이 작품은 의학 연구위원회와 마리 퀴리 국제 재 통합 기금 제도 (JKV까지)에 의해 지원되었다.

1. cDNA 표현 클론를 선택 <ol><li> cDNA 라이브러리는 96 - 웰 형식으로 글리세롤 주식의 단일 박테리아 클론으로 제공됩니다. Norgen CP7200의 선택기 메뉴에서 Rearray 명령을 사용하여 96 deepwell (1 ML 잘) 판의 1.5 ML의 LB / A로 소스 플레이트와 예방에서 박테리아 클론을 선택합니다. </li><li> 가스 투과성의 밀폐와 deepwell 판을 봉쇄하고 흔드는에서 37 ° C에서 하루 아침에 품다. </li></ol> 2. cDNA 표현 도서관의 작성 <ol><li> 테이블 탑 원심 분리기에 판 어댑터를 사용 20 분에 2,000 rpm으로 박테리아를 포함하는 deepwell 판을 봐. </li><li> 박테리아 펠렛은 그대로두고, 우물에서 미디어를 대기음. </li><li> 그림 2와 같이 실험실 자동화 워크 스테이션의 데크를 구성합니다. 플라스미드 준비 솔루션은 골짜기 1-5로 배포되고 deepwell 판은 갑판에 배치됩니다. 용출 솔루션 multiwell 트로프deepwell 판에 인접 배치됩니다. 팁은 팁 랙에로드됩니다. </li><li> 진공 매니 폴드를 조립. 플라스미드 바인딩 플레이트는 매니 폴드 내부에 배치되어 있으며 플라스미드 필터 플레이트는 매니 폴드의 상단에 위치합니다. </li><li> 아래로 pipetting과에 250 μl 솔루션 1 (Resuspension 버퍼)로 알약을 Resuspend. </li><li> 250 μl 솔루션 2 (용해 버퍼)의 추가에 의해 박테리아를 Lyse. 플레이트는 봉인하고 완전한는 혼합 수 있도록 거꾸로되어 있습니다. </li><li> 2 분 타이머를 시작합니다. </li><li> 350 μl 솔루션 3 (Neutralisation 버퍼)를 추가합니다. 판을 봉쇄와 3 번 반전. </li><li> 플라스미드 필터 플레이트에 세균 lysates을 전송합니다. </li><li> 5 분에 진공을 적용합니다. </li><li> 필터 플레이트를 제거하고 매니 폴드 상단에 구속력 판을 놓습니다. 1 분에 진공을 적용합니다. </li><li> 추가 세척 (AW) 버퍼 500 μl를 추가합니다. </li><li> 2 분에 진공을 적용합니다. </li><li> 세탁 버퍼 해결 방법 4 900 μl를 추가합니다. 2 분에 진공을 적용합니다. </li><li> 반복의2.14 tep. 추가 15 분에 진공을 적용합니다. </li><li> 매니 폴드 내부의 DNA 수집 판을 놓습니다. 바인딩 플레이트에 용출 버퍼 100 μl를 추가하고 2 분에 품다. </li><li> 10 분에 진공. </li><li> Nanodrop 8000을 사용하여 수집 플레이트 및 측정 DNA 농도를 제거합니다. 일반적으로 ~의 수율은 100 NG / μl이 방법으로 예상 할 수 있습니다. </li></ol> 3. 셀 심는 <ol><li> HEK293 세포는 trypsinized 및 계산됩니다. </li><li> 2 X 10 4 셀은 ThermoFisher 96 - 웰 multidrop을 사용하여 PerkinElmer의 Viewplate의 각도에 투여합니다. </li><li> 세포는 37 하룻밤 incubated 아르 ° C 5 % CO 2. </li></ol> 4. Transfection <ol><li> 25 μl 혈청이없는 미디어의 당 잘 96 - 웰 플레이트 원형 바닥에 cDNA의 100 NG 100 NG GFP-Grb2 플라스미드 DNA의 믹스를 준비합니다. </li><li> 물론 당 0.5 μl Transfectin를 포함하는 25 μl 혈청이없는 미디어를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 믹스 및 타이머 구경 시작R 30 분. </li><li> 부드러운 분배 방법을 사용하여 셀에 Transfectin / cDNA 믹스의 50 μl를 전송합니다. 또는 transfection 믹스는 접시에 처음 투여 한 후 세포가 상단에 추가 할 수 있습니다 (역 transfection). </li><li> 37 세포가 하루 아침에 길러 ° C 5 % CO 2. </li></ol> 5. 이미지 수집 <ol><li> 오페라 소프트웨어를 시작합니다. 실험 설정의 화면 스냅 샷은 그림 3에 표시됩니다. &quot;구성&quot;탭을 선택하고 20x 객관적이고 정확한 판 유형을 선택합니다. &quot;칼라&quot;를 확인하는 것은 다른 판 유형 초점을 할 수 있도록 목적에 올바른 값으로 설정되어 있습니다. </li><li> &#39;현미경&#39;탭을 선택합니다. 