이 프로젝트는 (AJB 및 LGA, R01 AI076246에 대한) 건강 NIAID의 국립 연구소에 대한 보조금에 의해 부분적으로 지원되었다. 살모넬라 균 돌연변이 수집은 부분적으로 국민 건강 보조금 연구소 (MM를 들어, U01 A152237-05, R01 AI07397-01, R01 AI039557-11 및 R01 AI075093-01) HAP, R21에 대한 부분적으로 건강 보조금의 국립 연구소에 의해, (에 의해 지원되었다 AI083964-01, 1R0 1AI083646-01, 1R56AI077645, R01 AI075093). 우리는 복제 도금 및 컬렉션의 돌연변이를 확인하기위한 스테 Prowollik 감사합니다.

1 쥐과 대 식세포 RAW264.7 세포 배양 <ol><li> 낮은 통로 번호 뮤린 대식구 세포 성장을 10 % 소 태아 혈청이 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)에서 T-75 세포 배양 물 플라스크 벤트 필터 모자 RAW264.7 (ATCC ® 번호, TIB-71) (FBS) , 0.5 % 탄산 수소 나트륨, 1 %, 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 100 배 비 필수적인 아미노산 (NEAA). </li><li> 세포를 플라스크에서 60~80% 합류점에 도달하면, 세포를 수확 셀 스크레이퍼를 사용 hemacytometer에서 셀 카운트 및 세포 농도를 계산한다. </li><li> 세포를 재현 탁하고 신선한 세포 DMEM 배지에서 2.5 × 105 / ㎖로 세포 농도를 희석한다. 96 웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 5 × 104 세포를 함유하는 세포 DMEM 배지 200 μl를 플레이트에 다 채널 피펫을 사용한다. </li><li> 각 살모넬라 균주의 네 우물 플레이트. 한 세트에 세 개의 분리 된 판을 설정식세포 침공 분석의, 각각 &quot;협회&quot;, &quot;침략&quot;과 &quot;복제&quot;로 표시합니다. </li><li> 대식 세포가 우물의 바닥에 부착 할 수 있도록 37 ° C ON에서 5 % CO 2 배양기에서 접시를 놓습니다. </li></ol> 살모넬라 야생형과 돌연변이의 제조 2 <ol><li> 식세포 RAW264.7 세포를 제조 당일에, (야생형의 단일 콜로니 (WT) 살모넬라 엔테 혈청 형 티피 뮤 리엄 14028s, 루리아 - 베르 타니에 DinvA 변이체, DphoP 변이체, 원하는 시험 돌연변이 균주 및 배양들을 골라 LB) 브로스는 적절한 항생제로 보충. 10 돌연변이 균주 (DinvA 돌연변이 및 DphoP 돌연변이가 각각 침략과 세포 내 복제 결함)를 테스트하기 위해 식세포 침입 분석의 각 세트를 사용합니다. </li><li> 의 37 ° C에서 14 시간 동안 박테리아 성장둥근 바닥 튜브에 느슨하게 덮인 14 ㎖의 폴리 프로필렌에 5 ㎖의 LB 액체 배지에 각각 220 rpm에서 haking. LB 국물이 우리의 경우, 돌연변이 균주의 대부분은 카나마이신에 내성 적절한 항생제를 포함, 50 μg / ml의 </li><li> 다음 날, 220 rpm에서 진탕 추가로 4 시간 동안 1시 50분의 비율 LB 브로스의 일반 5ml에 살모넬라 균주의 배양 ON의 각 하위 문화. </li><li> 분광 광도계에 OD 각 세균 배양의 600 값을 읽고, 각 읽기는 살모넬라 균의 병원성 섬 - 1 타입 III 분비 시스템 침공 (SPI-1 TTSS) 유전자 발현을 최적화하기 위해 0.6-1.2 범위해야합니다. </li><li> 한 OD의 수식을 사용하여 (600) = 7.5 × 10 8 CFU 다음, 박테리아의 농도를 추정 신선한 DMEM 세포 배양 배지에서 5 × 106 CFU / ml의 농도로 희석 박테리아 / ㎖. </li></ol> 96 웰 배양 플레이트에서 3 침공 분석 <ol><li> 세 96 웰 CEL 제거리터 문화 CO 2 배양기에서 접시와 씻어 각 웰 1X PBS 버퍼 200 μL로 한 번. </li><li> PBS 세척하고 완전히 제거한 후, 각 웰에 200 ㎕의 균 DMEM 배지 (상기 참조)를 추가한다. 이 감염의 각 웰과 다양성 (20) (MOI)에서 1 × 10 6 살모넬라 균 세포에서 발생 : 1. </li><li> 다음 30 분 동안 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 번호판 (0시)를 교체, 10 분 동안 밀폐 된 캐리어에 1,000 XG에 번호판을 원심 분리기. 각 균주의 경우, 적어도 네 중복 우물을 설정합니다. </li><li> 30 분 후, 인큐베이터에서 접시를 제거하고 연결되지 않은 박테리아를 제거하는 1X PBS 200 μL로 3 회 씻는다. </li><li> 세척 후, 차후 치료를 위해 &quot;협회&quot;로 표시된 판을 저장합니다. 주문 t의 &quot;침략&quot;과 &quot;복제&quot;로 표시된 플레이트의 각 웰에 100 μg / ml의 겐타 마이신을 함유하는 DMEM 배지 200 μl를 추가오. 세포 외 살모넬라 균을 죽일 추가 시간 동안 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에 플레이트를 돌려줍니다. </li><li> , 대식 세포 수를 기록하기 위해 각 균주로부터 잘 감염을 저장 한 10 분 동안 1 % 트리톤 X-100을 포함하는 1X PBS 200 ㎕를 사용하여 &quot;관련&quot;플레이트에 웰의 나머지 취급. 트리톤 솔루션은 대식 세포를 용해 및 관련 살모넬라 균을 발표 할 예정이다. </li><li> 각 웰에서 수확 살모넬라 및 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 배치합니다. 각 웰에서 수확 된 샘플에 900μl 1X PBS로 3 10 배 희석액을 수행 소용돌이는 각 희석 사이에 수행된다. </li><li> 하나 LB (WT) 또는 LB 칸 (돌연변이) 접시에 세 번째 희석, 10 -3, 플레이트. 적절한 살모넬라 균주 이름, 희석 수, 시각 및 날짜 판을 레이블을 지정합니다. </li><li> 셋째 희석 튜브를 볼 텍싱 한 후, 한천 및 반복 (F)의 표면 상에 10 ㎕의 샘플을 조제5 방울의 총에 대한 우리의 시간. 5 ~ 10 μL은 페트리 접시 플레이트 (7)에 균등하게 떨어진다 공간으로해야합니다. </li><li> 방울 후, 한천에 스며을 통해 판을 켜고 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 하룻밤 배양한다. </li><li> 10 분 동안 0.25 % 트립신-EDTA를 포함하는 150 μL의 1XPBS와 대 식세포의 계산을 위해 저장 우물을 처리합니다. </li><li> 트립신 후, 1.5 ml의 에펜 도르프 튜브에 넣습니다 식세포와, 트립신 / EDTA 용액을 중화 FBS의 50 μL로 치료 0.4 % 트리 판 블루와 세포를 염색하고 hemacytometer를 사용을 통해 점수. </li><li> 한 시간 보육이 경과하면 CO 2 배양기에서 &quot;침략&quot;과 &quot;복제&quot;판을 제거하고, &quot;단계 3.4&quot;로 각 잘 씻는다. </li><li> &quot;단계 3.6-3.12&quot;로 추가 처리에 대한 &quot;침략&quot;판을 저장합니다. </li><li> 10 μg / ml의 겐타 마이신을 함유하는 DMEM 배지 200 μl를 추가&quot;복제&quot;플레이트 배지에서 세포 살모넬라의 간극을 유지한다. 추가로 22.5 시간 동안 5 % CO 2 배양기 37 ° C에 접시를 돌려줍니다. </li><li> 다음 날, 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 &quot;복제&quot;플레이트를 분리하고, 각 씻어 아니라 &quot;3.4 단계&quot;와 &quot;단계 3.6-3.12&quot;로 취급합니다. </li><li> 마지막으로, 37 ° C 배양기에서 하룻밤 배양 한 후 한천 플레이트를 제거하고 세균 콜로니의 수를 점수. </li><li> 좋은 식민지 분포는 식민지 10 ~ 100, 각 지점은 약 2 식민지 20, 그것은 한 자리에서 20 개 이상의 식민지가 있다면 점수 어려울 것 포함해야한다. 필요에 따라 개수가 너무 낮거나 너무 높으면, 시료 replate 높거나 낮은 희석 10 배. </li></ol> (4) 데이터 분석 <ol><li> 도금에 기초하여 각각의 판의 CFU (ML 당 콜로니 형성 단위)를 계산볼륨 및 희석 배수. </li><li> 각 균주로부터 기록 된 대식 세포 수 당 살모넬라 통해 식세포의 개수를 확인. </li><li> 각각 연관 셀, 침윤 또는 복제하기위한 적어도 3 개의 독립적 인 실험에서 대식구 당 CFU의 기하 평균을 계산하고, 상대적인 값을 WT로 더욱 정규화. </li><li> WT에 대한 각각의 변형을 비교하여, 각각의 스튜던트 t -test 의해 협회, 침윤 및 복제에 대한 데이터를 분석하고, P 값에 의해 유의성을 결정한다. </li></ol>

