우리는 투과 전자 현미경의 도움 스테판 켄스 감사합니다. 이 작품은 건강 그랜트 R01AG023731의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

이전 연구는 Mgm101의 첫 번째 아미노 말단 22 잔기가 미토콘드리아 19로 가져온 후 쪼개 것으로 나타났습니다. 대장균에서 발현를 들어, 첫 번째 22 코돈이 부족한 MGM101 오픈 읽기 프레임은 PCR에 의해 증폭되어 발현 벡터 PMAL - C2E의 수정 된 버전에 말토오스 결합 단백질 (MBP)를 코딩하는 남성 서열의 하류에 배치됩니다. 이 PreScission 프로테아제 (그림 3)를위한 절단 사이트를 포함하는 링커와 MBP-Mgm101 융합을 생성합니다. 플라스미드는 먼저 E.를 선택하여 구성되어 IPTG와 Xgal 화이트 / 블루 선택하지 대장균의 형질 전환. 결과 플라스미드 PMAL - C2E-MGM101 그런 E.에 소개 대장균은 암피실린 및 클로람페니콜 내성 식민지를 선택하여 BL21-CodonPlus (DE3) RIL을 변형. 1. 표현, 유도, 세포 용해와 DNase의 I 트리트먼트 <ol><li> INOC포도당 (0.2 %), 암피실린 (100 ㎍ / ㎖) 및 클로람페니콜 (50 ㎍ / ㎖)를 첨가 LB 배지 10 ㎖ (1 % Bacto 트립 톤, 0.5 % 효모 추출물, 1 %의 NaCl)에 새로운 형질을 ulate. 200 rpm으로 진탕 37 ° CO / N에 품어. </li><li> 위와 같이 보충 LB 배지 2 리터에 10 ㎖의 예비 컬쳐 접종. OD 600이 0.5에 도달 할 때까지 흔들어 37 ° C에서 세포를 성장. </li><li> 0.3 mm의 최종 농도에 이소 프로필 β-D-1-티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG)를 추가하여 MBP-Mgm101 융합 단백질의 발현을 유도. 5 시간 동안 30 ° C에서 진탕 세포를 성장. </li><li> 베크 JA-10 회 (5,500 XG, 4 ° C, 10 분)를 사용하여 원심 분리하여 세포를 수집합니다. 폐기 후 상층 액은 단백질 분해 효소 억제제 (25 μM의 펩틴, 1 μM의 pepstatin 및 1 ㎜ PMSF)를 포함 용해 버퍼의 30 ML (20 MM 트리스 - 염산, 산도 7.4, 1 mM의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 7.4)에있는 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 20 얼음에 세포 현탁액을 초음파 처리초 초음파 프로세서 (열 시스템, 모델 W-385)를 사용하여 50 % 듀티 사이클에서 30 초 동안 얼음에 냉각하고, 배 반복 할 수 있습니다. </li><li> 2 MG / ML에서 DNase의 1 주식의 1 ML을 추가합니다. 2 시간 동안 4 ° C에서 세포 해물 바위. </li><li> 500 mm의 최종 농도에 NaCl을 조정합니다. </li><li> 30 분 동안 4 ° C에서 10,000 XG에서 원심 분리하여 세포 파편을 제거합니다. </li></ol> 2. 아밀로오스 친 화성 크로마토 그래피로 정제 <ol><li> 용해 버퍼의 아밀로스 수지 (50 % 슬러리)의 1.5 ml의 평형. 세포의 파쇄에 평형 아밀로스 수지를 추가합니다. 4 ° CO / N.에 가볍게 흔들어 </li><li> 찬 방에 설치 이코노 컬럼 크로마토 그래피 칼럼에 해물 수지의 혼합을로드합니다. 언 바운드 단백질이 중력에 의해 열을 전달할 수 있습니다. </li><li> 세척 버퍼 I (; 400 mM의 NaCl을, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 7.4, 0.2 mM의 PMSF 20 MM 트리스 - 염산, 산도 7.4) 300 ml의 아밀로오스 수지 씻으십시오. </li><li> 세척 버퍼 II (20 mM의 T 150 ml의 세척을 반복RIS-염산, 산도 7.4, 200 MM의 염화나트륨, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 7.4, 0.2 mM의 PMSF). </li><li> 열, 4 품어 10 분 ° C, 수집 용출 버퍼의 5 ML을 (; 200 mM의 NaCl을; 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 7.4 및 0.2 mM의 PMSF, 10 MM 토스 20 MM 트리스 - 염산, 산도 7.4)을 추가 더 많은 시간을위한 용출액를 반복하십시오. </li><li> 용출액을 결합, 쿠마시 염색 (그림 4) 다음 SDS-PAGE 젤에 용출액의 나누어지는을로드하여 MBP-Mgm101의 수율과 순도를 결정합니다. </li></ol> 3. PreScission 프로테아제 분열과 양이온 교환 크로마토 그래피 <ol><li> MBP-Mgm101 용출액에 PreScission 프로테아제의 50 단위를 추가합니다. 4의 절단 ° CO / N를 수행하고 (20 MM 트리스 - 염산, 산도 7.4, 100 MM의 염화나트륨, 2 mM의 DTT, 1 mM의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 7.4, 0.2 mM의 PMSF)는 투석 버퍼에 대한 투석 동안 계속할 수 </li><li> SDS-PAGE 젤 (그림 5A)의 분열의 효율성을 확인합니다. </li><li> 여러가 주입에 의해 절단 된 MBP-Mgm101를로드바이오 스케일 미니 매크로 준비 높은 S 카트리지 이온은 바이오 방사선의 생물학적 DuoFlow FPLC 시스템에 연결되어 있습니다. </li><li> 단계 소금 5 mm의 그라데이션, 300 밀리미터, 500 밀리미터, 750 mm와 혼합 버퍼 A (10 mM의 NaCl을하여 만든 염화나트륨 1,000 밀리미터를 적용하여 양이온 교환 크로마토 그래피를 시작, 10 MM 나 - 인산, 산도 7.2, 1 MM의 PMSF) 및 버퍼 B (1 M의 NaCl, 10 MM 나 - 인산, 산도 7.2, 1 ㎜ PMSF). 0.5 ML / 분에서 유량을 설정합니다. Mgm101 분수를 수집하고 SDS-PAGE 젤 (그림 5B)에서 단백질의 순도를 확인합니다. </li></ol> 4. 크기 배제 크로마토 그래피 <ol><li> 양이온 교환 크로마토 그래피에서 단백질 분수를 결합합니다. (; 150 mM의 NaCl을, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 7.4, 5 MM 2 - 메르 캅토 에탄올, 0.2 mM의 PMSF 20 MM의 MOPS, 산도 7.0) GF 평형 버퍼에있는 단백질을 Dialyze. </li><li> 4 ° C.에서 3,000 XG에서 회전시켜 ~ 1 ML에 볼륨을 줄이기 위해 VIVASPIN 15R의 여과 스핀 열이 단백질을 집중 </li><li> Mgm101 (을)를로드NA는 크로마토 그래피 버퍼 (; 150 mM의 NaCl을, 5 MM의 β-메르 캅 토 에탄올, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 7.4, 0.2 mM의 PMSF 20 MM의 MOPS, 산도 7.0)로 평형화 Superose 6 준비 급료 열을 보정. </li><li> 0.5 ML / 분의 유속으로 실행 크로마토 그래피 버퍼 크기 배제를 시작합니다. </li><li> 정제 Mgm101 피크의 분수를 수집합니다. 단백질의 최종 품질 검사를위한 12 % SDS-PAGE에 분수 분주을로드합니다. </li><li> VIVASPIN 6 단백질을 농축 한 후 빠르게 -80에서 액체 질소와 저장소에 샘플을 동결 ° C. </li><li> ssDNA 결합 분석 (그림 8)의 경우와 투과 전자 현미경 (그림 9)에 의해 구조 시각화를위한 6-12 개월 이내에 Mgm101 샘플을 사용합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+eukaryotic+homologous+recombination.">Mechanism of eukaryotic homologous recombination.</a> Annu. Rev. Biochem. 77, 229-257 (2008).</li><li>Bishop, D. K., Park, D., Xu, L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMC1:+a+meiosis-specific+yeast+homolog+of+E.+coli+recA+required+for+recombination,+synaptonemal+complex+formation,+and+cell+cycle+progression.">DMC1: a meiosis-specific yeast homolog of E. coli recA required for recombination, synaptonemal complex formation, and cell cycle progression.</a> Cell. 69, 439-456 (1992).</li><li>Shinohara, A., Ogawa, H., Ogawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad51+protein+involved+in+repair+and+recombination+in+S.+cerevisiae+is+a+RecA-like+protein.">Rad51 protein involved in repair and recombination in S. cerevisiae is a RecA-like protein.</a> Cell. 69, 457-470 (1992).</li><li>Passy, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Dmc1+protein+binds+DNA+as+an+octameric+ring.">Human Dmc1 protein binds DNA as an octameric ring.