저자는 자금 지원 NIH / NIDCR R00DE018212 (SPH), NIH/NIDCR-R01DE022032 (SPH), NIH / NIDCR T32 DE07306 (AJ, JDL), NIH / NCRR S10RR026645 (SPH) 및 예방과 원기를 회복시키는 치과 과학의 부서를 인정하고 구강 안면 과학, UCSF. 또한, 저자는 Xradia 친목 대학원 (AJ), Xradia 주식, 플레 즌튼, 캘리포니아를 인정합니다. 저자는 데이터의 사후 처리와 그녀의 도움 박사 캐서린 Grandfield, UCSF 감사, 박사 부부를. 스티븐 와이너와 길리 Naveh, 과학, 레호 보트 이스라엘의 Weizmann 연구소;의 현장 로딩 장치에 특정 그들의 통찰력있는 논의 박사 론 샤 하르, 예루살렘의 히브리 대학, 이스라엘. 저자는 또한 마이크로 XCT의 사용과에서 현장 로딩 장치 UCSF에서 생체 재료 및 생체 공학 MicroCT 이미징 시설을 감사드립니다.

축사와 안락사 :이 데모에 사용 된 모든 동물이 기관 동물 케어 및 사용위원회 (IACUC)와 국립 보건 연구소 (NIH)의 지침에 따라 무균 조건 하에서 보관 하였다. 표준 하드 펠렛 쥐 차우와 물 광고 리브 동물을 제공합니다. IACUC 승인 한 UCSF의 표준 프로토콜에 따라 이산화탄소 질식, 양자 개흉술의 2 단계 방법을 통해 동물을 안락사. 조직의 저하를 방지하기 위해 동물의 희생을 24 시간 이내에 생체 역학 테스트를 수행합니다. 1. 준비 및 쥐 하악골이나 상악골의 해부 <ol><li> 척골 구상 과정과 과두 과정 (그림 1) (15)를 포함하여 전체 하악골을 유지하면서 부드럽게 막 조직과 근육 조직 첨부 파일을 단절하여 쥐의 턱을 제거합니다. </li><li> 자동차로 구분 hemimandiblesefully 메스 블레이드 하악 치골의 섬유 조직을 절단. 참고 : 물리적으로 2 차 몰의 생체 역학 테스트를 방해하는 경우 관상 동맥과 과두 프로세스, 하악 하악 (그림 1)를 제거해야합니다. </li><li> 몰의 로딩을 방해하지로 펄프 챔버를 노출하지 않고 앞니를 잘라. </li></ol> 2. 현장 압축 하중에 대한 표본 준비 (그림 2) <ol><li> 이전에 현장 로딩 장치 (그림 2A)에서에 넣기로 실험 표본보다 훨씬 더 뻣뻣 재료를 사용하여 스틸 스텁에 시편을 고정시킨다. 주 : 폴리 메틸 메타 크릴 레이트 (PMMA)가있는 경우, 치과 탐색기를 사용하여 제거하고, 본 연구와 과량의 시료를 고정화 하였다. </li><li> 모두 직선을​​ 사용하여 AFM 금속 시편 디스크와 관심 평행의 몰 (들)의 교합면을 맞 춥니 다면 (즉, 근심-말단과 구강 - 언어). </li><li> 어금니 주변 둔기로 저점을 만듭니다. 참고 :이 공간은 여분의 액체를 포함하고 현장 로딩하는 동안 조직의 수분을 유지하기 위해 &quot;해자&quot;의 역할을해야한다. </li><li> 치과 합성을 사용하여 동심 (그림 2B) 또는 편심 (그림 2C) 로딩 구축 치아 표면을 준비합니다. 15 초 동안 교합면에 35 % 인산 젤로 또한 치아의 표면을 에칭. </li><li> 탈 이온수로 철저하게 에칭을 씻어​​ 공기 / 물 주사기 또는 압축 공기 용기를 사용하여 표면을 건조. 탐험가로, 얇은 층에 열려있는 교두에 접착제 한 방울을 확산. 치과 치료 빛과 복합 치료. 참고 : 복합 재료를 포함한 모든 단계는 램프에서 직접 빛없이 수행해야합니다. 이러한 조건은 바람직하지 않게 중합 공정을 가속화하고 coul 것D 합성의 적절한 배치를 방지합니다. 실내 조명이 허용됩니다. </li><li> 미세한 메스 또는 면도날 인접 치아에서 과잉 접착제를 제거합니다. </li><li> 표면의 준비 다음 표면에 유동성 치과 합성을 놓고 치과 탐색기를 사용하여 관심의 몰 (들)의 홈에 확산. </li><li> 30 초 동안 치과 치료 빛에 복합 노출. </li><li> 그 몰 (들)과 30 초 동안 빛 치료의 교합면에서, 치과 수지 조성물을 사용하여 3 ~ 4 ㎜의 교합 형성을 금형. </li><li> 직선 및 고속 핸드 피스를 사용하여 모든 표본 일관된 로딩 방식을 사용하도록 평평한 표면에 평행으로 복합 상승의 상단을 줄일 수 있습니다. 주 : 생체 역학 테스트하는 동안 다른 시료 50 ㎎ / ㎖ 페니실린과 트리스 - 인산염 완충 용액 (TBS)에 저장하고, 스트렙토 마이신 (15)되어야한다. </li></ol> 3. 로딩 장치 드리프트강성, 소재 부동산의 차별화 된 기능, 섬유 공동의 현장 로딩 중 <ol><li> 그림 (b)에 나타낸 바와 같이, 균일 한 동안의로드 단계의 모루의 복합 상승과 시편, 테스트를 고정합니다. </li><li> 동심 또는 편심 하중 (그림 2B 및 2C)를 확인하기 위해 유한 부하에 시료를로드하여 다음 복합체의 표면에 관절 용지를 넣습니다. </li><li> 표본의 수분을 보장하기 위해 표본 주위에 TBS에 젖은 킴 와이프를 놓습니다. 시편 주위에 저점을 확인하고 촬영하는 동안 수화 기관을 유지하기 위해 TBS로 채 웁니다. </li><li> hemimandible의 고정 다음 변위 속도로 원하는 피크 부하에 몰을 압축하는 데벤 (Deben) 소프트웨어에 입력 피크 하중과 변위 속도. 참고 : 재료가 부하 센서 감도 = 0.1 (시간이 지남에 압축 전형적인 판독은 반동적 부하를 포함해야N). 로드 시간과 변위 시간에서, 압축 된 자료에 대한 하중 - 변위 곡선은 16-18를 얻을 수 있어야합니다. 로드 사이클로부터 수집 된 데이터를 사용하여, 공동의 여러가지 특성도 결정될 수있다. 조인트의 강성은 선형 부 변위 곡선 19 대 부하의 적재 단계 (데이터의 마지막 약 30 %)의 기울기를 고려하여 계산되어야한다. </li></ol> 4. 포스 포 산 (PTA)와 연조직, PDL의 염색, 참고 : X-선 감쇠 대비를 강화하기 위해, PDL은 5 % PTA 솔루션 (20)으로 염색해야한다. <ol><li> 백필 PTA 염색 깨끗한 1.8 ㎖의 유리 carpule에 솔루션 및 주사기에로드 carpule를 놓습니다. </li><li> 그 몰 주변 치주 조직에 구조적 손상을 방지하기 위해 인접 치아의 PDL 공간에 솔루션 천천히 (5 분 / carpule)를 주입. 참고 : 위의 단계 ㄱ한다용액의 약 5 완전 carpules (15 ㎖)까지 반복 전자가 주입되고 주변 조직에 흐르게된다. 수험 공부를 표본은 나머지 PTA 솔루션 (8 시간)에 하룻밤 담가 할 수 있습니다. </li></ol> 5. 추천 μ-XCT 스캔 설정 다음 스캔 설정 M-XCT를 수행 <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 목표 확대 </td><td> 4X, 10X </td></tr><tr><td></td><td> 1800 이미지 </td></tr><tr><td> X 선관 전압 </td><td> 75 KVP (PTA 스테인드 샘플 50 KVP) </td></tr><tr><td></td><td> 8 W </td></tr><tr><td> 노출 시간 </td><td> ~ 8-25 초 * </td></tr><tr><td></td><td> ~ 4 μm의 (4X 목적), 1 ~ 2 μm의 (10X 목적) ** </td></tr></tbody></table> * 노광 시간은 기하학과 시험편과 X-선관 VO의 광학 밀도에 기초하여 변화 할 수있다ltage. * 실제 픽셀 해상도가 다소 소스, 시험편 및 검출기의 구성에 따라 다를 것이다.

