 1.6 × 10 6 HMLE / 트위스트 - ER 세포와 비 TAM 처리 제어와 같은 0.01 % 에탄올로 치료 세포. </li><li> 두 일 배양 한 후, 세포의 형태 학적 변화를 기록하기 위해 10 배 배율의 광학 현미경 사진을 찍을. </li><li> 제어 또는 TAM 처리의 한 접시에서 매체를 기음세포. RNA 분리 및 단백질 분석 RIPA 버퍼 내의 다른 절반 RNA 용해 완충액 플레이트의 절반을 폐기하여 차가운 PBS와 세포 및 세포 수확을 씻는다. </li><li> 중복에 10cm 접시에 재 도금 1.6 × 10 6 세포에 의한 제어 또는 TAM 처리 된 요리에서 통과 세포. 연속 20 nM의 TAM 또는 차량 세포를 취급합니다. </li><li> 반복 차량 처리 된 대조군 세포는 조약돌 모양의 상피 세포 형태를 유지하는 반면, 어떤 시간에, TAM 처리 트위스트 - ER 세포, 방추형 중간 엽 형태를 보여, 14 일까지 5 회 매일 7 단계를 반복합니다. </li></ol> EMT의 2 특성 참고 : EMT의 완료가로 표시됩니다 : 스핀들 모양의 섬유 모세포와 같은 외관 조약돌 모양의 상피 형태에서 (1) 셀 형태 학적 변화; (2) 세포 - 세포 접합에서 E-cadherin의 현지화 패, 손실에 의해 정의 EMT 마커 및 (3) 식 스위치,상피 마커 및 중간 엽 마커의 이득. 세포 형태 학적 변화는이 절에 설명되어 세포 접합부에서 E-cadherin의 제 1 면역 형광 검출에 설명, EMT 유도의 시간 경과시 10 배 배율의 광학 현미경에 의해 캡처됩니다. EMT 마커의 발현은 발현 수준에 의해 검출된다. 일반적인 상피 마커는 E-cadherin의, γ-catenin이, 그리고 occludin, 그리고 중간 엽 마커 피브로넥틴, N-cadherin의 및 멘틴을 포함한다. 면역 블로의 일반 절차는 4 절에 설명되어 있습니다. <ol><li> TAM 처리, 시드 24 - 웰 플레이트에 넣고 잘 12mm 원형 유리 커버 슬립에 1 × 105 세포에서 12 일. </li><li> 미리 예열 PBS와 시드, 흡인 매체 및 세척 세포 후 48 시간. </li><li> 15 분 동안 미리 예열 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정합니다. </li><li> PBS로 세포를 세 번 씻으십시오. </li><li> 15 PBS에서 0.2 % 트리톤 X-100으로 세포를 부화RT에서 분. </li><li> PBS로 세포를 세 번 씻으십시오. </li><li> 비특이적 결합 차단 RT에서 1 시간 동안 5 % BSA / PBS에서 세포를 배양한다. </li><li> 4 ° C에서 1:50 희석 1 %의 BSA / 가습 챔버 O에서 PBS / N에 차 항체 E-cadherin의와 세포를 품어. 참고 : 차 항체의 희석 범위는 1:50 일 사이에 일반적입니다 : 200, 각 항체에 대한 최적의 희석은 실험적으로 결정되어야한다. </li><li> 차 항체를 가만히 따르다하고 PBS로 세포를 세 번 씻는다. </li><li> 실온에서 1 시간 동안 500 희석 : 1에 형광 표지 된 이차 항체와 세포를 품어. 에서이 단계에서 빛으로부터 세포를 보호합니다. </li><li> 차 항체를 가만히 따르다하고 PBS로 3 회 씻는다. </li><li> 를 10 분 동안 0.1 g / ㎖ DAPI 또는 훽스트와 얼룩 셀. </li><li> PBS로 3 회 세포를 씻어. </li><li> 마운트 매니큐어와 장착 매체의 드롭 및 밀봉 된 커버로 된 커버. </li><li> 세포를 관찰하고 수행63X 형광 현미경 이미지. </li></ol> 추가 항체로 염색하는 EMT 표현형을 확인하기 위해 수행 할 수 있습니다. 예를 들어, N-cadherin의 및 α-평활근 액틴은 중간 엽 표현형 29,31,32 스테인드 할 수 있습니다. 골격 구조의 개편은 F-액틴 11 phalloidin으로 세포를 염색하여 모니터링 할 수 있습니다. 또한, 세포 운동성 및 세포 사멸에 대한 저항성 분석법 EMT (11)의 특성을 조사하기 위해 수행 될 수있다. QRT-PCR 분석 실험을 사용하여 검출 스플 라이스 동종의 3 <ol><li> 프라이머 디자인 NOTE : 프라이머 쌍은 신중 구별 동종 접합을 증폭하도록 설계되어야한다. 스킵 엑손, 가장 일반적으로 관찰 대안 접합 이벤트, 프라이머 디자인 전략을 설명하기 위해 예로서 여기에 도시되어있다.도 1a는 가변 엑손로서 제 엑손으로, 네 엑손 사전의 mRNA를 도시한다. 엑손의 포함 3 결과엑손 3의 스킵 반면 긴 스플 라이스 이소 형의 생산은, 스플 라이스 짧은 이소 형을 생성한다. 프라이머는 엑손-3-이소 포함하고 엑손-3-이소 스킵를 구별하고,이 전체의 mRNA 전 사체를 검출하도록 설계 될 필요가있다. <ol><li> 엑손 개재물의 검출을 위해, 신중하게 가변 엑손 포함 이소 형의 비 증폭을 허용 변수 엑손 3 및 인근 항시 엑손 4 내부 역방향 프라이머 안에 순방향 프라이머를 설계한다. 순방향 설계 및 게놈 DNA 또는 전-mRNA의 PCR 증폭에서 제품을 피하기 위하여 동일한 변수 엑손 내의 역방향 프라이머하지 않도록주의. </li><li> 특히 엑손 건너 뛰는 이벤트, 디자인을 증폭하려면 변수 엑손 3가 포함 된 경우, 그렇지 않으면 파괴 될 것이다 구성 적 엑손 2 엑손 4의 교차점에 걸쳐 프라이머 중 하나. 이와 같이 항시 적 엑손 4 안에 다른 프라이머를 설계, PCR 제품 변수 엑손 3 exclud 때만 생성된다ED 및 엑손 2, 엑손 사이어서 서로 결합 항시. </li><li> , 유전자의 전체 전 사체를 검출이 항시 엑손 1 및 2에서 프라이머를 설계하기 때문에, PCR 생성물은 모든 아형에서 증폭된다. </li><li> 반드시 모든 프라이머에 대한 융해 온도 (TM)는 약 55 ° C, 각 프라이머의 길이는 약 18-22 뉴클레오타이드이다 확인하고, PCR 생성물의 크기는 80 내지 150 염기쌍이다. </li></ol></li><li> RNA 추출 (재료의 표 참조) 총 RNA 분리 키트를 사용하여 RNA를 추출합니다. <ol><li> 350 ㎕의 RNA의 용해 완충액에 세포를 수집한다. </li><li> 해물을 70 % 에탄올 350 μl를 첨가하고 잘 섞는다. </li><li> RNA 정제 컬럼에 샘플을 전송합니다. </li><li> 1 분 및 폐기의 흐름을 통해 10,000 XG에 원심 분리기. </li><li> RNA의 세척 버퍼 II 회 RNA 세척 버퍼 I의 500 μL와 배의 열을 씻으십시오. </li><li> 잔류 RNA 세척 버퍼를 제거2 분 동안 최대 속도에서 원심 분리에 의해 컬럼으로부터 II. </li><li> , 새로운 1.5 ㎖의 튜브에 열을 이동시켜 열 행렬의 중심에 50 μL 클레아없는 물을 첨가하고 최대 속도로 원심 분리하여 RNA를 용출시킨다. </li></ol></li><li> 첫 번째 가닥의 cDNA 합성 <ol><li> UV 흡수 측정에 의한 농도와 RNA의 품질을 결정합니다. 참고 : 좋은 품질의 RNA는 약 2.0의 260 나노 미터 / 280 nm의 흡광도 비율을 가지고 있어야합니다. </li><li> 20 μL의 최종 볼륨에서 250 NG 총 RNA, 0.05 μg 랜덤 헥사 머 프라이머, 50 pmol의 MgCl2를, 10 pmol의의의 dNTP, 2 ㎕의 5 × GoScript 버퍼, 1 μL RT 효소를 포함하는 역전사 효소 (RT) 반응을 설정합니다. </li><li> RT 효소를 불 활성화하기 위해 5 분 동안 70 ° C에서 배양 한 다음 1 시간, 42 ° C에서 RT 반응을 수행합니다. </li></ol></li><li> 실시간 PCR <ol><li> 10 μL의 SYBR 녹색 마스터 믹스로 구성되어 20 ㎕의 반응을 설정,0.1 ~ 1.0 ㎕의 cDNA를 템플릿, 5 pmol의 앞으로 및 역방향 프라이머. </li><li> 다음 단계의 40주기 실시간 PCR을 실행하여 95 ° C 변성을 10 초, 10 초 동안 58 ° C 어닐링, 30 초 동안 60 ° C의 확장을 위해. 세중에서 PCR 반응을 수행합니다. </li><li> 해리 곡선을 확인하고 하나의 피크가 각각의 프라이머 세트에 대한 관찰되어 있는지 확인합니다. </li><li> 증폭 곡선의 이차 미분 값을 계산하여 정량화 사이클 (Cq와) 값을 얻습니다. </li><li> &#39;델타 델타 Cq와 (ΔΔCq)&#39;다음의 화학식으로 나타낸 바와 같이 방법을 사용하여 유도되지 않은 샘플과 비교하여 샘플에서 유도 된 대상의 mRNA의 상대적 양 (RQ)를 계산한다. 참고로, 같은 GAPDH 또는 TBP 등의 하우스 키핑 유전자를 사용합니다. </li></ol></li></ol><img alt="식 (1)" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51845/51845eq1.jpg" /> 더 정확하게 스플 라이스 동종의 상대 값을 계산하려면 t그는 고려되어야 여러 참조 유전자의 사용합니다. 결과 Pfaffl 외 33,34 설명 변성 절대치 정량 방법을 사용하여 분석 할 수있다. 단백질 수준에서 스플 라이스 동종의 4 시험 <ol><li> 100 ㎕의 얼음처럼 차가운 RIPA 버퍼에 세포를 수집합니다. </li><li> 약 10 분 동안 얼음에 해물을 설정합니다. </li><li> 4 ° C에서 10 분 동안 14,000 XG에 원심 분리하고, 상층 액을 수집합니다. </li><li> 브래드 포드 분석에 의해 단백질 농도를 측정한다. </li><li> SDS 로딩 버퍼에 단백질 시료를 희석하고 10 % SDS-PAGE 젤에 단백질의 20 ~ 40 μg을로드합니다. </li><li> 1.5 시간 동안 20mA에서 SDS-PAGE 젤을 실행합니다. </li><li> 85 V.에서 3 시간 동안 4 ° C에서 젖은 전송 시스템에서 PVDF 멤브레인에 전송 단백질은 목적 단백질의 분자량에 따라 전송 시간을 조정합니다. </li><li> 30 분 실온에서 1 시간에 5 % 무 지방 우유에 차단 막. </li><li> 막 위스콘신 품어4 ° CO / N에 차 항체를 일. (200)와 1 : 5000, 실험적 각 항체에 대한 최적의 희석을 결정 차 항체 희석의 범위는 일반적으로 (1) 사이에있다. 이 프로토콜에서 사용되는 항체의 희석은 &quot;특정 시약 및 장비의 테이블&quot;에서 찾을 수있다. <ol><li> 스플 라이스 아형을 검출하기 위해, 특히 특정한 이소 형을 인식하는 항체를 사용한다. 대안 적으로, 구성 적 코딩 엑손 영역의 에피토프를 인식하는 항체를 사용하여 서로 다른 크기의 단백질을 기반으로 동시에 접합 아형을 검출한다. </li><li> 동시에, EMT 마커에 대한 발현 수준에 의해 EMT를 모니터링 할 수 있습니다. 중간 엽 마커로 사용하여 E-cadherin의, γ-catenin이, 상피 마커로 occludin 및 피브로넥틴, N-cadherin의 및 멘틴. </li></ol></li><li> 5 분 간격으로 TBS-T (50 mM 트리스, 150 mM의 염화나트륨, 0.05 % 트윈 20, 산도 7.4)로 세척 막 세 번. </li><li> HRP-결합 된 보조 개미와 멤브레인을 품어실온에서 1 시간 동안 만 희석 : 1 ibody. </li><li> 5 분 간격으로 TBS-T로 세척 막 세 번. </li><li> 화학 발광 검출 계와 단백질을 시각화하고 오토 라디오 그래피 막에 막을 노출. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

