이 작품은 LNN에 룬드 벡 주니어 그룹 리더 원정대에 의해 지원되었다. PWW는 캐나다 자연 과학 및 공학 연구위원회 (NSERC)의 보조금 지원을 인정합니다. 우리는 또한 디스크 현미경을 회전에 액세스 남부 덴마크 대학에서 덴마크 분자 바이오 이미징 센터 감사합니다.

KICS 분석 세포막에서 EGFP-태그 된 단백질의 취득은 표면 형광 현미경 TIRF 설정 또는 그 막의 이미지를 얻기위한 설정 회전 디스크 현미경에서 수행 될 수있다. 영상 프레임 간의 카메라 화소 크기뿐만 아니라 시간은 분석을 위해 필요하다. 4-30 Hz의 프레임 속도 100-1,200 프레임 이미지 시퀀스가​​ 분석을 위해 사용될 수있다. 획득 동안, 영상의 재생 시간에 걸쳐 초점 멤브레인을 유지하고 형광이 균일하게 분포되는 평막의 일부분에 집중하는 것이 중요하다. , 소포 이동 막 지역 및 세포 소기관을 돌출하는 것은 나중에 분석 과정에서 잘릴 수 있습니다. 셀의 제공된 드리프트 나 움직임이 없도록 획득 시간이 선택되어야한다. MATLAB에 대한 한국 통신 학회 코드 스크립트를 얻으려면, 폴 현자 문의 (Paul.Wiseman @ McGill.ca). 첫 번째 시간은 한국 통신 학회 코드는 오픈 MAT에게 사용LAB 및 파일을 클릭 한 다음 설정 경로, 다음 하위 폴더 추가를 클릭하고 KICS 코드가있는 컴퓨터의 폴더를 찾을 수 있습니다. 그런 다음 확인을 클릭 저장 부근에 있습니다. 이제 다음의 점에 설명 된 작물의 분석을 계속합니다. 1. TIFF 스택으로 영상 분석 프로그램에 관심있는 이미지 시퀀스 가져 오기 stack1.tif : 이름으로 파일을 저장합니다. <ol><li> 막 움직이는 세포의 세포 기관을 제외하고 막 영역을 돌출의 평평한 부분에 관심 (ROI)의 사각형 영역을 선택합니다. 충분한 통계가 좋은 K 2 플롯에 대해 생성되도록 작물의 크기가 선택됩니다. </li><li> 지역 자르기 및 해당 폴더에 TIFF 파일로 작물을 저장합니다. 같은 영화에서 여러 가지 작물이있는 경우, 예를 들면 &quot;stack1crop.tif&quot;, &quot;stack1crop2.tif&quot;, &quot;stack1crop3.tif를&quot;숫자 증가를 사용합니다. </li><li> 로컬 작물이 들어있는 폴더를 배치컴퓨터가 아닌 서버에서, 한국 통신 학회의 분석을하고있다. </li></ol> 2. 분석을 수행 할 하나 분석 소프트웨어 하나에 작물을 가져 <ol><li> 명령 창을 눌러 열려 MATLAB 및 유형 &quot;icsgui은&quot;을 입력합니다. ICS는 GUI 화상 상관 분광법 그래픽 사용자 인터페이스 프로그램을위한 실행 파일 이름이다. </li><li> ICS의 GUI에서 &quot;한국 통신 학회&quot;탭을 클릭합니다. 분석 윈도우의 스크린 샷은도 1에 도시된다. </li><li> 폴더 이름 &quot;MATLAB 코드로&quot;폴더를 찾아 파일 이름을 &quot;스크립트&quot;로 파일을 이동하고 그것을 더블 클릭하여 엽니 다. 또한, 파일을 마우스 오른쪽 클릭하고 &quot;MATLAB으로 열기&quot;또는 파일로 이동, MATLAB에서 열고 스크립트 파일을 열기를 선택합니다. 이 파일은 편집기라고합니다. </li><li> 편집기 스크롤 &quot;로드 KICS 데이터 세트&quot;에, 다음 명령 행에 복사 또는 형식 파일 이름과 폴더 위치에서 시작IMG = 예 &quot;: 사용자 문서 AQP3dynamics stack1crop.tif C&quot;와. 예를 들어, [1:500] - 폴더 위치 아래의 명령 행에서 분석 할 프레임 수를 설정합니다. 데이터 계열의 모든 연속 영화에 대해 동일한 설정을 사용합니다. 포커스 드리프트하기의 범위 내에있는 경우, 이들 분석에서 제외한다. </li><li> 편집기에서 &#39;저장&#39;을 클릭 한 다음 &quot;셀을 평가&quot;를 클릭합니다. 데이터 집합은 이제 분석 소프트웨어에에로드됩니다. </li><li> GUI에서 한국 통신 학회 분석 창에서 분석을위한 설정을 입력합니다 : <ol><li> &quot;T 세포&quot;상자를 지 웁니다. </li><li> 입력 시간의 수는 분석 될 떨어진다. 타임 래그 (τ)의 수는 확산 플롯에 영향을 미칠 것이며, 확산 플롯 선형이되도록 선택되어야한다. 