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</ol>

The authors have nothing to disclose.

NMR 분광법은 매우 정확하고 재현 가능한 방식으로 용액 화학 물질의 농도를 측정하기위한 효율적인 방법이다. 그러나, 고품질의 데이터를 얻기 위해 그 샘플 준비 및 분석에 관한 소정의 규칙에 적용하는 것이 필요하다. 관측 된 신호의 강도가 검출 임계치 (특히 약한 신호)에 접근하지 않는 NMR 분광법에 의한 대사 산물 농도의 결정에있어서, 생성이나 NMR 신호의 수신도는 정량 오류를 지배하고있다. 다른 모든 경우 생물학적 변동, 시료 전처리 기법 (추출 효율, 화합물의 물리적 및 화학적 안정성, 피펫 및 오류 등을 계량), 및 / 또는 정밀도와 결과의 정확도를 결정하는 신호 획득 및 처리 파라미터의 선택에. 물론, 조직 수확하는 동안 발생하는 모든 신진 대사의 변화는 농도가 얻을 대사에 반영됩니다에디션. 따라서, 가능한 한 빠르게 조직 수확을 완료하고, 이러한 깔때기 빠르게 대사 화합물의 생체 내 농도에서 정확한 경우 동결로서 특정 조직 동결 기법을 적용 (중요 매우 중요 특히 글루코스, 락 테이트, ATP와 catabolites, ADP 및 AMP). 심지어 루틴 고해상도 NMR 분광계 우수한 스펙트럼의 중간 자계 강도 (9.4 T)를 얻을 수있다. 예를 들어, 쥐의 뇌 추출물의 성상의 1 H NMR 스펙트럼에서, 그 차이는 화학 시프트 신호, Δδ가 (400 ㎒의 공진 주파수에서 2.0 Hz로 대응) 0.005 ppm의 CA에 별도로 식별 및 정량화 될 수 달한다. 그림 1;이 그것의 기초 (젖산 13 C 위성 이중에있는 작은 봉우리에서 (내가) 젖산과 쓰 레오 닌 이중선, 그리고 (ii) 알라닌 이중의 부분 분리에 의해 도시된다) 최고. 이 장비로 인해 높은 구매 비용 NMR 실험실에서 흔하지 있지만 높은 분야 (14.1 또는 18.8 T)에서 작동 분광계는 더 해상도와 감도를 증가시킬 것이다. 1 H NMR 분광기를 사용하여 대사 산물의 넓은 범위에 하나의 취득, 즉 동시에 분석 될 수있다. 이 선택은 비례 적 측정 시간이 증가하더라도 실험의 감도는, 축적 된 과도 상태의 수를 증가시킴으로써 향상 될 수있다. (신호 대 잡음 비율은 과도 상태의 개수의 제곱근에 비례한다.) 그러나, 상기 프로토콜에서 주어진 최대 총 획득 시간 - 양 않는 거의 모든 목적을 위해 충분해야한다 (20 ~ 30 분) 추출 가능한 조직으로 매우 제한되어있다. 가장 민감한 NMR 핵 (양성자)의 활용 외에, 메타 볼로 1 H NMR 분광법은 종합의 이점을 갖는다데이터베이스는 다른 필드의 강점에 사용할 수있는 샘플의 pH는 10 값. 또한, 자동 또는 반자동 스펙트럼 평가를위한 소프트웨어는 10 사용할 수있게되었다. 조직 추출물의 1 H NMR 스펙트럼이 잘 킬레이트 제를 첨가하지 않고 해결 될 수 있지만, 이것은 더 이상 31 P NMR 스펙트럼도 마찬가지입니다. 사실, 킬레이트 제의 농도 (예를 들면, EDTA 또는 CDTA)은 선폭 인산화 대사 따른 31 P NMR 신호의 화학 시프트 양에 중대한 영향력을 사용했다. 추출물의 농도가 증가 CDTA 31 P NMR의 선폭이 감소하지만, 이러한 장점은 이웃 피크의 화학적 이동, Δδ 사이의 작은 차이에 의해 압도 될 수있다. 따라서, 킬레이트 제의 양은 함께 선폭과 화학적 이동 모두에 대해 최적화 할 수있다 사용된다. 지질 추출물, 이러한 두 스펙트럼 파라미터는 significa 아르ntly뿐만 아니라, pH 값 및 NMR 측정시 시료의 온도에 의해 추출 된 조직의 양, 즉, 전체 시료 농도의 영향. 결과적으로, 측정 조건 중 어느 최적화는 모든 관련 파라미터 실험이없는 첨가제의 몇몇의 결합 효과를 고려해야한다. 이 상황의 복잡성은도 2에 도시 된 PL 31 P NMR 스펙트럼의 동작으로 예시된다. 낮은 조직 농도 (118 ㎎ / ㎖), 최저 온도 (277 K) 및 최고 CDTA 농도 (1000 밀리미터)를 시험했지만 최소 선폭을 초래할 것이고, 제안 된 프로토콜은 신호 중복을 피하기 위해 적절한 조직 농도 (236 ㎎ / ㎖), 중간 CDTA 농도 (200 mM)을 실온 (297 K)의 사용을 권장한다. 샘플 준비 및 스펙트럼의 획득 조건이지만, 매우 중요하다원시 데이터로부터 취득한 정보 중 최대 값을 추출하는 스펙트럼 프로세싱 파라미터의 역할은 과소 평가되어서는 안된다. 처리 파라미터의 특정 세트는 검출 및 낮은 농도에서 발생 치하 정량 이상적의 나; 그러나, 동일한 매개 변수의 세트는 &#39;혼잡&#39;스펙트럼 영역 (그림 3, 오른쪽 위)의 각 피크를 모호하게 할 수 있습니다. 반대로, 강력하게 중복 공명 (그림 3, 하단)의 영역에서 최적의 해상도 향상을 제공하는 처리 매개 변수는 낮은 강도의 피크가 발견되지 않아야한다. 광범위한 PL 31 P NMR의 데이터베이스도 포함 13,14 최근 발전은, 크게 13,14 NMR 스펙트럼의 분석을 용이하게한다. 궁극적으로, 애플리케이션의 기본 목적은 분광 해상도, 감도, 대사 quantif의 정밀도의 원하는 균형, 즉 최적화 기준을 정의해야가스화, 속도, 및 다른 요인. 예를 들면, 추천 한 위상이 상 시스템 (도 3, 상단 좌측)보다 더 안정적이고 효율적인 PL 정량화 PL 분석 허가를위한 시스템 및이 덜 풍부한 치하의 정량 높은 스펙트럼 해상도뿐만 아니라 충분한 감도를 제공한다 . 이 쉽게 샘플 상분리에 이르게되지만 그러나 최상의 신호 분리가 효율적이고 정확한 정량을보다 높은 우선 순위 인 경우에, 용매 혼합물에 클로로포름 (D)의 높은 비율의 사용이 시도 될 수있다. 이 경우, 하층의 부피는 PL 절대 양을 얻기 위해 결정되어야한다 (MG PL, g 조직 또는 밀리그램 당 총 단백질). 양성자 디커플링 헤테로 핵의 NMR 실험에서의 신호 강도를 빠르게 획득 방식에 포화 상태에 부가하여, 핵 Overhauser 효과 (NOE)에 의해 변경 될 수있다. 교정되지 않은 경우 이러한 효과는 대사 산물 ...로서 발생ntitation 오류가 발생합니다. 이 도전을 다루는 두 가지 다른 전략이있다. 첫 번째 방법에서는 인수의 개별 과도 긴 지연으로 구분됩니다. 이 방법은 모든 포화를 방지 또는 NOE하지만, 상대적으로 긴 실험 결과; 정밀하고 정확한 결과가 필요한 경우에 사용한다. 어떤 경우에는, 우선 순위는 단지 과도 높은 번호를 사용하여 측정 할 수 매우 희석 된 샘플에 대해, 특히, 신속한 스펙트럼 취득에 제공 될 필요가있다. 이러한 경우, 샘플 상자성 이완 화제의 첨가는 포화 또는 NOE없이 신속한 데이터 수집을 허용한다. 대안 적으로, 상자성 화제의 첨가없이 고속의 데이터 수집을 채용 할 수있다. 후자의 방법은 휴식 제의 존재에 대한 대사 물질의 정량의 정밀도를 감소시킬 수있다 NMR 신호들의 일부 넓어짐을 야기하는 반면, 각 NMR 공명 결정되어야하는 정정 인자로서 신호 영역의 보정을 필요혼잡 한 스펙트럼 영역. 일반적 실험 조건의 최적의 선택은 샘플의 유형에 의해 좌우되지 않고, 또한 실험에 의해 정보 (13)로부터 추출한다. 높은 우선 순위가 높은 정밀도와 정확도를 필요로하지 않고, 오히려 풍부한 대사 빠른 분석에 부여되어야하는 경우, 고농도의 샘플을 측정하여 상자성 이완 에이전트가 샘플에 첨가 가능성과 함께, 짧은 반복 횟수를 사용하는 것이 적합 할 수있다. 대사 산물의 대량 정량의 정확한 속도보다 더 중요한 경우 여기 제시된 프로토콜 있듯이 대조적으로, 그것은 덜 농축 된 추출물을 사용하는 NMR 및 긴 획득 시간을 허용하는 것이 바람직하다. 특정 연구 프로젝트는 특정 대사를 강조하는 경우 또한, 실험 조건은 해당 스펙트럼 영역에 대한 최적의 스펙트럼 해상도를 달성하도록 조정될 수있다. 여기에 제시된 프로토콜과 논의는 O를위한 가이드 역할을 할 수 있습니다NMR 분광법에 의한 원유 조직 추출물의 대사 체 분석 ptimization.