여기에 설명 된 절차를 유도 EMT 모델에서 스 플라이 싱의 검출을 가능하게한다. 스플 라이스 이소 형의 발현의 이러한 동적 변화가 EMT의 시간 경과에 걸쳐 캡처 할 수있다. UN 관련 세포주 구별 유전 배경 부당 대체 스 플라이 싱에 영향을 미칠 수 있기 때문에이 방법은 다른 스 플라이 싱의 비교를위한 상이한 epithelial- 또는 간엽-나타내는 세포주의 사용에 이점을 갖는다. 그러나, EMT의 성공적인 유도 신중하게 선택적 스 플라이 싱 (alternative splicing)의 변화에​​ 어떤 결론을하기 전에 다양한 EMT 마커를 그릴 수 있습니다 사용하여 확인해야합니다. 또한, 여기에 설명 된 트위스트 - ER-유도 EMT 시스템에 추가하여, 이러한 달팽이-ER 또는 TGFβ에 의해 유도 된 것과 같은 다른 EMT 시스템은 실험 결과 11,30의 검증을 위해 사용하는 것이 좋습니다. EMT 동안 동종 접합의 스위칭 모두 RNA 및 단백질 수준에서 검출 할 수있다. 스플 라이스 이소형태 - 특이 항체는 단백질 분석을 위해 바람직하다. 이소 형 - 특이 항체를 사용할 수없는 경우에는, 스플 라이스 동종의 단백질 수준을 면역 블 롯팅에 의해 SDS-PAGE에 자신의 분자량에 기초하여 결정될 수있다. 각각의 이소 형의 RNA 수준은 이소 형 - 특이 적 프라이머로 정량화 될 수있다. QRT-PCR 분석을 사용하여 각 이소 형의 배 변화는 민감하고 정확하게 측정 할 수 있습니다. 실험 재료와 같은 임상 검체에서 특정 스플 라이스 이소 형의 발현을 분석하기로 한정 될 때, 특히, QRT-PCR 분석은 면역 조직 화학에 대한 이소 형 - 특이 항체의 부족을 보상 할 정량적 측정 값을 제공한다. 여기에 언급 된 방법은 EMT 동안 공지 스플 라이스 이소 변화의 검출에 적합하다. 또한,이 방법은 게놈 전체의 대체 스 플라이 싱의 연구 및 EMT 동안 신규 한 접합 이소 스위칭의 식별을 위해 확장 될 수있다. 이를 위해서는그러한 깊은 시퀀싱 RNA 스 플라이 싱 또는 민감한 마이크로 어레이 플랫폼으로서 대규모 기법의 사용은, 상기 유도 EMT 모델로부터 분리 RNA를 사용하여 수행 될 수있다. 그럼에도 불구하고, 이소 변경 QRT-PCR 유효성 검사는 대규모 분석 다음이 필요합니다. 결론적으로, 대안적인 스 플라이 싱은 동적 EMT, 배아 발생 및 종양 전이를위한 중요한 과정 중에 조절된다. 인간 게놈에서 대체 스 플라이 싱의 고주파를 고려할 때 대체 스 플라이 싱의 조절은 세포 분화, 조직 개발, 프로그램 된 세포 사멸 35-41 포함하여 많은 다른 생물학적, 병리학 적 과정에서 중요한 역할을하는 것으로 보인다. 스플 라이스 동종의 검출을 위해 본원에 기재된 프로토콜뿐만 아니라 이러한 다른 시스템에 적용 할 수있을 것이다. 이러한 접합 기자 minigene 분석 등의 추가 실험 양식, 수 b전자는 더 시스 행동 요소와 선택적 스 플라이 싱 (alternative splicing) 30,42,43를 제어 트랜스 작용 요인의 규제 메커니즘을 조사하는 데 사용됩니다. 또한, EMT 동안 특정 스플 라이스 이소의 기능적 역할은 침묵 또는 ectopically 특정 이소을 표현하고 설명 EMT 유도 시스템 (11)에 EMT 유도를 모니터링하여 조사 할 수있다.

