와 제임스 Neiswender, 순영 관이 작업에 사용 plasmids의 선물의 고 (故) 치 빈 치엔; 항체 염색법과 도움 제임스 리스터와 데이빗 Raible 우리는 그의 연구실이 기술이 처음 개발에서 박사 레너드 I. Zon 감사 microinjection 비디오. 이 작품은 CJC에 NIH 보조금 R00AR056899-03가 추진하는 사업

1. 흑종의 발병 조절을위한 검사 <ol><li> PCR 관심의 유전자의 전체 길이 열려있는 독서 프레임 (GOI)를 증폭하고 BP clonase II (Invitrogen)를 사용하여 pDONR 221에 ​​recombining에 의해 게이트웨이 중간 항목 클론을 만들 수 있습니다. miniCoopR 벡터 (그림 1A)에 mitfa 프로모터에서의 관심 유전자를 삽입 재조합 p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit # 302 p3E_SV40polyA 6 miniCoopR 5 Multisite 게이트웨이 기술 (Invitrogen)를 사용합니다. </li><li> 이전 7에 설명 된대로 mitfa (LF) triply homozygous zebrafish의 배아, p53의 (만약에) : 한 셀 TG (BRAF V600E mitfa)에 25 picograms Tol2 transposase의 mRNA와 함께 각 클론의 25 picograms를 삽입. 28.5에서 주입 배아를 배양 ° C. 24 hpf에있는 죽은 태아를 제거합니다. </li><li> 해부 microscop에 주입 배아를 포함하는 페트리 접시를 배치하여 72 hpf에서 구출 melanocytes과 유전자 변형 동물을 선택흰색 배경 (그림 1A)에 대한 입사광에 따라 5. </li><li> 이전에 8에 설명 된대로 네 dpf에서 zebrafish 시설의 보육의 3 L 탱크에 동물을 전송합니다. </li><li> 2개월에서 4mm 2 (그림 1A)보다 큰 melanocyte 구조의 적어도 하나의 공간이있는 동물을 선택합니다. 72 hpf에서 melanocyte 구조의 정도, 2 개월 melanocyte 구조의 정도 사이에 강한 상관 관계가 있습니다. melanocyte 구조와 태아가 72 hpf로 선택하는 경우, 그들 중 대부분 (~ 80 %) 2 개월 4mm 2보다 큰 melanocyte 구조의 적어도 하나의 영역을 갖게됩니다. </li><li> 화면 종양의 존재 (그림 1B)에 대한 주간 선택한 동물. histopathologic와 morphologic 변경 사항을 사이에 강한 상관 관계가 있습니다. 양성에서 악성으로 전환이 병변은 동물의 표면을 제기 될 morphologic 변경으로 인정 받고 있습니다. 종양 베어링 애니 마을 분리연구 있나요. </li><li> 종좌표에 자리표와 %의 흑색 증이없는 생존의 주 나이가 흑색 증 - 무료 생존 곡선을 그립니다. 관심있는 유전자를 표현하는 melanocytes가있는 동물은 동물을 제어하는 비교됩니다 melanocytes에서 명시 적 EGFP (강화 된 녹색 형광 단백질) (그림 1C). miniCoopR-EGFP를 주입 동물에 대한 중간 종양의 증상은 약 18 주입니다. 두 곡선이 로그 순위 테스트를 사용하여 통계적으로 다른 있는지 여부를 확인합니다. </li></ol> 2. 종양 침략 분석 <ol><li> hindbrain과 등쪽 지느러미 (그림 2A)의 앞쪽에 경계의 뒤쪽 경계 사이의 지역에서, dorsally 종양을 개발하는 절연 zebrafish를 선택합니다. </li><li> 흑색 증의 증상은 메사추세츠 의과 대학 기능 대학에서 안락사에 대한 미국의 동물 의료 협회 패널에 의해 지정된 및 승인 지침에 따라 물고기를 안락사시켜야 2 주 후에titutional 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC). 