25을 입력 시작하고 확산 음모 선형 곳으로 감소. τ는 수이다 KICS 분석를 비교 타임 래그와 시간 차이는 시간 B이며etween 한 프레임과 다음. 선형 플롯을주는 작은 값을 선택해야합니다. 시간의 최대 수는 선형 피팅은 높은 값이 끼워 줄 수없는 데이터를 생성 할 것이다 가리지 얻어 지도록 선택된다 떨어진다. </li><li> 최대 K 2 값을 입력합니다 (그림 1 원 1 참조), 일반적으로 20 ~ 50입니다. 좋은 K 2 플롯 라인을 따라 분포되어 많은 데이터 포인트가되는 플롯이다. (70)를 입력 시작하고 K 2 및 확산 음모를 평가 한 후 감소와 가장 낮은 값을 선택 곳 직선 주위의 데이터 포인트 클러스터. 이 K 값은 푸리에 공간에서 공간적 K-벡터의 크기의 제곱이다. 좋은 K 2 플롯 : 초기 분석은 최고의 가치가 결정 될 때까지, 다음 선택한 설정이 데이터에 잘 맞는을주고 있는지 확인 항상 데이터 계열의 모든 연속 영화에 대해 동일한 설정을 사용하지만 반복해야합니다및 선형 확산 플롯. </li><li> &quot;저장 설정을 계속 진행&quot;을 클릭합니다. </li><li> 모든 그래프를 표시하기 위해 &quot;예&quot;를 클릭합니다. </li><li> &quot;로드 이미지 시리즈&quot;(그림 1의 원 2 참조)을 클릭 한 후 &quot;작업 공간&quot;을 클릭합니다. </li><li> &quot;imgSerCrop&quot;를 선택한 다음 &quot;작업 영역에서 가져 오기&quot;를 클릭합니다. </li><li> 촬상 시스템 모음 설정을 입력하세요. 박스 &quot;화소 사이즈」화상 스택을 취득하는 촬상 시스템의 투영 화소의 크기를 입력한다. AQP3-EGFP를 들어, 0.111 사용 하였다. 상자 &quot;프레임 사이의 시간 (초)을 입력합니다&quot;에서 0.1150는 AQP3-EGFP를 사용 하였다. </li><li> &quot;1&quot;, 확인을 클릭하고 &quot;전체 이미지를 사용하여&quot;입력 &quot;의 ROI를 선택&quot;을 클릭합니다. </li><li> &quot;할 일 한국 통신 학회 분석&quot;을 클릭하고 &quot;움직 필터링&quot;을 수행하는 예를 클릭합니다. 결과는 이미지로 자동으로 열립니다. </li><li> 설정 창을 최소화, 셀 정보 진열창을 최소화w 및 광 물리학 창을 최소화한다. 역학 창에서 역학 플롯은 데이터 포인트의 상관 관계 무료 확산 간주 될 수 있음을 의미하는 음의 기울기를 가진 라인에 데이터의 선형 적합을 표시되는지 확인합니다. 특정 시간 지연에 대한 확산 계수를 기록하고이 설정을 (그것의 적당한 표준 편차에주의 할 필요가 없다) K. K 2 그래프의 데이터 포인트는 떨어진다 주어진 시간 동안 라인 주위에 클러스터해야합니다. </li><li> 진드기 상자 &quot;이미지로 열린 그림 저장&quot;을 한 후 결과 파일을 저장하려면 &quot;이미지로 열린 그림 저장&quot;을 클릭합니다. C 아래에 새 폴더에 저장 : 사용자 문서 AQP3diffusion을 . &quot;분명 현재의 데이터&quot;를 클릭하고 다음 작물의 분석을 계속합니다. </li></ol></li></ol> 계산 된 확산 계수 3. 평균은 분석 데이터의 개요를 계산한다 <ol><li> spre의 각 투자 수익 (ROI)에서 각각의 확산 계수를 입력adsheet (τ를 기록하고 2 값을 K해야합니다), 위의 설정과 작물의 이름을 사용합니다. </li><li> 스프레드 시트 프로그램을 이용하여 확산 계수의 평균 및 표준 편차를 계산한다. </li><li> 콜 모고 로프 - 스 미르 노프 테스트 또는 학생 5 %의 유의 수준을 사용하여 통계적인 차이를 평가하는 t-검정을 수행합니다. 세포 (예를 들어 nontreated 대 처리) 사이 Quantitave 비교는 할 수있다. </li><li> 각각의 작물에 대해 분석 소프트웨어에 의해 생성하고, 각각의 타임 래그의 각 조건에 대해 데이터를 평균 하였다 확산 플롯의 스프레드 시트의 버전을 연다. 논문이나 프리젠 테이션을 표시하기위한 새로운 평균 확산 음모를 생성합니다. </li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