상피 - 간엽 전환 (EMT)의 배 발생시 기관의 형태 형성 및 조직 리모델링을 구동하는 발달 프로그램입니다. 비정상적으로 활성화되면, EMT는 종양 전이 및 장기 섬유화 1,2를 촉진한다. 강제적 인 연구 cobble-의 유실있는 adherens 접합 단백질 E-카드 헤린의 발현을 억제 그러한 트위스트, 달팽이 및 ZEB 여러 전사 인자,,,로 정의, EMT 과정에서 전사 조절의 중요성을 설명 하였다 상피 형태와 스핀들 모양의 중간 엽 표현형 3-8의 이득과 같은 돌. RNA를 게놈 차원의 분석을 통해 최근의 연구 접합 패턴 상피 또는 중간 엽 표현형 9, 10 중 하나와 관련된 유전자의 그룹이 존재하는 것으로 나타났습니다. 우리가 실험실에서 작업 기능적 선택적 스 플라이 싱 (alternative splicing)와 EMT 연결. 세포 표면 부착 분자 CD44을 연구함으로써 CD44의 altern 시연극상의 접합이 긴밀하게 EMT 동안 규제하고, 더 중요한 것은, 인과 적으로 전환하는 CD44 스플 라이스 이소 11 EMT에 기여한다. 대안 12-14을 접합하는 인간의 다중 엑손 유전자의 95 %까지로 대체 접합은 유전자 조절의 광범위하고 보존 모델을 나타냅니다. 단일 유전자로부터 다중 단백질 제품을 생성함으로써, 대안적인 스 플라이 싱은 인간 게놈에 또 다른 층의 복잡성을 추가 단백질 다양성 필수기구를 구성한다. 따라서, 선택적 스 플라이 싱 (alternative splicing)의 조절 이상이 잠재적으로 인간의 질병을 일으키는 원인이 심오한 생물학적 효과가 발생할 수 있습니다. 사실, 질병에서 벗어난 대안으로 연결할 수는 spliceosome 기계를 코딩하는 유전자의 돌연변이는 일반적으로 골수 형성 이상 증후군 26 ~ 28에서 발견되는 최근의 연구 결과를 포함, 10 년 이상 15 ~ 25에 설명되어 있습니다. 따라서, 다르게 스 플라이 싱 된 난의 검출을위한 신뢰성있는 방법을 개발soforms는 EMT 등 다양한 생물학적 과정의 연구에 매우 중요하다. 여기서 우리는 유도 EMT 모델을 사용하여 대체 스 플라이 싱의 변화를 검출하는 프로토콜을 제공한다. 스플 라이스 이소 폼을 PCR 프라이머를 설계 및 검출하기위한 방법이 EMT 대체 스 플라이 싱 동안의 연구뿐만 아니라 다른 생물학적 과정에서 대체 스 플라이 싱의 연구뿐만 아니라 적합하다. EMT 동안 대체 스 플라이 싱을 더 조사하면, 따라서 암 전이를 치료하기위한 효과적인 전략의 개발을 촉진 EMT 및 종양 전이의 메커니즘을 이해하기 위해 필수적이다.