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저자가 공개하는 게 없다.

이 프로토콜을 수립하는 첫번째 단계는 강체를 사용하여로드 프레임의 강성을 평가 참여. 결과에 따라, 강성이 상당히 낮은 강성 값과 시험편의 추가 테스트를위한 장착 장치의 사용을 가능하게 높았다. 두 번째 단계는 강체 다른 가교 밀도 PDMS 재료 및 섬유상 조인트를 사용하여 생성 된 하역 곡선의 두 단계를 이용하여 서로 다른 강성 값을 구별하는 기기의 능력을 강조했다. 백래쉬 단계 동안로드 단계와 푸시에서 강성은 다음 언 로딩 및 재료의 회복 물질의 저항을 식별하기 위해 사용되는 (도 3 및 4) 하였다. 프로토콜의 세 번째와 네 번째 단계는 t로 수행 시츄 촬상에 장착 장치로부터 얻어진 하중 - 변위 곡선의 변화를 상호 연관되었습니다그는 X-선 (그림 5)의 사용. 이 관절을로드 각각 동심 및 편심 상태에서, 무부하 및 부하에 단층 촬영을 얻을 수있었습니다. 프로토콜은 PDL 압축의 수준 로딩 축 차이를 변화시킴으로써 (도 6 및도 7)을 강조 할 수 있다는 것을 보여 주었다. 이 토론에서 우리는 첫 번째 계기 기능과 적절하게 이해하고 전에 뼈 PDL 치아 복합체의 생체 역학 테스트하기 위해 충족해야 문제를 강조 할 것입니다. 실험 장치의 도전 복합 상승 : 프로토콜 자체는 비교적 간단하지만, 신중하게 수행해야합니다 몇 가지 단계가 있습니다. 가장 큰 과제 중 하나는 기계적으로 여러 개의 치아를 연결합니다 인접 치아에 그 초과하는 복합 재료가 오버 플로우하지 않았다 보장하고 공동 mechan을 잘못했다단일 치아의 ICS. 치과 도구의 상당한 손재주와 지식이 절차에 유용한 것으로 판명 때문에, 로딩을위한 시료의 준비는 주로 광학 배율의 도움으로 치과 학생 및 치과 의사에 의해 수행되었다. 일관된 로딩 방식은 : 생체 역학 테스트를위한 또 다른 중요한 정보는 일관된 로딩 방식을 확인하는 것이 었습니다. 원위치에서 장착 장치의 턱 및 복합체의 대향 표면 사이의 접촉 면적이 실험에 매우 중요한 것으로 입증되었다. 섬유상 관절의 역학 동심 및 편심 (언밸런스) 하중을 이용하여 본 연구에서 시뮬레이션 된 접촉 영역의 결과로서 변화 할 수 있기 때문이다. 본 연구에서 제시 한 시나리오는 폐포 소켓 내에서 치아 이동의 변화 (그림 5)에서 발생할 수있는 포유 동물의 치아의 교합 변화 가능성을 모방. 그것은 그쪽으로 이해되는 동안t 제안 테스트기구는 표준 시험 방법으로 자신을 소개 생리 저작주기를 모방하지 않는다. 로드 단계의 턱에 평행 한 표면을 가진 복합 상승을 만들어, 우리는 일관된 로딩 패턴을 생성 할 수 있었다. 본 표준 시험 방법은 다양한 실험군에서 뼈 PDL 치아 착체의 역학에 변화를 식별하기 위해 사용될 수있다. 의 현장 로딩 장치의 감도 : 실험 프로토콜의 검출 한계의 유효성을 검사하는 방법을 설명하는 두 개의 표준 물질로 간주 될 수있는 세 가지 표본을 사용하여 현장 로딩 장치. 알루미늄 테스트로드 프레임의 강성은 다양한 PDMS 시편의 기계적 거동을 관찰하고, 섬유 관절의 생체 역학적 반응을 무시할 포스팅으로 높았다. 테스트 한 모든 표본 반발 기간이있는 동안~ 3 초 약간 검체의 종류 (도 4a) 변화 백래쉬 부의 형상. 부드러운 표본이 급감 (그림 4A)를 전시하지 않았지만 경질 표본 반동적 부하의 급격한 감소 (그림 3A 및 4A)를 나타냈다. 백래쉬 행동 차이가 기어 반전시에 기어 위로 밀어 시험편의 능력에 기인한다고 주장 할 수있다. 턱이 떨어져 표본에서 이동을 시작으로 기어의 푸시 백 효과는 재료의 최대 반동적 인 응답의 낮은 드롭으로 나타낼 수있다. 따라서, 반발 세그먼트는 재료 특성에 대한 통찰력을 얻기 위해 이용 될 수있다. 하중 변위 곡선으로부터 산출 PDMS의 강성 값은 문헌 (22) 값과 일치했고, 가교 PDMS위한 강성의 범위는 뼈 PDL 치아 착체의 범위 이내였다. 따라서, 현장로드에 Device 그것이 폐포 소켓으로 압축 될 때 치아의 변위 및 반동 반응을 측정하기 위해 적당하다. 반동 반응은 부드러운 및 / 또는 어렵게 성분에서 할 수있다. 열심히에 부드러운 성분의 지배 디지털 뼈 PDL 치아 단지 (13) 내에 변형 지배 영역을 식별하기 위해로드 조건에 더 부하를 상관 없습니다 다음, 점진적 및 이미지로드하여 식별 할 수 있습니다. 저작의 주성분은 축 방향이다 : 인간과 유사하게, 래트의 저작 사이클은 후드 (23, 24)을 씹는 하악의 자유로운 움직임을 포함한다. 이 움직임은 같은 측면 움직임과 같은 많은 다른 경로를 포함하도록 매핑되었지만, 부하의 주성분은 축 방향 (23)에있는 것으로 생각된다. 따라서, 축 방향으로 현장로드에서 시뮬레이션은 동심원 하나를 배치했다LY 또는 편심 (그림 2). 오르간 레벨 역학 관련된 결과에 영향을 미칠 수있는 실험적인 요인 : 시츄 로딩에서와 X-레이 현미경을 결합의 장점은 하중 - 변위 곡선은 폐포 소켓, 루트의 형태로 치아의 공간적 관계에 상관 될 수 있다는 및 폐포 표면 및 부하 PDL 공간의 축소 및 넓히는. 상관 관계와 상호 보완적인 평가는 기관의 역학을 결정하는 포괄적 인 접근 방식을 제공합니다. 과거에는, 그것만 장기 및 / 또는 조직의 역학 하중 - 변위 거동을 프롬프트 할 수 있음을 가정 하였다. 이 프로토콜은 부하 이동 회원의 협회도 관찰 강성의 특성을 정의 할 수 있다는 것을 보여줍니다. 제 5-8 N에서 관찰 된 모든 변경 사항은 PDL의 질 내에서 초기 형태 적 변화에 기여하는 것으로 생각된다콜라겐과로드 할 최소한의 저항 간질 액 교환,이 영역은 &quot;uncrimping&quot;영역 (26)로 언급하고있다. 7 N보다 높은로드는 치아, 뼈, 치주 인대의 변형 경화 효과 및 조직을 연결하는 인터페이스로 기부 할 수있다. PDL 공간을 최소화하고, PDL은 변형 경화를 거쳐으로, 치아와 뼈 소켓 사이에 단단한 조직의 상호 작용은 경사 변위 급격한 부하의 결과로 interradicular 지역에서 발생하면. 물질 회수 이외에, 장착 장치의 백래쉬는 다른 연구 (16), (25)에 대해서 행한 조인트를 변경하지 않고 PDL의 점탄성 특성을 조사하기 위하여 이용 될 수있다. 하중 변위 곡선 내에서 일반 영역은 관절 내 일부 이벤트 상관 관계. 위의 이벤트는 두 로딩 방식 사이의 공통 분모이다. 그러나 차이점동심 및 편심 하중 - 변위 프로파일과 해당 단층 촬영 사이에 전체 기관의 생체 역학에 하중 방향의 영향을 강조했다. 