이 논문은 형광 단백질 태그로 단백질의 현미경 화상으로부터 확산 계수를 결정하기 위하여 통신 학회 분석 방법을 적용하는 방법의 상세한 단계별 개요를 제시했다. 분석 라벨링 밀도 매우 광범위한 동적 범위를 가진 프로브 선택 독립적이며, 따라서 또한 양자점뿐만 아니라 염료 등 EGFP 같은 형광 단백질로 표지 단백질에 적용될 수있다. 단백질 유효 확산 계수를 계산하기 위해 최적화 된 몇몇 중요한 단계가있다. 만 막에 이미지를 표시 단백질에 필수적이다. 분석 할 이미지 시퀀스에서 소포 또는 세포 내 소기관으로 이동 같은 추가 오브젝트가있는 경우, 이러한 확산 계수의 과소 또는 과대 평가를 초래 계산 된 확산 계수에 기여한다. 위에 나열된 단계에 따라, 한국 통신 학회의 GUI 코드는 사용자 친화적입니다차 분석은 빠르다. 확산 계수의 평균과 유의 한 값의 신속한 생성을 용이 래그 타임의 함수로서 원형 평균화 및 슬로프 확산 플롯의 기울기의 계산 모두를 포함 : 그것은 여러 평균화 단계를 포함한다. 따라서, SPT 실험, 한국 통신 학회에서 확산 계수를 계산하는 데 필요한 광범위한 분석에 비해 사용자 친화적 인 급속 및 생물 물리학의 전문 교육없이 수행 할 수 있습니다. 분석이 음의 확산 계수 또는 수평 확산 음모에 결과가 같은 경우, 문제 해결은 여기에 설명 된 모든 요구 사항을 충족하는지 확인하기 위해 작물의 육안 검사가 포함되어 있습니다. 너무 작은 작물은 비 물리적 인 음의 확산 계수를 산출하고 폐기해야합니다. 확산 계수를 계산하기 위해, 분석하거나 자르기 증가 적합한 데이터 세트에서 다른 곳에서 새로운 작물을 만들기 위해 종종 가능크기는 가능한 한. 이 기술은 대부분의 데이터 세트에 적용 할 수 있지만, 현재 통신 학회 분석은 단지 평균 확산 계수를 계산하고 다른 단백질 이주 패턴을 구별 또는 궤도를 생성 할 수 없습니다. KICS을 사용하여, 확산 계수를 쉽게 추출 될 수 있고, 단백질의 확산 처리 및 비 처리 된 세포 사이 또는 야생형과 돌연변이의 치료가 확산에 차이를 유발하는 경우 계시 돌연변이 단백질 사이 따라서, 예를 들어 비교 될 수있다 잠재적으로 단백질 - 단백질 및 / 또는 단백질 지질 상호 작용. FRAP 측정 AQP2의 세포막 확산은 ER에서, 또한 다른 야생형 AQP2 9 이상 확산 신원 성 요붕증의 원인 AQP2의 변이 된 버전을, 포스 콜린, 캠프 작용제 (10)의 첨가에 따라 감소 및 표시했다. 그것은 단일 입자 D에서 확산 계수를 계산하는 것이 가능하지만ATA 평균 제곱 변위 스텝 사이즈 분석 또는 입자상 상관 분광법 2,11,12을 사용하여, 이러한 분석 방법은 계산적으로 요구 될 수 있으며, 종종 사용자 정의 컴퓨터 알고리즘 쓸 필요. 여기에 제시된 통신 학회 프로토콜의 장점은 표지 밀도의 비교적 독립적 계산적 쉽다는 점이다. 한국 통신 학회 분석을 통해이 거리에 따라서 쉽게 그 자신의 막 단백질에 적용 할 수 많은 세포 생물 학자, 유용합니다.