로 FITC (488 레이저) 및 노출 2로 노출 정의 1 UV (365 레이저). 두 노출에 UV 필터를 활성화 및 카메라 1과 카메라 2 노출 2 노출 1 지정할 수 있습니다. 노출 1, 노출이 40 밀리 초 800 밀리 초에 대한 노출 시간을 설정합니다. </li><li> &#39;현미경&#39;탭을 선택합니다. 전자를 정의UV (365 레이저)로 FITC (488 레이저) 및 노출이 같은 xposure 1. 두 노출에 UV 필터를 활성화 및 카메라 1과 카메라 2 노출 2 노출 1 지정할 수 있습니다. 노출 1, 노출이 40 밀리 초 800 밀리 초에 대한 노출 시간을 설정합니다. </li><li> 노출 1을 선택합니다. 높이 0 μm에 초점을 설정합니다. &quot;포커스&quot;를 선택하십시오. 일단 초점을 맞추고, 카메라 1 노출. 노출 비행기를 최적화하고 &quot;촬영 높이&quot;를 클릭하여 초점 높이를 조정합니다. ~ 3,000의 최대 픽셀 강도를 제공 노출 시간 및 레이저 파워를 변경합니다. 노출 매개 변수를 저장합니다. 노출 2 반복합니다. </li><li> &quot;실험 정의 &#39;탭을 선택합니다. 레이아웃 및 sublayout을 만듭니다. 드래그 및 관련 레이아웃, 노출, 참조 이미지, skewcrop 파일과 sublayout을 놓습니다. 실험을 저장합니다. </li><li> &quot;자동 실험 &#39;탭을 선택하고 이미지를 획득. </li></ol> 6. (ImageJ 1.46h 버전을 기반으로합니다.) 이미지 분석 <ol><li> 를 사용하여 독점 PerkinElmer을 변환합니다. 플렉스 파일은 태그가 지정된 이미지 형식으로. TIF 파일Flex2Volocity 그럼 아카펠라 스크립트. </li><li><ol><li> 스택의 결과, 이미지 시퀀스로 ImageJ에서 이미지를 가져옵니다. </li><li> Hyperstack 메뉴 항목에 이미지 / Hyperstack / 스택을 선택하여 2 채널 hyperstack에 스택을 변환합니다. 조각의 수는 수입 스택의 반으로 설정해야합니다. </li><li> 이미지 / 중복 명령을 사용하여 GFP 채널을 중복 : 중복 hyperstack 확인란을 선택합니다 및 채널 지정 : 1-1하십시오. 향후 중복 스택을 사용합니다. </li></ol></li><li> 프로세스를 선택 / 0.01 % 포화 픽셀과 대비를 향상, 스택 히스토그램을 사용하고 Image/Type/8-bit와 8 비트를 변환합니다. </li><li> 반대로 임계 값 (매개 변수 1) Q = 30으로 Bernsen 알고리즘을 사용하여 15 픽셀 반경 현지 적응 세분화를 정의합니다. 이미지 / 조정 / 자동 지역 임계 값 메뉴에서 검정색 배경 확인란에 흰색 개체을 선택합니다. </li><li> 세분화 품질 관리 : 원본 이미지에 분할 객체 윤곽 오버레이를 생성합니다. </li><li> Featu입자를 분석하여 추출 다시 : 측정 지역, 그리고 각 세포 기관의 총 강도. 결과 파일을 저장합니다. </li><li> R의 기능에 결과 파일을 열고 막대 그래프를 생성합니다. </li></ol> 7. 대표 결과 정상 상태에서는 Grb2은 전체 셀에 걸쳐 현지화되어 있습니다. 성장 인자 수용체의 자극하면 그것은 플라즈마 막에 translocates 및도 4에 도시 된 바와 같이 이후 endosomes에 internalized 있습니다. 바인딩 Grb2 할 수있는 세포 표면 수용체의 표현이 translocation을 유발하기에 충분합니다. 전형적인 심사 실험에서 GFP-Grb2 현지화에 변화가 관찰되지 않습니다. 그러나, 단백질이 표현 될 때 하위 휴대 사이트에 모집의 Grb2는 형광 현미경으로 쉽게 시각화 할 수 있습니다 현지화에 변화가 있다는 것을. endosome과 같은 구조로 GFP-Grb2의 relocalization에서 EGFR 결과의 예를 들어, 표현 (그림4). 따라서, 게놈 전체 라이브러리를 적용 할 때, 그것은 소설 Grb2 바인딩 세포 표면 단백질을 식별 할 수있는 예상 할 수 있습니다. 이 방법은 세포 표면 단백질의 검출에 국한되지 않습니다. 예를 들어, Dynamin2는 GFP-Grb2는 endosome과 같은 모집합니다 (그림 5) 표시의 하위 세포의 현지화에 변화를 유도한다. Dynamin2는 Grb2의 C-터미널 SH3 도메인에 바인딩이 복잡한 9,10의 endocytosis에 관한 일을하고있다. 따라서, 이러한 방식은 일반적으로 단백질 바인딩 단지의 식별을 가능하게하고 SH2 도메인에 대한 상호 작용 파트너의 식별에 국한되지 않습니다. translocation 여러 가지 종류가 다른 세포질 기공을 갖는 구조 또는 핵에가 endosomes하는 등 플라즈마 막에 현지화로 예상 할 수 있습니다. 