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겐타 마이신 보호 분석법 널리 숙주 세포 내부의 세포 내 박테리아 병원균의 침입 및 복제를 연구하는 데 사용되며, 특히 그 내습 감염 하나를 설정하기위한 필수 공정이다 살모넬라와 같은 병원체를 연구하는데 중요한 생물학적 도구이다. 살모넬라 연구 커뮤니티의 표준 겐타 마이신 보호 분석은 24 웰 배양 접시 5에서 구현된다. 48 또는 96 웰 플레이트의 사용은 높은 처리량 9 전에 논의되었다하더라도, 실제 프로토콜 상세하게 입증되지 성공적 박테리아 변이주의 컬렉션을 테스트하기 위해 사용되어왔다. 여기서, 수정 및 표준화 된 프로토콜은 살모넬라 돌연변이 표현형 96 웰 배양 접시를 사용하기 위해 개발되었다. 특히,이 프로토콜은 살모넬라와 식세포에 대한 테스트되었습니다 따라서 수정 및 최적화는 분명히 인접으로 필요하다<html> r에 세균이나 숙주 세포. 식세포에서 살모넬라 협회, 침략과 복제를 표현형 수정 겐타 마이신 보호 분석에는 몇 가지 장점이있다. 먼저, 96 - 웰 배양 접시 포맷은 최대 10 개의 상이한 균주 충분한 반복 통계 분석 및 내부 제어를 동시에 테스트 할 수 있으며, 높은 처리량 테스트 및 분석을 허용한다. 다른 시간에 반복 둘째 때문에 분석의 고감도, 겐타 마이신 보호 분석의 미가공 데이터는 기술적 차이에 민감 할 수있다. 프로토콜이 변경됨에 따라, 여러 가지 변형이 분산을 줄이는 과정에 걸쳐 동일한 조건 phenotyped된다. 마지막으로, 멀티 채널 피펫의 사용 효율을 증가시키고, 작업자의 피로를 감소시킨다. 정량적 재현성 대용량의 데이터를 생성하는 동안 새로운 프로토콜은 빠른 표현형보기 수많은 살모넬라 돌연변이를 용이. &quot;ove_content&gt; 96 - 웰 배양 접시에 침윤 분석을하고있는 하나의 관심사는 웰이이 문제를 해결하기 위해. 적은 진핵 세포를 포함하고, 이로 인해 정량 손상 될 수 있다는 것이다 분석법 큰 일련의 재현성을 최적화하기 위해 수행되었다. 우선 이 프로토콜에서 사용 RAW264.7 대 식세포는 20 개 미만 통로가 있고, 세포를 분석하기 전에 밤새 96 - 웰 배양 접시에 접종 하였다 둘째, MOI 20로 감소 하였다. 1 : 정기적 (50)를 사용하여 1 100 : 1 A MOI 20 :.. 1 식세포의 99 %가 스토캐스틱 점에있어서 포아송 분포에 의해 산출 10-30 박테리아 감염에 노출 될 것으로 이는 생물학적 요인에 한정되지 않고, 생각된다 보장 세포 손상이있을 수 . 압도적 인 박테리아에서 발생하는 물리적 접촉 (10)는 또한, 살모넬라 침공 긍정적 높은 MOI (11)와 관련된 대 식세포의 세포 사멸을 유도 할 수있는 20의 MOI 사용 :. 1, 휴대 damag전자는 아마도 인해 제한 박테리아가 대 식세포의 신체 접촉에, 최소한의 것으로 밝혀졌다. 셋째, 배양 시간 간격은 세 번째 포인트에 대해 최적화되었다 : 연관성없는 겐타 마이신과 함께 30 분 동안; 100 μg / ml의 겐타 마이신과 추가 1 시간 (총 1.5 시간의 감염 후)에 대한 침략; 10 μg / ml의 겐타 마이신과 함께 추가로 22.5 시간 (총 24 시간 후 감염)에 대한 복제. 우리의 테스트에서, 5㎍을 / ㎖ 겐타 마이신이, 따라서 10 % 무 세포 DMEM에 100 μg을 소 태아 혈청 (게시되지 않은 데이터)를 모든 살모넬라 균을 죽일 충분하다 / ㎖ 겐타 마이신은 급속한 살인 및 10g을 확보 할 것으로 예상된다 / ㎖ 겐타 마이신 밤새 배양을위한 세포 배양 배지에서 세포 외 박테리아의 간극을 유지하는 것이 생체, 그것은 송아지 소장 상피 세포 12,13와 조직 연관된 살모넬라 균을 검출하기 위해 약 15 분 소요]. 시험관 내에서 30 분간 인큐베이션을하여보고 야생형에 적절 <em는&gt; 14를 침공합니다. 표준 침윤 분석에서, 처음 두 시간 포인트의 작업 부하는 세척 용액을 희석하고, 도금에 의한 매우 강렬한. 장치가 크게 조작자의 효율성 및 정확성을 증가시키기 때문에 각 시점에 대한 정확한 시간 간격은, 멀티 채널 피펫을 이용하여 달성되었다. 또한, 샘플 도금 기법 대신 100 μL 도금 수동 10 μL 5 개별 방울 크게 도금 시간을 감소시키고 정확도를 증가 웰 플레이트의 각 반복에 대해 도말, 확산로, 용액을 희석 한 후 변경된 최종 카운트 인해 당이 잘 오 도금 샘플에서 득점있다. 종합적으로 이러한 최적화 및 표준화 절차는 분석의 재현성을 증가, 다른 사업자들은 반복적으로 서로 다른 시간에 일관성있는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜은이 분석을 위해 식세포 대신 상피 세포를 사용한다작은 96 - 웰 포맷. 살모넬라 병인론 연구에서 가장 널리 사용되는 상피 세포주 이종 인간 대장 상피 선암에서 파생는 Caco-2이다. 주 Caco-2 세포와 정규 24 - 웰 배양 접시 내습 시험을 사용하여, 각각의 시점에서 회수 한 균체의 실제 개수, 표현형 복제 특히 22.5 시간 시점이 때보다 훨씬 낮은 등 J774 또는 RAW264 같은 식세포, 0.7 대 식세포 (게시되지 않은 데이터)를 사용한다. 따라서, 이것은 더 어렵게 각 잘 적은 숙주 세포가 96 - 웰 배양 접시를 사용하여 표현형을 수행 할 수있다. 또한 대 식세포 세포는 활발히 이상의 박테리아 내재화되는 원인이 박테리아, 삼킬 수있는 것으로 알려져있다, 또한 살모넬라 명백하게는 Caco-2 세포에서 더 느리게 복제 것을 배제 할 수 없다. 생존과 내부 대식 세포를 복제하는 살모넬라 균의 능력의 병인에 중요한 역할 관련이살모넬라, 즉 대규모 호스트 염증 반응을 유발하고 전신 감염 일을 촉진. 우리는 주로 호스트 상호 작용의 잠재적 인 계약을 위해 연산 파이프 라인을 선택 유전자의 대형 세트 표현형 수정 및 표준화 겐타 마이신 보호 분석을 사용. 그것은 살모넬라 돌연변이의 약 50 % 식세포에서 세포 내 복제와 관련된 유전자로 phenotyped되었다 밝혀졌다.