세포막 단백질의 사 차원 시공간 조직 횡 이동성 단단히 규제 및 단백질 기능, 활성 및 단백질 - 단백질 상호 작용의 역할을 할 수있다. 세포막 단백질의 측면 확산은, 전통적으로 양자점의 저속 촬상로부터 단일 입자의 확산 계수를 산출하거나 표시된 세포막 단백질 2-4 염색에 의해 연구되었다. 이 방법은 단백질 폴딩과 기능을 손상시킬 수 있으므로, 일부 단백질을 얻을 수없는 양자점 나 염료 라벨링 세포막 단백질의 세포 외 태그의 삽입을 필요로한다. 양자점의 입체 볼륨은 단백질 5의 확산 속도를 느리게하고, 또한, 인구의 단백질의 단지 작은 부분이 양자 도트로 표시되어 보여왔다,이 분수는 총 대표적인 경우는 알려져 있지 않다 세포막 단백질의 풀. 단일 입자 TRA양자점 표지 단백질의 이미지 시리즈에서 확산 계수의 요리하는 (SPT) 측정 매핑 두 차원 가우스와 함께 입자의 이미지가 피크 위치 광범위한 분석 알고리즘 다음에 적합하다을 포함한다. 분석 기술 입자 궤적에 현미경 점 분포 함수 (전형적 이차원 공간 가우시안) 및 입자 위치의 후속 링크의 근사치에 경과 시퀀스의 각 화상 프레임에 피팅 유용한 비 - 선형 곡선을 필요 계산적 매우 집약적 단일 분자 6,7의 움직임. 최근에 개발 된 이미지 상관 기법은 K-공간 이미지 상관 분광학 (KICS)는 찬란 세포막 단백질을 태그 확산 계수의 상대적으로 간단한 측정을 가능하게한다. 일상적 KICS 의해 형광 단백질로 표지 막 단백질의 확산 계수를 계산하는 가능성 보유 고유 도구전통적인 양자에 비해 여러 장점이 SPT 분석 점 : 세포 라벨링 소모 세포 태그와 시간의 삽입은 없음 (형광 단백질을 발현하는 세포주가 사용될 수있다) 요구되지 않는다; 확산 계수는 양자 점으로 표시된 부분 집합에 비해 형광 단백질의 전체 풀에서 추출된다; 분석은 단일 단백질을 추적 할 필요없이 간단하고, 분석은 추가적인 사용자 프로그래밍 대한 요구와 함께 기존의 코드를 사용하여 수행 될 수있다. 는 확산 계수의 고속 연산 및 계산을 가능하게 평균화 기법이므로 방법은 빠르다. 단백질 인구 이러한 급속한 확산 측정 근면 SPT 방법으로 인구의 서브 세트에 대해 얻은 분자량보다 상세한 교통 정보를 보완. KICS 시간 먼저 푸리에 공간으로 변환 된 형광 현미경 이미지 시퀀스의 상관 관계를, 이에 플로리다를 분리분자 수송 1에 의한 것과 광 물리학에 의한 uorescence 변동. 결과적으로, 통신 학회는 수밀도를 결정 속도를 흐르게하고, 복잡한 광표백 의해 공정한 지거나, 형광의 점멸 중에 확산의 형광 분자를 표지 할 수있다. 이것은 통신 학회 신속 정의 기입 알고리즘 없이도 형광 표지 된 세포 막 단백질의 확산 동성을 결정하기위한 유용한 도구를 만든다. 게다가 형광 표지 된 단백질은 KICS 또한 양자점 표지 된 막 단백질 (8)에 적용될 수있다. 이 문서는 코드와 방법에 생성 된 플롯을 평가하는 방법을 사용하는 방법, 작물을 배치하는 방법을 보여줌으로써 EGFP-태그 세포막 단백질의 확산 계수를 추출하기 위해 한국 통신 학회를 사용하는 방법을 단계별로 소개를 제공하는 확산에서 계수가 추출된다. 예로서, 반 내부 전반사에 디스크 현미경 세트를 회전하여 얻어진 데이터는 형광EGFP 태그 신장 물 채널 단백질 아쿠아 포린 -3 (AQP3)의 후부 (TIRF) 모드가 표시됩니다.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31600-083</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/13752?lang=en&amp;amp;region=DK&quot;&gt;13752&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Gibco</td><td>15160070</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>11860038</td><td></td></tr><tr><td>Phenol red free medium</td><td>Gibco</td><td>11880-028</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8418?lang=en&amp;amp;region=DK&quot;&gt;D8418 &lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>Apparatus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spinning Disk Microscope</td><td>Nikon</td><td>Ti Eclipse</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD Camera</td><td>Andor</td><td>Ixon+</td><td></td></tr></tbody></table>

easy measurement of diffusion coefficients of egfp-tagged plasma membrane proteins using k-space image correlation spectroscopy

측면 확산과 세포막 단백질의 구획화 단단히 세포에서 조절되고, 따라서, 이러한 프로세스를 연구하는 세포막 단백질 기능 및 규제에 새로운 통찰력을 밝힐 것이다. 최근 K-공간 이미지 상관 분광학 (KICS) (1)는 직접 프로브 광 물리학에 의해 도입 된 체계적인 편견을 피할 찬란 태그 세포막 단백질의 이미지에서 확산 계수의 일상적인 측정을 가능하게하기 위해 개발되었다. 분석을위한 이론적 근거는 복잡하지만,이 방법은 단백질의 확산 계수를 측정하기 위해 개방 코드를 사용 비전문가에 의해 구현 될 수있다. 한국 통신 학회는 상호 (K-) 공간에 각 이미지의 푸리에 변환 한 후 형광 현미경 이미지 스택에서 시간 상관 함수를 계산합니다. 이어서, 원형 평균화, 자연 대수는 변환 및 선형 산출 상관 함수에 확산 계수를 적합하다. 이논문은 한국 통신 학회를 통한 이미지 분석 및 확산 계수의 측정에 대한 단계별 가이드를 제공합니다. 먼저, 형광 표지 된 세포막 단백질의 높은 프레임 레이트 콘텐츠의 시퀀스는 형광 현미경을 이용하여 획득된다. 그런 다음, 관심 (ROI) 막 영역을, 세포 내 소기관을 피하고 소포를 이동하거나 돌출의 영역이 선택됩니다. 투자 수익 (ROI) 스택은 자유롭게 사용할 코드로 가져 여러 정의 된 매개 변수 (방법 섹션을 참조하십시오) 한국 통신 학회 분석을 위해 설정됩니다. 프로그램은 K-시공간 상관 함수에서 플롯 &quot;슬로프의 기울기&quot;이 발생하고, 확산 계수는 플롯의 기울기로부터 계산된다. 아래 정식 예로 EGFP 태그로 신장 수로 아쿠아 포린 -3 이용한 세포막 단백질의 확산 계수를 측정하는 단계별 KICS 절차이다.