따라서,이 모든 이미지도 눈으로 검사를하는 것이 좋습니다. 그러나, 많은 세트를 검사 할 때하는 것은 자동을 cDNAs이미지 분석 알고리즘이 더 실용적입니다. 이 경우, 알고리즘의 조합은 세포 모양 변경을 식별 할 수 shuttling 핵 및 일반 형태학 알고리즘을 식별 할 수 endosomes, 세포질 / 핵 감지를 식별 할 장소 검색으로 바람직하다. 서로 다른 phenotypic 검출 방법의 사용은 다른 11 개 상세하게 설명되어 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig1.jpg" /> 그림 1. 실험의 전체 구조. 실험 내용 cDNA 라이브러리의 증폭 및 준비, 무료 오픈 소프트웨어 IMAGEJ를 사용하여 cDNA 벡터 플러스 기자 구조, 이미지 수집 및 이미지 분석의 transfection으로 시작하는 완벽한 높은 콘텐츠를 검사 워크 플로우를. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig2.jpg" /> 에프Tecan 덱의 igure 2. 구성. (1) 왼쪽에 다섯 100 ML 골짜기는 버퍼 1 (40 ML), 2 (40 ML), 3 (50 ML), AW (60 ML)와 A4 (100 ML)로 가득해야합니다. 트로프의 A4는 절차를 수행하는 동안 한 번 다시 작성해야합니다. (2) 진공 매니 폴드는이 예에서 위치 14에 위치해 있습니다. (3) 세균 펠릿있는 deepwell 판은 25 ML의 용출 버퍼로 용출 버퍼 트로프 옆에 위치 30에 위치하고 있습니다. (4) 8 채널 머리에 일회용 팁 위치 40 작성해야하는 채널 머리를 왼쪽과 도움말에 팁 랙에로드해야합니다. 이 실험에 사용 된 Tecan FreedomEvo 액체 처리기는 500 μl 주사기가 구비되어 있습니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/4382/4382fig2large.jpg" target="_blank">더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig3.jpg" /> 그림오페라 LX에 이미지 수집 3. 자동화. A) 구성 탭 (1)을 선택합니다. 실험 (2)에 필요한 레이저 라인을 활성화합니다. 이미지 획득 (3)의 카메라를 선택합니다. 실험 (4)의 플레이트 종류와 목적 렌즈를 선택합니다. B) 현미경 탭 (1)을 선택합니다. 광원 및 노출 1 (2,3)에 대한 노출 시간을 정의합니다. 물론 하나를 집중와 높이 (4) 걸릴. C) 실험 정의 탭 (1)을 선택합니다. 드래그 앤 노출, skewcrop, 참조, 레이아웃 및 sublayout 파일 (2) 놓습니다. 드래그하고 실험 파일 (3) 놓습니다. D) 자동 실험 (1)를 선택합니다. 드래그 앤 실험 파일 (2) 놓습니다. 해당 바코드 (3) 할당합니다. 시작 버튼 (4)을 클릭하여 이미지 획득을 시작합니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/4382/4382fig3large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig4.jpg" /> <strocDNA 표현에 의한 것이다&gt; 그림 4. GFP-Grb2의 translocation. GFP-Grb2의 transmembrane의 성장 인자 수용체의 overexpression시 endosome과 같은 구조에 지배적 인 세포질 현지화에서 relocates과 이후 endosomes에 물질이. 왼쪽에서 COS M6 세포의 현미경 이미지는 transiently GFP-Grb2 (상단) 또는 GFP-Grb2 플러스 EGFR (아래)와 transfected 않은 표시됩니다. endosome과 같은 구조로 GFP-Grb2의 이전에 EGFR 결과의 공동 표현. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig5.jpg" /> 그림 5. GFP-Grb2의 cDNA 유발 translocation의 예. Grb2로 인한 endocytosis에 관여하는 GTPase Dynamin2는 endosome과 같은 구조 (원)에 GFP-Grb2을 relocates. 이 실험에서 GFP-Grb2는 HEK293T 셀에 DNM2와 공동으로 transfected되었습니다. 24 H 및 이미지는 Ope에 인수 된 후 셀은 Hoechst 33342 물들되었습니다RA LX. 하나의 녹색 (GFP) 채널의 시야와 UV (파란색, Hoechst 33342)이 표시됩니다.