이러한 차이의 주요 원인은 특정 영역에서 PDL 공간의 압축을 일으키는 원인이되는 관절 내에서 변위로 치아의 회전의 도입이었다. 이것은 정상적인 생리로드가 회전 치아 이동을 도입하는 것을 포함 여러 방향으로 치아에 적용되는 것으로 이해된다. 그러나, 동심 로딩 방식이 모든 표본을 통해 &quot;표준&quot;편심 하중을 적용하는 어려움으로 인해가 표준 방식으로 사용하는 것이 좋습니다. 이와 실험 프로토콜이 적응 nonadapted 시스템 사이의 생체 역학적 차이를 구분하는 데 사용 될 수있는. 고 에너지 X-선을 사용의 단점 중 하나는 이들이 최소한 부드러운 조직에 의해 흡수 및 불충분 콘트라스트를 생산하는 것이있다. PDL은 transpare입니다NT X-레이와 같은 결과는 조영제의 사용을 필요로한다. PTA는 직접 27 ~ 29 염색 및 X-선을 사용하여 시각화를 위해 허용하여 연부 조직의 대조를 강화한다. 따라서,로드 및 언로드 단층 촬영 사이의 스테인드 부드러운 조직의 영역 내에서 조영제, 볼의 변형을 사용하여 관찰하지만 높은 배율 (10 배 이상)를 분석 (데이터가 표시되지 않음)을 권장합니다. 염색 프로토콜의 한계는 에탄올의 사용, PDL 및 잘못된 결론에 이르는 전체 공동 역학의 강성을 변경할 수도 가벼운 정착액 (29)를 포함. 결론 이 연구 결과는 그대로 뼈 PDL 치아 섬유 관절의 생체 역학적 반응을 분석하는 새로운 테스트 프로토콜을 강조하지만, 생체 조건에서. 데이터의 사후 분석 등 설명한 실험 방법 exper를의 효과를 측정 할 수있다imental 변수 (예 : 질병, 성장 인자, 연령, 치료 분자) 뼈 PDL 치아 섬유 관절의 역학. 또한,이 실험의 결과는 대용량 기관 수준의 변화 사이의 관계는 조직과 세포 수준에서 특정 변경에 관련 될 수있는 기준이 될 것입니다. 프로토콜의 제한, 생체 조건에서 촬영, 조영제의 사용 및 단층 생성에 필요 이상 수집 시간 동안 인해 조직의 이완 치아와 치조골 소켓의 표면 사이의 공간 정확도의 손실을 포함한다. 내장 보충 물질 상악 내 어금니의 생체 역학 테스트를위한 프로토콜 : 1. 상악 테스트 할 것 인 경우에, 위로 향하게 복부 측면 (입천장) 각 쥐의 두개골에서 상악를 제거합니다. 근육과 인대의 연결 조직에서 끊다현관 (잇몸과 뺨 사이에 포켓)을 절단하여 두개골의 측면 측면. 2. 만져 및 두개골의 상악 뼈의 광대뼈 과정을 파괴하고 상악 뼈에서 광대뼈 아치를 절단. 3. 똑바로 부드러운 구개부터 뇌를 통해 대량 해부 가위와 두개골을 잘라. 두개골의 앞쪽 부분을 분리하고 떨어져 두개골의 등 부분 (상단)의 머릿 가죽을 벗긴다. 4. 미세 해부 가위로, 경구개의 중심을 통해 앞니 사이의 치간 지역까지 직선을 따라 절개하여 좌우 hemimaxillae를 구분합니다. 컷의 깊이가 얕은 있는지 확인 - 만 충분히 깊은 경구개에 구​​멍을합니다. 5. 절개 (두개골의 긴 축)과 직교하는 것으로 hemimaxillae 격리세 번째 어금니에 제 1 대구치 후방에 전방. 1) 루트 구조를 중단시킬 수에 대한 첫 번째와 세 번째 어금니에 너무 가깝게 자르지 말라, 2) 세 개의 어금니를 둘러싼 잇몸 조직을 접고하지 마십시오. 각 hemimaxilla 뛰어난 얇은 상악 뼈를 절단하여 두개골에서 hemimaxillae을 분리합니다. 초과 조직과 뼈의 spicules를 제​​거합니다. 기계적 검사 장치의 유효성 : 로드 프레임의 강성 및 하중 / 변위 센서의 감도를 결정하기 위해, 실험 시편보다 작게함으로써 이러한 높은 탄성률과 알루미늄 등의 강체를 사용한다. 악기가 부드러운 요소의 다양한 강성 값 담당자를 구별 할 수 있는지 확인하려면 다른 가교 밀도 (1:5 1:10 중량베이스 1:25 가교제)와 PDMS 블록을 제작 및이를 사용하여 이러한로드현장 로딩 장치. 부드러운 요소의 콘트라스트 향상을위한 위상 콘트라스트 모드 : PDL의 대비 향상은 스캐너의 위상 콘트라스트 모드를 이용하여 수행 할 수 있습니다. 기본적으로 위상 콘트라스트는 조직의 가장자리 위상에 변화의 스캐너 감지 기능을 이용하고, 강화 된 구조 세부 사항을 제공합니다. 그 결과, 본 연구에서, cementocyte - lacunae 및 골 세포 - lacunae의 lacunae는 각각의 광물 조직 내의 기공으로 나타났다. 이러한 구조는 이전에 흡수 모드에서 표준 검사에서 발견되지 하였다. 단층 촬영 부정적인 공간, 즉 PDL 공간과 Haversian 운하 시스템 (3D 모델은 그림 S1 참조) 등의 내막 공간 내에서 구조의 시각화를 위해 허용 된 전송 모드에서 인수했다. PDL-공간 내에서 추가 구조는 그 나는 연속되는 혈관으로뿐만 아니라, 시각화 할 수 있습니다N 뼈. 단층 수집 및 시스템 드리프트 평형 부하 :.이 섹션은 최고의 보충 그림 2를 참조하여 설명 할 수있다 그림 S2A 전에 단층 촬영 취득에 최대 부하를 평형의 필요성을 보여줍니다. 피크 부하는 변함없이 낮은 크기에 부패와 6-8 시간의 단층이 인수되기 전에 시스템이 시간 동안 적어도 평형되어야한다. 그것은 획득 한 단층 촬영은 최대 부하에서 뼈 치아 협회의 대표는 아니지만 주목해야한다 피크 부하보다 2 ~ 3 N 낮은 부하에서. 또한, 견고한 알루미늄 스텁을 사용하여 식별 측정 시스템 드리프트 변위 속도 및 / 또는 피크 부하 (그림 S2B 및 S2C)로 변경 밝혀졌다. 근사 드리프트 값 + 1에서 N / 시간이었다. 기계적 시험 후, 섬유 관절의 단층 촬영은 무부하에서 찍은,<html> 그리고 원하는 변위 속도에서 피크 부하에. 이전에로드 된 상태에서 단층 촬영을 획득에주의를 시스템이 검사를 진행한다 평형 (안정성) 다음에 올 수 있도록주의해야한다. 비슷한 조건 편심로드와 PTA 염색 단지 반복했다. 단층 촬영에서 가상 슬라이스는이 - 및 삼 - 차원 모두 치아 뼈 연관을 식별하기 위해로드 조건 무부하에서 비교 하​​였다. 보충 그림 1. 위상차 향상된 X-레이 현미경을 사용하여 부정적인 공간의 3D 재구성은. 위상 콘트라스트 개선 모드에서 조직의 가장자리에서 발생하는 위상 시프트는 PDL 내의 혈관을 강조하기 위해 이용 하였다. 전송 모드 (오른쪽) 내막 스페이스뿐만 PDL 공간 내 혈관을 강조하면서 구체적 흡수 모드 (왼쪽), 시야 내의 광물 조직을 강조했다. 십t &quot;&gt; 이전에 CT 스캔에 평형 상태로 보충 그림 2 피크 반동 세력의.의 붕괴. 곡선은 섬유 공동 (상판)의 반동적 인 응답의 다른 붕괴 속도를 표시하고 강체 (아래 패널).