KICS로 분석하기에 적합한 화상 스택을 획득하기 위해, 다른 현미경 시스템이 사용될 수있다. 그것은 에피 형광 현미경 등 TIRF 또는 스피닝 디스크 설정으로부터 이미지 시퀀스를 분석하는 것이 가능하다. 막 어떤 큰 움직이는 세포 소기관없이 또는 소포 / 움직이는 물체 평면해야합니다. 이 논문은 23.4 ㎐의 프레임 속도 원형질막으로 설정된 초점 회전 디스크 현미경에 결상 라이브 MDCK 세포에서 EGFP 태그 AQP3의 시간 경과 이미지 시퀀스를 나타낸다. 포커스는 기저 (바닥) 원형질막으로 설정 하였다. 데이터는 최근 AJP 셀 (13)에 게시되었습니다. 도 2A는 셀의 이미지를 나타낸다. scalebar는 10mm이며, 예를 들어 ROI 작물은 사각형으로 표시됩니다. 작물의 선택을위한 그것 막이 균일하고 평평한 이렇게 단지 이차원 확산이 가시화되어있다 셀의 주변부에 잘라내는 것이 중요하다. CELL 소기관, 소포 및 막 돌기는 피해야하며 제공된 드리프트가 시간 경과 중에이 없다는 분석에 중요하다. 분석에서 제외 될 작물의 예는도 2B 및 2C에 제시되어있다. 이동 소포는 상관 관계 (그림 2B)이 경우 (그림 2C) 분명히 분석에 포함되어서는 안 흔들리지 막에 구멍에 기여한다. 그것은 ROI 작물은 분석을위한 충분한 공간 샘플링을 (고 NA 대물 렌즈와 이미징에 32 픽셀의 최소 선형 크기는 합리적인 지침입니다)이 충분히 큰 것 또한 중요합니다. 이 데이터 집합에 대한 60X (NA 1.40)를 사용 하였다. 그림 3a는 한국 통신 학회로 생성 한 작물의 확산 음모를 보여줍니다. 이 방법은 EGFP (또는 다른 형광 단백질) 태그로 단백질의 확산 계수를 찾기 위해 사용될 수 있으며, 염료또는 양자 점. 확산 플롯에서 곡선의 기울기는 단순히 확산 계수의 부정적이다. 이 경우, AQP3-GFP의 확산 계수는 0.0104 ± 0.0040 μM 2 / 초.도 3b는 너무 많은 시간이 계산 확산 플롯이 경우 분석을 다시 수행하고, 후행하지만 적은 시간에 뒤쳐되도록 확산 플롯 선형이다. 도 4a는 일반적인 K 2 플롯을 제공합니다. 이 선택한 시간 지연에 대한 반경 방향 평균 및 LN 변형 상관 곡선이다. 시차를도 3a에 나타낸 바와 같이 결과가 확산 플롯이다 대 이러한 K이 플롯으로부터 경사 플롯. K이 플롯을 검사 할 때, 적당한가 평가하는 것이 중요하다.도 4b는 그것이 작물이 너무 작다고 결론 지을 수 및 예상대로 분석 될 수없는 모 AK 두 플롯의 일례이다노이즈 플로어에 선형 적으로 음의 기울기와 부패가있다. 그림 4c는 적합으로 감소 최대 K 2 값으로 다시 분석 할 필요가 알래스카 2 플롯의 예입니다 큰 K의 증가 잔차에 의해 판단으로 (더 이상 적합하지 않습니다 2 값). 이 경우 분석은 다시이 경우 25 년, 낮은 최대 K 2 값을 입력 실행해야합니다. 그림 5는 평균 확산 음모 10여 작물의 평균을 보여줍니다. 확산 플롯 분석 엑셀 파일에서 발견 된, 모든 확산 플롯은 이제 동일한 실험에서 모든 작물에 대해 평균 될 수있다. 얻어진 확산 플롯에서 셀의 다른 처리는 동일 도면에 결합 될 수있다. 평행 추세선은 동일 확산 계수이며, 비 평행 추세선은 불평등 확산을 나타냅니다. 이 도면에서, AQP3-EGFP 확산 계수 (AJP 셀 (13)로부터의 데이터)를 산출한다. 그림 1. KICS 분석 윈도우의 스크린 샷.이 창에서 KICS 분석을 수행합니다. 원은 프로토콜의 각 단계에 대해 언론에 어떤 단추를 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51074/51074fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51074/51074fig2highres.jpg" width="300" /> 안정적 AQP3-GFP와 같이 대표 작물을 표현 MDCK 세포의 그림 2. GFP를 발현하는 세포의 디스크 이미지를 회전합니다. (A) 대표 이미지. 콘텐츠는 기저 세포막에 포커스 부근으로 회전 디스크 현미경에 취득된다. (B) Repres<html> 확산 계수에 공헌 할 수있는 이동 소포가 있기 때문에 한국 통신 학회에 분석에서 제외 하였다 entative 작물. (C) 막에 구멍이있는 작물의 예는, 따라서, 이러한 작물은 분석에서 제외 하였다. 모든 스케일 바는 10 μm의 수 있습니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51074/51074fig2highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51074/51074fig3highres.jpg" width="500" /> 그림 3. 확산 플롯. (A) 모든 지점이 선에 맞는 가까이에있는 대표적인 확산 음모. 데이터가 선형 때문 양호한 확산 플롯이다. (B) 분석 timelags의 낮은 번호를 사용하여 다시 실행해야하는 확산 플롯의 예.<html> 3highres.jpg &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt; 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 4" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51074/51074fig4highres.jpg" width="300" /> 도 4. K로서는이 플롯. 데이터 포인트가 동등하게 적합 라인의 양측에 분포되는 K 좋음이 플롯의 (A) 예. (B)의 최적 크기보다 작은 작물 알래스카 2 플롯의 예. 이 K이 플롯에서, 라인의 적당한 기울기가 양, 그것은 부정 따라서 작물이 분석에서 제외되어야한다. (C)이 K이 플롯 분석 K 두 플롯의 일부를 선택하기 위해 더 낮은 최대 K 2 값이 재실행되어야한다는 표시 데이터가 동일하게 행 적당한 양쪽에 분포되어 있었다.oad/51074/51074fig4highres.jpg &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt; 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51074/51074fig5highres.jpg" width="500" /> 그림 5. 확산 음모를 평균. 10에 작물을 평균 산출 확산 음모를 평균.