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 10684-10688 (1999).</li><li>Story, R. M., Weber, I. T., Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+E.+coli+recA+protein+monomer+and+polymer.">The structure of the E. coli recA protein monomer and polymer.</a> Nature. 355, 318-325 (1992).</li><li>Yu, X., Jacobs, S. A., West, S. C., Ogawa, T., Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+structure+and+dynamics+in+the+helical+filaments+formed+by+RecA+and+Rad51+on+DNA.">Domain structure and dynamics in the helical filaments formed by RecA and Rad51 on DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 8419-8424 (2001).</li><li>Conway, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+Rad51+filament.">Crystal structure of a Rad51 filament.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 11, 791-796 (2004).</li><li>Bai, Y., Davis, A. P., Symington, L. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+pathways+of+recombination+induced+by+double-strand+breaks+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 349-404 (1999).</li><li>Lopes, A., Amarir-Bouhram, J., Faure, G., Petit, M. A., Guerois, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+novel+recombinases+in+bacteriophage+genomes+unveils+Rad52,+Rad51+and+Gp2.5+remote+homologs.">Detection of novel recombinases in bacteriophage genomes unveils Rad52, Rad51 and Gp2.5 remote homologs.</a> Nucleic Acids Res. 38, 3952-3962 (2010).</li><li>Poteete, A. R., Sauer, R. T., Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+structure+and+quaternary+organization+of+the+bacteriophage+P22+Erf+protein.">Domain structure and quaternary organization of the bacteriophage P22 Erf protein.</a> J. Mol. Biol. 171, 401-418 (1983).</li><li>Passy, S. I., Yu, X., Li, Z., Radding, C. M., Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rings+and+filaments+of+beta+protein+from+bacteriophage+lambda+suggest+a+superfamily+of+recombination+proteins.">Rings and filaments of beta protein from bacteriophage lambda suggest a superfamily of recombination proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 4279-4284 (1999).</li><li>Ploquin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+basis+for+a+bacteriophage+homolog+of+human+RAD52.">Functional and structural basis for a bacteriophage homolog of human RAD52.</a> Curr. Biol. 18, 1142-1146 (2008).</li><li>Chen, X. J., Guan, M. X., Clark-Walker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MGM101,+a+nuclear+gene+involved+in+maintenance+of+the+mitochondrial+genome+in+Saccharomyces+cerevisiae.">MGM101, a nuclear gene involved in maintenance of the mitochondrial genome in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucl. Acids Res. 21, 3473-3477 (1993).</li><li>Meeusen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mgm101p+is+a+novel+component+of+the+mitochondrial+nucleoid+that+binds+DNA+and+is+required+for+the+repair+of+oxidatively+damaged+mitochondrial+DNA.">Mgm101p is a novel component of the mitochondrial nucleoid that binds DNA and is required for the repair of oxidatively damaged mitochondrial DNA.</a> J. Cell Biol. 145, 291-304 (1999).</li><li>Mbantenkhu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mgm101+is+a+Rad52-related+protein+required+for+mitochondrial+DNA+recombination.">Mgm101 is a Rad52-related protein required for mitochondrial DNA recombination.</a> J. Biol. Chem. 286, 42360-42370 (2011).</li><li>Nardozzi, J. D., Wang, X., Mbantenkhu, M., Wilkens, S., Chen, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+properly+configured+ring+structure+is+critical+for+the+function+of+the+mitochondrial+DNA+recombination+protein.">A properly configured ring structure is critical for the function of the mitochondrial DNA recombination protein.</a> Mgm101. J. Biol. Chem. 287, 37259-37268 (2012).</li><li>Zuo, X., Xue, D., Li, N., Clark-Walker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+core+of+the+mitochondrial+genome+maintenance+protein+Mgm101p+in+Saccharomyces+cerevisiae+determined+with+a+temperature-conditional+allele.">A functional core of the mitochondrial genome maintenance protein Mgm101p in Saccharomyces cerevisiae determined with a temperature-conditional allele.</a> FEMS Yeast Res. 7, 131-140 (2007).</li><li>Itoh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+packaging+proteins+Glom+and+Glom2+coordinately+organize+the+mitochondrial+nucleoid+of+Physarum+polycephalum.">DNA packaging proteins Glom and Glom2 coordinately organize the mitochondrial nucleoid of Physarum polycephalum.</a> Mitochondrion. 11, 575-586 (2011).</li><li>Janicka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+RAD52-like+single-stranded+DNA+binding+protein+affects+mitochondrial+DNA+repair+by+recombination.">A RAD52-like single-stranded DNA binding protein affects mitochondrial DNA repair by recombination.</a> Plant J. 72, 423-435 (2012).</li></ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