여러 가지 실험 방법은 diarthrodial 및 섬유 관절의 생체 역학 조사를 계속 사용. 치아 기관의 역학에 대한 구체적인 방법은 스트레인 게이지 1-3, 광탄성 방법 4, 5, 모아레 간섭 6, 7, 전자 스페 클 간섭 8, 디지털 이미지의 상관 관계 (DIC) 9-14의 사용을 포함한다. 이 연구에서 혁신적인 접근 방식은 섬유 관절의 내부 구조를 노출하는 X-선을 사용하여 (부드러운 영역으로 구성된 광물 조직과 자신의 인터페이스를하고 인대 등의 조직을 인터페이스) 생체 내 조건에 해당하는 부하에서 비 침습적 영상이 포함되어 있습니다. 마이크로 X-선 현미경에 결합 시츄 장착 장치가 사용될 것이다. 로드 시간과 하중 - 변위 곡선은 갓 수확 쥐 헤미 - 하악 내 관심의 몰로드로 수집됩니다. M1) 무부하 때로드 때 2)과 동심으로 편심로드 : 본 연구에서 제시된 방법의 아인 목표로 조건을 비교하여 치아 뼈의 3 차원 형태의 효과를 강조하고있다. 잘라 시험편에 대한 필요성을 제거하고, 습식 조건 하에서 전체 그대로 기관에 실험을 수행하여 3D 응력 상태의 최대 보존을 허용한다. 이것은 다양한로드 시나리오에서 복잡한 동적 프로세스를 이해하는 연구의 새로운 영역을 엽니 다. 본 연구에서는, 스프 라그 돌리 쥐의 손상되지 않은 섬유 관절 내에서 테스트 PDL의 생체 역학에 대한 방법은 최적의 생체 공학 모델 시스템으로 간주 관절 상세히 설명한다. 실험들은 기관 수준의 생체 역학 관련으로 관절의 세 가지 중요한 기능을 강조하기 위해 수화 된 상태에서 저작 부하의 시뮬레이션이 포함됩니다. 3 점 포함됩니다 변위 대 1) 반동을 :치아 치조 소켓 내에서 변위 및 하중에의 반동 반응, 2) 3 차원 (3D) 공간 구성 및 morphometrics : 폐포 소켓과 치아의 기하학적 관계와 수의 변동으로 인해 판독 1, 2, 3) 변경 동심의 편심 하중, 즉로드 축. 제안 된 기술의 세 가지 기본 판독 인해 기능적 요구의 변화 및 ​​/ 또는 질병의 하나 척추 관절의 적응 특성을 조사하기 위해 적용될 수있다. 상기 판독 값의 변화, 다른 로딩 속도에서 구체적으로 변위 반동 부하 사이의 상관 관계, 그리고 반동로드 시간과 하중 - 변위 곡선의 결과는 공동 역학의 전반적인 변화를 강조하기 위해 적용 할 수 있습니다. 제안 된 프로토콜의 효능은 3D morphometrics과 관절의 전반적인 생체 역학에 기계적 시험 판독 결합에 의해 평가됩니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="652">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Bard Parker Blade</td>
			<td style="width:101px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">MEDC-001054</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">AFM metal disk</td>
			<td style="width:101px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:123px;">16218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Polymethyl methacrylate&#160;</td>
			<td style="width:101px;">GC America</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Uni-Etch</td>
			<td style="width:101px;">Bisco</td>
			<td style="width:123px;">E5502EBM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Optibond Solo Plus</td>
			<td style="width:101px;">Kerr Corp</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Filtek Flow</td>
			<td style="width:101px;">3M</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Hurculite Ultra</td>
			<td style="width:101px;">Kerr</td>
			<td style="width:123px;">34346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Tris buffer</td>
			<td style="width:101px;">Mediatech Inc.</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Articulating paper</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Phosphotungstic Acid</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">HT152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ compressive loading and correlative noninvasive imaging of the bone-periodontal ligament-tooth fibrous joint