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Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

이 논문은 형광 라이브 포유 동물 세포에서 세포막 단백질을 표지 확산 계수를 측정 변동 분석 기술 K-공간 이미지 상관 분광학 (KICS)에 대한 단계를 안내하여 단계를 제공합니다.

K-공간 이미지의 상관 관계 분광학을 사용하여 EGFP-태그 플라즈마 막 단백질의 확산 계수의 간편한 측정

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.7K 조회수.  Aarhus University.  이 논문은 형광 라이브 포유 동물 세포에서 세포막 단백질을 표지 확산 계수를 측정 변동 분석 기술 K-공간 이미지 상관 분광학 (KICS)에 대한 단계를 안내하여 단계를 제공합니다. 

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In Situ Monitoring of Diffusion of Guest Molecules in Porous Media Using Electron Paramagnetic Resonance Imaging

A method is demonstrated to monitor macroscopic translational diffusion using electron paramagnetic resonance (EPR) imaging. A host-guest system with nitroxide spin probe 3-(2-Iodoacetamido)-2,2,5,5-tetramethyl-1-pyrrolidinyloxy (IPSL) as a guest inside the periodic mesoporous organosilica (PMO) aerogel UKON1-GEL as a host and ethanol as a solvent is used as an example to describe the protocol. Data is shown from a previous publication, where the protocol has been applied to both IPSL and Tris(8-carboxy-2,2,6,6-perdeutero-tetramethyl-benzo[1,2-d:4,5-d&#8242;]bis(1,3)dithiole) methyl (Trityl) as guest molecules and UKON1-GEL and SILICA-GEL as host systems. 
A method is shown to prepare aerogel samples that cannot be synthesized directly in the sample tube for measurement due to a size change during synthesis. The aerogel is attached to sample tubes using heat shrink tubing and a pressure cooker to reach the necessary temperature without evaporating the solvent in the process. The method does not assume a clearly defined initial distribution of guest molecules at the start of the measurement. Instead, it requires a reservoir on top of the aerogel and experimentally determines the influx rate during data analysis.
The diffusion is monitored continually over a period of 20 hr by recording the 1d spin density profile within the sample. The spectrometer settings for the imaging experiment are described quantitatively. Data analysis software is provided to take the resonator sensitivity profile into account and to numerically solve the diffusion equation. The software determines the macroscopic translational diffusion coefficient by least square minimization of the difference between the experiment and the numerical solution of the diffusion equation.

In Situ Monitoring of Diffusion of Guest Molecules in Porous Media Using Electron Paramagnetic Resonance Imaging

A protocol for the in situ monitoring of the diffusion of guest molecules in porous media using electron paramagnetic resonance (EPR) imaging is presented.

전자 상자성 공명 영상을 이용하여 다공성 미디어에서 고객 분자의 확산의 제자리 모니터링에

A method is demonstrated to monitor macroscopic translational diffusion using electron paramagnetic resonance (EPR) imaging. A host-guest system with ...

