우리는 읽고 원고를 편집 브래드 Lackford 감사드립니다. 이 연구는 환경 건강 과학, 건강 교내 연구 프로그램 Z01ES102745 국립 연구소 (GH까지)의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

1. Oct4GiP 마우스 ES 세포 유지 보수 Oct4GiP 전지는 친절 박사 오스틴 스미스에 의해 제공되었다. 그들은 Oct4-GFPiresPac transgene 4,5 들고 129/Ola 마우스에서 파생되었다. 그들은 ESGRO 전체 더하기 clonal 학년 중간 (Millipore), 또는 M15 매체의 젤라틴 코팅 조직 배양 플레이트에 유지됩니다 DMEM (Invitrogen)은 15% FBS, 1000 U / ML ESGRO (Millipore), 1X 비로 보충 필수 아미노산 (Invitrogen), 1X EmbryoMax Nucleasides (Millipore) 및 10 μm의 β-메르 캅 토 에탄올. <ol><li> 30 분간 실온에서 0.1 % 젤라틴 (시그마) (0.1 ML 젤라틴 용액 / cm 2)와 코트 판. </li><li> 플레이트 Oct4GiP의 ~ 2시 젤라틴 코팅 접시에있는 세포 × 10 4 / cm 2. </li><li> 0.05 %의 트립신과 함께 이틀 세포를 분할. </li></ol> 2. Oct4GiP 셀에서 siRNA의 Transfection Oct4GiP 기자 분석은 대부분의 convenien입니다M15 매체 또는 접시 384도 (코닝 또는 BD) - tly 젤라틴 코팅 평평한 바닥에서 96 실시. 전체 절차는 그림 1에 설명되어있다. <ol><li> siRNA - 지질 단지 어셈블리 : <ol><li> 96 - 웰 플레이트에 transfection 들어, U-바닥에 siRNA - 지질 단지 96 - 웰 플레이트를 조립. </li><li> 각 우물로, 10 μl OptiMEM (Invitrogen)와 0.3 μl Lipofectamine 2000 (Invitrogen)를 혼합하고 5 분 동안 상온에서 품어. </li><li> 지질 OptiMEM 혼합물에 5 pmol siRNA를 추가하고 또 다른 15 분 동안 품어. siRNA : 6ul : 지질 비율이 100 pmol입니다. </li><li> 멀티 채널 피펫으로 젤라틴 코팅 평면 바닥 판으로 U-맨 아래 판에서 OptiMEM의 siRNA-지질 단지를 전송합니다. </li><li> 384 잘 접시에 transfection 들어, 0.1 μl Lipofectamine 2000 및 10 μl OptiMEM 2 pmol siRNA를 이용하여 siRNA - 지질 단지를 준비합니다. </li></ol></li></ol> 참고 : 최종 siRNA 농도의transfections 50 nm의입니다. 3-4 생물 학적을 수행하면 각 siRNA의 transfection을 위해 복제합니다. 플랫 바닥 젤라틴 코팅 플레이트로 U-바닥 플레이트와 나누어지는의 siRNA-지질 단지의 마스터 섞어 설정합니다. <ol start="2"><li> Oct4GiP 전지 도금 및 transfection : <ol><li> 96 - 웰 플레이트에 transfection 내용 Oct4GiP 세포를 수집 및 9 X 10 4 셀 / ML에 신선한 M15 매체에서 그들을 resuspend. </li><li> 잘 멀티 채널 피펫을 사용하여 각 세포 현탁액을 100 μl를 추가합니다. </li><li> 3-5 번 아래로 pipeting 및하여 우물에 사전 aliquoted siRNA-lipids의 단지와 세포 현탁액을 섞는다. 다른 siRNA의 transfections 대한 정보를 변경합니다. </li><li> 384 잘 번호판, resuspend의 Oct4GiP 세포의 Transfection을 위해 6 X 10 4 셀 / 각도에 대한 ML 및 나누어지는 30 μl 세포 현탁액. </li></ol></li></ol> 참고 : 최적의 셀 도금 밀도는 일반적으로 3 × 10 5 세포 / ㎝ 2입니다하지만 m불안하다는 크게 세포 성장이나 생존에 영향을 siRNAs에 대한 최적화가 필요합니다. 