Nontyphoidal 살모넬라 균은 모든 척추 동물의 장내 질환의 중요한 원인이됩니다. 인간의 살모넬라증은 최고 세균성 식중독 질병 일 중 하나입니다. 자신의 동물 호스트와 살모넬라 균의 상호 작용을 뒷받침하는 분자 메커니즘의 특성은 주로 감염의 조직 문화와 동물 모델에서 살모넬라 엔테 혈청 형 티피 뮤 리움 (STM)의 연구를 통해 달성된다. STM-호스트 상호 작용에 대한 통찰력을 확보하는 것은 우리가 살모넬라 균은 생존과 숙주 세포 내부에 성장하는 방법을 이해하는 데 도움이됩니다. 이러한 상호 작용을 연구의 첫 번째 과제는 호스트와 병원체 모두에서 가능한 한 많은 참여 요인을 파악하는 것입니다,하지만, 이러한 노력은 주로, 동시에 두 개의 독립적 인 복잡한 생물학적 시스템 즉, 호스트 및 살모넬라 균을 다루는 중요한 문제로 막혀, 생리 학적 조건 하에서. 또한, 큰 repert살모넬라 균의 oire 잠재적 호스트 상호 작용에 관여하는 요인을 인코딩 호스트 유전자는 이러한 문제를 해결하기 위해 높은 처리량 생물 플랫폼이 필요합니다. 수정, 표준화 된 분석은 가능성이 살모넬라 -host 상호 작용에 관여하는 유전자의 큰 세트를 검사하기 위해 개발 된 높은 처리 용량 대 식세포에서 살모넬라 협회, 침략과 복제를 표현형. 겐타 마이신 보호 분석은 1973이 개발되었지만, 첫째 철저하게 1994 3,4에 Elsinghorst에 의해 설명되었다. 지금은 살모넬라 5,6 포함한 생체 많은 세포 내 세균성 병원체를 공부하기위한 표준 도구가되었습니다. 내면화 된 세균은 진핵 세포 (3)를 통과 할 수 겐타 마이신 등 일부 항생제에 의해 살해되지 않도록. 이 현상을 이용하여, 겐타 마이신 보호 분석법은 세포 (BA)의 생존 및 성장을 측정cterial 병원균. 감염 동안 세 개의 이벤트, 즉 진핵 세포 침윤 및 복제와 관련하여, 감염, 겐타 마이신 처리하고, 또한 배양 (도 1) 사이의 시간 간격에 따라 세포 내 박테리아 병원균에 대해 평가 될 수있다. 진핵 세포주는 호스트 병원체 상호 작용 연구에 대한 중요한 동물 모델보다 덜 복잡하며 생리적 환경을 제공한다. 겐타 마이신 보호 분석은 STM-호스트 상호 작용을 연구하는 적절한 플랫폼이지만, 24 - 웰 배양 접시에있는 표준 분석은 낮은 처리량을 갖는다. 생체 데이터 셋의 전산 분석은 약 300 호스트 유전자 제품 (게시되지 않은 데이터)와 상호 작용 할 것으로 예상되는 149 살모넬라 균의 유전자 산물을 확인했다. 겐타 마이신 표준 보호 분석법 효율적 돌연변이 숫자를 표현형 능력이 없다. 와 T에서이온, 겐타 마이신 보호 분석은 이론적으로도 단일 세균의 침입을 감지 할 수 있습니다. 다른 시간에 반복되면이 때문에 고유 감도, 원시 데이터는 기술적 차이에 민감하다. 내부 통제 및 정상화 후 상대 데이터 프레 젠 테이션 결과의 의미 해석에 필수적이다. 이러한 고려 사항을 감안할 때, 변성 표준화 겐타 마이신 보호 분석은 테스트 능력을 향상하고 정밀도를 높이기 위해 개발되었다. 다음의 상세한 프로토콜은 96 - 웰 배양 접시 및 뮤린 RAW264.7 대 식세포 세포주를 사용하여 개질 겐타 마이신 보호 분석을 수행하기 위해 도시되어있다. 24 웰 배양 접시에서 표준 프로토콜에 비해 수정 된 프로토콜은 다음과 같은 장점이있다 : 1) 96 - 웰 배양 접시를 사용하여 충분한 통계적인 힘을 가진 내부 양성 및 음성 컨트롤을 포함하여 phenotyped 할 10 가지 돌연변이 균주를 허용을;돌연변이 균주가 동일 배양 접시에서 동시에 시험 때문에 2) 결과의 편차가 현저하게 감소된다; 운전자의 피로를 줄이는 동시에 3) 멀티 채널 피펫을 사용하면 처리량을 증가시킨다. 마지막으로, 24 - 웰 배양 접시에 비하여 96 - 웰 배양 접시에 웰당 이하 숙주 세포 우려 프로토콜 최적화 및 표준화를 통해 해결 하였다. 요약하면, 대 식세포에서 체외 표현형 살모넬라 또는 다른 세균성 협회, 침윤 및 복제에 변경됨 표준화 분석은 정밀도 향상과 작업자의 피로를 감소시키면서 높은 처리 능력을 달성한다.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>HyClone</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>T-75 Cell culture flask vented filter cap</td><td>Nest Biotechnology</td><td>708003</td><td></td></tr><tr><td>100x Non-Essential Amino Acids</td><td>Life Technologies</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>BD Falcon</td><td>353086</td><td></td></tr><tr><td>96-well Cell culture plate</td><td>Corning Incorporated</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) broth</td><td>MP Biomedicals</td><td>3002-075</td><td></td></tr><tr><td>14 ml Polypropylene Round-Bottom Tube</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>10010</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin solution</td><td>Sigma</td><td>K0254</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin solution</td><td>Sigma</td><td>G1272</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput assay to phenotype salmonella enterica typhimurium association, invasion, and replication in macrophages