그것은 E.에서 안정적인 기본 재조합 Mgm101 단백질을 생산하기 위해 도전하고있다 박테리아 세포에서의 용해성을 가능성으로 인해 대장균. 이 보고서에서, 우리는 MBP 융합 전략은 단백질이 비교적 높은 수준에서 표현 될 수 있다는 점을 보여줍니다. 부정적인 염색 투과 전자 현미경 및 크기 배제 크로마토 그래피를 사용하여, 우리는 이전에 MBP-융합 단백질은 생체 18 균일 한 중합체를 형성하는 것으로 나타났습니다. 그것은 Mgm101의 폴딩 및 올리고머는 미토콘드리아의 매트릭스에 비해 박테리아 세포에 속도가 느려질 수 있습니다. unoligomerized Mgm101 신속하게 생체 내 독성 집계를 형성 할 수있다. MBP-태그를 생산 올리고머를 허용하고 독성을 감소 수용성 형태에 Mgm101을 유지 할 수 있습니다. 좋은 품질 Mgm101 준비를위한 중요한 기준은 DNA에 의해 최소한의 오염을 가지고있다. 280 / A <suB&gt; 260 비율이 샘플에서 오염 물질 DNA의 수준을 추정하는 데 사용됩니다. 일반적으로, 비율&gt; 1.4 쉽게 핵산을 오염 &lt;0.75 %로 좋은 품질의 것으로 간주되는, 달성 될 수있다. 280 / 260 비율이 수준 이하 인 경우 DNase의와 확장 된 소화 I을 권장합니다. 미래에, 그것은 S1 핵산과 RNA 분해 효소와 소화가 더 핵산의 오염을 줄일 수 있는지 여부를 확인하는 데 유용 할 수 있습니다. 우리는 이전 몇 주 동안 4에서 Mgm101 ° C의 저장을 긴 나선형 필라멘트 (17)의 형성을 유도하는 것으로 나타났습니다. 필라멘트 형성의 메커니즘이 잘 이해되지 않습니다. 오버 필 라멘은 단백질의 용해도에 영향을 미칩니다. 따라서, 강력 갓 준비한 Mgm101 단백질 분취를 빠르게 -80에서 저장 한 다음 액체 질소에 냉동하는 것이 좋습니다 ° C. 단백질의 DNA 결합 활성 스토리지 U의 6-12 개월 이후에 변경되지 않은 상태로 유지이러한 조건을 nder. 이 프로토콜은 Mgm101의 돌연변이 단백질을 준비하는 데 사용할 수 있습니다. 올리고머 상태와 Mgm101의 안정성 자주 돌연변이에 의해 영향을받습니다. 온화한 돌연변이 MBP의 분열에 따라 정제 된 단백질의 부분 침전이 발생할 수 있습니다. 이러한 경우에는 6 리터 문화 볼륨을 증가하는 크기 배제 크로마토 그래피에서 안정적인 정제 단백질의 충분한 수율을 허용 할 수 있습니다. 올리고머에 영향을 미치는 심각한 돌연변이 MBP 융합 형태로 단백질의 생산을 허용 할 수 있지만, 단백질 MBP의 제거 후 안정되지 않을 수 있습니다. 요약하면, 현재의 프로토콜은 E. 큰 Mgm101 올리고머 반지의 높은 수준의 표현을 허용하는 신뢰할 대장균. 이 프로토콜은 이러한 단백질의 용해도가 박테리아 세포에서 낮은 특히, Mgm101 orthologs 20, 21 및 기타 올리고머 단백질의 생산에 적용 할 수 있습니다.