낮은 도금 밀도는 transfection 동안 가난한 세포 생존으로 이어질 것입니다. 높은 도금 밀도가 높은 세포 합류 유도 차별화에 의한 높은 배경으로 이어질 것입니다. 만약 2-4 × 10 5 세포 / ㎝ 2 사이의 필요한 테스트 도금 밀도. <ol start="3"><li> 매체 변화 : <ol><li> 다중 채널 흡인기 (코닝) 또는 진공 지팡이 (VP-학술)을 사용하여 오래된 매체를 제거합니다. 접시의 바닥에 전지를 긁히지 않게 조심해라. </li><li> 매일 멀티 채널 피펫을 사용하여 신선한 ES 세포 매체 (384 잘 접시 96 - 웰 플레이트에서 30 μl 100 μl)으로 세포를 먹이. </li></ol></li></ol> 3. FACS 분석 <ol><li> 세포 분열 : <ol><li> 나흘 transfection 후, 멀티 채널 흡인기 (코닝) 또는 진공 지팡이 (VP-학술)을 사용하여 매체를 제거합니다. </li><li> 96 - 웰 플레이트 들어, 100μ으로 한 세포를 헹굼리터 PBS. </li><li> 잘 멀티 채널 피펫을 사용하여 각 25 μl 0.25 %의 트립신을 추가합니다. </li><li> 가끔 교반과 오분 동안 상온에서 부화하고, 시각 세포의 완전한 분리를 보장하기 위해 검사한다. </li><li> 트립신을 inactivate 반복 pipetting하여 단일 세포 현탁액으로 세포를 떼어 놓다 10 % FBS와 PBS의 90 μl를 추가합니다. </li><li> 384 잘 접시의 경우 10 % FBS와 30 μl PBS 갖춘 10 μl 트립신과 끄지으로 세포를 끊을. </li></ol></li><li> FACS 분석 : <ol><li> HTS 유닛 또는 기타 유사 시설의 FACS 분석기 (예 : Accuri 또는 Intellicyt 등)을 갖춘 BD LSRII FACS 분석기에서 GFP의 형광 분석. </li><li> HTS의 높은 처리량 모드를 사용하여 세포 현탁액의 10 μl를 분석합니다. 1.0 X 10 4 세포로 카운트 임계값을 설정합니다. </li><li> 앞으로 대 사이드 분산형 음모에 세포를 캡처하는 PMT 전압과 임계값을 조정합니다. forw에서 라이브 세포 인구를위한 게이트ARD 대 사이드 분산형 계획. </li><li> GFP 채널에 대한 히스토그램 플롯을 만듭니다. 세포 ~ 10 %는 모방이나 제어 siRNA transfected 세포에 GFP-음수로 표시되도록 GFP 채널의 게이트를 설정합니다. </li><li> % 차별화된 세포 세포 = %의 GFP-음성 : 각 치료에서 % GFP-음성 세포를 결정합니다. 2 꼬리 T-테스트를​​ 사용하여 실험 및 제어 siRNA의 transfections 사이 % 차별화된 세포를 비교하고, P-값 &lt;0.01로 긍정적인 안타를 득점. </li></ol></li></ol> 4. 대표 결과 Oct4, Nanog, 그리고 Sox2는 ES 세포 자기 갱신 6,7,9-11의 유지에 중요한 역할을 세 유전자 있습니다. 그림 Oct4GiP 기자 분석이 쉽게 이러한 요인을 입을으로 인한 차별을 감지할 수있는이 공연 Oct4GiP ES 세포. 그림 2A는 ES로 유지하면 Oct4GiP의 ES 세포는 GFP-양수 보여줍니다<html> . 그림 2B 세포는 앞으로 대 측면 분산형 계획 및 제어 또는 Oct4-siRNAs로 transfected Oct4GiP 세포의 GFP 채널의 히스토그램을 보여줍니다. 죽은 세포와 파편 GFP-음성이며 배경을 증가하므로 그것은 앞으로 대 측면 분산형 플롯에서 라이브 세포에 대한 게이트가 필요합니다. 