<table><tbody><tr><td>4-hydroxytamoxifen</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td>Make stock solution by dissolving 4-hydroxytamoxifen in ethanol to 200 &amp;#956;M. Keep the solution at -20 &amp;#176;C protected from light.</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Total RNA Isolation kit</td><td>Omega Bio-Tek</td><td>R6731</td><td>Total RNA isolation kit</td></tr><tr><td>GoScript Reverse Transcription System</td><td>Promega</td><td>A5001</td><td>Reagent for qRT-PCR assay</td></tr><tr><td>GoTaq qPCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>A6002</td><td>Reagent for qRT-PCR assay</td></tr><tr><td>LightCycler 480 Real-Time PCR System</td><td>Roche</td><td></td><td>Equipment for qRT-PCR assay</td></tr><tr><td>CD44 antibody</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>BBA10</td><td>1:1,000 dilution</td></tr><tr><td>E-cadherin antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4065</td><td>1:2,500 dilution for immunoblotting; 1:50 dilution for immunofluorescence</td></tr><tr><td>&amp;gamma;-Catenin antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2309</td><td>1:1,000 dilution</td></tr><tr><td>Occludin antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td><td>sc-5562</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>Fibronectin antibody</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610077</td><td>1:5,000 dilution</td></tr><tr><td>N-cadherin antibody</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610920</td><td>1:2,000 dilution</td></tr><tr><td>Vimentin antibody</td><td>NeoMarkers</td><td>MS-129-p1</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>GAPDH antibody</td><td>Millipore Corporation</td><td>MAB374</td><td>1:10,000 dilution</td></tr><tr><td>Amasham ECL Western blotting detection reagent</td><td>GE Health Life Science</td><td>RPN2209</td><td>Chemiluminescence system</td></tr></tbody></table>

detection of alternative splicing during epithelial-mesenchymal transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