살모넬라 종은 인수 공통 병원균과 인간과 가축 한 식품 매개 질환의 주요 원인이다. 살모넬라 -host 상호 작용을 기본 메커니즘을 이해 살모넬라 감염의 분자 기전을 규명하는 것이 중요하다. 겐타 마이신 보호 분석은 높은 처리량 검사가 RAW 264.7 쥐의 대 식세포를 사용하여 호스트 상호 작용에 살모넬라 엔테 혈청 형 티피 뮤 리움의 삭제 돌연변이의 역할을 정의 할 수 있도록 적응했다 식세포에서 살모넬라 협회, 침략과 복제를 표현형.이 프로토콜에서 분산을 야생형 및 돌연변이 균주 여러 동일 배양 접시에서 동시에 테스트 할 수 있기 때문에 측정에서 크게, 표준 프로토콜에 비해 감소된다. 멀티 채널 피펫을 사용하면 처리량을 증가시키고, 정밀도를 향상시킨다. 또한, 우려가 적은 호 사용에 관한96 - 웰 배양 접시에 웰당 성 세포를 해결 하였다. 여기서, 대 식세포를 사용하여 시험 관내 변형 된 살모넬라 침윤 분석의 프로토콜이 성공적으로 연관, 침윤 및 세포 내 복제 38 개인 살모넬라 결실 돌연변이 표현형을 사용 하였다. 체외 표현형은 일부는 이후 동물 모델에서 생체 내 표현형에있는 것이 확인되었다되게됩니다. 따라서, 수정 된, 표준화 된 분석은 높은 처리량이 세균 숙주의 상호 작용을 연구하기 위해보다 광범위하게 이용 될 수있는 대 식세포에서 살모넬라 협회, 침윤 및 복제 표현형.