한편, 가능한 세포 대단히 짧은 시간을 제외하도록 차별을 이중어 항상 필요하지 않습니다. 제어 siRNA transfected 세포에서는 세포의 대부분은 GFP 양성해야합니다. 명백한 GFP - 부정적인 인구가 제어 siRNA transfected 우물에있는 경우, 시작 Oct4GiP 세포 또는 transfection 절차가 손상되었을 수 있으며 결과는 interpretable되지 않을 수 있습니다. 그림 2C는에서 % 차별화된 세포 (% 차별화된 세포 = % GFP-음성 세포)의 막대 그래프를 보여줍니다 제어, Oct4-, Nanog-, 그리고 Sox2-siRNA transfected 세포. <html> d/3987/3987fig1.jpg &quot;/&gt; 1 그림. Oct4GiP 기자 분석의 개요. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3987/3987fig2.jpg" /> 그림 2. Oct4GiP 기자 분석은 Nanog, Oct4, Sox2 또는 입을 의한 ES 세포 분화를 검색할 수 있습니다. ) E14Tg2a (야생 형, 블랙 라인) 및 Oct4GiP (녹색 라인) 세포는 FACS로 분석되었다. GFP 채널의 히스토그램은 Oct4GiP 세포가 GFP 양성한지 확인하십시오. B) Oct4GiP 세포는 제어 또는 Oct4-siRNA와 96 - 웰 플레이트에 transfected와 FACS는 사일 transfection 후 분석했다 보여줍니다. 앞으로 transfected 세포의 GFP 채널의 측면 분산형 플롯과 histograms 수와 같습니다. C)가 Oct4GiP 전지로 transfected되었다 제어, Nanog -, Oct4-, 또는 Sox2-siRNA. % 차별화된 세포는 % 사일 transfection 후 세포가 GFP-음성으로 결정되었고, + / - 뜻으로 꾸몄다되었다 - 평균의 표준 오차 (N = 4).F = &quot;https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/3987/3987fig2large.jpg&quot;대상 = &quot;_blank&quot;&gt; 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Cell Biol. 9, 625-635 (2007).</li><li>Mitsui, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homeoprotein+Nanog+is+required+for+maintenance+of+pluripotency+in+mouse+epiblast+and+ES+cells.">The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells.</a> Cell. 113, 631-642 (2003).</li><li>Fazzio, T. G., Huff, J. T., Panning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNAi+screen+of+chromatin+proteins+identifies+Tip60-p400+as+a+regulator+of+embryonic+stem+cell+identity.">An RNAi screen of chromatin proteins identifies Tip60-p400 as a regulator of embryonic stem cell identity.</a> Cell. 134, 162-174 (2008).</li><li>Pease, S., Braghetta, P., Gearing, D., Grail, D., Williams, R. 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관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