쥐 모델은 뇌 연구 1에서 광범위하게 활용되고있다. 유전자형 표현형 상관 관계는 다른 2-6 한편 RNA 및 / 또는 단백질 수준에서 유전자 발현을 연구함으로써, 마우스 및 래트의 뇌에 조사하고, 형태 학적 기능, 전기 생리 학적 및 / 또는 행동 적 표현형되었다. 그러나, 완전히 유전자형 표현형에 연결 메커니즘을 이해하기 위해서는 하류 단백질 발현, 즉 분자의 사건을 조사하는 것이 필수적이다. 효소는 7 행동을 두는 생화학 기판의 신진 대사. 이 요구 사항은 생물학 8,9의 여러 가지 대사 연구의 르네상스로 지난 10-15년 이상했다. 고전 대사 연구는 종종 특정 경로의 상세에 집중되었지만, 새로운 메타 볼로 접근법 고려 조직의 대사 프로파일의 글로벌 모두 포괄 맞도록 조사된다.이 개념 중 하나 결과는 특정 대사 경로 및 / 또는 화합물의 클래스에 대한 편견을 최소화 분석 도구에 대한 명백한 필요합니다. 그러나, 전통적인 생화학 적 분석은 분석이 수행되기 전에 지정해야 특정 분석 물의 특정 화학 반응에 기초한다. 대조적으로, 핵 자기 공명 (NMR) 분광법 및 질량 분석법 (MS) (I)와 같은 광학적 기술은 생화학 물질, 특정 분자 (물리적) 특성을 기반으로는 각각의 스펙트럼에있어서, 하나 또는 다수의 별개의 신호를 일으킨다 한 실험 과정에서 검출; 및 (ⅱ) 실험마다 상이한 다수의 화합물을 검출한다. 따라서, 각각의 스펙트럼은 대사 산물의 전체 범위의 결합 된 정보가 포함되어 있습니다. 더 이전의 선택은 피 분석의 특성에 관한 8 측정 할 할 필요가 없기 때문에 이러한 이유로, 분 광학적 방법은 대사 체학을위한 적절한 툴, 아르 </sup&gt;. 그들은 매우 예기치 대사 변화의 검출을 용이하게하기 때문에 결과적으로, 이들 기술은 자연 탐색 연구에는 적합. NMR 분광기 및 MS는 많은 대사 분석을 위해 상호 교환 적으로 사용될 수 있지만, 각각의 방법은 특정의 장점과 최근 10를 평가 한 단점을 가지고있다. 간단히, NMR 분광법은 보통 조 추출물에서 수행 할 수 있으며, 분석하기 전에 샘플 화합물을 크로마토 그래피 분리를 필요로하지 않는다. 반면, MS는 질량 분석 이미징 특히 최근 개발을 제외하고, 기체 또는 액체 크로마토 그래피 (GC 또는 LC) 분리와 함께 작동합니다. 다른 당의 공진 라인 (1 H) 양성자 NMR 스펙트럼에서 상당히 중첩 때문에 이러한 당의 분석과 같은 몇몇 특별한 경우에서, LC 분리는 물론 NMR 분광법에 대한 필요성이 될 수있다. CHR없이 그럼에도 1 H NMR 분광법omatographic 분리는 가장 인기있는 거의 보편적으로 적용 메타 볼로 NMR 방법 남아있다. 일반적으로, 샘플 준비는 NMR 분광법에 대해 MS보다 더 많은 시간이 걸리고 복잡한이다. 매트릭스 효과로 인해 심각한 문제가 많은가 상당히 약화 신호로 이어질 수있는 위치 MS보다 NMR 분광법 덜 일반적이다. 대사 정량은 어느 방법으로 달성 될 수있다. 그러나, 여러 표준 화합물 인해 대사 사이의 매트릭스 효과 및 이온화 효율의 변동에 MS 필요하다. 대조적으로, 샘플 당 하나의 표준 때문에 적절한 측정 조건 하에서 NMR 분광 분석에 필요한, ​​후자의 방법은 본질적으로 관측 핵에 의해 엄격하게 선형 응답 NMR로 정량 덕분이다. NMR의 주요 단점은 상대적으로 낮은 민감도이다. MS, 특히 LC-MS에 몇 배에 의해 NMR보다 더 민감하다; 이러한 이유로, MS는 NMR에 대해 선호 될매우 낮은 농도에서 발생하는 화합물의 분석. 한편, NMR 실험의 비파괴 특성은 MS 위에 분명한 장점은; 이러한 방식으로, NMR은 1 H, 인-31 (31 P), 탄소 -13 (13 C) 같은 다른 NMR-활성 핵 위해, 예를 들어 동일한 샘플에 반복적으로 수행 할 수있는 불소 - 19 (19 F) 등., MS 측정 반대로 어떤 물질이 NMR에 의해 소비되지 않은 것처럼. NMR 및 MS 모두는 상이한 모드로 사용될 수 있으며, 각각의 하나는 특정의 화학적 특성을 갖는 화합물의 검출에 최적 인. 거의 모든 대사 인산화도 양자를 포함 할지라도, 예를 들어, 31 P NMR 종종 적당히 농축 인산화 분석 화합물의 1 H NMR보다 더 적합하다. 그러나, 그들의 1 H NMR 신호는 후자 반면, 다른 비 - 인산화 된 화합물 1 H NMR 신호에 의해 가려 질 수도분명히 31 P NMR 스펙트럼에서 배경 신호를 발생하지 않습니다. 13 C NMR의 특별한 경우는 거의 독점적으로 관심있는 동안 아날로그 상황에서, 19 F NMR 분석, 불소 화합물, 예를 들면, 플루오르 화 약물 (내인성 대사에서 배경 없음 신호)에 바람직 할 경우 13 C-의 운명 표시 외인성 대사 전구 물질로 인해 13 C 동위 원소 (약 1 %)의 매우 낮은 자연 풍부 따라야합니다. 많은 질량 분석기는 음이온 모드 또는 양이온 모드에서 작동합니다. 따라서, 앞서 이온이 부정적 또는 긍정적으로 청구됩니다 관찰 할 수 있는지 여부를 분석 아는 것이 중요합니다. 이 방법은 시료 준비에 필요한 (I)의 시간적으로 저비용으로 중요한 대사 산물 농도의 많은 수를 산출하기 때문에 우리는 1 H, 31 P NMR 분광법에 의한 뇌 조직의 대사 체의 분석 프로토콜에 여기에 집중차 (II) 노력은 대사 산물 정량이 필요합니다. 모든 실험은 표준 습식 화학 실험실의 장비 및 고해상도 NMR 분광법 설비를 사용하여 수행 될 수있다. 또한 요구 사항은 아래의 프로토콜 부분에 설명되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>Virbac</td><td>Vetflurane</td><td>Anesthetic for animals</td></tr><tr><td>Isoflurane vaporizer</td><td>Ohmeda</td><td>Isotec 3</td><td>Newer model available: Isotec 4</td></tr><tr><td>Scalpel, scissors, forceps, clamps</td><td>Harvard Apparatus&lt;br/&gt; Fisher Scientific</td><td>various&lt;br/&gt; various</td><td>Surgical equipment for animals</td></tr><tr><td>Freeze-clamp tool</td><td>homebuilt</td><td>n/a</td><td>Tong with aluminium plates, to be inserted&lt;br/&gt; in liquid nitrogen for cooling</td></tr><tr><td>Dewar</td><td>Nalgene</td><td>4150-4000</td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td>Air Liquide</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogen gas</td><td>Air Liquide</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogen evaporator</td><td>Organomation Associates</td><td>N-EVAP 111</td><td>Can be replaced by homebuilt device</td></tr><tr><td>Mortar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z247472</td><td></td></tr><tr><td>Pestle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z247510</td><td></td></tr><tr><td>Tissue homogenizer</td><td>Kinematica</td><td>Polytron</td><td>With test tubes fitting homogenizer shaft</td></tr><tr><td>Electronic scale</td><td>Sartorius</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3641</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>366910</td><td></td></tr><tr><td>Glass centrifuge tubes</td><td>Kimble</td><td>45500-15, 45500-30</td><td>Kimax 15 ml, 30 ml tube</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes</td><td>Kimble</td><td>45150-2</td><td>Kimax 2 ml tube; should replace &quot;Eppendorf&quot; tube if compatible with centrifuge rotor</td></tr><tr><td>Polystyrene pipettes</td><td>Costar Corning</td><td>Stripettes</td><td>5 and 10 ml volumes</td></tr><tr><td>Deuterochloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431915</td><td>99.96% deuterated</td></tr><tr><td>Deuterium oxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>423459</td><td>99.96% deuterated</td></tr><tr><td>Deuterium chloride</td><td>Alpha Aesar</td><td>42406</td><td>20% in deuterium oxide</td></tr><tr><td>Sodium deuteroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>164488</td><td>30% in deuterium oxide</td></tr><tr><td>Lyophilizer</td><td>Christ</td><td>Alpha 1-2</td><td></td></tr><tr><td>Cold centrifuge</td><td>Heraeus</td><td>Megafuge 16R</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Eutech Cybernetics</td><td>Cyberscan</td><td></td></tr><tr><td>CDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0922</td><td></td></tr><tr><td>Cesium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>516988</td><td></td></tr><tr><td>NMR tubes</td><td>Wilmad</td><td>528-PP</td><td></td></tr><tr><td>NMR stem coaxial insert</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z278513</td><td>By Wilmad</td></tr><tr><td>NMR pipettes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z255688</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Eppendorf</td><td>Research</td><td>With tips for volumes from 0.5 to 1,000 &amp;mu;l</td></tr><tr><td>Pipet-Aid</td><td>Drummond</td><td>XP</td><td></td></tr><tr><td>NMR spectrometer</td><td>Bruker</td><td>AVANCE 400</td><td>including probe and other accessories</td></tr><tr><td>NMR software</td><td>Bruker</td><td>TopSpin 1.3</td><td>newer version available: Topspin 3.2</td></tr><tr><td>Water-soluble standard compounds</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>various</td><td></td></tr><tr><td>Phospholipid standard compounds</td><td>Avanti Polar Lipids&lt;br/&gt; Doosan Serdary&lt;br/&gt; Sigma-Aldrich</td><td>various&lt;br/&gt; various&lt;br/&gt; various</td><td>Source for plasmalogens, but may be &amp;lt;70 - 80% purity</td></tr><tr><td>Methylenediphosphonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9508</td><td></td></tr><tr><td>TSP-d4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>269913</td><td></td></tr></tbody></table>