상동 재조합 이중 가닥 나누기의 수리 (DSBs) 및 interstrand 가교를 위해 및 축소 복제 포크 1 DNA 복제의 reinitiation 중요합니다. 기존의 상동 재조합에, 중앙 반응은 원핵 생물에서 RECA 및 Rad51와 1-3 진핵 생물 Dmc1 등 ATP-의존 recombinases에 의해 촉매된다. 이 recombinases 양면 DNA 템플릿 (그림 1 왼쪽 패널) 4-7에서 동성 검색 및 가닥의 침공을 시작하기에 필수적인 ssDNA에 핵 단백질 필라멘트를 형성한다. 기존의 방식에 더하여, 상동 재조합은 RecA/Rad51-independent 방식 (그림 1, 오른쪽 패널)에 자리를 취할 수 있습니다. 예를 들어, 효모 Rad52 및 Rad59 단백질은 직접 dsDNA 나누기 resectioning에 의해 노출되는 보완 ssDNA 가닥의 어닐링을 촉진 할 수 있습니다. 노래로 알려진이 재조합 과정르 가닥 어닐링, 일반적으로 동종 dsDNA 템플릿을 페어링 포함되지 않습니다. 어닐링 후, 이종 꼬리 exonucleases에 의해 제거하고 흠이 게놈 연속성 8-10을 복원 할 결찰하고 있습니다. 한 가닥 어닐링 기계의 수리는 종종 직접적으로 반복 영역 사이의 게놈 시퀀스의 삭제가 붙어 있습니다. Rad52는 살균 11 사이에 널리 퍼져 재조합 단백질의 다양한 그룹에 속한다. 이 단백질은 또한 동종 단일 가닥 DNA 분자의 풀림을 촉진 자신의 활동을 기반으로, 단일 가닥 어닐링 단백질 (SSAPs)로 알려져 있습니다. 가장 특징 박테리오파지 SSAPs는 Redβ 및 lactococcal 파지 ul36에서 prophage RAC와 Sak의 단백질에서 박테리오파지 λ와 P22, 사각형에서 ERF 수 있습니다. 유사성이 거의 undetect 있지만 SSAPs는 구조적으로, 전형적인 β-β-β-α 배로 특징자신의 기본 시퀀스 수. 10 그들은 모두 형태의 대형 호모 중합체 링 - 체외 12-14 14 배 대칭. 이러한 특성 고차 구조 조직의 기능 의미가 잘 이해되지 않습니다. 우리는 미토콘드리아 게놈의 상동 재조합의 메커니즘을 이해에 관심이 있습니다. 우리는 이전에 사카 cerevisiae의 15 미토콘드리아 DNA의 유지에 필수적입니다 MGM101 유전자를 발견했습니다. MGM101은 이후 미토콘드리아 nucleoids과 연관된 것으로 발견되었으며, DNA를 손상 요원 미토콘드리아의 허용 오차 16이 필요합니다. 그러나 Mgm101의 연구는 재조합 Mgm101을 생산하기 위해 어려움 지난 10 년 다시 개최되었습니다. 우리는 최근에 E.에서 대량으로 용해 Mgm101 생산에 성공했다 MBP 융합 전략을 사용 대장균. 이것은 우리가 그 Mgm101 주식을 보여줄 수있게되었습니다단백질 17,18의 Rad52 - 가족과 함께 생화학 및 구조 유사성. 이 보고서에서는 세 단계 정화 절차는 균일 Mgm101for 생화학 및 구조 분석 (그림 2)을 생산하는 기술입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expression vector pMAL-c2E</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#N8066S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PreScission Protease</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>#27-0843-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells</td>
			<td>Strategene</td>
			<td>#230245</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>#11034626001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>#11359053001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>#10837091001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#DN25-1G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>#11411446001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylose resin</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#E8021L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Column chromatography column</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#7372512</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#732-4130</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO)</td>
			<td>Sartorius Stedium</td>
			<td>#VS15RH02</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 6 prep grade column</td>
			<td>Amersham Bioscirnces</td>
			<td>#17-0489-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO)</td>
			<td>Sartorius Stedium</td>
			<td>#VS0611</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of the mgm101 recombination protein by mbp-based tagging strategy