우리가 위에서 설명 Oct4GiP 기자 분석은 정량적 자기 갱신 대 분화의 정도를 측정할 수 있습니다. 이러한 형태학 기반의 12 확산 / assays 생존 기반과 같은 다른 가능한 방법, 비교, 그것은 높은 감도 및 처리량뿐만 아니라 ES 세포 상태의 더 직접적인 측정을 제공합니다. 그것은 따라서 잘 대형 스크린 및 유전자 epistasis 분석에 적합합니다. 실제로, 우리는 다른 사람이 성공적으로 게놈 전체의 RNAi 화면 3,8에 대한 Oct4GiP 기자 분석을 사용 하였다. 모든 assays처럼, 그러나 그것은 또한 제한 사항이 있습니다. 그것은 직접 또는 간접적으로 Oct4 프로 모터의 활동을 조절하는 유전자를 공부하고 그것이 거짓으로 사후 transcriptionally GFP 발현, 안정성, 또는 기능에 영향을 미치는 유전자를 식별할 수 사용될 수 있습니다. 따라서 추가적인 assays 또는 알칼리성 인산 가수 분해 효소의 염색법 13 (Millipore, SCR004)과 immunofluorescence 염색법이나 정량 RT와 같은 보조 스크린,pluripotency 마커-PCR은 3,8,12,14이 방법에서 얻은 결과를 확인하기 위해 필요합니다. Oct4GiP 기자 분석은 효율적인 유전자 입을에 의존합니다. 효과적인 siRNAs하고 효율적인 siRNA를 transfections는 분석의 성공의 열쇠입니다. Google은 siRNA의 transfections 가진 기자 분석의 사용을 설명했지만, 분석도 침묵하거나 관심 overexpress 유전자로 DNA를 transfections으로 수행할 수 있습니다. DNA를 transfection 효율 siRNAs의 그것보다 일반적으로 낮은과 표현형의 강도를 줄일 수 있습니다. 무엇이 프로토콜에서 설명되었다 외에 Oct4GiP 기자 분석은 부정뿐만 아니라 자기 갱신을 조절 유전자를 식별 및 특성화를 위해 수정할 수 있습니다. 이 경우, 세포가 siRNAs로 transfected 수 있으며, 분화 조건에서 배양해. 자기 갱신의 부정적인 규제의 입을 것은 자기 갱신을 개선하고 D가 될 수 GFP 발현을 유지할 것이다마찬가지로 현재의 프로토콜에 설명된 FACS에 의해 etected. Oct4GiP 기자 세포 외에 같은 Nanog-GFP 15-18 (Millipore, SCR089)와 Rex1-GFP 19 전지와 같은 ES 세포 특정 발기인를 사용하여 다른 기자 셀 라인도 생성되었습니다. 그들은 또한 동일한 전략을 사용하여 ES 세포 자기 갱신과 유지 보수를 공부하는 데 사용할 수 있습니다. 이 ES 세포 마커 유전자 발기인의 활동과 특이성에 눈에 띄는 차이점이 있기 때문에 그러나 이러한 기자 셀 라인은 백그라운드 레벨 및 감도 면에서 다르게 행동하기 때문에 서로를 보완합니다. 마지막으로, 다른 혈통 특정 기자의 ES 세포 라인을 사용하여, 우리의 전략은 ES 세포의 운명 - 사양을 연구하고 포유류의 초기 개발을위한 체외 모델에서와 같은 ES 세포의 사용을 촉진하기 수정할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> ESGRO 완전한 플러스 clonal 등급 매체 </td><td> Millipore </td><td> SF001-500P </td></tr><tr><td> DMEM (높은 포도당 1X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11,965 </td></tr><tr><td> 0.25 % 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Invitrogen </td><td> 25,200 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 1,001,817 </td></tr><tr><td> OPTI-MEM (혈청 매체를 줄이기) </td><td> Invitrogen </td><td> 31,985 </td></tr><tr><td> ESGRO mLIF (10 7 units/1ml) </td><td> Millipore </td><td> DAM1776540 </td></tr><tr><td> MEM NEAA (비 필수 아미노산) </td><td> Invitrogen </td><td> 11,140 </td></tr><tr><td> ES 세포에 대한 100x Nucleosides </td><td> Millipore </td><td> 10620-1 </td&gt; </tr><tr><td> 2 - 메르 캅 토 에탄올 </td><td> 시그마 </td><td> M7522-100ml </td></tr><tr><td> ES-자격 태아 소 혈청 </td><td> Invitrogen </td><td> 10,437 </td></tr><tr><td> Nanog의 siRNA </td><td> Invitrogen </td><td> MSS231181 </td></tr><tr><td> Oct4 siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> D-046256-02 </td></tr><tr><td> Sox2의 siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> M-058489-01 </td></tr></tbody></table> 제어 siRNA : Dharamcon에 의해 합성 반딧불 루시페라제을 (5&#39;-CGTACGCGGAATACTTCGA) 대상으로 s​​iRNA의 이중.