metabolomic analysis of rat brain by high resolution nuclear magnetic resonance spectroscopy of tissue extracts

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics and proteomics have been complemented by comprehensive quantitative analysis of the metabolite pool present in biological systems. This strategy, termed metabolomics, strives to provide a global characterization of the small-molecule complement involved in metabolism. While the genome and the proteome define the tasks cells can perform, the metabolome is part of the actual phenotype. Among the methods currently used in metabolomics, spectroscopic techniques are of special interest because they allow one to simultaneously analyze a large number of metabolites without prior selection for specific biochemical pathways, thus enabling a broad unbiased approach. Here, an optimized experimental protocol for metabolomic analysis by high-resolution NMR spectroscopy is presented, which is the method of choice for efficient quantification of tissue metabolites. Important strengths of this method are (i) the use of crude extracts, without the need to purify the sample and/or separate metabolites; (ii) the intrinsically quantitative nature of NMR, permitting quantitation of all metabolites represented by an NMR spectrum with one reference compound only; and (iii) the nondestructive nature of NMR enabling repeated use of the same sample for multiple measurements. The dynamic range of metabolite concentrations that can be covered is considerable due to the linear response of NMR signals, although metabolites occurring at extremely low concentrations may be difficult to detect. For the least abundant compounds, the highly sensitive mass spectrometry method may be advantageous although this technique requires more intricate sample preparation and quantification procedures than NMR spectroscopy. We present here an NMR protocol adjusted to rat brain analysis; however, the same protocol can be applied to other tissues with minor modifications.