데이터가 수정 된 탐식 세포 침공 분석을 기반으로 꾸몄다 후 대표적인 결과 (그림 2)를 참조하십시오. 데이터 복제 팔에 대한 결함이있는 것으로 알려진 다섯 가지 변종, WT, ΔinvA, ΔphoP, 돌연변이, 그리고 침략에 대한 결함이있는 것으로 알려진 돌연변이 B. Δ INVA, 및 ΔphoP을 포함, 실험 유효성을 평가하기 위해 양성 대조군으로 사용됩니다 . 실제로, 변성 침윤 분석에서, 돌연변이는 ΔinvA RAW264.7 세포에 의해 내재화되고, 저조한 ΔphoP 돌연변이는 24 시간 후에 복제를 감소했다. 돌연변이 및 B는이 프로토콜을 사용하여 정량 대표적인 균주이다. 돌연변이는 ΔphoP 돌연변이 유사 복제 (그림 2)의 유의 한 감소를 보여줍니다; 흥미롭게도, 돌연변이 B 복제의 상당한 증가 (그림 2)를 보여줍니다. 데이터는 분명히 그 뮤타 모두 나타내국세청은 대 식세포의 침략과 생존을위한 표현형을 변경했다. 요약하면, 다수의 살모넬라 결실 돌연변이 개별적 변성 내습 분석법을 사용 RAW264.7 대 식세포에서 세균 협회, 침윤 및 복제에의 참여를 위해 phenotyped 하였다. 38 시험 돌연변이의 스물 지금까지 식세포 (표 1), 대 식세포에서 체외 표현형 살모넬라 균 등 세균 협회, 침략과 복제 정밀도 및 높은 처리량 용량 동안 증가에 따라서 수정 된 분석의 세균 감염에 변수이지만 중요한 결함을 표시 작업자의 피로를 감소시킨다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51759/51759fig1highres.jpg" width="500" /> 높은 처리량 분석의 그림 1 작업 방식. 겐타 마이신 보호 분석이 MODI입니다및 실적은 96 웰 플레이트에서 동시에 다수의 살모넬라 돌연변이 표현형 표준화. 주요 단계는 RAW264.7 대식 세포에서 살모넬라 협회, 침략과 복제를 조사하기 위 수행됩니다. <img alt="그림이" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51759/51759fig2highres.jpg" width="500" /> . WT, ΔinvA, ΔphoP, 돌연변이 A, B 및 돌연변이 - -도 2 주제 결과는 높은 처리량 분석법 살모넬라 균주 수행 RAW264.7 대식 세포. 각 균주를 들어, 대 식세포 당 CFU의 기하 평균이 표시됩니다 WT와 그래픽 표현을 추가로 정규화 각각 셀 협회, 침략과 복제에 대한 3 개의 독립적 인 실험에서 얻을 수 있습니다. 오차 막대는 표준 오차를 나타내며, 각 균주의 통계적 유의성은 참조WT에 학생의 t의 - 테스트에 의해 결정되었다. * p &lt;0.05. 는 MOI = 20. <img alt="표 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51759/51759table1.jpg" width="400" /> 표 후보 유전자의 표현형 1. 후보 살모넬라 돌연변이는 RAW264.7 대식 세포에서 협회 침략과 복제를위한 수정, 표준화 된 분석에 의해 phenotyped된다. 20 돌연변이 협회, 침략 및 / 또는 복제에 상당한 결함이있다.