oct4gip reporter assay to study genes that regulate mouse embryonic stem cell maintenance and self-renewal

Pluripotency과 자기 갱신은 배아 줄기 세포의 두 정의 특성 (ES 세포)입니다. 기본적인 분자 메커니즘을 이해하는 것은 크게 발달 생물학 연구, 질병 모델링, 약물 발견 및 재생 의료 (1,2 년 검토)의 ES 세포의 사용을 촉진합니다. ES 세포 유지 및 자기 갱신의 소설 규제의 식별 및 특성을 신속하게하기 위해 우리는 양적 Oct4GiP 세포에게 3을 사용 마우스 ES 세포의 자기 갱신 상태를 측정하는 형광 리포터 기반의 분석을 개발했습니다. Oct4GiP 전지는 4,5 Oct4 유전자 프로 모터 영역의 통제하에 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현. Oct4는 차별 6,7 중에 ES 세포 자기 갱신이 필요합니다, 그리고 고도의 ES 세포에 표현되며, 빠르게 아래쪽 규제. 그 결과, 기자 세포에서 GFP 발현과 형광 성실하게 상호ES 세포 정체성 5 및 형광 - 활성 셀 정렬과 (FACS) 분석 밀접하게 단세포 레벨 3,8에서 세포의 자기 갱신 상태를 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. RNAi와 결합, Oct4GiP 기자 분석은 신속 ES 세포 유지 및 자기 갱신 3,8의 규제를 파악하고 공부하는 데 사용할 수 있습니다. 자기 갱신을 시금위한 다른 방법과 비교했을 때, 그것은 더 편리하고 민감한, 양적, 그리고 낮은 비용입니다. 이러한 높은 처리량 화면 또는 유전자 epistasis 분석과 같은 대규모 연구 또는 접시 384 - 잘 - 그것은 96에 실시 할 수 있습니다. 마지막으로, 다른 혈통 특정 기자의 ES 세포 라인을 사용하여, 우리가 여기서 설명하는 분석도 ES 세포 분화 동안 운명 사양을 공부하고 수정할 수 있습니다.

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Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

우리는 신속하게 식별하고 마우스 배아 줄기 세포 유지 및 자기 갱신을 조절 유전자를 특성화하기 위해 형광 기자 분석을 설명합니다.

마우스 배아 줄기 세포 유지 보수 및 자체 갱신을 조절 유전자를 공부하는 Oct4GiP 리포터 분석

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will ...

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10.4K 조회수.  National Institute of Environmental Health Sciences. 우리는 신속하게 식별하고 마우스 배아 줄기 세포 유지 및 자기 갱신을 조절 유전자를 특성화하기 위해 형광 기자 분석을 설명합니다.

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An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C

Embryonic stem (ES) cells have the potential to differentiate into any of the three germ layers (endoderm, mesoderm, or ectoderm), and can generate many lineages for regenerative medicine. ES cell culture in vitro has long been the subject of widespread concerns. Classically, mouse ES cells are maintained in serum and leukemia inhibitory factor (LIF)-containing medium. However, under serum/LIF conditions, cells show heterogeneity in morphology and the expression profile of pluripotency-related genes, and are mostly in a metastable state. Moreover, cultured ES cells exhibit global hypermethylation, but na&#239;ve ES cells of the inner cell mass (ICM) and primordial germ cells (PGCs) are in a state of global hypomethylation. The hypomethylated state of ICM and PGCs is closely associated with their pluripotency. To improve mouse ES cell culture methods, we have recently developed a new method based on the selectively combined utilization of two small-molecule compounds to maintain the DNA hypomethylated and pluripotent state. Here, we present that the co-treatment of vitamin C (Vc) and PD0325901 can erase about 90% of 5-methylcytosine (5mC) at 5 days in mouse ES cells. The generated 5mC content is comparable to that in PGCs. The mechanistic investigation shows that PD0325901 up-regulates Prdm14 expression to suppress Dnmt3b (de novo DNA methyltransferase) and Dnmt3l (the cofactor of Dnmt3b), by reducing de novo 5mC synthesis. Vc facilitates the conversion of 5mC to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) catalyzed mainly by Tet1 and Tet2, indicating the involvement of both passive and active DNA demethylations. Moreover, under Vc/PD0325901 conditions, mouse ES cells show homogeneous morphology and pluripotent state. Collectively, we propose a novel and chemical-synergy culture method for achieving DNA hypomethylation and maintenance of pluripotency in mouse ES cells. The small-molecule chemical-dependent method overcomes the major shortcomings of serum culture, and holds promise to generate homogeneous ES cells for further clinical applications and researches.