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

표현 복제는 바이러스 수용체와 혈액 세포 항원 12 소설 세포 구성 요소를 식별하기 위해 과거에 사용 된 강력한 도구입니다. 여기, 우리는 Grb2에 바인딩 소설 putative 신호 전달 수용체의 식별을 용이하게하는 방법을 설명합니다. 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. <ol><li> 자동화 된 플라스미드 준비는 박테리아 펠렛의 완전한 resuspension가 절대적으로 중요합니다. 때때로, 그것은 엄격한 흔들림 단계 또는 피펫에 대한 추가 혼합을 포함 할 필요가 있습니다. </li><li> 솔루션 2와 3의 추가 후, 혼합 완료 필수적이며, 우리는 수동으로 반전 밀봉 된 판은 자동으로 흔드는의 사용을보다 효율적 것으로 나타났습니다. 이 DNA의 전단으로 이어질 것 같은 Pipetting이 단계에서 피해야한다. </li><li> 모든 진공 단계에서, 하나는 액체가 완전히 배수되어 있는지 확인합니다판에서. 그렇지 않으면 낮은 수율이 예상 할 수 있습니다. </li><li> 용출되면, 그것은 eluate는 플라스미드 바인딩 플레이트의 하단에있는 양식을 떨어 것이 매우 일반적입니다. 이 물방울 용출 판에서 수집 할 필요가 있으므로이 플라스미드 바인딩 플레이트가 신중하게 해제되어 하단에 잔여 물방울이주의 깊게 eluate 판으로 전송하는 것이 좋습니다. </li><li> transfection 동안, 복잡한 형성의 시간이 중요합니다. 우리는 보통 20-30 분을 준수합니다. 짧은 시간이 권장되지 않는 동안 한 H에 더 이상 시간까지는 생산량의 감소없이 잘됩니다. </li><li> 현미경의 경우 배율의 선택이 중요합니다. 여기에 사용 된 오페라 LX 시스템에서 20x의 해상도는 높은 품질의 이미지를 얻을 수 충분합니다. 높은 해상도의 이미지가 필요한 경우, 목표는 세포의 통계적으로 의미있는 번호를 받기 위해 변경하지만, 할 수 필드와 높은 수집 시간 더 많은 정보가 필요합니다. 일반적으로, 우리는 목표물론 당 이미지로 최소 100 세포를합니다. </li></ol> Grb2의 translocation 분석은 EGFR 키나아제 활성화 6 작은 분자 억제제를 식별하는 다른 그룹에 의해 사용되었습니다. 이 경우 EGFR은 특히 리간드는 플라즈마 막에 Grb2 모집의 원인으로 활성화됩니다. 이 상호 작용의 중단 그 다음 작은 분자 화합물을 사용하여 조사 할 수 있습니다. 마찬가지로, 그것은 siRNA 화면이 EGFR-Grb2 신호 또는 C-KIT 또는 erythropoietin 수용체와 같은 다른 Grb2 바인딩 성장 인자 수용체에 참여 내생 유전자를 식별하기 위해 고용 할 수 envisaged 할 수 있습니다. 따라서,이 기법에 대해 여러 가능성이 응용 프로그램이 있습니다. 유사한 접근 방식은 이러한 SHC, 갭 또는 IRS와 같은 다른 어댑터 분자에 대한 GFP 태그 기자 시스템에 적용 할 수 있습니다. 포유류의 세포에서이 셀 기반 분석을 사용하여 중 하나 큰 장점은 생리 학적으로 상대의 식별을 가능하게하는 것입니다evant 상호 작용을 확인할 수 있습니다. 분석은 단백질 복잡한 형성을위한 표시 장치이지만, 더 중요한 것은 관련 상호 작용이 올바른 하위 세포의 사이트에서 모니터링됩니다. 이런 점에서,이 기술은 효모 - 두 하이브리드 또는 체외 assays에서와 같은 다른 단백질 단백질 상호 작용 방법과 유물을 극복. 그것은 간접적 인 상호 작용도 Grb2 모집 될 수,하지만 주목해야한다. 마찬가지로, 바인딩 파트너의 전사까지 규제는 cDNA 식에 의해 유도 될 수 있습니다. 이러한 가능성을 구별하려면, 직접 및 간접 구속력 효과를 구별 할 수있는 적절한 보조 assays를 수행 할 필요가 있습니다. 결론적으로, GFP-어댑터 분자 translocation 분석은 게놈 전체 검사 및 약물 발견 응용 프로그램에 대한 높은 가능성을 약속드립니다.