MGM101 유전자는 미토콘드리아 DNA의 유지에있는 그것의 역할을 위해 20 년 전에 발견되었다. 여러 그룹에서 연구 Mgm101 단백질이 미토콘드리아 DNA의 재조합 복구에 관여하는 것을 제안했습니다. 최근 조사 Mgm101이 Rad52 형 재조합 단백질의 가족과 관련된 지적했다. 이 단백질은 큰 올리고머 고리를 형성하고 일치하는 단일 가닥 DNA 분자의 풀림을 촉진합니다. 그러나 Mgm101의 특성은 재조합 단백질을 생산의 어려움에 의해 방해되었다. 여기 재조합 Mgm101의 준비를위한 믿을 수있는 절차를 설명합니다. 말토오스 결합 단백질은 (MBP) 태그 Mgm101 먼저 대장균에서 발현된다. 융합 단백질은 처음 아밀로오스 친 화성 크로마토 그래피로 정제한다. 단백질 가수 분해 분열에 의해 발표 된 후, Mgm101는 양이온 교환 크로마토 그래피로 MBP에서 분리됩니다. 단 분산 Mgm101은 다음 얻을 수있다크기 배제 크로마토 그래피 있습니다. 세균성 문화의 리터 당 Mgm101의 ~ 0.87 밀리그램의 수익률은 정기적으로 얻을 수 있습니다. 재조합 Mgm101는 DNA 최소한의 오염을 보유하고 있습니다. 준비된 샘플이 성공적으로 Mgm101의 생화학 적 구조 및 단일 입자 이미지 분석에 사용됩니다. 이 프로토콜은 또한으로 misfolded 및 박테리아 세포에 독성이 될 수있는 다른 큰 올리고머 DNA-결합 단백질의 준비를 위해 사용될 수있다.