추출 솔루션의 현재 : 두뇌와 다른 조직 추출물의 대사 NMR 스펙트럼에서 최상의 해상도를 얻으려면, 그것은 긴 제거하거나 (상자성 이온 가장 중요한) 마스크 금속 이온을하는 것이 일반적이었다. 이것은, 또는 Chelex-100 (20)로 이온 교환 수지를 통해 추출물을 전달하여 추출물 19 EDTA 또는 CDTA 같은 킬레이트 제를 첨가함으로써 하나를 달성되었다. 도 1에 제시된 결과는 뇌 추출물을 조심스럽게 상기 프로토콜에 따라 제조하는 경우에는이 단계는 1 H NMR 분광 분석에 대한 필요가 없다는 보여준다. 여기서, 매우 좁은 스펙트럼 선 분석 스펙트럼 모든 영역에 대해 얻어졌다. 심지어 글루타민 / 글루타메이트와 미오의 -inositol / 글리신 매우 혼잡 한 지역, 예를 들면,에, &lt;0.01 ppm으로 거리에서 피크가 거의 400 메가 헤르츠 (그림 1, 아래)에서 완전히 분리 할 수 있습니다. 결과적으로, 질적,도 1의 중앙 및 하부 패널에 보이는 작은 다수 있지만 현재 미사용 피크의 정량 분석은 미래에 예상 할 수있다. <img alt="그림 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51829/51829fig1highres.jpg" width="300" /> 도 암컷 루이스 래트에서 뇌 조직 추출물의 성상의 전형적인 한 H의 NMR 스펙트럼 (400 MHz)의 1 하위 영역은. 세 패널은 매우 높은 해상도를 얻을 수있는 본 논문에서는 프로토콜을 사용하여 설명한다. 어느 킬레이트 화제 나 이온 교환 수지를 샘플 제조 동안 사용되어왔다. 리소스 및 하부 패널은 최적화 실험 파라미터들을 사용하여 수행하는 경우 조직 추출물의 고해상도 1 H NMR 분광법에 의해 덮여 거 동적 범위 암시 많은 미사용 둘러 강도 피크의 존재를 나타낸다. 이 약하지만 잘검출 신호는 잠재적으로 식별하고 장래 정량화 될 수있다. 여러 감지 대사, 뇌 조직의 특정 예를 들면, 신경 세포 마커 NAA 또는 신경 전달 물질 인 GABA.; 그러나, 대부분의 화합물은 예컨대 아미노산, 분지 쇄 유기산, 폴리올, (포스) 지질 및 에너지 대사뿐만 아니라 작용과 glutaminolysis에서와 같이 포유 동물 세포에 공통적 인 대사 경로의 광범위한 스펙트럼에 관여 이러한 삼투압 조절, 세포 성장 및 증식과 같은 기능을한다. 별표는 메탄올 불순물에 따른 메틸 공명을 나타낸다. 요약 : 람, 알라닌; 락, 락 테이트; 트레오, 트레오닌; BHB, β-하이드 록시; 발, 발린; ILE, 이소류신; 레우, 류신; AAB, α-aminobutyrate; AHB, α-하이드 록시; 타우, 타우린, SCY -Ins, scyllo -inositol, 미오 -Ins, 미오의 -inositol; GPC, glycerophosphocholine; PC, 포스 포 콜린; 초, 콜린; CRN, 크레아티닌; 크레아틴 크롬; GABA,47; -aminobutyrate; ASP, 아스 파르 테이트; NAA, N의 -acetylaspartate; GLN, 글루타민; GLU, 글루타메이트; SUC, 숙시 네이트; NANA, N의 -acetylneuraminate; 교류, 아세테이트; GLY, 글리신. 젖산 13 C 위성 이중 (상단 패널)에서 알라 이중 줄기의 기지에서 작은 봉우리. 크리에이티브 커먼즈 저작자 표시 라이센스에 따라 재판 (CCAL) 루츠 NW 등 실험자가 면역 뇌척수염 및 보조 관절염 (2013) 뇌 생화학 적 경로의 용어 :. 비교 대사 체 연구. PLoS의 ONE 8 (2). e56101 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51829/51829fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 31 P NMR 분광법에서 상자성 양이온 (주로 철)를 마스킹하거나 제거하는 인산염 쉽게 가의 3가 이온과 복합체를 형성하기 때문에 필요성은 의심 할 여지없이이다. 추출물에 첨가 CDTA 두 스펙트럼 라인을 너비 영향D 화학적 이동; 그림 2, 상단과 하단 왼쪽을 비교합니다. 밀리미터 (왼쪽 아래) 1000 밀리미터를 선택하는 대신 200에 의해 라인이 좁아은 (왼쪽 위) CDTA 원하는하지만 (왼쪽 상단)을 개별적으로 정량화해야한다 PL 신호의 중첩 결과했다. 따라서, 200 mM의 CDTA는 PL 용매의 수성 성분을 권장합니다, 다른 모든 조건이 동일하다면. 또한, 측정시의 샘플 온도는 스펙트럼 선폭과 같은 화학적 쉬프트에 영향을 미친다; 그림 2, 상단과 오른쪽 하단을 비교합니다. 대신 297 K (오른쪽 위)의 (오른쪽 아래) 277 K를 선택하여 라인 축소 원하는하지만, (오른쪽 위) 개별적으로 정량화해야한다 PL 신호의 중첩 결과했다. 따라서, 297 K가 측정 온도로 추천, 다른 모든 조건이 동일하다면. 이 상단 패널의 비교는 보여줍니다 50 밀리미터 (오른쪽 위) 만 결과에 200 밀리미터 (왼쪽 위)에서 CDTA 농도의 감소라인의 완만 한 증가 폭, 화학 변화에 거의 변화. 그러나, 우측 상단 패널 (13)에 상대적으로 좁은 라인을 설명, 200 mM의 CDTA 추출물에서와 같이 50 mM의 CDTA 추출물 조직 농도가 높은 반되어 있습니다. <img alt="그림이" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51829/51829fig2highres.jpg" width="500" /> 그림 2 포스파티딜 에탄올 아민 (PtdE) 여성 루이스 쥐에서 뇌 조직 추출물의 인지질 31 P NMR 스펙트럼 (162 MHz의) (위 왼쪽 패널) 뇌 조직 농도의 지역, 236 ㎎ / ㎖.; CDTA 농도 및 용매의 수성 성분의 pH, 200 mM의 각각 7.33; 측정 온도는 297 K. PtdE 원형질 및 SM 신호는 잘 해결된다 (하부 왼쪽) 뇌 조직 농도 236 ㎎ / ㎖.; CDTA의 concentration과 용매의 수성 성분의 pH, 1000 mM의 각각 7.36; 측정 온도, 297 K. PtdE 원형질 및 SM 신호가 완전히 중복; 그들은 좌측 상단 스펙트럼에 비해 감소 된 선폭에도 확인할 수없는 (오른쪽 위) 뇌 조직 농도 118 ㎎ / ㎖.; CDTA 농도 및 용매의 수성 성분의 pH를 50 mM의 각각 7.14; 측정 온도는 297 K. PtdE 및 SM 신호는 잘 해결된다 (하부 오른쪽) 뇌 조직 농도 118 ㎎ / ㎖.; CDTA 농도 및 용매의 수성 성분의 pH를 50 mM의 각각 7.14; 측정 온도, 277 K. PtdE 및 SM 신호가 완전히 중복; 그들은 상단 오른쪽 스펙트럼과 비교하여 감소 된 선폭에도 불구하고, 해결 될 수 없다. 요약 : PtdE 원형질, 에탄올 아민 plasmalogen; PtdE, 포스파티딜 에탄올 아민; SM, 스 핑고 마이 엘린; PTD로는, phosphatidylserine; PTDC, 포스파티딜콜린. 루츠 NW 외. (2010) 원유 조직 추출물의 인지질의 31 P NMR 분광 분석 Multiparametric 최적화의 허가 재판. 1 화학 시프트 및 신호 분리. 아날 켐 82 (13) : 5433-5440. 저작권 2010 미국 화학 학회. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51829/51829fig2highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 상기 프로토콜 (1 단계 시스템 (14)]도 3, 상단 좌측)를 사용하여 상당한 농도 범위를 덮고, 정량화 치하 다수 검출되었다 (도 3, 상단 오른쪽) (절단 된 고휘도 신호를 참고). 이러한 신호의 일부는 (U1, U2, U6) 아직 할당되지 않은입니다. 이 프로토콜에 나타낸 바와 같이 샘플 준비, NMR 스펙트럼 측정 및 처리를 수행하는 경우, 스펙트럼 해상도 일상적 내지 D에도 충분특정 피크의 부분 분할 etect (PTD로는, PtdE, PtdE 원형질, AAPtdE을, 왼쪽 아래). . PtdC1u는 PL이 유래 한 결과, 정 성적 및 미래에 예상 할 수 있고, 또한 PL 서브 그룹의 정량 분석으로 제 3, 오른쪽 아래 도표 부분적 여기 저농도 화합물 (별도의 신호가 적절히 선택된 처리 파라미터의 파워를 도시 공진 완전히 식별되지 PTDC 및 PTDC 원형질)에게서 매우 강한 신호 (주변 : PTDC). <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51829/51829fig3highres.jpg" width="500" /> 암컷 루이스 래트에서 뇌 조직 추출물도 3 인지질 31 P의 NMR 스펙트럼 (162 MHz의). (위쪽 왼쪽 패널) 1 단계 시스템 (왼쪽)이 상 시스템 (오른쪽)보다 선호 하였다. 일반적으로 사용되는 두 가지 상 시스템은 올바른 방해상위 단계의 대부분이 코일의 민감한 볼륨 외부에 위치하기 때문에 PL 정량. (오른쪽 위 패널) 쥐의 뇌 전체 31 P NMR PL 스펙트럼. 약한 신호 (PtdIP, PtdG), 지수 선폭 (LB = 3 Hz에서) 더 나은 가시성을 위해 적용되었다. 이 표현에서 여러 PL 신호는 특히 PTDC 및 PtdE 지역에서 잘 해결되지 않습니다. 이상의 31 P NMR 신호를 생성 치하 들어, 관측 핵은 (P tdIP, PtdI P, P tdIP 02 PtdI P 2)을 강조한다. 현재 할당되지 않은 신호 &quot;U 않음&quot;(여기서, n = 1, 2, ...). 동일한 스펙트럼 (하단 왼쪽 패널)과 PTD로는 PtdE 영역들로 표시된다. 더 나은 최고 해상도의 경우, 로렌츠 가우시안 라인 형상 변환이 적용되었다 (LB = -1 Hz에서, GB = 0.3). 때문에 이러한 처리 파라미터의 대부분 PL 매우 약한 신호는 검출하기 어렵다. 그러나, 적어도 두 개의 피크는 수PtdE 영역과 동일한 처리 매개 변수를 얻을 각 PtdE, PtdE 원형질, AAPtdE 및 PTD로는. (아래 오른쪽 패널) PTDC 영역에 대해 식별 될 수있다. 그들은 지수 선폭 (AAPtdC, PTDC 원형질, PtdC1u)로 생성 상단 스펙트럼에서 식별 할 수없는 상태에서 두드러진 활약을 PTDC 공명의 기지에서 몇 가지 신호는 명확하게 검출되었다. 현재 할당되지 않은 PTDC 아날로그 외에, PtdC1u는 더 작은 공명 PTDC에서 업 필드 존재할 수있다. 요약 : PtdIP, 포스파티딜 이노시톨 인산염; PtdIP이, 포스파티딜 이노시톨 인산; PtdA, 포스 파티 산; PtdG, 포스파티딜 글리세롤; CL, 카디오 리핀; PtdE .. PtdE, PtdE 원형질과 AAPtdE의 합; PtdI, 포스파티딜 이노시톨. 