We described in detail two chemical-based protocols for culturing mouse embryonic stem cells. This new method utilizes synergistic mechanisms of promoting Tet-mediated oxidation (by vitamin C) and repressing de novo synthesis of 5-methylcytosine (by PD0325901) to maintain DNA hypomethylation and pluripotency of mouse embryonic stem cells.

MEK 억제제 PD0325901와 비타민 C를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포의 게놈 Hypomethylation 유지 하는 대안 문화 방법

Embryonic stem (ES) cells have the potential to differentiate into any of the three germ layers (endoderm, mesoderm, or ectoderm), and can generate many ...

연구

생화학

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

트랜스포존 시스템을 사용하여 마우스 양수 세포로부터 다 능성 줄기 세포의 제조

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

발생학

Generating iPS Cells from MEFS through Forced Expression of Sox-2, Oct-4, c-Myc, and Klf4

Pluripotency can be induced in differentiated murine by viral transduction of Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc (Takahashi and Yamanaka, 2006; Wernig, et al., 2007; Okita, et al., 2007; Maherali, et al., 2007). We have devised a reprogramming strategy in which these four transcription factors are expressed from doxycycline (dox)-inducible lentiviral vectors (Brambrink et al., 2008). Using these inducible constructs, we can derive induced pluripotent stem (iPS) cells from mouse embryonic fibroblasts (MEFs). In this video, we demonstrate the procedure for the generation of inducible lentiviruses that express the four transcription factors and show how to infect MEFs with these viruses in order to produce iPS cells. By using inducible lentiviruses, the expression of the four factors in controlled by the addition of doxycyline to the culture medium. The advantage of this system over the traditional retroviral infection is the ability to turn the genes on and off so that the kinetics of reprogramming and gene expression requirements can be analyzed in detail.

This video shows the procedure for generating induced pluripotent stem cells using inducible lentivirus that express Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4.

삭스 - 2의 강제 표현을 통해 MEFS에서 IPS 세포를 생성, 10 - 4, C - Myc, 그리고 Klf4

Pluripotency can be induced in differentiated murine by viral transduction of Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc (Takahashi and Yamanaka, 2006;  Wernig, et al., ...

생물학

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been described, termed &#34;na&#239;ve&#34; and &#34;primed&#34; pluripotency. The mechanisms that control na&#239;ve-primed transition are poorly understood. In particular, we remain poorly informed about protein kinases that specify na&#239;ve and primed pluripotent states, despite increasing availability of high-quality tool compounds to probe kinase function. Here, we describe a scalable platform to perform targeted small molecule screens for kinase regulators of the na&#239;ve-primed pluripotent transition in mouse ESCs. This approach utilizes simple cell culture conditions and standard reagents, materials and equipment to uncover and validate kinase inhibitors with hitherto unappreciated effects on pluripotency. We discuss potential applications for this technology, including screening of other small molecule collections such as increasingly sophisticated kinase inhibitors and emerging libraries of epigenetic tool compounds.

Here, we present a quantitative and scalable protocol to perform targeted small molecule screens for kinase regulators of the na&#239;ve-primed pluripotent transition.