이 연구는 소설의 역학 시험 프로토콜을 보여줍니다. 이 프로토콜의 장점은 따라서 모의 생리적 하중 및 습식 조건 하에서 내부 구조 요소의 시각화를 가능하게 고해상 X-레이 현미경에 결합 시츄 장착 장치에서의 사용을 포함한다. 실험 표본은 그대로 뼈, 치주 인대 (PDL) - 치아 섬유 관절을 포함 할 것이다. 1) 변위 대 반동 : 치아 변위 폐포 소켓 사이 및 로딩, 2) 3 차원 (3D) 공간적 구성보기에 그 반동 응답 결과들은 장기 레벨 생체 역학에 적용 할 수있는 프로토콜의 세 가지 중요한 기능을 설명 할 것이다 및 morphometrics : 기하학적 인 폐포 소켓과 치아의 관계, 인한, 즉 편심 하중에 동심에서로드 축 변화에 판독 1, 2, 3)으로 변경됩니다. 제안 된 프로토콜의 효능 기계 테 커플 링에 의해 평가 될 것입니다3D morphometrics과 관절의 전반적인 생체 역학에 따끔 판독. 또한,이 기술은 특히 반동로드 전에 섬유상 관절 단층 촬영 취득에, 실험 조건을 평형화 필요성을 강조한다. 그것은 제안 된 프로토콜은 생체 조건에서 표본을 테스트로 제한하고, 부드러운 조직 기계적인 반응을 시각화하는 조영제의 사용은 조직과 기관 수준의 생체 역학에 대한 잘못된 결론으로 이어질 수 있음을 유의해야한다.