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High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

체외 표현형 살모넬라 또는 다른 세균성 협회, 침윤 및 높은 처리량과 식세포에서 복제에 높은 처리량 분석이 개발되었다. 방법은 호스트 병원체 상호 작용에서의 침범 위해 살모넬라 유전자 녹아웃 돌연변이 균주를 평가하기 위해 사용 하였다.

표현형 높은 처리량 분석<em&gt; 살모넬라 엔테</em&gt; 티피 뮤 리움 협회, 침략, 그리고 대 식세포에서의 복제

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

high-throughput-assay-to-phenotype-salmonella-enterica-typhimurium

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

12.6K 조회수.  Texas A&M University.  체외 표현형 살모넬라 또는 다른 세균성 협회, 침윤 및 높은 처리량과 식세포에서 복제에 높은 처리량 분석이 개발되었다. 방법은 호스트 병원체 상호 작용에서의 침범 위해 살모넬라 유전자 녹아웃 돌연변이 균주를 평가하기 위해 사용 하였다. 

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A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

고처리량/고함량 스크리닝에 적용된 세포내 진균의 정량화를 위한 현미경 표티픽 분석

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

연구

면역학 및 감염병학

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in na&#239;ve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

앞으로 유전학 식별하는 대 식세포를 사용하여 화면<em&gt; 톡소 포자충</em&gt; 유전자 중요 저항이하는 IFN-γ 의존 세포 자치 내성

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like Shigella flexneri and Francisella novicida need to induce the rupture of the phagosome. In contrast, Salmonella typhimurium replicates in a vacuolar compartment, known as Salmonella-containing vacuole (SCV). However certain mutants of Salmonella fail to maintain SCV integrity and are thus released into the cytosol. The percentage of cytosolic vs. vacuolar bacteria on the level of single bacteria can be measured by differential permeabilization, also known as phagosome-protection assay. The approach makes use of the property of detergent digitonin to selectively bind cholesterol. Since the plasma membrane contains more cholesterol than other cellular membranes, digitonin can be used to selectively permeabilize the plasma membrane while leaving intracellular membranes intact. In brief, following infection with the pathogen expressing a fluorescent marker protein (e.g. mCherry among others), the plasma membrane of host cells is permeabilized with a short incubation in digitonin containing buffer. Cells are then washed and incubated with a primary antibody (coupled to a fluorophore of choice) directed against the bacterium of choice (e.g. anti-Salmonella-FITC) and washed again. If unmarked bacteria are used, an additional step can be done, in which all membranes are permeabilized and all bacteria stained with a corresponding antibody. Following the staining, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria can be quantified by FACS or microscopy by counting single or double-positive events. Here we provide experimental details for use of this technique with the bacterium Salmonella typhimurium. The advantage of this assay is that, in contrast to other assay, it provides a quantification on the level of single bacteria, and if analyzed by microscopy provides the exact number of cytosolic and vacuolar bacteria in a given cell.