아가미의 움직임이 멈출 때까지 특히, 생선은 0.6 MG / ML tricaine와 함께 그릇에 배치됩니다. </li><li> 메스 생선의 복막 캐비티에 절개를 확인하고 고정에 대해 4 ° C에서 밤새 4 % paraformaldehyde에있는 물고기 (PFA)를 넣습니다. </li><li> 4에서 하루 아침에 0.5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)와 함께 치료 ° C가 decalcify합니다. </li><li> 밤 60시 2 시간 각 2 회 ° C.를 1 시간에 크실렌 3 회와 분명 1 시간에 탈수하고 파라핀으로 처리 카세트에 포르말린으로 고정 </li><li> 몰드에 파라핀의 조직을 삽입하고 30 분 ~ 1 시간을 위해 더욱 강화 할 수 있습니다. </li><li> 5 μm 섹션, 하나마다 50 μm하십시오. 섹션은 가로와 깊은 침략의 요점을 식별 할 수 있도록 전체 병변을 통해해야합니다. hematoxylin 및 eosin의 착색에 따릅니다. </li><li> 종양 세포가 collagenous 지층 compactum 밖에 남아 있는지 여부를 측정하여 종양 침략을 평가 등쪽에 침략근육은 나 척추 (그림 2B, C)에 더 침략. 샘플의 두 집합 사이의 통계적 차이를 확인합니다. </li></ol> 3. 규모 Melanocytes의 항체 염색법 <ol><li> 80 ML 0.1 M 오세영 2 HPO 4, 20 ML 0.1M 아니 2 PO 4 PO4 버퍼를 확인합니다. 산도는 7.3 있는지 확인하십시오. 8.0 g의 자당, 0.15 ML 0.2M CaCl 2, 90 ML 0.2M PO 4 버퍼, 산도 7.3을 포함하는 2 배 수정 버퍼를 확인합니다. 필요는 NaOH 또는 HCL과 7.3로 pH를 조정한다면 PO 4 버퍼 100 ML까지합니다. </li><li> 300 MG 고체 PFA까지 무게 microcentrifuge 튜브에 추가합니다. PFA 4.5 X 질량, MG에서 (예를 들면 450 UL 5 MM NaOH 100 MG PFA까지)와 같은 볼륨에 5 MM NaOH를 추가합니다. 60-70에서 열 ° C PFA가 해산 될 때까지 흔들림 가끔있는. 나머지 입자를 스핀 다운 20 % PFA 표면에 뜨는을 복구합니다. 신선한 때마다 확인합니다. </li><li> 1X Fi 접속 설비를 포함하는 고정 솔루션을 준비X 버퍼와 4퍼센트 PFA. </li><li> 0.17 MG / ML tricaine에서 물고기를 마취. </li><li> 날카로운 미세 스쳐 집게를 사용하여 등쪽의 비늘은 꺽을 해부 현미경으로 입사 광을 사용하여 규모의 melanocyte 함유 절반 (그림 3A)를 손상하지 돌봐. 직접 한 ML의 고정 솔루션과 실온에서 알을 품다,에 포셉 곳에서의 비늘가 도는 동안, ≥ 2 시간에. 물고기 물에 물고기를 전송하고 성공적인 복구를 확인하기 위해 생선을 모니터링 할 수 있습니다. </li><li> 표백 색소 melanocytes는 실온에서 5 분에 PBST (1X PBS 산도 7.4, 0.1 % 트리톤 X-100) 2 번에 고정 비늘을 씻어합니다. DH 2 O. 5 개 ML에 0.4 ML 10% 코와 0.15 ML 30% H 2 O 2를 포함 한 ML을 추가 갓 만든 표백 솔루션 튜브가 열려 파열에서 가스를 방지하기 위해 parafilm이나 모자를 자물쇠에 놔. 안료는 (그림 3B, C) ​​(10 분 전형적인) 사라질 때까지 표백 계속합니다. 