로딩 장치 &quot;반발&quot;일정한 부하가 &quot;푸시&quot;, 강성 및 시스템 드리프트 추정 백래쉬 : 사이클의 로딩 및 언 로딩 부분 사이에 진정한 하역 표본 멀리 가기 턱 (그림 3)에서 끌어 즉로, 개시하기 전에 모터에서 역 기어하는 동안 3 초 일시 정지가 존재한다. 이 기간은 시스템이 턱의 개구를 폐쇄로 전환하려고 할 때 시간 세그먼트를 나타내는 시스템의 백래쉬로 지칭된다. 그것은 모든 하중 싸이클 불문 시험편 또는 적하 상태의 유사 백래쉬 응답 (도 4)를 포함 할 것이라는 점을 주목해야한다. 강체를 사용하여 획득 시간 곡선 대 정상 부하는 서로 다른 두 리터에 로딩, 언 로딩, 백래쉬 영역을 강조하는도 3a 및도 3b에 도시6 N 16 N의 oads는 해당 세 부분을 강조 변위 곡선 대 수직 하중은 그림 3C에 표시됩니다. 푸시 : 전체 반발주기가 동일한 3 초의 시간 프레임 내에 응답 반동 및 반발 영역의 형상 시험편에 따라 변경할 수있는 결과로 발생할 수 있지만. 뼈 PDL 치아 복잡하고 polydimethlysiloxane (PDMS)과 비교할 때 강체 (도 3)를 사용하여 시스템을 테스트함으로써, 반동 부하 및 높은 가파른 하락이 관찰되었다. 그러나, 섬유 관절 PDMS에 비해 반발 단계에서 반동적 부하에 상당한 하락을 보여줍니다. PDMS (그림 4) 표본은 적어도 드롭 (- 그림 4A 1시 5분 및 1시 25분 가교제 밀도 사이의 차이)가 나타났다. 강성 : 로딩 장치의 강성 테스트 AGainst 강체는 복잡하고 PDMS 시험편보다 유의하게 높았다. 이러한 데이터는 뼈 PDL 치아 복잡하고 더 부드러운 재료 (도 4b)의 역학에 변화를 강조 장착 장치의 효과를 검증. μ-XCT를 사용하여 그대로 뼈 PDL 치아 단지 내에 소프트 및 하드 조직 구조를 시각화 : 흠,하지만 수화 섬유 관절, 치조골, 백악질, 에나멜과 상아질 등의 단단한 조직 기능의 감쇠가 강조되었다 (도 5A 및 (b)). 그러나, 주로 부드러운 유기 조직을 포함 공간 (블랙) 상대적으로 &quot;빈&quot;PDL 공간을 떠나, X-선에 투명했다. PTA로 처리 한 시편 따라서 PDL 및 치은 조직 (그림 5C-F)의 기능 담당자를 강조, PDL 공간 내에서 증가 대비를 보여 주었다. 높은 거룩한에서 검색ATION는 치아와 뼈 사이의 섬유 네트워크로 PDL을 공개했다. 변위 대 반동 : 현장 로딩 중 섬유 관절의 생체 역학적 반응 : 동심로드와 비교, 유사한 시편에 편심 하중 패턴이 주어진 반동 부하 (그림 6A)에 대한 공동 내에서 치아의 증가 변위를 보여 주었다. 그러나 PTA 처리 섬유상 관절 전체적인 생체 역학의 유의 한 차이에 관계없이 적재 상태 (도 6b)의 관찰되지 않았다. 미처리하지만 편심로드 된 시스템에서, 폐포 소켓에 루트의 상승 변위는 하중 - 변위 곡선 (도 6c)에서와 같이 낮은 강성으로 상관 될 수있다. 제어 그룹 내에서 수확 섬유 관절의 생체 역학적 반응의 범위에 이르는 자연 변화가있을 수 있지만, 섬유 PTA는 처리관절이 증가 강성을 전시하고 덜 소켓 내의 지정된 반동 피크 부하에 대한 치료 대응에 비해 난민. 그러나, 치료 및 PTA 처리 시험편 간의 부하 사이클의 백래쉬 위상의 형상이나 기간에 검출 가능한 변화는 없었다. 입체적인 공간 구성 및 morphometrics : μ-XCT를 사용하여로드 조건에서 뼈 치아의 구성을 매핑 : 단층 촬영에서 찍은 가상 슬라이스는 소켓 내에서 1) 치아 이동을 설명하기 위해 비교 하였다, 2) 치아 뼈 협회 2D와 3D 모두 3)에 의한 편심 운동의 정도는 동심로드에 비해. 치아 이동은 무부하에서 부하 및 발생 GIF 영화에서 유사한 가상 조각의 중첩에 의해 강조되었다. 두 로딩 방식은 치아, 관절 내에서 수직 방향으로 편심 하중 구성 (그림 (b)와 (c)) C를 치환하는 원인이 있지만뿌리가 동심로드 스 (도 7 및도 8)에 비해 뿌리의 원위 측면을 따라 감소 PDL 공간에서 얻어진 말단 회전로 치아의 추가적인 회전 효과 aused. PTA 염색 PDL 더 감쇠 (그림 5), PTA 처리 관절 폐포 소켓 내에서 치아의 이동 (그림 (b)와 (c)) 이하 발음과 생체 역학 데이터의 상관 관계를 보였다했지만. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51147/51147fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51147/51147fig1.jpg" /> 그림 1. 생체 역학 테스트를 위해 hemimandible을 준비하는 주요 위치의 적응 (15) 그림. 삽입 내 보이는이 hemimandible입니다. <p class="jove_content" fo:keep-together.within 페이지 = &quot;항상&quot;&gt; <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51147/51147fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51147/51147fig2.jpg" /> 그림 2. 마이크로 X-선 컴퓨터 단층 촬영 (μ-XCT) 단위 내에서 사용자 정의 홀더 현장 로딩 장치의 현장 로딩 장치와 μ-XCT 시스템의 구성. (A) 이미지. 동심 (B) 및 앤빌 및 복합 표면 사이의 접촉 형태에 의해 결정 편심 (C) 적하 상태는 회로도의 형태로 도시하고, 대응하는 실험 셋업 (영역 (A에서 흰색 상자에 의해 강조에 상응 아르 )이었다. 마크 용지가 앤빌 ​​및 치과 복합 사이의 초기 접촉 면적을 확인 분명히 말하는에서. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51147/51147fig2highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오. &lt;</a>/&gt; <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51147/51147fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51147/51147fig3.jpg" /> 그림 3. 강체를 사용하여 시간 대 대표로드 시간 곡선 시스템 &quot;반발&quot;설명.로드 폐쇄와 받침대의 구멍 사이의 이벤트로 반발 기간을 보여줍니다. 녹색 지역은 앤빌 (15) N (A) 및 5 N (B, 삽입)에 강체를로드 (녹색 영역)에 접근하고 로딩 시간을 나타냅니다. 파란색 영역은 받침대가 서로에서 후퇴하는 하역 기간을 나타냅니다. 그러나으로 인해으로 인해 기어 반전 촬영 시간에 순간 모터 응답의 부족으로 2 ~ 3 초 뒤 채찍질 기간이있다. 사실 언 로딩이 발생하기 전에이 시간 동안 부하가 2 N로 약 감소한다. 로딩 및 언 로딩 이벤트는 변위 그래프 대로드 관련 될 수백래쉬 기간 동안 최소한의 변위를 보여줍니다의 (C). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51147/51147fig3highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51147/51147fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51147/51147fig4.jpg" /> 그림 4. 주제 하중 - 변위 곡선 및 &quot;푸시&quot;효과는 PDMS를 이용하여 바닥 곡선 :. 가교제 비율로 단량체를 감소 PDMS 사이로드 시간 관계는 재료 특성의 차이를 검출 반응계 로딩 유닛의 능력을 보여준다. 높은 곡선은, 좌우로 인해 재료 회복 ​​시스템의 백래시의 변화를 예시한다. 비교 좌우 1:25 및 1:05 PDMS 사이 복구 차이가 최소화되거나 내에 있지 않은 것을 나타내는, 동일한 효과를 나타낸다로딩 장치의 검출 한계. B) 강체 알루미늄, 실험 표본 및 3 PDMS 표본을 포함한 다양한 재료의 하중 - 변위 곡선을. 그것은 재료의 강성을 계산하는 데 사용 된 하중 곡선의 30 % 선형 부분의 경사입니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51147/51147fig4highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51147/51147fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51147/51147fig5.jpg" /> 그림 5. PDL의 구조 개선에 스테인드 하악 두 번째 어금니의 X-선 가상 섹션. 치료 어금니 이내 (A, B) 그레이 스케일 값은 단지 내 부드러운 영역을 포함한 다양한 조직의 X 선 감쇠를 나타냅니다. 그러나, PDL 등 nonmineralized 조직으로 인해 그 m에 강조 표시되지 않은inimal 75 KVP에서 X-선 에너지의 특성을 감쇠. 부드러운 PDL의 감쇠 특성을 염색 (CF)에 따라 PTA는 강화되었고 PDL 내의 정보는 X-레이 현미경을 이용하여 가시화 하였다. 따라서, 2 차원 가상 시상 (C-4 배 확대, E-10X 배율) 및 가로 (D-4 배 확대, F-10X 배율) 섹션 PDL 섬유 방향 (노란색 화살표)를 공개했다. pulpal 공간이 흠 유지하면서 내막 공간 (주황색 화살표)과 PDL (흰색 화살표) 내 혈관의 루멘, 어두운 원형 구조를 나타납니다. 염색 과정 중에 생성 된 유물은 (D, 빨간 별표)에 명시되어 있습니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51147/51147fig5highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" fo:content-width="5in"<html> FO : SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51147/51147fig6highres.jpg&quot;SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51147/51147fig6.jpg&quot;/&gt; 그림 6. 동심 및 편심로드 표본. 정상 (A)와 하단 패널 (B)는 무부하에서 치아 뼈 관계의 빠른 시간의 영화를 설명하고 각각 동심 및 편심 15 N에로드 될 때. 상단과 하단 패널은 때 치료 (A)와 스테인드 (B) 조건 뼈 치아의 관계를 보여줍니다. 센터 패널 (C)는 (왼쪽 곡선)로드 단지, 스테인드와 흠 (오른쪽 곡선) 단지 편심과 동심 사이에 서로 다른 하중 - 변위 동작을 보여줍니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51147/51147fig6highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 147/51147fig7highres.jpg &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/51147/51147fig7.jpg &quot;/&gt; (A) 동심로드 편심 (B) 압축. 대부분이 interradicular (화살표 머리)와 정점 (화살표) 지역 내에서 볼 때 2 차 몰의 그림 7. 시상 부분은 폐포 소켓과 치아의 관계를 보여줍니다. 편심로드 (B)의 가상의 치아 부분과 비교하면, 톱니 모션 원인의 추가적인 회전 성분은 근심 루트의 선단 측에 압축을 증가시켰다. 오버레이 가로 섹션 (회색) 동심로드 치아에 원심 번역 및 치아의 시계 방향으로 회전 운동 (녹색 뿌리) 상대를 한 것으로 밝혀졌습니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51147/51147fig7highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 8" fo:content-width="5in"FO : SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51147/51147fig8highres.jpg&quot;SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51147/51147fig8.jpg&quot;/&gt; 그림 8. 복원 된 3D 영화는 (E) 편심로드 동심로드 복잡한 (D)에 비해 뿌리의 말단 측에서 감소 PDL 공간을 알 수있다. 클릭 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51147/JOVE-Eccentric.mpg" target="_blank">여기에</a> 편심 하중을보고 클릭 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51147/JOVE-Concentric.mpg" target="_blank">여기에</a> 동심로드를 볼 수 있습니다.