Mgm101은 미토콘드리아에서 Rad52 관련 재조합 단백질이다. Rad52은 광범위 미토콘드리아 DNA 재조합 (그림 1)에서의 역할에 대해 연구하고있다. 재조합 Mgm101은 세 단계의 절차 (그림 2)에 의해 제조 될 수있다. 이 Mgm101는 수용성 형태로 표현하고 이후 (그림 3) 단백질 가수 분해 분열에 의해 태그에서 해제 할 수 있습니다 MBP를 붙이는 전략의 사용에 의해 촉진된다. 일반적인 준비, MBP-Mgm101 융합의 약 2-3 mg의 아밀로오스 친 화성 크로마토 그래피 후 세균 배양 1 리터에서 복구 할 수 있습니다. SDS-PAGE 젤에 MBP-Mgm101는 2 ~ 70 kDa의 (그림 4)의 주요 밴드로 감지됩니다. 수지가 적절하게 용출되기 전에 세척하면 다른 단백질에 의한 오염은 최소화됩니다. PreScission의 단백질 분해 효소에 의해 절단 한 후, MBP와 Mgm101가에 각각 42 kDa의 28 kDa의의 밴드로 분리되어 표시됩니다SDS-PAGE (그림 5A). 불완전 소화의 경우, 같은 ~ 70 kDa의 밴드의 존재로 표시 추가 PreScission 프로테아제와 확장 된 소화 좋습니다. 절단 된 MBP-Mgm101의 양이온 교환 크로마토 그래피, MBP는 소금의 응용 프로그램을하기 전에 열 (그림 6)에 의해 유지되지 않습니다. 일반적으로, Mgm101은 MBP (그림 5B)가 눈에 띄는 오염없이 소금의 500 밀리미터로 용출된다. 300 밀리미터의 작은 피크 uncleaved MBP-Mgm101 융합의 미량에 해당하는 언젠가 볼 수 있습니다. 그것은이 부분에 Mgm101이 열에 바인딩 친화력을 감소 오염 DNA에 의해 바인딩 할 수 있습니다. 따라서, 양이온 교환 DNA 오염을 최소화하기 위해 필요한 단계입니다. 그림 7은 크기 배제 크로마토 그래피 Mgm101 정화의 마지막 단계를 보여줍니다. Mgm101 중합체는 일반적으로 단 분산 피크 용출~ 400 kDa의의. Mgm101의 일부 돌연변이 형태는 종종 증가 V0 사이의 크기 (공극 부피) 및 400 kDa의 피크로 볼 수 있습니다. 이것에 대한 이유는 아직 알 수 없습니다. Mgm101의 올리고머에 영향을 미치는 돌연변이 V0 분수에서 용출 집계의 형성을 유도 할 수 있습니다. 그러나, 우리는 단량체 Mgm101에 해당하는 피크를 본 적이있다. Mgm101 단량체 용액 가능성이 불안정합니다. 정제 Mgm101는 ssDNA에 높은 결합력 (그림 8)가 있습니다. ssDNA에 대한 결합력이 젤에 무료 ssDNA의 적정에 따라 추정 할 수있다. Mgm101/ssDNA 단지 밖으로 우물 잘못 마이그레이션합니다. 가능한 설명은 Mgm101는 양전하와 ssDNA에 Mgm101 여러 소단위의 결합 전기 영동 조건에서 단백질 / DNA 복합체는 부동하게 부정적인 요금을 중화 것입니다. 적절하게 준비 할 때, Mgm101는 ~ 200 nm의 Kd 값으로 ssDNA를 바인딩합니다. 그림 9는 부정적인 얼룩 투과 전자 현미경에 의한 정화 Mgm101의 직접 구조 시각화를 보여줍니다. 갓 준비한 Mgm101은 ~ 20 ㎚의 직경이 큰 올리고머 반지로 주로 존재합니다. 대신, 세 Mgm101 샘플은 압축 된 필라멘트를 형성한다. 이 필라멘트는 반지의 스태킹 간단한에 의해 형성되지 않습니다. 필라멘트에서 나선형 패턴은 분명히 있습니다. 필 라멘 과정을 조절 조건은 현재 조사 중입니다. 그것은 단백질의 품질은 4에서 배양 한 후 SDS-PAGE에서 확인되는 것이 바람직하다 전자 현미경으로 분석되기 전에 세 샘플 ° C. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/50448/50448fig1.jpg" /> 그림 1. Rad52는 캘리포니아에있는 재조합 사이트에 Rad51 재조합의 로딩을위한 매개체 역할을 보여주는 단순화 된 도식nonical 상동 재조합 경로 (왼쪽 패널), 그리고 Rad51 (오른쪽 패널) 독립적으로 열처리 한 가닥을 촉진합니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/50448/50448fig2.jpg" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50448/50448fig2highres.jpg"/> 그림 2. 재조합 Mgm101의 준비를위한 전반적인 계획. Mgm101이 처음 E.로 표현된다 MBP 융합 형태의 대장균. 박테리아 세포는 초음파에 의해 용해된다. DNase의 I 소화가 DNA 오염을 줄이기 위해 적용됩니다. MBP-Mgm101 융합은 다음 아밀로스 컬럼을 사용하여 DNA-고갈 해물에서 정제된다. 단백질 가수 분해 분열 후 Mgm101가 해제되고 양이온 교환 크로마토 그래피로 MBP에서 분리. 이 단계는 또한 DNA로 오염을 줄이기 위해 필요합니다. 용출 Mgm101 부분은 다음 Superose 6 준비 급 열을 전달하여 동질성을 정화합니다. <p class="jove_content"FO : 유지 - together.within 페이지 = &quot;항상&quot;&gt; <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/50448/50448fig3.jpg" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50448/50448fig3highres.jpg"/> 그림 3. Mgm101 발현 플라스미드 PMAL - C2E-MGM101의 물리적지도. MBP와 Mgm101 사이 PreScission 단백질 분해 효소의 절단 사이트가 표시됩니다. 각각 42, 28 kDa의의 분자량 단백질 가수 분해 분열 수율 MBP와 Mgm101. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/50448/50448fig4.jpg" /> 그림 4. 아밀로오스 친 화성 크로마토 그래피 후 MBP-Mgm101 융합 단백질의 순도를 보여주는 SDS-PAGE. 단백질 농도는 280 nm에서 흡광도를 측정하여 결정되며 Mgm101의 약 5 μg이 젤에로드됩니다. 젤은 매시 파란색으로 염색된다. <img alt="그림 5" sRC는 = &quot;/ files/ftp_upload/50448/50448fig5.jpg&quot;/&gt; 그림 5. Mgm101의 SDS-PAGE 분석. PreScission 프로테아제로 절단 한 후 MBP-Mgm101 융합 단백질의 Mgm101의) 릴리스. 단백질 분해 효소 O / N와 소화 한 후 단백질의 약 5 μg을 함유 나누어지는이 젤에로드됩니다. 젤은 매시 파란색으로 염색된다. Mgm101은 표준 SDS-PAGE 조건에서 단백질의 긍정적 인 요금으로 인해 28 kDa의의 예상 크기보다 약간 느린 마이그레이션합니다. B) 양이온 교환 크로마토 그래피 MBP에서 분리 한 후 Mgm101. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/50448/50448fig6.jpg" /> 그림 6. 양이온 교환 크로마토 그래피 MBP에서 Mgm101의 분리를 보여주는 크로마토 그램. 절단 된 MBP-Mgm101는 바이오 스케일 미니 매크로 준비 높은 S 카트리지를 여러 번 주입된다. 5 mm의 단계 소금 그라디언트, 300 밀리미터, 500 밀리미터, 750 mm와 염화나트륨의 1,000 밀리미터 그런 다음 적용됩니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50448/50448fig6large.jpg" target="_blank">larer 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/50448/50448fig7.jpg" /> 그림 7. 교정 Superose 6 준비 급료 열 Mgm101 올리고머의 용출 프로파일을 보여주는 크로마토 그램. 크로마토 그래피는 0.5 ML / 분의 유량에 의해 수행됩니다. 용출 Mgm101는 2 ~ 400 kDa의의 피크로 관찰된다. V0 : 공극 부피. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50448/50448fig7large.jpg" target="_blank">larer 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/50448/50448fig8.jpg" /> 그림 8. 정제 Mgm101가 ssDNA에 강력한 결합 활성을 보여주는 전기 영동 이동성 변화 분석. 1.25 × 10 -3 </100 mM의 KCl을, [γ-32P] ATP-라벨 올리고 뉴클레오티드 HS40AT-F (5&#39;-TTAATATTTAATAATATAATCAATAAATAATATTATAATAATATAATATAA-3 &#39;) 20 MM 트리스 - HCL, pH를 8.0의 바인딩 버퍼의 지정된 농도에서 Mgm101와 혼합의&gt; μM을 먹다 , 5 mM의 MgCl 2, 1 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8.0, 10 % 글리세롤, 1 mM의 DTT, 50 ㎍ / ㎖ BSA, 그리고 1 ㎜ PMSF. 30 분 동안 실온에서 배양 한 후, 샘플은 6 % 네이티브 아크릴 아미드 겔에로드하고 4 ℃에서 0.5X TBE 버퍼에서 실행 <img alt="그림 9" src="/files/ftp_upload/50448/50448fig9.jpg" /> 그림 9. 그 구조 신선한 조직 (왼쪽 패널)와 세 (오른쪽 패널) Mgm101 보여주는 전자 현미경 사진. 부정적인 염색 투과 전자 현미경은 200 kV의에서 JEM-2100 투과 전자 현미경 (JEOL) 운영 체제를 사용하여 수행됩니다. 음수 세 Mgm101의 얼룩, 단백질은 4에 저장된 GF 버퍼 ° C (20 MM의 MOPS, pH를 7.0, 150 mM의 NaCl을, 5 mM의 β-메르 캅 토 에탄올, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 7.4, 0.2 mM의 PMSF) 분석되기 전에 4 주 동안. (박사 스테판 켄스의 의례).