<table border="1"><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> cDNA 라이브러리 </td><td> Origene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LB + A </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 가스 투과성의 물개 </td><td> ThermoScientific </td><td> AB-0718 </td><td></td></tr><tr><td> Nucleospin 96 플라스미드 키트 </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740625.4 </td><td></td></tr><tr><td> Transfectin </td><td> BioRad </td><td> 170-3351 </td><td></td></tr><tr><td> Hoechst33342 </td><td> 분자 프로브 </td><td> H3570 </td><td></td></tr><tr><td> Viewplate 96 F TC </td><td> PerkinElmer </td><td> 6005182 </td><td></td></tr><tr><td> RapidPick </td><td> 허드슨 강 </td><td></td><td> Norgren CP7200 </td></tr><tr><td> 자유 에보 (Evo) </td><td> Tecan </td><td></td><td> 진공 매니 폴드와 </td></tr><tr><td> Multidrop 384 </td><td> 열 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 오페라 LX </td><td> PerkinElmer </td><td></td><td></td></tr></table>

a high-content imaging workflow to study grb2 signaling complexes by expression cloning

성장 인자 수용체의 신호 전달은 확산과 차별화를 유지하는 셀을 위해 필수적이며, 꼭 컨트롤이 필요합니다. 신호 전달은 transmembrane 수용체 및 다운 스트림 신호 폭포의 활성화에 외부 리간드의 결합에 의해 시작됩니다. mitogenic 신호의 핵심 레귤레이터는 Grb2, 효소 활동을 부족이 SH3 도메인으로 둘러싸인 내부 SH2 (SRC의 호몰 로지 2) 도메인으로 구성된 모듈 단백질입니다. Grb2는 constitutively의 N-말단 SH3 도메인을 통해 GTPase 쟁이 Sevenless (SOS)와 연결되어 있습니다. Grb2의 SH2 도메인 따라서 SOS - 라스 - MAP 키나제 신호 캐스케이드에 수용체 활성화를 커플 링 phosphorylated 티로신 잔류 물에서 성장 인자 수용체에 바인딩합니다. 또한, 신호 및 수용체의 endocytosis의 긍정적이거나 부정적인 레귤레이터와 같은 Grb2에 대한 다른 역할이 설명되어 있습니다. Grb2의 모듈 구성은 수용체와 transduc의 다양한 고정 할 수 있습니다하는 것이 좋습니다e는 1-3 다른 경로의 수많은 따라 신호. 여기에서 설명하는 것은 플라즈마 막에 Grb2 모집을 모니터링하는 간단한 현미경 분석이다. 그것은 녹색 형광 단백질의 하위 세포의 현지화 (GFP) 태그 자극 4-6에 대응 Grb2의 변화를 측정하는 분석에서 구성된다. 이러한 활성화 표피 성장 인자 수용체로 Grb2을 구속 플라즈마 막 수용체 (EGFR) 플라즈마 cDNA 표현시 멤브레인 및 이후 셀에 endosomal 구획에 옮겨 놓을 방법을 모집 GFP-Grb2. Grb2의 생체 단백질 단지에 식별하기 위해이 기술은 Grb2 하위 세포 현지화의 변화에 따라 게놈 차원 높은 콘텐츠를 화면을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. cDNA 표현 클론, transfection 및 이미지 수집의 준비는 아래에 자세히 설명되어 있습니다. 이러한 효모 - 두 HY 등의 단백질 상호 작용 파트너를 식별하는 데 사용되는 다른 게놈 방법에 비해brid,이 기술은 간단한 현미경 기반의 분석에 의한 상호 작용의 하위 휴대 사이트에서 포유류의 세포에 단백질 단지의 시각화 할 수 있습니다. 따라서 이러한 현지화의 패턴을 둘 질적 기능뿐만 아니라 상호 작용의 양적 강도로서 평가 될 수있다.