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In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

본 연구에서는, 섬유 관절 생체 역학에 대한 마이크로 X-선 계산 tomography 결합 시츄 장착 장치에서의 사용이 논의 될 것이다. 관절 생체 역학의 전반적인 변화에 식별 실험 판독이 포함됩니다 : 1) 반동 변위 대 힘, 폐포 소켓 내에서, 즉 치아의 변위 및 하중에의 반동 반응을, 2) 3 차원 (3D) 공간 구성 및 morphometrics, 즉 기하학적 로딩이 축, 즉 동심 또는 편심 하중의 변화에 폐포 소켓 치아 및 판독 1, 2, 3) 변화의 관계.

현장 압축 하중과 뼈, 치주 인대 치아 섬유 공동의 상관적인 비 침습 이미징

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a ...

in-situ-compressive-loading-correlative-noninvasive-imaging-bone

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

13.3K 조회수.  University of California San Francisco.  본 연구에서는, 섬유 관절 생체 역학에 대한 마이크로 X-선 계산 tomography 결합 시츄 장착 장치에서의 사용이 논의 될 것이다. 관절 생체 역학의 전반적인 변화에 식별 실험 판독이 포함됩니다 : 1) 반동 변위 대 힘, 폐포 소켓 내에서, 즉 치아의 변위 및 하중에의 반동 반응을, 2) 3 차원 (3D) 공간 구성 및 morphometrics, 즉 기하학적 로딩이 축, ?...

비디오: In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

고해상도 광섬유 Microendoscopy에 대한 현장에서 세포 이미징

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

연구

생체공학

Demonstrating the Uses of the Novel Gravitational Force Spectrometer to Stretch and Measure Fibrous Proteins

The study of macromolecular structure has become critical to the elucidation of molecular mechanisms and function. There are several limited, but important bioinstruments capable of testing the force dependence of structural features in proteins. Scale has been a limiting parameter on how accurately researchers can peer into the nanomechanical world of molecules, such as nucleic acids, enzymes, and motor proteins that perform life-sustaining work. Atomic force microscopy (AFM) is well tuned to determine native structures of fibrous proteins with a distance resolution on par with electron microscopy. However, in AFM force studies, the forces are typically much higher than a single molecule might experience 1, 2. Optical traps (OT) are very good at determining the relative distance between the trapped beads and they can impart very small forces 3. However, they do not yield accurate absolute lengths of the molecules under study. Molecular simulations provide supportive information to such experiments, but are limited in the ability to handle the same large molecular sizes, long time frames, and convince some researchers in the absence of other supporting evidence2, 4.
The gravitational force spectrometer (GFS) fills a critical niche in the arsenal of an investigator by providing a unique combination of abilities. This instrument is capable of generating forces typically with 98% or better accuracy from the femtonewton range to the nanonewton range. The distance measurements currently are capable of resolving the absolute molecular length down to five nanometers, and relative bead pair separation distances with a precision similar to an optical trap. Also, the GFS can determine stretching or uncoiling where the force is near equilibrium, or provide a graded force to juxtapose against any measured structural changes. It is even possible to determine how many amino acid residues are involved in uncoiling events under physiological force loads 2. Unlike in other methods where there is extensive force calibration that must precede any assay, the GFS requires no such force calibration 5. By complementing the strengths of other methods, the GFS will bridge gaps in understanding the nanomechanics of vital proteins and other macromolecules.

This is a step-by step guide showing the purpose, operation, and representative results from the novel gravitational force spectrometer.

섬유 단백질을 늘이기 및 측정 소설 중력 포스 분석기의 사용을 보여주는

The study of macromolecular structure has become critical to the elucidation of molecular mechanisms and function. There are several limited, but ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and mechanical strength. These native collagen fibrils have a characteristic banding periodicity of ~67 nm and are formed in vivo through the hierarchical assembly of Type I collagen monomers, which are 300 nm in length and 1.4 nm in diameter. In vitro, by varying the conditions to which the monomer building blocks are exposed, unique structures ranging in length scales up to 50 microns can be constructed, including not only native type fibrils, but also fibrous long spacing and segmental long spacing collagen. Herein, we present procedures for forming the three different collagen structures from a common commercially available collagen monomer. Using the protocols that we and others have published in the past to make these three types typically lead to mixtures of structures. In particular, unbanded fibrils were commonly found when making native collagen, and native fibrils were often present when making fibrous long spacing collagen. These new procedures have the advantage of producing the desired collagen fibril type almost exclusively. The formation of the desired structures is verified by imaging using an atomic force microscope.

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Simple and reproducible procedures are described for making three structurally distinct collagen assemblies from a common commercially available Type I collagen monomer. Native type, fibrous long spacing or segmental long spacing collagen can be constructed by varying the conditions to which the 300 nm long and 1.4 nm diameter monomer building block is exposed.