높은 처리량 억제제 스크리닝에 의한 배아 줄기 세포의 다 능성을 조절하는 키나제를 확인하는 간단한 방법

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of the cell and often consist of multiple functional domains, which can be influenced by posttranslational modifications. The depletion of the entire protein in conditional or constitutive knock-out (KO) mice does not take into account this functional diversity and regulation. An mESC line and a derived mouse model, in which a docking site for FLPe recombination-mediated cassette exchange (RMCE) was inserted within the ROSA26 (R26) locus, was previously reported. Here, we report on a structure-function approach that allows for molecular dissection of the different functionalities of a multidomain protein. To this end, RMCE-compatible mice must be crossed with KO mice and then RMCE-compatible KO mESCs must be isolated. Next, a panel of putative rescue constructs can be introduced into the R26 locus via RMCE targeting. The candidate rescue cDNAs can be easily inserted between RMCE sites of the targeting vector using recombination cloning. Next, KO mESCs are transfected with the targeting vector in combination with an FLPe recombinase expression plasmid. RMCE reactivates the promoter-less neomycin-resistance gene in the ROSA26 docking sites and allows for the selection of the correct targeting event. In this way, high targeting efficiencies close to 100% are obtained, allowing for insertion of multiple putative rescue constructs in a semi-high throughput manner. Finally, a multitude of R26-driven rescue constructs can be tested for their ability to rescue the phenotype that was observed in parental KO mESCs. We present a proof-of-principle structure-function study in p120 catenin (p120ctn) KO mESCs using endoderm differentiation in embryoid bodies (EBs) as the phenotypic readout. This approach enables the identification of important domains, putative downstream pathways, and disease-relevant point mutations that underlie KO phenotypes for a given protein.

Proteins often contain multiple domains that can exert different cellular functions. Gene knock-outs (KO) do not consider this functional diversity. Here, we report a recombination-mediated cassette exchange (RMCE)-based structure-function approach in KO embryonic stem cells that allows for the molecular dissection of various functional domains or variants of a protein.

재조합 효소 매개 카세트 교환을 사용하여 마우스 배아 줄기 세포의 구조 - 기능 연구

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc, and Klf4 is capable of inducing pluripotency in mouse fibroblasts.1 Subsequent reports have demonstrated the utility of the doxycycline (DOX) inducible lentiviral delivery system for the generation of both primary and secondary iPS cells from a variety of other adult mouse somatic cell types.2,3
Induced pluripotent stem (iPS) cells are similar to embryonic stem (ES) cells in morphology, proliferation and ability to induce teratoma formation. Both types of cell can be used as the pluripotent starting material for the generation of differentiated cells or tissues in regenerative medicine.4-6 iPS cells also have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming mouse embryonic fibroblast (MEF) cells with the Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set. We also demonstrate that the Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set is capable of expressing each of the four transcription factors upon transduction into MEFs thereby inducing a pluripotent stem cell state that displays the pluripotency markers characteristic of ES cells.

The Stemgent Dox Inducible Mouse TF Lentivirus Set can reprogram mouse embryonic fibroblasts (MEFs) to induced pluripotent stem (iPS) cells. Here we demonstrate the protocol for DOX-inducible expression of mouse reprogramming transcription factors Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc to generate iPS colonies that express common mES pluripotency markers.

4 전사 인자와 마우스 배아 섬유아 세포를 프로그래밍하여 유도 Pluripotent 줄기 세포의 생성, Doxycycline는 Lentiviral 전달 시스템 Inducible

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and ...

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and activation of the LIF/JAK/STAT3 pathway is not absolutely required to maintain the self-renewal state.2 The SC1 small molecule may be an economical alternative to LIF. SC1 functions through dual inhibition of Ras-GAP and ERK1.3 Illustration of its mechanism of action makes it a useful tool to study the fundamental molecular mechanism of self-renewal. Here we demonstrate the procedure for culturing mouse ES cells in the presence of SC1 and show that they are able to maintain self-renewal in the absence of LIF. Cells cultured with SC1 showed similar morphology compared to cells maintained with LIF. Both exhibited typical mouse ES morphology after five passages. Expression of typical pluripotency markers (Oct4, Sox2, Nanog, and SSEA1) was observed after five passages in the presence of SC1. Furthermore, SC1 caused no overt toxicity on mouse ES cells.