연구

화학

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

생화학

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

상용 현미경에서 라이브 세포막에 분자 확산 법률에 빠른 형광 이미징

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

생체공학

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ranging from nanometers to micrometers and microseconds to minutes, respectively. Such a broad range of biological processes challenges conventional microscopy approaches. Here, we detail the procedure for implementing spot variation Fluorescence Correlation Spectroscopy (svFCS) measurements using a classical fluorescence microscope that has been customized. The protocol includes a specific performance check of the svFCS setup and the guidelines for molecular diffusion measurements by svFCS on the plasma membrane of living cells under physiological conditions. Additionally, we provide a procedure for disrupting plasma membrane raft nanodomains by cholesterol oxidase treatment and demonstrate how these changes in the lateral organization of the plasma membrane might be revealed by svFCS analysis. In conclusion, this fluorescence-based method can provide unprecedented details on the lateral organization of the plasma membrane with the appropriate spatial and temporal resolution.

This article aims to present a protocol on how to build a spot variation Fluorescence Correlation Spectroscopy (svFCS) microscope to measure molecular diffusion at the plasma membrane of living cells.

살아있는 세포의 원형질막에서의 분자 확산 분석을위한 스팟 변이 형광 상관 분광법

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques. In dual-color FCCS, where the fluctuations in fluorescence intensity represent the dynamic &#34;fingerprint&#34; of the respective fluorescent biomolecule, we can probe co-diffusion or binding of the receptors. FRET, with its high sensitivity to molecular distances, serves as a well-known &#34;nanoruler&#34; to monitor intramolecular changes. Taken together, conformational changes and key parameters such as local receptor concentrations and mobility constants become accessible in cellular settings.
Quantitative fluorescence approaches are challenging in cells due to high noise levels and the vulnerability of the sample. Here we show how to perform this experiment, including the calibration steps using dual-color labeled &#946;2-adrenergic receptor (&#946;2AR) labeled with eGFP and SNAP-tag-TAMRA. A step-by-step data analysis procedure is provided using open-source software and templates that are easy to customize.
Our guideline enables researchers to unravel molecular interactions of biomolecules in live cells in situ with high reliability despite the limited signal-to-noise levels in live cell experiments. The operational window of FRET and particularly FCCS at low concentrations allows quantitative analysis at near-physiological conditions.

We present an experimental protocol and data analysis workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques.

살아있는 세포에서 단백질 단백질 상호 작용 및 단백질 역학을 연구하기 위한 이중 색 형광 교차 상관 분광법

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial and temporal resolution. FCS can quantify the molecular concentration and diffusion coefficient of fluorescently labeled molecules in the cell membrane. This technique has the ability to explore the molecular diffusion characteristics of molecules in the plasma membrane of immune cells in steady state (i.e., without processes affecting the result during the actual measurement time). FCS is suitable for studying the diffusion of proteins that are expressed at levels typical for most endogenous proteins. Here, a straightforward and robust method to determine the diffusion rate of cell membrane proteins on primary lymphocytes is demonstrated. An effective way to perform measurements on antibody-stained live cells and commonly occurring observations after acquisition are described. The recent advancements in the development of photo-stable fluorescent dyes can be utilized by conjugating the antibodies of interest to appropriate dyes that do not bleach extensively during the measurements. Additionally, this allows for the detection of slowly diffusing entities, which is a common feature of proteins expressed in cell membranes. The analysis procedure to extract molecular concentration and diffusion parameters from the generated autocorrelation curves is highlighted. In summary, a basic protocol for FCS measurements is provided; it can be followed by immunologists with an understanding of confocal microscopy but with no other previous experience of techniques for measuring dynamic parameters, such as molecular diffusion rates.

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

형광 상관 분광학에 의해 측정 된 차 림프구의 플라즈마 막 분자 확산

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

면역학 및 감염병학

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. Lipid rafts are membrane microdomains enriched in cholesterol and sphingolipids. They play a role in cellular physiological processes such as signalling, and trafficking1,2 but are also thought to be key players in several diseases including viral or bacterial infections and neurodegenerative diseases3.
Yet their existence is still a matter of controversy4,5. Indeed, lipid raft size has been estimated to be around 20 nm6, far under the resolution limit of conventional microscopy (around 200 nm), thus precluding their direct imaging. Up to now, the main techniques used to assess the partition of proteins of interest inside lipid rafts were Detergent Resistant Membranes (DRMs) isolation and co-patching with antibodies. Though widely used because of their rather easy implementation, these techniques were prone to artefacts and thus criticized7,8. Technical improvements were therefore necessary to overcome these artefacts and to be able to probe lipid rafts partition in living cells.
Here we present a method for the sensitive analysis of lipid rafts partition of fluorescently-tagged proteins or lipids in the plasma membrane of living cells. This method, termed Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS), relies on the disparity in diffusion times of fluorescent probes located inside or outside of lipid rafts. In fact, as evidenced in both artificial membranes and cell cultures, probes would diffuse much faster outside than inside dense lipid rafts9,10. To determine diffusion times, minute fluorescence fluctuations are measured as a function of time in a focal volume (approximately 1 femtoliter), located at the plasma membrane of cells with a confocal microscope (Fig. 1). The auto-correlation curves can then be drawn from these fluctuations and fitted with appropriate mathematical diffusion models11.
FCS can be used to determine the lipid raft partitioning of various probes, as long as they are fluorescently tagged. Fluorescent tagging can be achieved by expression of fluorescent fusion proteins or by binding of fluorescent ligands. Moreover, FCS can be used not only in artificial membranes and cell lines but also in primary cultures, as described recently12. It can also be used to follow the dynamics of lipid raft partitioning after drug addition or membrane lipid composition change12.