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A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

관할 transmembrane 수용체를 신호 소설의 식별을위한 높은 콘텐츠를 심사 방법은 설명되어 있습니다. 이 방법은 대규모 자동화 의무가 있으며, 수에 대한 예측<em&gt; 생체 내</em&gt; 단백질 바인딩과 포유류의 세포에 단백질 단지의 하위 세포 현지화.

표현 복제가 Grb2 신호 복합 단지를 공부하기 위해 높은 콘텐츠 이미징 워크 플로우

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

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Nanyang Technological University

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Biology

10.6K 조회수.  University College London. 관할 transmembrane 수용체를 신호 소설의 식별을위한 높은 콘텐츠를 심사 방법은 설명되어 있습니다. 이 방법은 대규모 자동화 의무가 있으며, 수에 대한 예측 생체 내 단백질 바인딩과 포유류의 세포에 단백질 단지의 하위 세포 현지화.

비디오: A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular functions and events1, 2. Their spatiotemporally dynamic nature has been revealed by visualization of their activity and localization in real time3. In order to gain deeper understanding of their roles in diverse cellular functions at the molecular level, the next step should be perturbation of protein activities at a precise subcellular location and timing. 
To achieve this goal, we have developed a method for light-induced, spatio-temporally controlled activation of small GTPases by combining two techniques: (1) rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and (2) a photo-caging method of rapamycin. With the use of rapamycin-mediated FKBP-FRB heterodimerization, we have developed a method for rapidly inducible activation or inactivation of small GTPases including Rac4, Cdc424, RhoA4 and Ras5, in which rapamycin induces translocation of FKBP-fused GTPases, or their activators, to the plasma membrane where FRB is anchored. For coupling with this heterodimerization system, we have also developed a photo-caging system of rapamycin analogs. A photo-caged compound is a small molecule whose activity is suppressed with a photocleavable protecting group known as a caging group. To suppress heterodimerization activity completely, we designed a caged rapamycin that is tethered to a macromolecule such that the resulting large complex cannot cross the plasma membrane, leading to virtually no background activity as a chemical dimerizer inside cells6. Figure 1 illustrates a scheme of our system. With the combination of these two systems, we locally recruited a Rac activator to the plasma membrane on a timescale of seconds and achieved light-induced Rac activation at the subcellular level6.

A method for spatio-temporal control of small GTPase activity by light is described. This method is based on rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and photo-caging systems. Optimization of light-irradiation enables the spatio-temporally controlled activation of small GTPases at the subcellular level.