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Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

효모 미토콘드리아 핵 양체 단백질, Mgm101이 큰 올리고머 고리를 형성하는 Rad52 형 재조합 단백질이다. 프로토콜은 말토오스 결합 단백질 (MBP) 태그 양이온 교환 및 크기 배제 크로마토 그래피와 결합 전략을 사용하고 수용성 재조합 Mgm101 준비를 설명합니다.

MBP 기반 태깅 전략에 의해 Mgm101 재조합 단백질의 제조

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the ...

preparation-mgm101-recombination-protein-mbp-based-tagging

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

12.0K 조회수.  State University of New York Upstate Medical University. 효모 미토콘드리아 핵 양체 단백질, Mgm101이 큰 올리고머 고리를 형성하는 Rad52 형 재조합 단백질이다. 프로토콜은 말토오스 결합 단백질 (MBP) 태그 양이온 교환 및 크기 배제 크로마토 그래피와 결합 전략을 사용하고 수용성 재조합 Mgm101 준비를 설명합니다.

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Predicting the Effectiveness of Population Replacement Strategy Using Mathematical Modeling

Charles Taylor and John Marshall explain the utility of mathematical modeling for evaluating the effectiveness of population replacement strategy.  Insight is given into how computational models can provide information on the population dynamics of mosquitoes and the spread of transposable elements through A. gambiae subspecies.  The ethical considerations of releasing genetically modified mosquitoes into the wild are discussed.

Charles Taylor and John Marshall explain the utility of mathematical modeling for evaluating the effectiveness of population replacement strategy. Insight is given into how computational models can provide information on the population dynamics of mosquitoes and the spread of transposable elements through A. gambiae subspecies. The ethical considerations of releasing genetically modified mosquitoes into the wild are discussed.

수학 모델링을 사용 인구 교체 전략의 효과를 예측

Charles Taylor and John Marshall explain the utility of mathematical modeling for evaluating the effectiveness of population replacement strategy.  ...

연구

생물학

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

단백질 Ubiquitination의 감지

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

액상 복구와 분자량 기반 분류에 대한 GELFREE 8100 분획화 시스템을 사용하여

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Branching morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the study of branching morphogenesis. In the developing SMG, this process involves iterative steps of epithelial bud and duct formation, to ultimately give rise to a complex branched network of acini and ducts, which serve to produce and modify/transport the saliva, respectively, into the oral cavity1-3. The epithelial-associated basement membrane and aspects of the mesenchymal compartment, including the mesenchyme cells, growth factors and the extracellular matrix, produced by these cells, are critical to the branching mechanism, although how the cellular and molecular events are coordinated remains poorly understood 4. The study of the molecular mechanisms driving epithelial morphogenesis advances our understanding of developmental mechanisms and provides insight into possible regenerative medicine approaches. Such studies have been hampered due to the lack of effective methods for genetic manipulation of the salivary epithelium. Currently, adenoviral transduction represents the most effective method for targeting epithelial cells in adult glands in vivo5. However, in embryonic explants, dense mesenchyme and the basement membrane surrounding the epithelial cells impedes viral access to the epithelial cells. If the mesenchyme is removed, the epithelium can be transfected using adenoviruses, and epithelial rudiments can resume branching morphogenesis in the presence of Matrigel or laminin-1116,7. Mesenchyme-free epithelial rudiment growth also requires additional supplementation with soluble growth factors and does not fully recapitulate branching morphogenesis as it occurs in intact glands8. Here we describe a technique which facilitates adenoviral transduction of epithelial cells and culture of the transfected epithelium with associated mesenchyme. Following microdissection of the embryonic SMGs, removal of the mesenchyme, and viral infection of the epithelium with a GFP-containing adenovirus, we show that the epithelium spontaneously recombines with uninfected mesenchyme, recapitulating intact SMG glandular structure and branching morphogenesis. The genetically modified epithelial cell population can be easily monitored using standard fluorescence microscopy methods, if fluorescently-tagged adenoviral constructs are used. The tissue recombination method described here is currently the most effective and accessible method for transfection of epithelial cells with a wild-type or mutant vector within a complex 3D tissue construct that does not require generation of transgenic animals.