상술 한 절차는 EMT 동안 대체 스 플라이 싱을 검출하는 강력한 방법을 제공한다. 트위스트에 의한 EMT 동안 CD44 스플 라이스 이소 전환의 대표적인 결과는 예를 들어 다음과 같습니다. HMLE / 트위스트 - ER 세포에서 트위스트에 의한 EMT는 가늘고 긴 섬유 모세포 표현형 상피 표현형 같은 자갈 돌에서 전환 (그림 2A), 상피 마커 E-cadherin의, γ-catenin이와 occludin과의 부재에 의해 특징했다 중간 엽 마커 피브로넥틴, N-cadherin의 및 멘틴 (그림 2B)의 상향 조절. 또한, EMT는 세포 - 세포 접합 (그림 2C)에서 E-cadherin의 현지화의 손실에 의해 평가되었다. EMT 동안 CD44 스플 라이스 동종의 전환 표현은 QRT-PCR과 면역 블로에 의해 조사 하였다. 인간 CD44 유전자는 구 변수 엑손으로 구성되어 있습니다. CD44의 대체 접합 프로에 셀 수 있습니다적어도 하나의 가변 엑손, 모든 변수 엑손의 결여이다 CD44 표준 (CD44s)를 포함 줄 이도록 CD44 변이체 (CD44v는).도 3a는 다양한 CD44 클로우 동종의 검출을위한 프라이머 디자인 전략을 도시한다. 역방향 프라이머는 V5 및 V6 변수를 함유 CD44v 클로우 아형을 검출하기위한 구성 적 엑손 5와 6 사이의 접합부에 걸쳐있는 동안 엑손 - 스킵 제품 CD44s의 검출을 위해, 정방향 프라이머는 항시 엑손 5에 위치하고 엑손, 정방향 및 역방향 프라이머 각각 V5 및 V6 내에 설계된다. 다른 CD44 가변 엑손 - 함유 동종의 검출을위한 프라이머가 동일한 전략을 사용하여 설계 될 수있다. 또한, 총 CD44 성적 증명서 앞으로의 사용과 구성 적 엑손 2 엑손 3 각각 (그림 3A)에있는 역방향 프라이머를 검출한다. 도 3b에 도시 된 바와 같이, QRT-PCR을 다음의 프라이머 세트를 이용하여 CD의 유의 한 감소를 나타 분석44V의 mRNA와 트위스트 - ER 발현 HMLE 세포에서 TAM 치료 14 일 후 CD44s mRNA의 증가. 대조적으로, CD44의 전체 성적은 EMT (그림 3C) 동안 변화가 없었다. CD44s 단백질의 발현이 크게 (도 3d)를 상향 조절 하였다 반면 QRT-PCR의 결과와 일치, CD44v 단백질의 수준은 현저하게 감소 하였다. 따라서, CD44의 주요 이소 형이 EMT 과정에서 CD44s에 CD44v 어긋나 있었다. <img alt="그림 1" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/51845/51845fig1highres.jpg" width="600" /> 그림 1 프라이머 디자인. 엑손 스키핑 모델에서 스 플라이 싱 이소 검출 용 프라이머의 위치를 설명하기위한 개략도. 회색 상자는 오렌지 박스 변수 엑손을 표현, 구성 적 엑손을 나타내고, 상자를 연결하는 얇은 선은 인트론을 나타낸다. 프라이머 위치는 indicat 아르화살표로 에드 : 검은 색 화살표는 전체의 mRNA를 검출하기위한 프라이머 세트를 표시, 주황색 화살표는 엑손 포함 이소을 증폭하기위한 프라이머 세트를 나타내며, 파란색 화살표는 엑손 스키핑 동종를 검출하기위한 프라이머 세트를 나타냅니다. <img alt="그림이" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51845/51845fig2highres.jpg" width="600" /> EMT의 2 유도 그림. (A) 위상 콘트라스트 이미지 (10 배)이 전 (치료) HMLE / 트위스트 - ER 세포의 형태 학적 변화를 설명하고 TAM 치료 14 일 후. (B) 면역 블롯 전에 HMLE / 트위스트 - ER 세포에서 EMT 마커 분석 (치료) 및 TAM 치료 14 일 후. TAM 처리, 하향 조절 하였다 상피 마커 E-카드 헤린, γ-카테닌, 및 occludin 및 간엽 마커 피브로넥틴, N-카드 헤린 및 멘틴에 상향 조절되었다. (C) 면역 형광 이미지 (63X) E-카드 헤린의 손실을 나타내는TAM 치료 14 일 후 세포 - 세포 접합에서 현지화. 그린 염색은 E-cadherin의를 표시하고, DAPI 염색 (파란색) 핵을 나타냅니다. 스케일 바 = 10 μm의. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51845/51845fig2highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51845/51845fig3highres.jpg" width="500" /> EMT 동안 CD44 스플 라이스 동종의 그림 3 스위치. (A) CD44 클로우 동종의 검출을위한 프라이머 디자인. 회색 상자는 오렌지 박스 변수 엑손을 표현, 구성 적 엑손을 나타내고, 상자를 연결하는 얇은 선은 인트론을 나타낸다. 프라이머 위치를 화살표로 표시됩니다 : 검은 색 화살표가 CD44 총 mRNA의 검출을위한 프라이머 세트를 표시, 주황색 화살표는 CD44v5-6을 증폭 프라이머 세트를 표시하고 파란색 화살표를위한 프라이머 세트를 나타냅니다CD44s 검출. (B, C) ​​즉 CD44v 가변 엑손의 V5 및 V6 (V5가 / 6) 및 CD44s (B), 및 CD44 전체의 mRNA를 함유하는 검출 EMT는 프라이머를 사용하는 동안 CD44 이소 형의 수준 QRT-PCR 분석 (C) . 일에서의 mRNA의 상대적 발현 수준은 14 세포는 TAM의 공 세포 치료 해당 일 및 처리하지 않은 그룹에 정상화되었다. 오차 막대는 SEM을 나타냅니다; N = HMLE / 트위스트 - ER 세포에서 TAM에 의한 EMT 동안 CD44 이소 형의 3 (D) 면역 블롯 분석. E-카드 헤린 및 N-카드 헤린의 수준은 EMT 상태를 파악하기 위해 모니터링되었다.