리빙 셀의 Subcellular 수준과 초 Timescale에 작은 GTPase 활동의 Spatio-시간적 조작

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

연구

생체공학

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

실시간, TCR의 동시 이미징 및 관련 신호 전달 단백질에 대한 TIRF 현미경 기법

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

면역학 및 감염병학

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

T 세포의 실시간 라이브 영상은 복잡한 형성을 신호

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and reactive moieties onto proteins directly in the live cell. Each ncAA is incorporated by a dedicated orthogonal suppressor-tRNA/amino-acyl-tRNA-synthetase (AARS) pair that is imported into the host organism. The incorporation efficiency of different ncAAs can greatly differ, and be unsatisfactory in some cases. Orthogonal pairs can be improved by manipulating either the AARS or the tRNA. However, directed evolution of tRNA or AARS using large libraries and dead/alive selection methods are not feasible in mammalian cells. Here, a facile and robust fluorescence-based assay to evaluate the efficiency of orthogonal pairs in mammalian cells is presented. The assay allows screening tens to hundreds of AARS/tRNA variants with a moderate effort and within a reasonable time. Use of this assay to generate new tRNAs that significantly improve the efficiency of the pyrrolysine orthogonal system is described, along with the application of ncAAs to the study of G-protein coupled receptors (GPCRs), which are challenging objects for ncAA mutagenesis. First, by systematically incorporating a photo-crosslinking ncAA throughout the extracellular surface of a receptor, binding sites of different ligands on the intact receptor are mapped directly in the live cell. Second, by incorporating last-generation ncAAs into a GPCR, ultrafast catalyst-free receptor labeling with a fluorescent dye is demonstrated, which exploits bioorthogonal strain-promoted inverse Diels Alder cycloaddition (SPIEDAC) on the live cell. As ncAAs can be generally applied to any protein independently on its size, the method is of general interest for a number of applications. In addition, ncAA incorporation does not require any special equipment and is easily performed in standard biochemistry labs.

A facile fluorescence assay is presented to evaluate the efficiency of amino-acyl-tRNA-synthetase/tRNA pairs incorporating non-canonical amino-acids (ncAAs) into proteins expressed in mammalian cells. The application of ncAAs to study G-protein coupled receptors (GPCRs) is described, including photo-crosslinking mapping of binding sites and bioorthogonal GPCR labeling on live cells.

사진-가교 매핑 및 라이브 포유류 세포에서 Bioorthogonal 화학 GPCRs에 프로브 화학의 유전 결합을 최적화

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and ...

화학

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

단일 분자 형광 현미경에 의한 수용체 역학의 고해상도 시공간 분석

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi) holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable cancer cell vulnerabilities. Limiting the potential of this technology is the inability to rapidly delineate the mechanistic basis of phenotypic outcomes and thus inform the development of molecularly targeted therapeutic strategies. We outline here methods to deconstruct cellular phenotypes induced by RNAi-mediated gene targeting using multiplexed reporter systems that allow monitoring of key cancer cell-associated processes. This high-content screening methodology is versatile and can be readily adapted for the screening of other types of large molecular libraries.

Achieving a systems level understanding of cellular processes is a goal of modern-day cell biology. We describe here strategies for multiplexing luciferase reporters of various cellular function end-points to interrogate gene function using genome-scale RNAi libraries.

배양 세포에서 암과 연관된 신호 전달을 심문위한 멀티 플렉스 루시 페라 기반 스크리닝 플랫폼

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

의학

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and sensitivity in cells because the resolution of conventional light microscopy is diffraction-limited to ~250 nm. By combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM), PPIs can be visualized in cells with single molecule sensitivity and nanometer spatial resolution. BiFC is a commonly used technique for visualizing PPIs with fluorescence contrast, which involves splitting of a fluorescent protein into two non-fluorescent fragments. PALM is a recent superresolution microscopy technique for imaging biological samples at the nanometer and single molecule scales, which uses phototransformable fluorescent probes such as photoactivatable fluorescent proteins (PA-FPs). BiFC-PALM was demonstrated by splitting PAmCherry1, a PA-FP compatible with PALM, for its monomeric nature, good single molecule brightness, high contrast ratio, and utility for stoichiometry measurements. When split between amino acids 159 and 160, PAmCherry1 can be made into a BiFC probe that reconstitutes efficiently at 37 &#176;C with high specificity to PPIs and low non-specific reconstitution. Ras-Raf interaction is used as an example to show how BiFC-PALM helps to probe interactions at the nanometer scale and with single molecule resolution. Their diffusion can also be tracked in live cells using single molecule tracking (smt-) PALM. In this protocol, factors to consider when designing the fusion proteins for BiFC-PALM are discussed, sample preparation, image acquisition, and data analysis steps are explained, and a few exemplary results are showcased. Providing high spatial resolution, specificity, and sensitivity, BiFC-PALM is a useful tool for studying PPIs in intact biological samples.