더 약어 전설 참조 그림 2를. 러츠 NW 등의 허가 재판. (2010) phospholipi의 31 P NMR 분광 분석 Multiparametric 최적화원유 조직 추출물 DS. 1 화학 시프트 및 신호 분리. 아날 켐 82 (13) : 5433-5440. 저작권 2010 미국 화학 학회. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51829/51829fig3highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 수확 및 쥐의 뇌를 동결 </td></tr><tr><td> N의 2liq에 대한 듀어.; 클램프를 동결 (예를 들어, 제 Wollenberger 집게, 심판 1과 2, 테이블의 맨 아래.) 마취 챔버; 외과 용 가위; 메스; 청소 알코올 500 ㎖의 병 </td><td> 각각의 1 </td></tr><tr><td> 포셉 </td><td> 이 </td></tr><tr><td> 1 ML의 주사기, 10 ML의 주사기 </td><td> 동물 당 각각 1 </td></tr><tr><td> 25 G 바늘 </td><td> 동물 당이 </td></tr><tr><td colspan="2"></td></tr><tr><td colspan="2"> 샘플 위해 준비ation </td></tr><tr><td> 추출 당 뇌 조직의 전형적인 양은 </td><td> 250-350 mg의 </td></tr><tr><td> 350 mg의 두뇌 조직 - 메탄올의 부피 (250)에서 사용 된 균질화 </td><td> 4 ML </td></tr><tr><td> 5 ㎖의 플라스틱 피펫 </td><td> 추출 당 3 </td></tr><tr><td> 10 ml의 플라스틱 피펫 </td><td> 추출 당 1 </td></tr><tr><td> 유리 병 (≥20 ML 볼륨) </td><td> 추출 당 1 </td></tr><tr><td> 클로로포름 내성 원심 분리 관 </td><td> 추출 당 1 </td></tr><tr><td> 메탄올에 조직 균질화 한 후 대기 기간 (4 ℃에서 혼합물) </td><td> 15 분 </td></tr><tr><td> 물 및 클로로포름 부피는 4 ml의 메탄올에 균질화 뇌 조직에 첨가 </td><td> 4 씩으로 </td></tr><tr><td> 물과 클로로포름과 균질 조직을 혼합 후 대기 기간 (혼합 -20 ° C에서) </td><td> 하룻밤 </td></tr><tr><td> 분리 O를위한 원심 분리유기 추출물 단계 (유리 원심 분리 관)에서 f를 수성 </td><td> 4 ° C에서 40 분 동안 13,000 ×의 g, </td></tr><tr><td> (추출 된 지질을 용해시키는 용매의 혼합물을 수성 상) CDTA 용액의 농도 </td><td> 200 밀리미터 </td></tr><tr><td> 추출 된 지질을 용해시키는 용매 혼합물의 수성상의 pH를 </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td> 지질의 체적비가 31 P PL의 분석에 사용되는 용제 (을 CDCl3 : 메탄올 : CDTA 용액) </td><td> 5 : 4 : 1 </td></tr><tr><td> 350 mg을 뇌 조직 - 용매의 양 (250)에서 추출 된 지질을 용해하는 데 사용 </td><td> 700 μL </td></tr><tr><td> NMR 샘플에서 고체 입자를 회전하는 원심 분리 (microcentrifuge 관) </td><td> 4 ° C에서 30 분 동안 11,000 XG, </td></tr><tr><td> 수용성 대사 물질을 함유하는 시료의 NMR 산도 </td><td> 7.3 </td></tr><tr><td> 시료량 centrif 후, NMR 튜브에 옮겨ugation </td><td> 600 μL </td></tr><tr><td> 31 P NMR 동축 삽입 줄기에서 MDP 농도 </td><td> 20 mM의 </td></tr><tr><td colspan="2"></td></tr><tr><td colspan="2"> NMR 실험 </td></tr><tr><td> NMR 실험 동안 샘플 온도 (피크 오버랩을 최소화하기 위해 조정될 수) </td><td> 25 ° C </td></tr><tr><td> NMR 실험 중에 주파수를 회전 </td><td> 15 ~ 20 Hz에서 </td></tr><tr><td colspan="2"></td></tr><tr><td colspan="2"> 1 H NMR 취득 매개 변수 </td></tr><tr><td> H 2 로크 신호를 제공 솔벤트 </td><td> D 2 O </td></tr><tr><td> 여기 펄스 폭, P1 </td><td> 11 마이크로 초 </td></tr><tr><td> 여기 펄스 증폭기 감쇄 PL1 </td><td> 0dB </td></tr><tr><td> FID 크기, TD </td><td> 32 K </td></tr><tr><td> FID 수집 팀전자, AQ </td><td> 3.283 초 </td></tr><tr><td> 휴식 지연, D1 </td><td> 15 초 </td></tr><tr><td> 용매 진압 지연 D4 </td><td> 6 초 </td></tr><tr><td> 전체 반복 시간 TR </td><td> 24.3 초 </td></tr><tr><td> PPM, SWP의 스펙트럼 폭 </td><td> 12.47 ppm으로 </td></tr><tr><td> Hz에서, SW의 스펙트럼 폭 </td><td> 4,990 Hz에서 </td></tr><tr><td> 수신기 이득, RG </td><td> 512 </td></tr><tr><td> 솔벤트 억제 (연속파) </td><td> CW </td></tr><tr><td> 용매를 억제, 증폭기 감쇠, p19 소 </td><td> 50dB </td></tr><tr><td> 과도의 수, NS </td><td> 32 또는 64 </td></tr><tr><td colspan="2"></td></tr><tr><td colspan="2"> 31 P NMR 취득 매개 변수 </td></tr><tr><td> H 2 로크 신호를 제공 솔벤트 </td><td> 을 CDCl3 </td></tr><tr><td> 여기 펄스 위스콘신DTH, P1 </td><td> 9.5 마이크로 초 </td></tr><tr><td> 여기 펄스 증폭기 감쇄 PL1 </td><td> 4dB </td></tr><tr><td> FID 크기, TD </td><td> 16 K </td></tr><tr><td> FID 취득 시간, AQ </td><td> 2.019 초 </td></tr><tr><td> 휴식 지연, D1 </td><td> 15 초 </td></tr><tr><td> 전체 반복 시간 TR </td><td> 17 초 </td></tr><tr><td> PPM, SWP의 스펙트럼 폭 </td><td> 25 ppm으로 </td></tr><tr><td> Hz에서, SW의 스펙트럼 폭 </td><td> 4,058 Hz에서 </td></tr><tr><td> 수신기 이득, RG (최대) </td><td> 16384 </td></tr><tr><td> 양성자 디커플링 (복합 펄스 디커플링) </td><td> CPD </td></tr><tr><td> 양성자 디커플링, 앰프 감쇄, PL13 </td><td> 19dB </td></tr><tr><td> 과도의 수, NS </td><td> 1500 또는 2000 </td></tr><tr><td colspan="2"></td></tr><tr><td colspan="2"> NMR 데이터 처리 </td></tR&gt; <tr><td colspan="2"> 한 H 해상도 향상, 가우시안 로렌츠 Lineshape 변환 </td></tr><tr><td> 스펙트럼의 전반적인 평가 (필요한 경우, 0.1 &lt;GB &lt;0.4, -0.6을 사용하여, 각각의 스펙트럼 영역에 대해 개별적으로 최적화 &lt;LB &lt;-0.2 Hz에서) </td><td> GB = 0.15, LB는 = -0.2 Hz에서 </td></tr><tr><td> 매우 약한 신호, 예를 들면, 방향족 산은 (또는 LB ≥ 0.5 Hz에서와 아포 다 이즈합니다) </td><td> GB = 0.015, LB는 = -0.3 Hz에서 </td></tr><tr><td> 봉우리 아래 분야 : 사용 lineshape는 공명을 통해 중복 맞는 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td></tr><tr><td colspan="2"> 31 P 해상도 향상, 가우스 로렌츠 lineshape 변환 </td></tr><tr><td> 스펙트럼의 전반적인 평가 (0.05 &lt;GB &lt;0.2와 -3.0 &lt;LB를 &lt;사용하여, 각각의 스펙트럼 영역에 대해 개별적으로 최적화60; -1.0 Hz에서) </td><td> GB = 0.05, LB는 = -1.0 Hz에서 </td></tr><tr><td> 매우 약한 신호, 예를 들어, PtdIP이, PtdA : 아포 다 이즈 </td><td> LB = 3 Hz에서 </td></tr><tr><td> 봉우리 아래 분야 : 사용 lineshape는 공명을 통해 중복 맞는 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td></tr><tr><td colspan="2"> 참조 </td></tr><tr><td colspan="2"> 1 팔라디노 GW, 목재 JJ, 프록터 HJ. 조직 분석에 대한 수정 동결 클램프 기법. 수술 연구 289 저널, 188-190 (1980). </td></tr><tr><td colspan="2"> 2 Wollenberger A, Ristau O, Schoffa G. [조직의 큰 조각의 매우 빠른 동결에 대한 간단한 테크닉]. Pflugers 히프 모피 죽을 gesamte Physiologie 데 Menschen 싶게 데르 Tiere 270, 399-412 (1960). </td></tr></tbody></table> 표 1 실험 고해상도 용 변수 1 H 및 뇌 31 P의 NMR 분광법볼륨 비율 및 뇌 조직 추출 및 NMR 샘플 제조에 사용되는 용매 및 시약의 농도에 대한 조직 추출합니다. 일반적인 값은되게됩니다. 또한 권장 값은 pH와 온도 측정뿐만 아니라 NMR 수집 및 처리 파라미터를 샘플링에 관한 것이다. 프로토콜은 뇌 이외의 조직에 적용하는 경우 약간의 조정이 특히 필요하다. NMR 파라미터는 9.4 T에서 측정을 위해 최적화되어 있고, 다른 자기장 강도에서 작동 분광계 필요에 따라 조정되어야한다.