온도는 실온에서 5 분 동안 PBST 네 번에 씻어erature. </li><li> 1X PBS 산도 7.4, 0.2 % 트리톤 X-100, 2 밀리그램 / ML BSA, 1 % DMSO, 0.02 % 할머니 3 2% 양 혈청으로 구성 블록 솔루션에 적어도 30 분을위한 블록. HRP 반응을 개발하면 할머니 3을 둡니다. </li><li> 실온에서 하룻밤 블록 솔루션에 기본 항체를 품다. 당신이 그들을 침수 유지하기 위해 샘플을 통해 솔루션의 적어도 400 μl이 필요합니다. </li><li> 상온에서 PBST에서 30 분의 비늘에게 3 번 씻으십시오. </li><li> 2 시간에서 실온에서 블록 솔루션 야간에 차 항체를 품다. </li><li> PBST + 0.1 μM의 DAPI로 10 분에 청바지. </li><li> PBST로 5 분에 3 번 씻으십시오. </li><li> 비늘의 오목면이 슬라이드 밑에 직면 있도록 vectashield 한 방울의 유리 슬라이드에 비늘를 장착하고 이상 유리 커버 전표를 놓습니다. 투명 매니큐어와 슬라이드의 가장자리를 밀봉하고 형광 현미경 (그림 3D, E, F, G에서 슬라이드를 관찰 </strong&gt;). </li></ol> 4. 이식 검정 <ol><li> 이식 10 이전 감마 방사선의 25 GY 일일를 irradiating에 의해받는 2~3개월 이전 캐스퍼 9 생선을 준비합니다. 물고기는 물고기 물에 복구 할 수 있습니다. </li><li> 이전에 설명 된대로 종양 - 베어링 생선 (2.2 절)을​​ 안락사시켜야. </li><li> 종양을 잘라 5 % FBS와 0.9x PBS를 소독 약 5 ML 필터를 페트리 접시에 넣어. 면도기 솔루션 중에있는 종양를 분석. </li><li> 실온에서 근무, 단일 세포를 얻을 수있는 P1000 피펫을 씹다. 5% FBS와 필터를 소독 0.9x PBS로 볼륨 25 ML로 구성합니다. </li><li> 40 μM 메쉬 필터를 통해 필터링 할 수 있습니다. </li><li> 10 분에 1,500 RPM (453 rcf)에서 Eppendorf 5810R의 탁상 원심 분리기에 봐. </li><li> 표면에 뜨는를 제거하고 약 원하는 농도 (100mm 3 종양에 대한 10 7 세포를 가정)에 세포 현탁액을합니다. </li><li> t를 계산그는 정확한 휴대폰 번호는 hemocytometer를 사용하여 최종 사출 볼륨이 약 5 μl이되도록 세포 현탁액을 희석. 50000 세포 주입 할 경우 예를 들어, 세포 현탁액은 10,000 세포 / μl의 최종 농도로 희석해야합니다. 세포 현탁액에게 전지 거리며 걷게을 방지하기 위해 모든 몇 분을 포함하는 관을 긋기. </li><li> 2 ~ 3 배는 100 % 에탄올과 0.9x PBS와 26s 게이지 (베벨 팁) 701 N 10 μl 해밀턴 주사기를 씻으십시오. 세포 현탁액의 5 μl로 주사기를로드합니다. </li><li> 0.17 MG / ML tricaine에서 방사능받는 물고기를 마취. 젖은 Kimwipe에서의 편에 자리 물고기 (그림 4A). </li><li> 한 손으로 물고기를 안정화 약 반 hindbrain와 등쪽 지느러미 앞쪽 테두리의 뒤쪽 경계 사이의 복막 캐비티 위의 생선의 측면에 45 ° 각도로 일어나 직면하고있는 베벨로 바늘을 삽입합니다. 부드럽게 플런저를 (그림 4B) 우울. &lt;/ 리&gt; <li> 생선 신선한 생선 물에 복구하고 종양 engraftment (그림 4C)를 매일 물고기를 관찰 할 수 있습니다. engraftment가 발생했습니다 경우, 지속적인 성장과 질병 개발도 볼 수 있습니다. </li></ol>