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Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

상피 - 간엽 전환시 선택적 스 플라이 싱 (alternative splicing)의 검출

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

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Nanyang Technological University

Research

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Biology

12.9K 조회수.  Northwestern University Feinberg School of Medicine. Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

비디오: Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance can be caused by a range of mechanisms, including increased drug elimination, decreased drug uptake, drug inactivation and alterations of drug targets. Recent data showed that other than by well-known genetic (mutation, amplification) and epigenetic (DNA hypermethylation, histone post-translational modification) modifications, drug resistance mechanisms might also be regulated by splicing aberrations. This is a rapidly growing field of investigation that deserves future attention in order to plan more effective therapeutic approaches. The protocol described in this paper is aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of several in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes. In particular, we evaluated the differential splicing of DDX5 and PKM transcripts. The aberrant splicing detected by the computational tool MATS was validated in leukemic cells, showing that different DDX5 splice variants are expressed in the parental vs. resistant cells. In these cells, we also observed a higher PKM2/PKM1 ratio, which was not detected in the Panc-1 gemcitabine-resistant counterpart compared to parental Panc-1 cells, suggesting a different mechanism of drug-resistance induced by gemcitabine exposure.

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Here we describe a protocol aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of parental and resistant in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes.

에 약물 저항 관련 소설 스플 라이스 변종을 감지하는 RNA 시퀀싱을 사용하여<em&gt; 체외</em&gt; 암 모델

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

연구

암 연구학

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which specifically binds the pre-mRNA target and an effector domain. Previously, we have taken advantage of the unique RNA binding mode of the PUF domain in human Pumilio 1 to generate a programmable RNA binding scaffold, which was used to engineer various artificial RBPs to manipulate RNA metabolism. Here, a detailed protocol is described to construct Engineered Splicing Factors (ESFs) that are specifically designed to modulate the alternative splicing of target genes. The protocol includes how to design and construct a customized PUF scaffold for a specific RNA target, how to construct an ESF expression plasmid by fusing a designer PUF domain and an effector domain, and how to use ESFs to manipulate the splicing of target genes. In the representative results of this method, we have also described the common assays of ESF activities using splicing reporters, the application of ESF in cultured human cells, and the subsequent effect of splicing changes. By following the detailed protocols in this report, it is possible to design and generate ESFs for the regulation of different types of Alternative Splicing (AS), providing a new strategy to study splicing regulation and the function of different splicing isoforms. Moreover, by fusing different functional domains with a designed PUF domain, researchers can engineer artificial factors that target specific RNAs to manipulate various steps of RNA processing.

This report describes a bioengineering method to design and construct novel Artificial Splicing Factors (ASFs) that specifically modulate the splicing of target genes in mammalian cells. This method can be further expanded to engineer various artificial factors to manipulate other aspects of RNA metabolism.

인공 요소 엔지니어 것은 특히 인간 세포에서의 스 플라이 싱을 조작 할

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

유전학

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell type-specific fashion. AS expression patterns are typically analyzed by RT-PCR and RNA-seq using RNA samples isolated from a population of cells. In situ examination of AS expression patterns for a particular biological structure can be carried out by RNA in situ hybridization (ISH) using exon-specific probes. However, this particular use of ISH has been limited because alternative exons are generally too short to design exon-specific probes. In this report, the use of BaseScope, a recently developed technology that employs short antisense oligonucleotides in RNA ISH, is described to analyze AS expression patterns in mouse brain sections. Exon 23a of neurofibromatosis type 1 (Nf1) is used as an example to illustrate that short exon-exon junction probes exhibit robust hybridization signals with high specificity in RNA ISH analysis on mouse brain sections. More importantly, signals detected with exon inclusion- and skipping-specific probes can be used to reliably calculate the percent spliced in values of Nf1 exon 23a expression in different anatomical areas of a mouse brain. The experimental protocol and calculation method for AS analysis are presented. The results indicate that BaseScope provides a powerful new tool to assess AS expression patterns in situ.

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

An in situ hybridization (ISH) protocol that uses short antisense oligonucleotides to detect alternative pre-mRNA splicing patterns in mouse brain sections is described.