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Metabolomic Analysis of Rat Brain by High Resolution Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy of Tissue Extracts

The neurochemistry of mammalian brain is changed in many neurological and systemic diseases. Characteristic profiles of cerebral metabolites can be efficiently obtained based on crude extracts of brain tissue. To this end, high-resolution NMR spectroscopy is employed, enabling detailed quantitative analysis of metabolite concentrations (metabolomics).

조직 추출물의 고해상도 핵 자기 공명 분광법에 의한 쥐 뇌의 대사 체 분석

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics ...

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Nanyang Technological University

Research

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Neuroscience

14.8K 조회수.  Aix-Marseille Université. The neurochemistry of mammalian brain is changed in many neurological and systemic diseases. Characteristic profiles of cerebral metabolites can be efficiently obtained based on crude extracts of brain tissue. To this end, high-resolution NMR spectroscopy is employed, enabling detailed quantitative analysis of metabolite concentrations (metabolomics).

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Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for objective diagnosis but also for the evaluation of therapeutic efficacy and resilience to trauma. Ongoing research is directed at identifying molecular biomarkers for PTSD, including traumatic stress induced proteins, transcriptomes, genomic variances and genetic modulators, using biologic samples from subjects' blood, saliva, urine, and postmortem brain tissues. However, the correlation of these biomarker molecules in peripheral or postmortem samples to altered brain functions associated with psychiatric symptoms in PTSD remains unresolved. Here, we present an animal model of PTSD in which both peripheral blood and central brain biomarkers, as well as behavioral phenotype, can be collected and measured, thus providing the needed correlation of the central biomarkers of PTSD, which are mechanistic and pathognomonic but cannot be collected from people, with the peripheral biomarkers and behavioral phenotypes, which can.
Our animal model of PTSD employs restraint and tail shocks repeated for three continuous days - the inescapable tail-shock model (ITS) in rats. This ITS model mimics the pathophysiology of PTSD 17, 7, 4, 10. We and others have verified that the ITS model induces behavioral and neurobiological alterations similar to those found in PTSD subjects 17, 7, 10, 9. Specifically, these stressed rats exhibit (1) a delayed and exaggerated startle response appearing several days after stressor cessation, which given the compressed time scale of the rat's life compared to a humans, corresponds to the one to three months delay of symptoms in PTSD patients (DSM-IV-TR PTSD Criterian D/E 13), (2) enhanced plasma corticosterone (CORT) for several days, indicating compromise of the hypothalamopituitary axis (HPA), and (3) retarded body weight gain after stressor cessation, indicating dysfunction of metabolic regulation.
The experimental paradigms employed for this model are: (1) a learned helplessness paradigm in the rat assayed by measurement of acoustic startle response (ASR) and a charting of body mass; (2) microdissection of the rat brain into regions and nuclei; (3) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for blood levels of CORT; (4) a gene expression microarray plus related bioinformatics tools 18. This microarray, dubbed rMNChip, focuses on mitochondrial and mitochondria-related nuclear genes in the rat so as to specifically address the neuronal bioenergetics hypothesized to be involved in PTSD.

We describe a rat model of post traumatic stress disorder (PTSD) that reveals the persistent alterations in neuroendocrine function and the delayed long-term, exaggerated fear response, characteristic of PTSD patients. The animal model and methods described here are useful for correlating biomarkers in brain nuclei, which are mechanistic but cannot be measured in patients, with biomarkers in peripheral white blood cells, which can.

PTSD의, 신경 Hematologic, 그리고 행동 상관 관계를 누설하는 행위에 대해서는 동물 모델에서 생체

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

연구

의학

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin synthesis. They also supply the host with a considerable amount of nutrients, making this ecosystem an essential metabolic organ. In the context of increasing evidence of the link between the gut flora and the metabolic syndrome, understanding the metabolic interaction between the host and its gut microbiota is becoming an important challenge of modern biology.1-4
 Colonization (also referred to as normalization process) designates the establishment of micro-organisms in a former germ-free animal. While it is a natural process occurring at birth, it is also used in adult germ-free animals to control the gut floral ecosystem and further determine its impact on the host metabolism. A common procedure to control the colonization process is to use the gavage method with a single or a mixture of micro-organisms. This method results in a very quick colonization and presents the disadvantage of being extremely stressful5. It is therefore useful to minimize the stress and to obtain a slower colonization process to observe gradually the impact of bacterial establishment on the host metabolism.
 In this manuscript, we describe a procedure to assess the modification of hepatic metabolism during a gradual colonization process using a non-destructive metabolic profiling technique. We propose to monitor gut microbial colonization by assessing the gut microbial metabolic activity reflected by the urinary excretion of microbial co-metabolites by 1H NMR-based metabolic profiling. This allows an appreciation of the stability of gut microbial activity beyond the stable establishment of the gut microbial ecosystem usually assessed by monitoring fecal bacteria by DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis).6 The colonization takes place in a conventional open environment and is initiated by a dirty litter soiled by conventional animals, which will serve as controls. Rodents being coprophagous animals, this ensures a homogenous colonization as previously described.7
 Hepatic metabolic profiling is measured directly from an intact liver biopsy using 1H High Resolution Magic Angle Spinning NMR spectroscopy. This semi-quantitative technique offers a quick way to assess, without damaging the cell structure, the major metabolites such as triglycerides, glucose and glycogen in order to further estimate the complex interaction between the colonization process and the hepatic metabolism7-10. This method can also be applied to any tissue biopsy11,12.