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

miniCoopR 방법은 zebrafish melanocytes에 대한 관심의 유전자의 표현이 가능합니다. 이 방법은 zebrafish mitfa 유전자가 세포 자율적으로 역할을한다는 사실을 활용합니다. 이러한 이유로, miniCoopR 벡터에 의해 구출 melanocytes는 minigene이 있고 물리적으로 연결된다에 관심이있는 유전자를 포함 할 확신합니다. 구출 melanocytes는 명확하게 볼 수 있으며, 단일 셀 배아로 주입 된 동물에서 얻을 수 있습니다. chimerism의 지정된 수준이 선택되어,이 컷오프를 능가 동물은 종양 발병 또는 기타 특성을 채점 할 수 있습니다. miniCoopR 방법의 가장 큰 장점은 충분한 chimerism과 동물 쉽게 식별하고 테스트 관심의 모든 유전자에 해당 안정적으로 유전자 변형 라인을 취득 할 필요없이 득점 할 수 있다는 것입니다. 시간과 노력, 비용을 조사 할 관심 유전자의 수에 비례에 저장됩니다. 이전 다섯보고 된 </suP&gt; miniCoopR 기반의 방법은 우리가 recurrently 인간 melanomas에서 증폭되어 염색체 1 지역에있는 많은 후보 oncogenes 시력 검사를 할 수있었습니다. 다른 염색체 간격은 비슷한 방식으로 상영 할 수 있습니다. 또한이 접근 방식은 melanocytes의 모든 유전자를 표현하는 데 사용할 수 있습니다, 이러한 세포의 특성을 모니터링 할 수 있습니다. 더욱 광범위하게, 구출 minigene에 관심있는 유전자를 커플 링의 원리는 다른 조직 유형에 적용 할 수 있습니다. 이러한 응용 프로그램의 경우, 조직 별 유전자 돌연변이와 해당 셀 자율적으로 행동 구조 유전자가 필요합니다. 다른 조직 유형에 대한 돌연변이와 유전자 쌍은 조직 유형의 넓은 스펙트럼에서 빠른 기능 assays의 가능성을 열어, zebrafish와 다른 종에 존재합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 게이트웨이 재결합 시약 </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> miniCoopR </td><td></td><td></td><td> 인용 발명 5 </td></tr><tr><td> Mitfa 항체 </td><td></td><td></td><td> 인용 발명 5 </td></tr><tr><td> FITC 염소 안티 - 토끼 IgG 항체 </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> 벡터 연구소 </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> 캐스퍼 Zebrafish </td><td></td><td></td><td> 참조 9 </td></tr><tr><td> 701N 10 μl 주사기 </td><td> 해밀턴 / 피셔 </td><td> 14-824 </td><td> 및nbsp; </td></tr><tr><td> 40 μM 필터 </td><td> BD 팔콘 / 피셔 </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 26140079 </td><td></td></tr></tbody></table>

screening for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model

인간의 암의 게놈 연구는 종양 하나, 둘, 셋에서 변경 아르 유전자에 대한 풍부한 정보를 굴복했습니다. 이 연구에서 발생하는 문제는 많은 유전자가 변경된다는 것입니다, 그것은 모든 사람들이 변화하는 동안 부수적으로 발생한 그에서 tumorigenesis를 몰고 유전자 변경을 구분하기 어려울 수 있습니다. 이 구별을 그리려면이 양적 종양 계속하고 배포 할 수 있도록 종양 개시 및 기타 프로세스에 변경된 유전자의 효과를 측정 할 수 있습니다 검정을 가지고 유용합니다. 여기 흑색 증의 개시 및 유지 보수에 필요한 단계를 포함 autochthonous 종양 모델 (4)를 사용하여 zebrafish에 후보 흑색 증 조절 다수의 화면에 빠른 방법을 제시한다. 이 분석의 주요 시약 어떤 게이트웨이 재결합 카세트에 커플 mitfa melanocyte 사양 계수의 야생 형 사본을 miniCoopR 벡터, 어느 후보 멜로anoma 유전자는 5 재결합 할 수 있습니다. miniCoopR 벡터는 발기인, 오픈 읽기 프레임과 야생 형 mitfa 유전자의 3&#39;-번역되지 않은 지역을 포함하는 mitfa의 구조를 minigene 있습니다. 우리는 후보 흑색 증 조절의 전체 길이 열려있는 독서 프레임을 사용하여 구조를 할 수 있습니다. p53의 (만약에); mitfa (LF) zebrafish의 배아 :이 각각의 클론 그런 다음 단일 셀 TG (BRAF V600E mitfa)에 주입 될 수있다. miniCoopR 벡터는 Tol2로 인한 transgenesis 6 통합 melanocytes를 구출됩니다. 그들이 실제로 mitfa 구출 minigene에 연결되기 때문에, 후보 유전자는 변화와 종양으로 발전 할 일부의 구출 melanocytes에 표현됩니다. 흑색 증의 개시 및 흑색 증 세포의 특성에 후보 유전자의 효과가 흑색 증없는 생존 곡선, 침략의 assays, 항체 염색법과 이식 assays를 사용하여 측정 할 수 있습니다.