A technique to genetically manipulate epithelial cells within whole ex vivo cultured embryonic mouse submandibular glands (SMGs) using viral gene transfer is described. This method takes advantage of the innate ability of SMG epithelium and mesenchyme to spontaneously recombine after separation and infection of epithelial rudiments with adenoviral vectors.

침샘 조직 문화의 유전자 변형과 재결합

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added to random screens. By increasing the likelihood that crystals will grow in the metastable zone of a protein's phase diagram, extra crystallization leads are often obtained, the quality of crystals produced may be increased, and a good supply of crystals for data collection and soaking experiments is provided. Here we describe a general method for rMMS that may be applied to either sitting drop or hanging drop vapor diffusion experiments, established either by hand or using liquid handling robotics, in 96-well or 24-well tray format.

Here we describe a general method for random microseed matrix screening. This technique is shown to significantly increase the success rate of protein crystallization screening experiments, reduce the need for optimization, and provide a reliable supply of crystals for data collection and ligand-soaking experiments.

임의 Microseed 매트릭스 심사에 의해 단백질 결정화의 성공률을 향상

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends

Microtubule depolymerization can provide force to transport different protein complexes and protein-coated beads in vitro. The underlying mechanisms are thought to play a vital role in the microtubule-dependent chromosome motions during cell division, but the relevant proteins and their exact roles are ill-defined. Thus, there is a growing need to develop assays with which to study such motility in vitro using purified components and defined biochemical milieu. Microtubules, however, are inherently unstable polymers; their switching between growth and shortening is stochastic and difficult to control. The protocols we describe here take advantage of the segmented microtubules that are made with the photoablatable stabilizing caps. Depolymerization of such segmented microtubules can be triggered with high temporal and spatial resolution, thereby assisting studies of motility at the disassembling microtubule ends. This technique can be used to carry out a quantitative analysis of the number of molecules in the fluorescently-labeled protein complexes, which move processively with dynamic microtubule ends. To optimize a signal-to-noise ratio in this and other quantitative fluorescent assays, coverslips should be treated to reduce nonspecific absorption of soluble fluorescently-labeled proteins. Detailed protocols are provided to take into account the unevenness of fluorescent illumination, and determine the intensity of a single fluorophore using equidistant Gaussian fit. Finally, we describe the use of segmented microtubules to study microtubule-dependent motions of the protein-coated microbeads, providing insights into the ability of different motor and nonmotor proteins to couple microtubule depolymerization to processive cargo motion.

Microtubules are inherently unstable polymers, and their switching between growth and shortening is stochastic and difficult to control. Here we describe protocols using segmented microtubules with photoablatable stabilizing caps. Depolymerization of segmented microtubules can be triggered with high temporal and spatial resolution, thereby assisting analysis of motions with the disassembling microtubule ends.

분해 미세 소관 엔드에 힘 입어 모션을 연구하기 위해 분단 미세 소관의 준비

Microtubule depolymerization can provide force to transport different protein complexes and protein-coated beads in vitro. The underlying mechanisms are ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에<em&gt; 대장균</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein subcellular localization changes; in particular, a nuclear translocation under a heat stress condition. Proteins react correspondingly to external and internal signals. A common mechanism is to change its subcellular localization. This article describes a protocol to track protein localization that does not require an antibody, radioactive labeling, or a confocal microscope. In this article, GFP is used to tag the target protein EXL-1 in C. elegans, a member of the chloride intracellular channel proteins (CLICs) family, including mammalian CLIC4. An integrated translational exl-1::gfp transgenic line (with a promoter and a full gene sequence) was created by transformation and &#947;-radiation, and stably expresses the gene and gfp. Recent research showed that upon heat stress, not oxidative stress, EXL-1::GFP accumulates in the nucleus. Overlapping the GFP signal with both the nuclei structure and the DAPI signals confirms the EXL-1 subcellular localization changes under stress. This protocol presents two different fixation methods for DAPI staining: ethanol fixation and acetone fixation. The DAPI staining protocol presented in this article is fast and efficient and preserves both the GFP signal and the protein subcellular localization changes. This method only requires a fluorescence microscope with Nomarski, a FITC filter, and a DAPI filter. It is suitable for a small laboratory setting, undergraduate student research, high school student research, and biotechnology classrooms.

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

This protocol demonstrates how to track a protein nuclear translocation under heat stress by using a green fluorescence protein (GFP) fusion protein as a marker and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining. The DAPI staining protocol is fast and preserves the GFP and protein subcellular localization signals.

녹색 형광 단백질 태그와 4', 6-Diamidino-2-phenylindole 꼬마 선 충 에 얼룩이 단백질 Subcellular 지 방화를 감지

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from low-sensitivity, indirect read-outs, limited throughput, and/or population-level rather than single-cell resolution. We designed a flow cytometry-based single methodology that addresses all of these limitations: Distributed Amphifluoric FRET or DAmFRET. DAmFRET detects and quantifies protein self-assemblies by sensitized emission FRET in vivo, enables deployment across model systems-from yeast to human cells-and achieves sensitive, single-cell, high-throughput read-outs irrespective of protein localization or solubility.

This article describes a FRET-based flow cytometry protocol to quantify protein self-assembly in both S. cerevisiae and HEK293T cells.