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

공포 성 대 세포질의 정량화<em&gt; 살모넬라</em&gt; 차동 투과성으로하여 기본 대 식세포에서

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by direct contact with infected animals or by ingestion of contaminated food and can lead to severe chronic infections.
Brucella can invade professional and non-professional phagocytic cells and replicates within endoplasmic reticulum (ER)-derived vacuoles. The host factors required for Brucella entry into host cells, avoidance of lysosomal degradation, and replication in the ER-like compartment remain largely unknown. Here we describe two assays to identify host factors involved in Brucella entry and replication in HeLa cells. The protocols describe the use of RNA interference, while alternative screening methods could be applied. The assays are based on the detection of fluorescently labeled bacteria in fluorescently labeled host cells using automated wide-field microscopy. The fluorescent images are analyzed using a standardized image analysis pipeline in CellProfiler which allows single cell-based infection scoring.
In the endpoint assay, intracellular replication is measured two days after infection. This allows bacteria to traffic to their replicative niche where proliferation is initiated around 12 hr after bacterial entry. Brucella which have successfully established an intracellular niche will thus have strongly proliferated inside host cells. Since intracellular bacteria will greatly outnumber individual extracellular or intracellular non-replicative bacteria, a strain constitutively expressing GFP can be used. The strong GFP signal is then used to identify infected cells.
In contrast, for the entry assay it is essential to differentiate between intracellular and extracellular bacteria. Here, a strain encoding for a tetracycline-inducible GFP is used. Induction of GFP with simultaneous inactivation of extracellular bacteria by gentamicin enables the differentiation between intracellular and extracellular bacteria based on the GFP signal, with only intracellular bacteria being able to express GFP. This allows the robust detection of single intracellular bacteria before intracellular proliferation is initiated.

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Two assays for microscopy-based high-throughput screening of host factors involved in Brucella infection are described. The entry assay detects host factors required for Brucella entry and the endpoint assay those required for intracellular replication. While applicable for alternative approaches, siRNA screening in HeLa cells is used to illustrate the protocols.

에 참여 호스트 요인의 높은 처리량 검사에 대한 현미경 기반 분석 실험<em&gt; 브루셀라</em&gt; HeLa 세포의 감염

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

살 모 넬 라 typhimurium의 절연-대 식 세포에서 Phagosomes를 포함 하

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' pathogens (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, and Rickettsia spp.) gain access to the infected cell cytosol by physically and enzymatically degrading the primary vacuolar membrane. Once in the cytosol, these pathogens both proliferate as well as generate sufficient mechanical forces to penetrate the plasma membrane of the host cell in order to infect new cells. Here, we show how this terminal step of the cellular infection cycle of L. monocytogenes (Lm) can be quantified by both colony-forming unit assays and flow cytometry and give examples of how both pathogen- and host-encoded factors impact this process. We also show a close correspondence of Lm infection dynamics of cultured cells infected in vitro and those of hepatic cells derived from mice infected in vivo. These function-based assays are relatively simple and can be readily scaled up for discovery-based high-throughput screens for modulators of eukaryotic cell function.

We describe both in vitro and in vivo infection assays that can be used to analyze the activities of host-encoding factors.

셀룰러 및 Organismic 수준 호스트 응답 세균성 병원 체 프로브를 사용 하 여

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

NF-&#954;B-dependent Luciferase Activation and Quantification of Gene Expression in Salmonella Infected Tissue Culture Cells

The dimeric transcription factor NF-&#954;B regulates many cellular response pathways, including inflammatory pathways by inducing the expression of various cytokines and chemokines. NF-&#954;B is constitutively expressed and is sequestered in the cytosol by the inhibitory protein nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B cells inhibitor, alpha (I&#954;B&#945;). Activation of NF-&#954;B requires the degradation of I&#954;B&#945;, which then exposes a nuclear localization signal on NF-&#954;B and promotes its trafficking to the nucleus. Once in the nucleus, NF-&#954;B binds to the promotor region of NF-&#954;B target genes such as interleukin 6 (IL-6) and IL-23, to promote their expression.
The activation of NF-&#954;B occurs independently of transcription or translation. Therefore, the activation state of NF-&#954;B must be measured either by quantifying NF-&#954;B specifically in the nucleus, or by quantifying expression of NF-&#954;B target genes. In this protocol, cells stably transfected with an NF-&#954;B::luciferase reporter construct are assayed for NF-&#954;B activation using in vitro tissue culture techniques. These cells are infected with Salmonella Typhimurium to activate NF-&#954;B, which traffics to the nucleus and binds to &#954;B sites in the promoter region of luciferase, inducing its expression. Cells are lysed and analyzed with the luciferase assay system. The amount of luciferase produced by the cells correlates with the intensity of the luminescence signal, which is detected by a plate reader. The luminescence signal generated by this procedure provides a quick and highly sensitive method by which to assess NF-&#954;B activation under a range of conditions. This protocol also utilizes quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR) to detect relative mRNA levels that are indicative of gene expression.

Here, we present a protocol to quickly and easily measure nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-&#954;B) activation in cell lines expressing NF-&#954;B::luciferase reporter constructs, via measurements of luminescence in the cell lysate. Additionally, gene expression is determined via RT-qPCR isolated from cells infected with Salmonella Typhimurium.