하나의 셀 TG (mitfa : BRAF V600E), p53의 (만약에), mitfa (LF) zebrafish의 배아는 흑색 증의 종양 유전자 mitfa 프로모터의 조절하에 SETDB1 5 EGFP 각을 포함하는 miniCoopR 벡터를 주입했다. melanocyte 구조와 태아가 선택되고 성숙 할 수 있었다. melanocyte 구조와 세 동물 2 개월에 4mm 2보다 더 큰이 선택되었습니다. 동물 melanomas 주 단위로 상영되었다. 성인을위한 종양 발생률 곡선은 SETDB1 종양 유전자는 크게 EGFP 제어 (그림 1)에 비해 흑색 증의 onsetas을 가속화 것으로 나타났다. hindbrain의 뒤쪽 경계와 등쪽 지느러미 (그림 2A)의 앞 국경 사이에 종양을 개발 동물 격리되었다. 두 주 흑색 증의 발병 후에는 hematoxylin과 eosin으로 sectioned과 스테인드은 취소에 흑색 증의 침략을 평가하기 위해, 4 % paraformaldehyde에 고정 된조직을 derlying. SETDB1을 표현 Melanomas은 EGFP 제어 melanomas (그림 2C)보다 더 많은 로컬 침입했다. 후보 유전자의 표현을 찾기 위해 위해, 등쪽의 비늘은 FITC 염소 항에 1:1,000 희석 한 다음 Mitfa 전사 인자를 인식하는 기본 항체의 1:100 희석을 사용하여 야생 형 zebrafish과 스테인드 뜯어 낸되었다 - 토끼 IgG 항체 (그림 3). miniCoopR-EGFP를 주입 mitfa (만약에) 물고기, p53의 (만약에) : 종양의 transplantability을 평가하기 위해, 흑색 증 세포는 TG (BRAF V600E mitfa)에서 분리되었다. 50000 세포는 피하 25 GY로 전날을 발견 했소 된받는 사람 캐스퍼 돌연변이에 주입했다. 세 2 주에 의해 색소 기증자 파생 세포는 쉽게 (그림 4) 인정되었다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5.5in" f<html> O : SRC = SRC = &quot;/ files/ftp_upload/50086/50086fig1.jpg&quot;/ &quot;를 / files/ftp_upload/50086/50086fig1highres.jpg&quot;&gt; 그림 1. miniCoopR 분석을 사용하여 흑색 증의 발병 조절을위한 검사. miniCoopR 분석의 A) 도식. miniCoopR 벡터 관심의 유전자를 포함하는 구조 melanocytes (화살촉)와 배아. 스케일 바 = 250 μM. 4mm 2 melanocyte 구조 (화살촉)보다 큰있는 성인. 스케일 바 = 500 μM B) MiniCoopR-EGFP는 amelanotic과 색소 종양 (화살촉)와 zebrafish를 구출. C) 대표 흑색 증 - 무료 생존 곡선은 종양 유전자의 SETDB1 및 제어 EGFP 유전자를 표현하는 종양을 비교 (P = 9.4 × 10 -7, logrank χ 2). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50086/50086fig1large.jpg" target="_blank">더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . &quot;2.jpg /&gt; 그림 2. 종양 침공 분석. hindbrain의 뒤쪽 경계와 등쪽 지느러미 앞쪽 가장자리 사이의 등쪽 종양 (화살촉)와 A) MiniCoopR - 탈출의 zebrafish. 지층 compactum (SC), 비늘, 규모 - 관련 melanocyte (SAM) (삽입, 스케일 바 = 50 μM), 근육 (M)과 척추 (SPC)를 보여주는 B) 가로 절을 참조하십시오. 스케일 바 = 200 μM. C) 비 침습적 miniCoopR-EGFP 종양 (T) (왼쪽)와 지층 compactuminto 근육 (M)와 척추를 침범 한 miniCoopR - SETDB1 종양 (오른쪽) 보여 가로 섹션을 제공합니다. 스케일 바 = 200 μM. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/50086/50086fig3.jpg" /> 규모 melanocytes의 그림 3. 항체 염색법. A) 저울은 anesthetized miniCoopR-EGFP zebrafish에서 뽑혀된다. 색소 melanocytes와 C와 B) 표백하지 않은 기준) 표백들miniCoopR-EGFP zebrafish에서 케일. 스케일 바 = 100 μM. 표백하지 않은 규모)는 D) Mitfa 항체와 E와 DAPI를 더럽 혔다. 표백 규모)는 Mitfa 항체와 G에게) F와 DAPI를 더럽 혔다. 스케일 바 = 40 μM. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/50086/50086fig4.jpg" /> 그림 4. 흑색 증 세포의 이식. A) 캐스퍼의 zebrafish는 Uninjected. 스케일 바 = 500 μM. 즉시 50,000 흑색 증 세포로 주입 한 후 방사능 캐스퍼받는 사람에 대한 B) 피하 이식 사이트 (화살촉). 스케일 바 = 200 μM. C) 방사능 캐스퍼받는 두 주 50,000 흑색 증 세포로 주입 후 종양이 engraftment (화살촉)를 보여주고 있습니다.