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

A technique to probe the lipid raft partitioning of fluorescent proteins at the plasma membrane of living cells is described. It takes advantage of the disparity in diffusion times of proteins located inside or outside of lipid rafts. Acquisition can be performed dynamically in control conditions or after drug addition.

지질 뗏목의 결정은 형광 상관 분광학 (FCS)에 의해 살아있는 세포에서 Fluorescently 태그가 추가된 프로브의 파티션

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

생물학

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at characterizing the complex organization and dynamics of the plasma membrane at single-molecule level, by developing analytic tools dedicated to Single-Particle Tracking (SPT) at high density: Multiple-Target Tracing (MTT)1. Single-molecule videomicroscopy, offering millisecond and nanometric resolution1-11, allows a detailed representation of membrane organization12-14 by accurately mapping descriptors such as cell receptors localization, mobility, confinement or interactions.
We revisited SPT, both experimentally and algorithmically. Experimental aspects included optimizing setup and cell labeling, with a particular emphasis on reaching the highest possible labeling density, in order to provide a dynamic snapshot of molecular dynamics as it occurs within the membrane. Algorithmic issues concerned each step used for rebuilding trajectories: peaks detection, estimation and reconnection, addressed by specific tools from image analysis15,16. Implementing deflation after detection allows rescuing peaks initially hidden by neighboring, stronger peaks. Of note, improving detection directly impacts reconnection, by reducing gaps within trajectories. Performances have been evaluated using Monte-Carlo simulations for various labeling density and noise values, which typically represent the two major limitations for parallel measurements at high spatiotemporal resolution.
The nanometric accuracy17 obtained for single molecules, using either successive on/off photoswitching or non-linear optics, can deliver exhaustive observations. This is the basis of nanoscopy methods17 such as STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 or STED22,23, which may often require imaging fixed samples. The central task is the detection and estimation of diffraction-limited peaks emanating from single-molecules. Hence, providing adequate assumptions such as handling a constant positional accuracy instead of Brownian motion, MTT is straightforwardly suited for nanoscopic analyses. Furthermore, MTT can fundamentally be used at any scale: not only for molecules, but also for cells or animals, for instance. Hence, MTT is a powerful tracking algorithm that finds applications at molecular and cellular scales.

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Multiple-Target Tracing is a homemade algorithm developed for tracking individually labeled molecules within the plasma membrane of living cells. Efficiently detecting, estimating and tracing molecules over time at high-density provide a user-friendly, comprehensive tool to investigate nanoscale membrane dynamics.

다중 타겟 추적 (MTT)에 의해 플라즈마 막의 분자 확산을 매핑

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using the analysis of cell membrane receptor clusters as a model, we present a detailed protocol for this image analysis task using Fiji (ImageJ) and Matlab routines to: 1) define regions of interest and design masks adapted to these regions; 2) track the particles in fluorescence microscopy videos; 3) analyze the diffusion and intensity characteristics of selected tracks. The quantitative analysis of the diffusion coefficients, types of motion, and cluster size obtained by fluorescence microscopy and image processing provides a valuable tool to objectively determine particle dynamics and the consequences of modifying environmental conditions. In this article we present detailed protocols for the analysis of these features. The method described here not only allows single-molecule tracking detection, but also automates the estimation of lateral diffusion parameters at the cell membrane, classifies the type of trajectory and allows complete analysis thus overcoming the difficulties in quantifying spot size over its entire trajectory at the cell membrane.

Here, we present a protocol for single particle tracking image analysis that allows quantitative evaluation of diffusion coefficients, types of motion and cluster sizes of single particles detected by fluorescence microscopy.

확산의 분석 및 형광 현미경 검사 법에 의해 수용 체 막의 클러스터 크기에 대 한 프로토콜을 처리 하는 이미지

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein using the profiles of fluorescence intensity across the plasma membrane. Measured fluorescence profiles are fitted by a model for membrane and cytoplasm fluorescence distribution along a line applied perpendicularly to the cell periphery. This model is constructed from the fluorescence intensity values in reference cells expressing a fluorescently-tagged marker for cytoplasm and with FM 4-64-labeled plasma membrane. The method can be applied to various cell types and organisms; however, only plasma membranes of non-neighboring cells can be evaluated. This fast microscopy-based method is suitable for experiments, where subtle and dynamic changes of plasma membrane-associated markers are expected and need to be quantified, e.g., in the analysis of mutant versions of proteins, inhibitor treatments, and signal transduction observations. The method is implemented in a multi-platform R package that is coupled with an ImageJ macro that serves as a user-friendly interface.

Here, we present a protocol to perform a quantitative analysis of the level of plasma-membrane association for fluorescently-tagged peripherally-associated protein. The method is based on the computational decomposition of membrane and cytoplasmic component of signal observed in cells labeled with plasma membrane fluorescent marker.

원형질 막 주변 관련 된 단백질에 대 한 분할 결정

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...