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

A progressive colonization procedure is described to further assess its impact on the host hepatic metabolism. Colonization is monitored non invasively by evaluating the urinary excretion of microbial co-metabolites by NMR-based metabolic profiling while hepatic metabolism is assessed by High Resolution Magic Angle Spinning (HR MAS) NMR profiling of intact biopsy.

하여 세균없는 마우스 프로 그레시브 콜로니 동안 간장 신진 대사 변경 사항 평가 1 H NMR 분광학

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin ...

면역학 및 감염병학

Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents 

The ability to measure extracellular basal levels of neurotransmitters in the brain of awake animals allows for the determination of effects of different systemic challenges (pharmacological or physiological) to the CNS. For example, one can directly measure how the animal's midbrain dopamine projections respond to dopamine-releasing drugs like d-amphetamine or natural stimuli like food. In this video, we show you how to implant guide cannulas targeting specific sites in the rat brain, how to insert and implant a microdialysis probe and how to use high performance liquid chromatography coupled with electrochemical detection (HPLC-EC) to measure extracellular levels of oxidizable neurotransmitters and metabolites. Local precise introduction of drugs through the microdialysis probe allows for refined work on site specificity in a compound s mechanism of action. This technique has excellent anatomical and chemical resolution but only modest time resolution as microdialysis samples are usually processed every 20-30 minutes to ensure detectable neurotransmitter levels. Complementary ex vivo tools (i.e., slice and cell culture electrophysiology) can assist with monitoring real-time neurotransmission.

Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents

The monitoring of extracellular neurotransmitter levels in distinct brain regions of freely moving animals offers insights on the link between neurotransmitter release and behavior. In vivo microdialysis coupled with electrochemical detection provides excellent anatomical and chemical resolution; and information on how basal neurotransmission is altered by pharmacological or physiological manipulations.

설치류에 살아서 Stereotaxic 외과

The ability to measure extracellular basal levels of neurotransmitters in the brain of awake animals allows for the determination of effects of different ...

생물학

Comprehensive Profiling of Dopamine Regulation in Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five decades of inquiry into the molecular deficiencies associated with dopamine regulation. The majority of these inquiries of dopamine regulation in the brain focus upon the molecular basis for its regulation in the terminal field regions of the nigrostriatal and mesoaccumbens pathways; striatum and nucleus accumbens. Furthermore, such studies have concentrated on analysis of dopamine tissue content with normalization to only wet tissue weight. Investigation of the proteins that regulate dopamine, such as tyrosine hydroxylase (TH) protein, TH phosphorylation, dopamine transporter (DAT), and vesicular monoamine transporter 2 (VMAT2) protein often do not include analysis of dopamine tissue content in the same sample. The ability to analyze both dopamine tissue content and its regulating proteins (including post-translational modifications) not only gives inherent power to interpreting the relationship of dopamine with the protein level and function of TH, DAT, or VMAT2, but also extends sample economy. This translates into less cost, and yet produces insights into the molecular regulation of dopamine in virtually any paradigm of the investigators' choice.
We focus the analyses in the midbrain. Although the SN and VTA are typically neglected in most studies of dopamine regulation, these nuclei are easily dissected with practice. A comprehensive readout of dopamine tissue content and TH, DAT, or VMAT2 can be conducted. There is burgeoning literature on the impact of dopamine function in the SN and VTA on behavior, and the impingements of exogenous substances or disease processes therein 1-5. Furthermore, compounds such as growth factors have a profound effect on dopamine and dopamine-regulating proteins, to a comparatively greater extent in the SN or VTA 6-8. Therefore, this methodology is presented for reference to laboratories that want to extend their inquiries on how specific treatments modulate behaviour and dopamine regulation. Here, a multi-step method is presented for the analyses of dopamine tissue content, the protein levels of TH, DAT, or VMAT2, and TH phosphorylation from the substantia nigra and VTA from rodent midbrain. The analysis of TH phosphorylation can yield significant insights into not only how TH activity is regulated, but also the signaling cascades affected in the somatodendritic nuclei in a given paradigm.
We will illustrate the dissection technique to segregate these two nuclei and the sample processing of dissected tissue that produces a profile revealing molecular mechanisms of dopamine regulation in vivo, specific for each nuclei (Figure 1).

Dopamine is distinctly regulated in the midbrain nuclei, which contain the cell bodies and dendrites of the dopamine neurons. Here we describe a dissection and sample-handling approach to maximize results, and thus conclusions and insights, on dopamine regulation in the midbrain nuclei of the substantia nigra (SN) and ventral tegmental area (VTA) in rodents.

Substantia Nigra 및 복부 Tegmental 지역의 도파민 규정의 종합적인 프로파일

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five ...

신경과학

Pure Shift Nuclear Magnetic Resonance: a New Tool for Plant Metabolomics

Nuclear Magnetic Resonance (NMR) is one of the most powerful tools used in metabolomics. It stands as a highly accurate and reproducible method that not only provides quantitative data but also permits structural identification of the metabolites present in complex mixtures.
Metabolic profiling by 1H NMR has proven useful in the study of various types of plant scenarios, which include the evaluation of crop&#160;conditions, harvest and post- harvest treatments, metabolic phenotyping, metabolic pathways, gene regulation, identification of biomarkers, chemotaxonomy, quality control, denomination of origin, among others. However, signal overlapping of the large number of resonances with expanded J-coupling multiplicities complicates the spectra analysis and its interpretation, and represents a limitation for classical 1H NMR profiling.
In the last decade, novel NMR broadband homonuclear decoupling techniques through which multiplet signals collapse into single resonance lines - commonly called Pure Shift methods - have been developed to overcome the spectra resolution problem inherent to 1H NMR classical spectra.
Here a step-by-step protocol of the plant extract preparation and the procedure to record optimal Pure Shift PSYCHE and SAPPHIRE-PSYCHE spectra in three different plant matrices - Vanilla plant&#160;leaves, potato tubers (S. tuberosum), and Cape gooseberries (P. peruviana) - is presented. The effect of the gain in resolution in metabolic identification, correlation analysis and multivariate analyses, as compared against classical spectra, is discussed.

<meta charset="utf8"></head><body>Pure Shift 핵 자기 공명: 식물 대사체학을 위한 새로운 도구

This paper presents the use of PSYCHE and SAPPHIRE-PSYCHE in the metabolic profiling of plants and includes detailed procedures for sample preparation and optimal Pure Shift NMR spectra recording. Examples through which the gain in resolution achieved by homonuclear decoupling allows a more comprehensive understanding of the system are discussed.

Pure Shift 핵 자기 공명: 식물 대사체학을 위한 새로운 도구

Nuclear Magnetic Resonance (NMR) is one of the most powerful tools used in metabolomics. It stands as a highly accurate and reproducible method that not ...

생화학

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory discrimination learning in mice is described. In this learning paradigm, mice are trained in a shuttle box Go/NoGo-task to discriminate between rising and falling frequency-modulated tones in order to avoid a mild electric foot-shock. The protocol involves the enrichment of synaptosomes from four brain areas, namely the auditory cortex, frontal cortex, hippocampus, and striatum, at different stages of training. Synaptic protein expression patterns obtained from trained mice are compared to na&#239;ve controls using a proteomic approach. To achieve sufficient analytical depth, samples are fractionated in three different ways prior to mass spectrometry, namely 1D SDS-PAGE/in-gel digestion, in-solution digestion and phospho-peptide enrichment. 
High-resolution proteomic analysis on a mass spectrometer and label-free quantification are used to examine synaptic protein profiles in phospho-peptide-depleted and phospho-peptide-enriched fractions of synaptosomal protein samples. A commercial software package is utilized to reveal proteins and phospho-peptides with significantly regulated relative synaptic abundance levels (trained/na&#239;ve controls). Common and differential regulation modes for the synaptic proteome in the investigated brain regions of mice after training were observed. Subsequently, meta-analyses utilizing several databases are employed to identify underlying cellular functions and biological pathways.