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Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

zebrafish autochthonous 종양 모델을 사용하여 흑색 증 조절을위한 화면으로 빠른 방법은 제공됩니다. 그것은 melanocytes에서 후보 흑색 증의 유전자의 표현을 허용 miniCoopR 벡터의 이점을 걸립니다. 흑색 증 - 무료 생존 곡선, 침략 분석, 규모 melanocytes의 항체 염색법을위한 프로토콜과 흑색 증 이식 분석을 구하는 방법이 설명되어 있습니다.

Zebrafish Autochthonous 종양 모델을 사용하여 흑종 조절을위한 검사

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

13.6K 조회수.  University of Massachusetts Medical School. zebrafish autochthonous 종양 모델을 사용하여 흑색 증 조절을위한 화면으로 빠른 방법은 제공됩니다. 그것은 melanocytes에서 후보 흑색 증의 유전자의 표현을 허용 miniCoopR 벡터의 이점을 걸립니다. 흑색 증 - 무료 생존 곡선, 침략 분석, 규모 melanocytes의 항체 염색법을위한 프로토콜과 흑색 증 이식 분석을 구하는 방법이 설명되어 있습니다.

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Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic &#8220;drivers&#8221; among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

종양의 병인에 후보 협동 유전자의 기능 게놈 분석을위한 모자이크 Zebrafish의 Transgenesis

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers.  To robustly and efficiently ...

연구

발생학

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to assess potential patient response to therapy. Current methods largely depend on using syngeneic or immune-compromised animals to avoid rejection of the tumor graft. Such methods require the use of specific genetic strains that often prevent the analysis of immune-tumor cell interactions and/or are limited to specific genetic backgrounds. An alternative method in zebrafish takes advantage of an incompletely developed immune system in the embryonic brain before 3 days, where tumor cells are transplanted for use in short-term assays (i.e., 3 to 10 days). However, these methods cause host lethality, which prevents the long-term study of tumor cell behavior and drug response. This protocol describes a simple and efficient method for the long-term orthotopic transplantation of zebrafish brain tumor tissue into the fourth ventricle of a 2-day-old immune-competent zebrafish. This method allows: 1) long-term study of tumor cell behaviors, such as invasion and dissemination; 2) durable tumor response to drugs; and 3) re-transplantation of tumors for the study of tumor evolution and/or the impact of different host genetic backgrounds. In summary, this technique allows cancer researchers to assess engraftment, invasion, and growth at distant sites, as well as to perform chemical screens and cell competition assays over many months. This protocol can be extended to studies of other tumor types and can be used to elucidate mechanisms of chemoresistance and metastasis.

The transplantation of cancer cells is an important tool for the identification of cancer mechanisms and therapeutic responses. Current techniques depend on immune-incompetent animals. Here, we describe a method to transplant zebrafish tumor cells into immune-competent embryos for the long-term analysis of tumor cell behavior and in vivo drug responses.

종양 세포의 행동과 약물 반응에 대한 장기 연구를 위해 면역 능력이있는 숙주 내로 Zebrafish Pediatric Brain 종양을 이식

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

암 연구학

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the standard in the field, but zebrafish have emerged as an alternative model with several advantages, including the ability for high-throughput and low-cost drug screening. Zebrafish also allow for in vivo drug screening with large replicate numbers that were previously only obtainable with in vitro systems. The ability to rapidly perform large scale drug screens may open up the possibility for personalized medicine with rapid translation of results back to clinic. Zebrafish xenograft models could also be used to rapidly screen for actionable mutations based on tumor response to targeted therapies or to identify new anti-cancer compounds from large libraries. The current major limitation in the field has been quantifying and automating the process so that drug screens can be done on a larger scale and be less labor-intensive. We have developed a workflow for xenografting primary patient samples into zebrafish larvae and performing large scale drug screens using a fluorescence microscope equipped imaging unit and automated sampler unit. This method allows for standardization and quantification of engrafted tumor area and response to drug treatment across large numbers of zebrafish larvae. Overall, this method is advantageous over traditional cell culture drug screening as it allows for growth of tumor cells in an in vivo environment throughout drug treatment, and is more practical and cost-effective than mice for large scale in vivo drug screens.

Zebrafish xenograft models allow for high-throughput drug screening and fluorescent imaging of human cancer cells in an in vivo microenvironment. We developed a workflow for large scale, automated drug screening on patient-derived leukemia samples in zebrafish using an automated fluorescence microscope equipped imaging unit.