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM

Protein-protein interactions are visualized in cells with nanometer spatial resolution by combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM). Described here is the use of BiFC-PALM for imaging Ras-Raf interactions in U2OS cells for visualizing the nanoscale clustering and diffusion of individual Ras-Raf complexes.

이분자 형광 보완과 광 활성화 현지화 현미경 (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening (HTS) of random small molecule libraries against GPCRs is used by the pharmaceutical industry for target-specific drug discovery. In this study, an HTS was employed to identify novel small-molecule ligands of invertebrate-specific neuropeptide GPCRs as probes for physiological studies of vectors of deadly human and veterinary pathogens.
The invertebrate-specific kinin receptor was chosen as a target because it regulates many important physiological processes in invertebrates, including diuresis, feeding, and digestion. Furthermore, the pharmacology of many invertebrate GPCRs is poorly characterized or not characterized at all; therefore, the differential pharmacology of these groups of receptors with respect to the related GPCRs in other metazoans, especially humans, adds knowledge to the structure-activity relationships of GPCRs as a superfamily. An HTS assay was developed for cells in 384-well plates for the discovery of ligands of the kinin receptor from the cattle fever tick, or southern cattle tick, Rhipicephalus microplus. The tick kinin receptor was stably expressed in CHO-K1 cells.
The kinin receptor, when activated by endogenous kinin neuropeptides or other small molecule agonists, triggers Ca2+ release from calcium stores into the cytoplasm. This calcium fluorescence assay combined with a &#34;dual-addition&#34; approach can detect functional agonist and antagonist &#34;hit&#34; molecules in the same assay plate. Each assay was conducted using drug plates carrying an array of 320 random small molecules. A reliable Z&#39; factor of 0.7 was obtained, and three agonist and two antagonist hit molecules were identified when the HTS was at a 2 &#181;M final concentration. The calcium fluorescence assay reported here can be adapted to screen other GPCRs that activate the Ca2+ signaling cascade.

In this work, a high-throughput, intracellular calcium fluorescence assay for 384-well plates to screen small molecule libraries on recombinant G protein-coupled receptors (GPCRs) is described. The target, the kinin receptor from the cattle fever tick, Rhipicephalus microplus, is expressed in CHO-K1 cells. This assay identifies agonists and antagonists using the same cells in one "dual-addition" assay.

재조합 G 단백질 결합 수용체의 고처리량 스크리닝을 위한 "이중 첨가" 칼슘 형광 분석

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

생화학

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

이미징 단백질 - 단백질 상호 작용 생체내에</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

생물학

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly dependent on modes of single-cell analysis. Methods which deliver composite data reflecting the mean values of biomarkers from cell populations risk losing subpopulation dynamics that reflect the heterogeneity of the studied biological system. In keeping with this, traditional approaches are being replaced by, or supported with, more sophisticated forms of cellular assay developed to allow assessment by high-content microscopy. These assays potentially generate large numbers of images of fluorescent biomarkers, which enabled by accompanying proprietary software packages, allows for multi-parametric measurements per cell. However, the relatively high capital costs and overspecialization of many of these devices have prevented their accessibility to many investigators.
Described here is a universally applicable workflow for the quantification of multiple fluorescent marker intensities from specific subcellular regions of individual cells suitable for use with images from most fluorescent microscopes. Key to this workflow is the implementation of the freely available Cell Profiler software1&#160;to distinguish individual cells in these images, segment them into defined subcellular regions and deliver fluorescence marker intensity values specific to these regions. The extraction of individual cell intensity values from image data is the central purpose of this workflow and will be illustrated with the analysis of control data from a siRNA screen for G1 checkpoint regulators in adherent human cells. However, the workflow presented here can be applied to analysis of data from other means of cell perturbation (e.g., compound screens) and other forms of fluorescence based cellular markers and thus should be useful for a wide range of laboratories.

Presented is a flexible informatics workflow enabling multiplexed image-based analysis of fluorescently labeled cells. The workflow quantifies nuclear and cytoplasmic markers and computes marker translocation between these compartments. Procedures are provided for perturbation of cells using siRNA and reliable methodology for marker detection by indirect immunofluorescence in 96-well formats.

높은 콘텐츠, 오픈 소스 소프트웨어에 의해 지원되는 범용 현미경 데이터에서 형광 마커, 개별 셀 정량화를위한​​ 워크 플로우

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

표현 복제가 Grb2 신호 복합 단지를 공부하기 위해 높은 콘텐츠 이미징 워크 플로우

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