The identification of molecules and pathways controlling synaptic plasticity and memory is still a major challenge in neuroscience. Here, a workflow is described addressing the relative quantification of synaptic proteins supposedly involved in the molecular reorganization of synapses during learning and memory consolidation in an auditory learning paradigm.

청각 차별 학습 한 후 마우스 뇌 영역의 높은 해상도 양적 시냅틱 프로테옴 프로파일

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

Concentration of Metabolites from Low-density Planktonic Communities for Environmental Metabolomics using Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Environmental metabolomics is an emerging field that is promoting new understanding in how organisms respond to and interact with the environment and each other at the biochemical level1. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is one of several technologies, including gas chromatography&#x2013;mass spectrometry (GC-MS), with considerable promise for such studies. Advantages of NMR are that it is suitable for untargeted analyses, provides structural information and spectra can be queried in quantitative and statistical manners against recently available databases of individual metabolite spectra2,3. In addition, NMR spectral data can be combined with data from other omics levels (e.g. transcriptomics, genomics) to provide a more comprehensive understanding of the physiological responses of taxa to each other and the environment4,5,6. However, NMR is less sensitive than other metabolomic techniques, making it difficult to apply to natural microbial systems where sample populations can be low-density and metabolite concentrations low compared to metabolites from well-defined and readily extractable sources such as whole tissues, biofluids or cell-cultures. Consequently, the few direct environmental metabolomic studies of microbes performed to date have been limited to culture-based or easily defined high-density ecosystems such as host-symbiont systems, constructed co-cultures or manipulations of the gut environment where stable isotope labeling can be additionally used to enhance NMR signals7,8,9,10,11,12. Methods that facilitate the concentration and collection of environmental metabolites at concentrations suitable for NMR are lacking. Since recent attention has been given to the environmental metabolomics of organisms within the aquatic environment, where much of the energy and material flow is mediated by the planktonic community13,14, we have developed a method for the concentration and extraction of whole-community metabolites from planktonic microbial systems by filtration. Commercially available hydrophilic poly-1,1-difluoroethene (PVDF) filters are specially treated to completely remove extractables, which can otherwise appear as contaminants in subsequent analyses. These treated filters are then used to filter environmental or experimental samples of interest. Filters containing the wet sample material are lyophilized and aqueous-soluble metabolites are extracted directly for conventional NMR spectroscopy using a standardized potassium phosphate extraction buffer2. Data derived from these methods can be analyzed statistically to identify meaningful patterns, or integrated with other omics levels for comprehensive understanding of community and ecosystem function.

A method for metabolite extraction from microbial planktonic communities is presented. Whole community sampling is achieved by filtration onto specially prepared filters. After lyophilization, aqueous-soluble metabolites are extracted. This approach allows for application of environmental metabolomics to trans-omics investigations of natural or experimental microbial communities.

핵 자기 공명 분광학을 사용하여 환경 Metabolomics를위한 낮은 밀도 Planktonic 커뮤니티에서 Metabolites의 농도

Environmental metabolomics is an emerging field that is promoting new understanding in how organisms respond to and interact with the environment and each ...

Functional Magnetic Resonance Spectroscopy at 7 T in the Rat Barrel Cortex During Whisker Activation

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy offers the opportunity to measure cerebral metabolite contents in vivo and noninvasively. Thanks to technological developments over the last decade and the increase in magnetic field strength, it is now possible to obtain good resolution spectra in vivo in the rat brain. Neuroenergetics (i.e., the study of brain metabolism) and, especially, metabolic interactions between the different cell types have attracted more and more interest in recent years. Among these metabolic interactions, the existence of a lactate shuttle between neurons and astrocytes is still debated. It is, thus, of great interest to perform functional proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) in a rat model of brain activation and monitor lactate. However, the methyl lactate peak overlaps lipid resonance peaks and is difficult to quantify. The protocol described below allows metabolic and lactate fluctuations to be monitored in an activated brain area. Cerebral activation is obtained by whisker stimulation and 1H-MRS is performed in the corresponding activated barrel cortex, whose area is detected using blood-oxygen-level-dependent functional magnetic resonance imaging (BOLD fMRI). All steps are fully described: the choice of anesthetics, coils, and sequences, achieving efficient whisker stimulation directly in the magnet, and data processing.

After checking by blood-oxygen-level-dependent functional magnetic resonance imaging (BOLD fMRI) that the corresponding somatosensory barrel field cortex area (called S1BF) is correctly activated, the main goal of this study is to quantify lactate content fluctuations in the activated rat brains by localized proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) at 7 T.

7 기능 자기 공명 분광학 수염 활성화 중 쥐 신 피 질에서 T

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy offers the opportunity to measure cerebral metabolite contents in vivo and noninvasively. Thanks to ...

Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial organization of synaptic vesicles. In order to obtain high-quality electron micrographs that can yield the degree of morphological detail necessary for quantitative analysis of pre-synaptic vesicle distribution, optimal specimen preparation is critical. Chemical fixation is the first step in the process of specimen preparation, and of utmost importance to preserve fine ultrastructure. Vascular fixation with a glutaraldehyde-formaldehyde solution, followed by treatment of vibratome-sectioned specimens with osmium tetroxide, stabilizes the maximum number of molecules, especially proteins and lipids, and results in superior conservation of ultrastructure. Tissue is then processed with counterstaining, sequential dehydration and resin-embedding. En bloc staining with uranyl acetate (i.e., staining of vibratome-sectioned tissue before resin embedding) enhances endogenous contrast and stabilizes cell components against extraction during specimen processing. Contrast can be further increased by applying uranyl acetate as a post-stain on ultrathin sections. Double-staining of ultrathin sections with lead citrate after uranyl acetate treatment also improves image resolution, by intensifying electron-opacity of nucleic acid-containing structures through selective binding of lead to uranyl acetate. Transmission electron microscopy is a powerful tool for characterization of the morphological details of synaptic vesicles and quantification of their size and spatial organization in the terminal bouton. However, because it uses fixed tissue, transmission electron microscopy can only provide indirect information regarding living or evolving processes. Therefore, other techniques should be considered when the main objective is to study dynamic or functional aspects of synaptic vesicle trafficking and exocytosis.

We describe procedures for processing newborn rat brain tissue to obtain high-resolution electron micrographs for morphometric analysis of synaptic vesicle distribution at nerve terminals. The micrographs obtained with these methods can also be used to study the morphology of a number of other cellular components and their dimensional structural relationships.

조직 추출물의 고해상도 핵 자기 공명 분광법에 의한 쥐 뇌의 대사 체 분석

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PTSD의, 신경 Hematologic, 그리고 행동 상관 관계를 누설하는 행위에 대해서는 동물 모델에서 생체

하여 세균없는 마우스 프로 그레시브 콜로니 동안 간장 신진 대사 변경 사항 평가¹ H NMR 분광학

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Pure Shift 핵 자기 공명: 식물 대사체학을 위한 새로운 도구

Pure Shift 핵 자기 공명: 식물 대사체학을 위한 새로운 도구

청각 차별 학습 한 후 마우스 뇌 영역의 높은 해상도 양적 시냅틱 프로테옴 프로파일

핵 자기 공명 분광학을 사용하여 환경 Metabolomics를위한 낮은 밀도 Planktonic 커뮤니티에서 Metabolites의 농도

7 기능 자기 공명 분광학 수염 활성화 중 쥐 신 피 질에서 T

신경 말단에서 시 냅 스 소포 분포의 미세 구조 형태학 적 분석을 위한 신생아 쥐 뇌 조직의 제조