제브라피시의 1차 환자 유래 종양 이종이식의 약물 스크리닝

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Ortho- and Ectopic Zebrafish Xeno-Engraftment of Ocular Melanoma to Recapitulate Primary Tumor and Experimental Metastasis Development

There are currently no animal models for metastatic ocular melanoma. The lack of metastatic disease models has greatly hampered the research and development of novel strategies for the treatment of metastatic ocular melanoma. In this protocol we delineate a quick and efficient way to generate embryonic zebrafish models for both the primary and disseminated stage of ocular melanoma, using retro-orbital orthotopic and intravascular ectopic cell engraftment, respectively. Combining these two different engraftment strategies we can recapitulate the etiology of cancer in its totality, progressing from primary, localized tumor growth under the eye to a peri-vascular metastasis formation in the tail. These models allow us to quickly and easily modify the cancer cells prior to implantation with specific labeling, genetic or chemical interference; and to treat the engrafted hosts with (small molecular) inhibitors to attenuate tumor development. 
Here, we describe the generation and quantification of both orthotopic and ectopic engraftment of ocular melanomas (conjunctival and uveal melanoma) using fluorescently labelled stable cell lines. This protocol is also applicable for engraftment of primary cells derived from patient biopsy and patient/PDX derived material (manuscript in preparation). Within hours post engraftment cell migration and proliferation can be visualized and quantified. Both tumor foci are readily available for imaging with both epifluorescence microscopy and confocal microscopy. Using these models, we can confirm or refute the activity of either chemical or genetic inhibition strategies within as little as 8 days after the onset of the experiment, allowing not only highly efficient screening on stable cell lines, but also enables patient directed screening for precision medicine approaches.

Here, we present a protocol to establish versatile orthotopic and ectopic zebrafish xenograft models for ocular melanoma to assess the growth kinetics of the primary tumor, dissemination, extravasation and distant, peri-vascular metastasis formation and the effect of chemical inhibition thereon.

There are currently no animal models for metastatic ocular melanoma. The lack of metastatic disease models has greatly hampered the research and ...

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly visualizing the response to anti-cancer therapies (chemo, radiotherapy, and biologicals), angiogenesis and metastasis with single cell resolution, places the zebrafish xenograft model as a top choice to develop preclinical studies.

The zebrafish larval xenograft assay presents several experimental advantages compared to other models, but probably the most striking is the reduction of size scale and consequently time. This reduction of scale allows single cell imaging, the use of a relatively low number of human cells (compatible with biopsies), medium-high-throughput drug screenings, but most importantly enables a significant reduction of the time of the assay. All these advantages make the zebrafish xenograft assay extremely attractive for future personalized medicine applications.

Many zebrafish xenograft protocols have been developed with a wide diversity of human tumors; however, a general and standardized protocol to efficiently generate zebrafish larval xenografts is still lacking. Here we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

Here, we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

제브라피시 애벌레 제노이식 및 종양 행동 분석의 생성

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing technologies applied in zebrafish modeling, the ease of maintenance, high-yield productivity, and powerful live imaging altogether make the zebrafish a valuable model system to study metastasis and cellular and molecular bases underlying this process in vivo. The first zebrafish neuroblastoma (NB) model of metastasis was developed by overexpressing two oncogenes, MYCN and LMO1, under control of the dopamine-beta-hydroxylase (d&#946;h) promoter. Co-overexpressed MYCN and LMO1 led to the reduced latency and increased penetrance of neuroblastomagenesis, as well as accelerated distant metastasis of tumor cells. This new model reliably reiterates many key features of human metastatic NB, including involvement of clinically relevant and metastasis-associated genetic alterations; natural and spontaneous development of metastasis in vivo; and conserved sites of metastases. Therefore, the zebrafish model possesses unique advantages to dissect the complex process of tumor metastasis in vivo.

This paper introduces the method of developing, characterizing, and tracking in real-time the tumor metastasis in zebrafish model of neuroblastoma, specifically in the transgenic zebrafish line with overexpression of MYCN and LMO1, which develops metastasis spontaneously.