The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

SC1 functions through dual inhibition of Ras- GAP and ERK1. We tested the function of SC1 in supporting mouse ES cell self-renewal in the absence of LIF and showed that SC1 is able to maintain self-renewal of mouse ES cell cultures.

난생의 부재에서 자기 갱신 mESC를 지원하기 위해 SC1 (Pluripotin)의 사용

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and ...

Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways. One of the hurdles to its understanding has been the varied methods in correlating changes of key signaling events to differentiation efficiency. We describe here the use of a mouse embryonic stem (ES) cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. By scoring for contracting embryonic bodies (EBs) in a 96-well plate format, we can quickly quantify cardiogenic efficiency and identify crucial time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation in a time course following specific modulator treatments. The principal outlined here is not limited to cardiac induction alone, and can be applied towards the study of many other cell lineages. In addition, the 96-well format has the potential to be further developed as a high throughput, automated assay to allow for the testing of more sophisticated experimental hypotheses.

We describe the use of a mouse ES cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&#946;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. The method provides a standardized platform that reliably quantifies cardiogenic efficiency, and it is applicable to the study of other cell lineages.

Cardiogenic 유도 효율을 Quantifying에 대한 수정 마우스 배아의 줄기 세포 기반 어세이

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways.  One of the hurdles ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

정량적 RT-PCR에 의해 개별 인간 배아 줄기 세포를 프로파일 링

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Cell Surface Marker Mediated Purification of iPS Cell Intermediates from a Reprogrammable Mouse Model

Mature cells can be reprogrammed to a pluripotent state. These so called induced pluripotent stem (iPS) cells are able to give rise to all cell types of the body and consequently have vast potential for regenerative medicine applications. Traditionally iPS cells are generated by viral introduction of transcription factors Oct-4, Klf-4, Sox-2, and c-Myc (OKSM) into fibroblasts. However, reprogramming is an inefficient process with only 0.1-1% of cells reverting towards a pluripotent state, making it difficult to study the reprogramming mechanism. A proven methodology that has allowed the study of the reprogramming process is to separate the rare intermediates of the reaction from the refractory bulk population. In the case of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we and others have previously shown that reprogramming cells undergo a distinct series of changes in the expression profile of cell surface markers which can be used for the separation of these cells. During the early stages of OKSM expression successfully reprogramming cells lose fibroblast identity marker Thy-1.2 and up-regulate pluripotency associated marker Ssea-1. The final transition of a subset of Ssea-1 positive cells towards the pluripotent state is marked by the expression of Epcam during the late stages of reprogramming. Here we provide a detailed description of the methodology used to isolate reprogramming intermediates from cultures of reprogramming MEFs. In order to increase experimental reproducibility we use a reprogrammable mouse strain that has been engineered to express a transcriptional transactivator (m2rtTA) under control of the Rosa26 locus and OKSM under control of a doxycycline responsive promoter. Cells isolated from these mice are isogenic and express OKSM homogenously upon addition of doxycycline. We describe in detail the establishment of the reprogrammable mice, the derivation of MEFs, and the subsequent isolation of intermediates during reprogramming into iPS cells via fluorescent activated cells sorting (FACS).

Mouse embryonic fibroblast can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells at low efficiency by the forced expression of transcription factors Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. The rare intermediates of the reprogramming reaction are FACS isolated via labeling with antibodies against cell surface makers Thy-1.2, Ssea-1, and Epcam.

재 프로그래밍 가능한 마우스 모델에서 유도 만능 줄기 세포 중간체의 세포 표면 마커 중재 정화

Mature cells can be reprogrammed to a pluripotent state. These so called induced pluripotent stem (iPS) cells are able to give rise to all cell types of ...