기본, 섬유 긴 간격 및 Segmental 긴 간격 콜라겐의 체외 합성에

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

We designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for transplantation. While the device primarily functions as a bioreactor that mimics the native mechanical strains, it is also outfitted with a load cell for providing force feedback or mechanical testing of the constructs. The device subjects engineered cartilage constructs to biaxial mechanical loading with great precision of loading dose (amplitude and frequency) and is compact enough to fit inside a standard tissue culture incubator. It loads samples directly in a tissue culture plate, and multiple plate sizes are compatible with the system. The device has been designed using components manufactured for precision-guided laser applications. Bi-axial loading is accomplished by two orthogonal stages. The stages have a 50 mm travel range and are driven independently by stepper motor actuators, controlled by a closed-loop stepper motor driver that features micro-stepping capabilities, enabling step sizes of less than 50 nm. A polysulfone loading platen is coupled to the bi-axial moving platform. Movements of the stages are controlled by Thor-labs Advanced Positioning Technology (APT) software. The stepper motor driver is used with the software to adjust load parameters of frequency and amplitude of both shear and compression independently and simultaneously. Positional feedback is provided by linear optical encoders that have a bidirectional repeatability of 0.1 &mu;m and a resolution of 20 nm, translating to a positional accuracy of less than 3 &mu;m over the full 50 mm of travel. These encoders provide the necessary position feedback to the drive electronics to ensure true nanopositioning capabilities. In order to provide the force feedback to detect contact and evaluate loading responses, a precision miniature load cell is positioned between the loading platen and the moving platform. The load cell has high accuracies of 0.15% to 0.25% full scale.

We designed a novel mechanical loading bioreactor that can apply uniaxial or biaxial mechanical strain to a cartilage biocomposite prior to transplantation into an articular cartilage defect.

조직 공학을위한 이축 기계 로딩 생물 반응기의 설계

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be validated for predictive purposes. Ideally such systems would be low volume, which precludes sampling and destructive analyses when time course data are to be obtained. What is needed is an in situ monitoring tool which can report the necessary information in real-time and noninvasively. An interesting option is the use of fluorescent, protein-based in vivo biological sensors as reporters of intracellular concentrations. One particular class of in vivo biosensors that has found applications in metabolite quantification is based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between two fluorescent proteins connected by a ligand binding domain. FRET integrated biological sensors (FIBS) are constitutively produced within the cell line, they have fast response times and their spectral characteristics change based on the concentration of metabolite within the cell. In this paper, the method for constructing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines that constitutively express a FIBS for glucose and glutamine and calibrating the FIBS in vivo in batch cell culture in order to enable future quantification of intracellular metabolite concentration is described. Data from fed-batch CHO cell cultures demonstrates that the FIBS was able in each case to detect the resulting change in the intracellular concentration. Using the fluorescent signal from the FIBS and the previously constructed calibration curve, the intracellular concentration was accurately determined as confirmed by an independent enzymatic assay.

A description of how to calibrate F&#246;rster Resonance Energy Transfer integrated biological sensors (FIBS) for in situ metabolic profiling is presented.&#160;The FIBS can be used to measure intracellular levels of metabolites noninvasively aiding in the development of metabolic models and high throughput screening of bioprocess conditions.

비 침습 대사 프로파일 링에게 FIBS 지원

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence microscopy and environmental scanning electron microscopy (ESEM) of whole cells in hydrated state. Fluorescent quantum dots (QDs) were coupled to EGFR via a two-step labeling protocol, providing an efficient and specific protein labeling, while avoiding label-induced clustering of the receptor. Fluorescence microscopy provided overview images of the cellular locations of the EGFR. The scanning transmission electron microscopy (STEM) detector was used to detect the QD labels with nanoscale resolution. The resulting correlative images provide data of the cellular EGFR distribution, and the stoichiometry at the single molecular level in the natural context of the hydrated intact cell. ESEM-STEM images revealed the receptor to be present as monomer, as homodimer, and in small clusters. Labeling with two different QDs, i.e.,&#160;one emitting at 655 nm and at 800 revealed similar characteristic results.

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

상호 현미경을 사용하여 본래 세포의 표피 성장 인자 수용체의 화학 양론을 공부

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

양자점 나노 입자를 사용하여 상호 빛 - 및 전자 현미경

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

환경 상처 3 차원 생체 외에서 내 셀 마이그레이션 특성화

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Optimized Setup and Protocol for Magnetic Domain Imaging with In Situ Hysteresis Measurement

This paper elaborates the sample preparation protocols required to obtain optimal domain patterns using the Bitter method, focusing on the extra steps compared to standard metallographic sample preparation procedures. The paper proposes a novel bespoke rig for dynamic domain imaging with in situ BH (magnetic hysteresis) measurements and elaborates the protocols for the sensor preparation and the use of the rig to ensure accurate BH measurement. The protocols for static and ordinary dynamic domain imaging (without in situ BH measurements) are also presented. The reported method takes advantage of the convenience and high sensitivity of the traditional Bitter method and enables in situ BH measurement without interrupting or interfering with the domain wall movement processes. This facilitates establishing a direct and quantitative link between the domain wall movement processes&#8211;microstructural feature interactions in ferritic steels with their BH loops. This method is anticipated to become a useful tool for the fundamental study of microstructure&#8211;magnetic property relationships in steels and to help interpret the electromagnetic sensor signals for non-destructive evaluation of steel microstructures.

Optimized Setup and Protocol for Magnetic Domain Imaging with In Situ Hysteresis Measurement

This paper elaborates the sample and sensor preparation procedures and the protocols for using the test rig particularly for dynamic domain imaging with in situ BH measurements in order to achieve optimal domain pattern quality and accurate BH measurements.

최적화 된 설치 및 히스테리시스 측정 현장에서 자기 도메인 이미징에 대 한 프로토콜

This paper elaborates the sample preparation protocols required to obtain optimal domain patterns using the Bitter method, focusing on the extra steps ...

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and allostasis. Moreover, dysregulated protease activity drives pathogenesis and is a functional biomarker of diseases such as cancer; therefore, the ability to detect protease activity in vivo may provide clinically relevant information for biomedical diagnostics. The goal of this protocol is to create nanosensors that probe for protease activity in vivo by producing a quantifiable signal in urine. These protease nanosensors consist of two components: a nanoparticle and substrate. The nanoparticle functions to increase circulation half-life and substrate delivery to target disease sites. The substrate is a short peptide sequence (6-8 AA), which is designed to be specific to a target protease or group of proteases. The substrate is conjugated to the surface of the nanoparticle and is terminated by a reporter, such as a fluorescent marker, for detection. As dysregulated proteases cleave the peptide substrate, the reporter is filtered into urine for quantification as a biomarker of protease activity. Herein we describe construction of a nanosensor for matrix metalloproteinase 9 (MMP9), which is associated with tumor progression and metastasis, for detection of colorectal cancer in a mouse model.

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteases are tightly regulated enzymes involved in fundamental biological processes, and dysregulated protease activity drives progression of complex diseases such as cancer. This method&#39;s goal is to create nanosensors that measure protease activity in vivo by producing a cleavage signal that is detectable from host urine and discriminates disease.

Nanosensors 프로 테아 제 활동에 감지 비보에 비 침 투 적인 진단에 대 한

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...