대체 사전 mRNA 접합 교 잡 시험 현장에서 RNA를 사용 하 여 마우스 뇌 섹션에서의 정량 분석

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

Phenotypic plasticity refers to a phenomenon in which cells transiently gain traits of another lineage. During carcinoma progression, phenotypic plasticity drives invasion, dissemination and metastasis. Indeed, while most of the studies of phenotypic plasticity have been in the context of epithelial-derived carcinomas, it turns out sarcomas, which are mesenchymal in origin, also exhibit phenotypic plasticity, with a subset of sarcomas undergoing a phenomenon that resembles a mesenchymal-epithelial transition (MET). Here, we developed a method comprising the miR-200 family and grainyhead-like 2 (GRHL2) to mimic this MET-like phenomenon observed in sarcoma patient samples.We sequentially express GRHL2 and the miR-200 family using cell transduction and transfection, respectively, to better understand the molecular underpinnings of these phenotypic transitions in sarcoma cells. Sarcoma cells expressing miR-200s and GRHL2 demonstrated enhanced epithelial characteristics in cell morphology and alteration of epithelial and mesenchymal biomarkers. Future studies using these methods can be used to better understand the phenotypic consequences of MET-like processes on sarcoma cells, such as migration, invasion, metastatic propensity, and therapy resistance.

We present here a cell culture method for inducing mesenchymal-epithelial transitions (MET) in sarcoma cells based on combined ectopic expression of microRNA-200 family members and grainyhead-like 2 (GRHL2). This method is suitable for better understanding the biological impact of phenotypic plasticity on cancer aggressiveness and treatments.

육종 세포의 중간 엽 상피 전환 유도

Phenotypic plasticity refers to a phenomenon in which cells transiently gain traits of another lineage. During carcinoma progression, phenotypic ...

발생학

Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of TGF-&#946; signaling can lead to breast cancer. TGF-&#946; elicits its effects on proliferation and differentiation via specific cell surface TGF-&#946; type I and type II receptors (i.e., T&#946;RI and T&#946;RII) that contain an intrinsic serine/threonine kinase domain. Upon TGF-&#946;-induced heteromeric complex formation, activated T&#946;RI elicits intracellular signaling by phosphorylating SMAD2 and SMAD3. These activated SMADs form heteromeric complexes with SMAD4 to regulate specific target genes, including plasminogen activation inhibitor 1 (PAI-1, encoded by the SERPINE1 gene). The induction of epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) allows epithelial cancer cells at the primary site or during colonization at distant sites to gain an invasive phenotype and drive tumor progression. TGF-&#946; acts as a potent inducer of breast cancer invasion by driving EMT. Here, we describe systematic methods to investigate TGF-&#946; signaling and EMT responses using premalignant human MCF10A-RAS (M2) cells and mouse NMuMG epithelial cells as examples. We describe methods to determine TGF-&#946;-induced SMAD2 phosphorylation by Western blotting, SMAD3/SMAD4-dependent transcriptional activity using luciferase reporter activity and SERPINE1 target gene expression by quantitative real-time-polymerase chain reaction (qRT-PCR). In addition, methods are described to examine TGF-&#946;-induced EMT by measuring changes in morphology, epithelial and mesenchymal marker expression, filamentous actin staining and immunofluorescence staining of E-cadherin. Two selective small molecule TGF-&#946; receptor kinase inhibitors, GW788388 and SB431542, were used to block TGF-&#946;-induced SMAD2 phosphorylation, target genes and changes in EMT marker expression. Moreover, we describe the transdifferentiation of mesenchymal breast Py2T murine epithelial tumor cells into adipocytes. Methods to examine TGF-&#946;-induced signaling and EMT in breast cancer may contribute to new therapeutic approaches for breast cancer.

We describe a systematic workflow to investigate TGF-&#946; signaling and TGF-&#946;-induced EMT by studying the protein and gene expression involved in this signaling pathway. The methods include Western blotting, a luciferase reporter assay, qPCR, and immunofluorescence staining.

유방암과 정상 세포에서 TGF β 신호 및 TGF β 유도 된 상피 - 중간 엽 전환 연구

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of ...

Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides constitutive splicing, alternative mRNA splicing allows the expression of multifunctional proteins from one gene. As interactome studies are generally the first analysis for new or unknown proteins, the association of the bait protein with splicing factors is an indication that it can participate in mRNA splicing process, but to determine in what context or what genes are regulated is an empirical process. A good starting point to evaluate this function is using the classical minigene tool. Here we present the adenoviral E1A minigene usage for evaluating the alternative splicing changes after different cellular stress stimuli. We evaluated the splicing of E1A minigene in HEK293 stably overexpressing Nek4 protein after different stressing treatments. The protocol includes E1A minigene transfection, cell treatment, RNA extraction and cDNA synthesis, followed by PCR and gel analysis and quantification of the E1A spliced variants. The use of this simple and well-established method combined with specific treatments is a reliable starting point to shed light on cellular processes or what genes can be regulated by mRNA splicing.

This protocol presents a rapid and useful tool for evaluating the role of a protein with uncharacterized function in alternative splicing regulation after chemotherapeutic treatment.

E1A 미니진 도구를 사용하여 mRNA 접합 변화를 연구합니다.

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides ...