살모넬라 감염 조직 배양 세포에서 유전자 발현의 NF-θB 의존성 루시퍼라아제 활성화 및 정량화

The dimeric transcription factor NF-&#954;B regulates many cellular response pathways, including inflammatory pathways by inducing the expression of ...

Automated Analysis of Intracellular Phenotypes of Salmonella Using ImageJ

Salmonella is an enteric pathogen able to invade the intestinal epithelium and replicate in enterocytes, both inside Salmonella-specific vacuoles and free in the cytosol (cytosolic hyper-replication). These different phenotypes of intracellular replication drive to different pathways of pathogenesis, i.e., cytosolic hyper-replication induces inflammatory cell death and extrusion into the gut lumen, while vacuolar replication leads to trans-epithelium penetration and systemic spread. Significant effort was made to create microscopy tools to study the behavior of Salmonella inside invaded cells, such as the pCHAR-Duo fluorescence reporter plasmid that allows discrimination between vacuolar and cytosolic bacteria by differential expression of mCherry and GFP. However, intracellular phenotypes are often manually scored, a time-consuming procedure that limits analysis to a small number of samples and cells. To overcome these limitations, two complementary and automated image analyses were developed using ImageJ, a freely available image analysis software. In the high-throughput protocol, epithelial cells were infected with Salmonella carrying pCHAR-Duo using 96-well plates. Imaging was performed using an automated fluorescence microscope. Then, two image analysis methods were applied to measure the intracellular behavior of Salmonella at different detail levels. The first method measures the overall intracellular bacterial load and the extent of cytosolic hyper-replication. It is fast and allows the scoring of a high number of cells and samples, making it suitable for high-throughput assays such as screening experiments. The second method performs single-cell analysis to determine the percentage of infected cells, the mean vacuolar load of Salmonella, and the cytosolic hyper-replication rate giving greater details about Salmonella behavior inside epithelial cells. The protocols can be performed by specifically designed ImageJ scripts to automatically run batch analyses of the major steps of Salmonella-enterocyte interaction.

Automated Analysis of Intracellular Phenotypes of Salmonella Using ImageJ

Salmonella invades and replicates inside intestinal epithelial cells both in Salmonella-specific vacuoles and free in the cytosol (hyper-replication). A high-throughput fluorescence microscopy-based protocol is described here to quantify the intracellular phenotypes of Salmonella by two complementary image analyses through ImageJ, reaching single-cell resolution and scoring.

ImageJ를 이용한 살모넬라균 의 세포내 표현형 자동 분석

Salmonella is an enteric pathogen able to invade the intestinal epithelium and replicate in enterocytes, both inside Salmonella-specific vacuoles and free ...

An In Vitro Assay to Quantify the Intracellular Growth of Parasite in Macrophages

Source: Sarkar, A., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/57486">Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates an assay to quantify the intracellular growth of parasites in bone marrow-derived macrophages (BMMs). The macrophage cells are infected with the motile and non-motile invasive stages of Leishmania, metacyclic promastigotes and amastigotes, respectively. The parasites invade the macrophages, getting internalized into a parasitophorous vacuole and multiplying inside. The intracellular parasite growth is quantified using a microscope upon fluorescently staining the macrophage and parasite nuclei.

대식세포에서 기생충의 세포 내 성장을 정량화하기 위한 In vitro 분석

1. Plating BMMs on Coverslips for Infection 

	Prepare 6-well tissue culture plates by placing four (4) sterile 12 mm glass coverslips (autoclaved and ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Specialized Assays

An Assay to Quantify Cytosolic and Vacuolar Salmonella in Infected Primary Macrophages

Source: Meunier, E., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/52960">Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates an assay to quantify cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium inside bone marrow-derived macrophages using differential permeabilization. The macrophages are infected with a fluorescent protein-expressing Salmonella, which is internalized inside a specialized vacuolar structure called Salmonella-containing vacuole or SCV. A subset of bacteria escape the SCV and enter the cytosol. The cholesterol-rich plasma membrane of macrophages is permeabilized using digitonin, leaving the SCV intact. Upon labeling the cytosolic bacteria with a fluorescently tagged antibody, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria is quantified using fluorescence-activated cell sorting (FACS).

표현형 높은 처리량 분석

요약

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이 비디오의 챕터

고처리량/고함량 스크리닝에 적용된 세포내 진균의 정량화를 위한 현미경 표티픽 분석

앞으로 유전학 식별하는 대 식세포를 사용하여 화면

공포 성 대 세포질의 정량화

에 참여 호스트 요인의 높은 처리량 검사에 대한 현미경 기반 분석 실험

살 모 넬 라 typhimurium의 절연-대 식 세포에서 Phagosomes를 포함 하

셀룰러 및 Organismic 수준 호스트 응답 세균성 병원 체 프로브를 사용 하 여

살모넬라 감염 조직 배양 세포에서 유전자 발현의 NF-θB 의존성 루시퍼라아제 활성화 및 정량화

ImageJ를 이용한 살모넬라균 의 세포내 표현형 자동 분석

대식세포에서 기생충의 세포 내 성장을 정량화하기 위한 In vitro 분석

감염된 1차 대식세포에서 세포질 및 진공 살모넬라균을 정량화하기 위한 분석