신경 모세포종 전이의 제브라피시 모델

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

Normal and Malignant Muscle Cell Transplantation into Immune Compromised Adult Zebrafish

Zebrafish have become a powerful tool for assessing development, regeneration, and cancer. More recently, allograft cell transplantation protocols have been developed that permit engraftment of normal and malignant cells into irradiated, syngeneic, and immune compromised adult zebrafish. These models when coupled with optimized cell transplantation protocols allow for the rapid assessment of stem cell function, regeneration following injury, and cancer. Here, we present a method for cell transplantation of zebrafish adult skeletal muscle and embryonal rhabdomyosarcoma (ERMS), a pediatric sarcoma that shares features with embryonic muscle, into immune compromised adult rag2E450fs homozygous mutant zebrafish. Importantly, these animals lack T cells and have reduced B cell function, facilitating engraftment of a wide range of tissues from unrelated donor animals. Our optimized protocols show that fluorescently labeled muscle cell preparations from &#945;-actin-RFP transgenic zebrafish engraft robustly when implanted into the dorsal musculature of rag2 homozygous mutant fish. We also demonstrate engraftment of fluorescent-transgenic ERMS where fluorescence is confined to cells based on differentiation status. Specifically, ERMS were created in AB-strain myf5-GFP; mylpfa-mCherry double transgenic animals and tumors injected into the peritoneum of adult immune compromised fish. The utility of these protocols extends to engraftment of a wide range of normal and malignant donor cells that can be implanted into dorsal musculature or peritoneum of adult zebrafish.

Here, we present a protocol for cell transplantation of zebrafish skeletal muscle and embryonal rhabdomyosarcoma (ERMS) into adult immune compromised rag2E450fs homozygous mutant zebrafish. This protocol allows for the efficient analysis of regeneration and malignant transformation of muscle cells.

면역이 저하 된 성인 Zebrafish의에 정상 및 악성 근육 세포 이식

Zebrafish have become a powerful tool for assessing development, regeneration, and cancer. More recently, allograft cell transplantation protocols have ...

면역학 및 감염병학

효율적인 In Vivo 종양 연구를 위한 유충 제브라피시 활용

A Simple, Rapid, and Effective Method for Tumor Xenotransplantation Analysis in Transparent Zebrafish Embryos

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we present larval zebrafish as a transplant model that has numerous advantages over murine models, including ease of handling, low expense, and short experimental duration. Moreover, the absence of an adaptive immune system during larval stages obviates the need to generate and use immunodeficient strains. While established protocols for xenotransplantation in zebrafish embryos exist, we present here an improved method involving embryo staging for faster transfer, survival analysis, and the use of flow cytometry to assess disease burden. Embryos are staged to facilitate rapid cell injection into the yolk of the larvae and cell marking to monitor the consistency of the injected cell bolus. After injection, embryo survival analysis is assessed up to 7 days post injection (dpi). Finally, disease burden is also assessed by marking transferred cells with a fluorescent protein and analysis by flow cytometry. Flow cytometry is enabled by a standardized method of preparing cell suspensions from zebrafish embryos, which could also be used in establishing the primary culture of zebrafish cells. In summary, the procedure described here allows a more rapid assessment of the behavior of tumor cells in vivo with larger numbers of animals per study arm and in a more cost-effective manner.

저자 스포트라이트: 제브라피시에서 종양 이종장기이식을 사용한 암 치료의 발전

We describe a protocol for xenotransplantation into the yolk of transparent zebrafish embryos that is optimized by a simple, rapid staging method. Post-injection analyses include survival and assessing the disease burden of xenotransplanted cells by flow cytometry.

투명 제브라피시 배아에서 종양 이종 이식 분석을 위한 간단하고 빠르며 효과적인 방법

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we ...

Zebrafish Autochthonous 종양 모델을 사용하여 흑종 조절을위한 검사

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종양의 병인에 후보 협동 유전자의 기능 게놈 분석을위한 모자이크 Zebrafish의 Transgenesis

종양 세포의 행동과 약물 반응에 대한 장기 연구를 위해 면역 능력이있는 숙주 내로 Zebrafish Pediatric Brain 종양을 이식

제브라피시의 1차 환자 유래 종양 이종이식의 약물 스크리닝

Ortho- and Ectopic Zebrafish Xeno-Engraftment of Ocular Melanoma to Recapitulate Primary Tumor and Experimental Metastasis Development

제브라피시 애벌레 제노이식 및 종양 행동 분석의 생성

신경 모세포종 전이의 제브라피시 모델

면역이 저하 된 성인 Zebrafish의에 정상 및 악성 근육 세포 이식

투명 제브라피시 배아에서 종양 이종 이식 분석을 위한 간단하고 빠르며 효과적인 방법

투명 제브라피시 배아에서 종양 이종 이식 분석을 위한 간단하고 빠르며 효과적인 방법

투명 제브라피시 배아에서 종양 이종 이식 분석을 위한 간단하고 빠르며 효과적인 방법