A Reporter Based Cellular Assay for Monitoring Splicing Efficiency

During gene expression, the vital step of pre-mRNA splicing involves accurate recognition of splice sites and efficient assembly of spliceosomal complexes to join exons and remove introns prior to cytoplasmic export of the mature mRNA. Splicing efficiency can be altered by the presence of mutations at splice sites, the influence of trans-acting splicing factors, or the activity of therapeutics. Here, we describe the protocol for a cellular assay that can be applied for monitoring the splicing efficiency of any given exon. The assay uses an adaptable plasmid encoded 3-exon/2-intron minigene reporter, which can be expressed in mammalian cells by transient transfection. Post-transfection, total cellular RNA is isolated, and the efficiency of exon splicing in the reporter mRNA is determined by either primer extension or semi-quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). We describe how the impact of disease associated 5&#8242; splice-site mutations can be determined by introducing them in the reporter; and how the suppression of these mutations can be achieved by co-transfection with U1 small nuclear RNA (snRNA) construct carrying compensatory mutations in its 5&#8242; region that basepairs with the 5&#8242;-splice sites at exon-intron junctions in pre-mRNAs. Thus, the reporter can be used for the design of therapeutic U1 particles to improve recognition of mutant 5&#8242; splice-sites. Insertion of cis-acting&#160;regulatory sites, such as splicing enhancer or silencer sequences, into the reporter can also be used to examine the role of U1 snRNP in regulation mediated by a specific alternative splicing factor. Finally, reporter expressing cells can be incubated with small molecules to determine the effect of potential therapeutics on constitutive pre-mRNA splicing or on exons carrying mutant 5&#8242; splice sites. Overall, the reporter assay can be applied to monitor splicing efficiency in a variety of conditions to study fundamental splicing mechanisms and splicing-associated diseases.

This protocol describes a minigene reporter assay to monitor the impact of 5&#180;-splice site mutations on splicing and develops suppressor U1 snRNA for the rescue of mutation-induced splicing inhibition. The reporter and suppressor U1 snRNA constructs are expressed in HeLa cells, and splicing is analyzed by primer extension or RT-PCR.

접합 효율 모니터링을 위한 기자 기반 셀룰러 분석

During gene expression, the vital step of pre-mRNA splicing involves accurate recognition of splice sites and efficient assembly of spliceosomal complexes ...

생화학

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

간엽 전환을 유도하고 상피의 분석

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

생물학

Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also be utilized to explore other complex regulatory mechanisms at the exon level. Alternative splicing and polyadenylation play a crucial role in the functional diversity of a gene by generating different isoforms to regulate gene expression at the post-transcriptional level, and limiting analyses to the whole gene level can miss this important regulatory layer. Here, we demonstrate detailed step by step analyses for identification and visualization of differential exon and polyadenylation site usage across conditions, using Bioconductor and other packages and functions, including DEXSeq, diffSplice from the Limma package, and rMATS.

Alternative splicing (AS) and alternative polyadenylation (APA) expand the diversity of transcript isoforms and their products. Here, we describe bioinformatic protocols to analyze bulk RNA-seq and 3' end sequencing assays to detect and visualize AS and APA varying across experimental conditions.

RNA-seq 데이터에서 대체 스플라이싱 및 폴리아데닐화 식별

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also ...

RNA Splicing

Splicing is the process by which eukaryotic RNA is edited before its translation into protein. The RNA strand transcribed from eukaryotic DNA is called the primary transcript. The primary transcripts that become mRNAs are called precursor messenger RNAs (pre-mRNAs). Eukaryotic pre-mRNA contains alternating sequences of exons and introns. Exons are nucleotide sequences that code for proteins, whereas introns are the non-coding regions. In RNA splicing, introns are removed and exons are bonded together.
Splicing is Mediated by the Spliceosome
Splicing occurs in the nucleosome and is mediated by a complex of proteins and small RNAs called small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs). snRNPs, together with other proteins, form the spliceosome, which recognizes specific nucleotide sequences at the ends of the exon and intron. First, it binds to a GU-containing sequence at the 5&#39; end of the intron and to a branch point sequence containing an A towards the 3&#39; end of the intron. In a number of carefully-orchestrated steps, other snRNPs then bring the branch point close to the 5&#39; splice site. Subsequently, a chemical reaction cleaves the 5&#39; end of the intron from its upstream exon and attaches it to the branch point, forming a loop called a lariat. To release the lariat, the AG-containing sequence of the intron near the 5&#39; end of the downstream exon reacts with the 3&#39; end of the upstream exon. This reaction patches the two exons together, concluding the splicing process.
Splicing Allows the Expression of Several Proteins from a Single Gene
Typically, exons are joined together in the order in which they appear in a gene. However, during alternative splicing, different combinations of exons in pre-mRNA are combined to form mature mRNA. This produces several different proteins from a single pre-mRNA transcript.
Different patterns of alternative splicing include exon skipping, alternative 5&#39; or 3&#39; splice sites, and intron retention. These patterns are guided by the length of exons or introns and the strength of the splicing signal at the splice sites. Because of this, exons that are shorter than other exons may be overlooked by the spliceosome and omitted from the mature mRNA. In contrast, introns that are significantly shorter than other introns may evade removal by the spliceosome and are retained in the mature mRNA. As a result, alternative splicing generates variants of mature mRNA that were copied from the same stretch of DNA. The RNA sequence variants produce different proteins with additional or fewer amino acids, shifts in the reading frame, or a premature stop codon. These protein isoforms have different biological properties, including function, cellular localization, and interaction with other proteins, thereby playing a vital role in tissue- and environment-specific gene expression.
Abnormal Splicing Can Cause Diseases
Errors in splicing can produce aberrant protein isoforms, which may contribute to diseases, including cancer. For instance, alternative splicing of the BCL2L1 gene generates a long and short protein isoform&#8212;BCL-XL and BCL-XS, respectively&#8212; through the use of alternative 5&#39; splice sites. The longer BCL-XL isoform promotes cell survival and is highly expressed in several types of cancers (e.g., blood, breast, and liver cancers). Expression of the short BCL-XS isoform that promotes cell death is suppressed in cancer.

RNA Splicing, Lariat and the Spliceososme

RNA 스플라이싱

Splicing is the process by which eukaryotic RNA is edited before its translation into protein. The RNA strand transcribed from eukaryotic DNA is called ...