NIH 그랜트 R01EY016099 및 실명 경력 개발 상을 방지하기 위해 연구 : 본 연구는 건강의 국립 연구소 (NIH) 코어 그랜트 (5P30EY008098) 다음과 같은 자금 XW에 의해 지원되었다. 우리는 공촛점 이미징에 도움 키라 라스럽 감사합니다.

1 일. 준비 1. 물고기 십자가를 설정 저녁에 zebrafish의 pairwise 교차를 설정합니다. 원하는 시간 전에 무작위로 교배를 방지하기 위해 짝짓기 카세트에서 암컷과 수컷 물고기를 구분하는 디바이더를 사용합니다. GFP - 표현 유전자 변형 물고기 것은 기증자 blastomeres의 소스로 사용됩니다. pt104 유전자 변형 라인 (Zou 외., 2008), 여기에 사용 EF1 모터의 제어하에 ubiquitously GFP를 표현합니다. GFP의 표현이 라이브 영상으로 기증자 세포의 시각화 수 있습니다. 적합한 형광 단백질을 표현하는 다른 유전자 변형 물고기 라인은 특정 요구에 맞게 사용할 수 있습니다. 2. 배아 보관을위한 쐐기 모양의 아가로 오스 웰스 준비 페트리 접시에 E3 계란 물 (웨스 터, 2007)에서 준비 녹아 1퍼센트 아가로 오스를, 하거라. 아가로 오스 솔루션 쐐기 모양의 라고나할까요을 가지고 있으며, 아가로 오스 솔루션이 완전히 응고하게 플라스틱 금형을 플로트. 자세히 곰팡이를 제거하고 E3 물과 아가로 오스 침대 젖어. 3. 이식의 바늘을 준비 유리 모세관 pipettes (세계 정밀 악기)를 당겨 바늘을 만들 11.5 설정을 전원에서 수직 니들 풀러 (데이비드 KOPF 악기)를 사용합니다. 좋은 바늘 팁 긴 샤프트와 테이퍼합니다. 내경 40 - 45μm의 beveled 개구부 (그림 1A)를 얻을 수있다 때까지 마이크로 그라인더 (Marishige)와 45도 각도로 바늘 도움말을 분쇄. 바늘 팁을 정리, 바늘의 뭉툭한 끝에 호스를 연결 주사기에 호스를 연결한 다음 빨아 모든 보이는 이물질이 제거될 때까지 10 % 불화 수 소산​​ 산성 솔루션을 출시. 다음, 100 % 에탄올 다음 증류수로 도움말을 씻으십시오. 모든 에탄올 증발까지 바늘을 공기 건조. 잔여 에탄올의 고온 연마 단계에서 바늘을 망치는 것입니다 도움말을 완전히 건조되도록하는 것이 중요합니다. 바늘 팁의 거친 모서리를 부드럽게하고 폴란드어하려면, 마이크로 위조자 (Marishige)의 필라멘트에 의해 생성된 열을와 바늘 팁을 구워. 바늘 도움말을 연마 중에 필라멘트를 만지지 않도록하십시오. 필라멘트와 바늘 팁 사이의 필라멘트와 거리지만 전달하는 전기의 양은 원하는 난방 조건을 달성하기 위해 조정할 수 있습니다. 온도가 너무 높으해서는 안됩니다 :이 녹으 바늘 조언을 변형합니다. 거친 가장자리가 smoothened 후 조심스럽게 바늘 끝으로 가열 필라멘트를 터치하고 부드럽게 지적 엔드 (그림의 1B)를 생성하는 바늘에서 멀리 필라멘트를 당기십시오. 날카로운 부드럽고 깨끗한 바늘은 그대로 기증 blastomeres를 취득하고 호스트 배아를 손상되지 않습니다 중요합니다. 4. 배아 - 위치 프로브를 준비 smoothened 끝에있는 고급 유리 프로브를 얻기 위해 가스 불꽃을 통해 유리 피펫을 당기세요. 이 프로브는 이전에 이식하기 위해 적절한 방향에서 배아를 위치로 사용됩니다. 일 2. Blastomere 이식 1. 수집 및 dechorionate 배아 다음날, 친구에게 물고기를 허용하도록 교차 카세트에 디바이더를 제거합니다. E3 물이 가득 배양 접시에있는 배아를 놓습니다. 그런 다음 수동으로 미세 포셉 한 쌍의와 배아에서 chorions 멀리 되는걸하여 dechorionate 배아. 신중하게 아가로 오스 웰스에 dechorionated 배아를 전송하는 구부러진 샤프트와 유리 피펫을 사용합니다. 공기와 배아의 접촉을 피하십시오, 이것은 버스트에 배아의 원인이됩니다. 배아는 28.5에서 개발하자 ° 아가로 오스 웰스의 C 3 시간 게시물 수정, 또는 HPF까지. 2. 이식 장치를 설정 배아가 발달하는 동안, 미네랄 오일 - 채워진 마이크로 펌핑 시스템에 이식 바늘을 연결하여 이식 장치를 설정합니다. 시스템이 누설되지 않으며 기포가 시스템에 갇혀 있지 않은지 확인하십시오. 위로 0.5을 제외하고, 미네랄 오일과 함께 전체 이식 바늘을 채우기 - 공간 1 μl를 팁 오프닝에서. 3. blastomeres의 이식 blastomeres을 이식하려면, 이상 3 - 4 - HPF의 태아의 blastomere 측면을 동쪽을 향하게하는 유리 위치 프로브를 사용합니다. 그런 다음, 부드럽게 기증자의 배아에 이식 바늘을 삽입하고 천천히 바늘로 50-20 blastomeres을 빨아. 호스트 배아에 blastomere - 채워진 바늘을 넣고 천천히 blastomeres를 놓습니다. 그들의 자손들이 나중에 발달 단계에서 집중 어디 blastomeres가 출시되는이 사이트는 영향을 미칠 것이다. 망막과 두뇌 개발, 동물 극에서 출시 세포를 분석합니다. 이식하는 동안, 바늘 끝 공기에 문의 있지 않은지 확인하십시오. 기계적 피해를 최소화하기 위해, 호스트 배아는 다음날까지 28.5 ° C의 아가로 오스 우물에 남아한다. 그런 다음, T각각 잘 한 배 (胚)와, 1 % 아가로 오스의 0.5 ML 사전 코팅 24 잘 접시에 모자이크 배아를 ransfer. E3 계란 물 1 ML 각 잘에 추가됩니다. 박테리아 감염을 방지하기 위해, 100X 페니실린 및 E3 계란 물에 스트렙토 마이신 10 μl를 추가합니다. 3 일. 퍼가기과 모자이크 배아의 라이브 영상 1. 퍼가기 배아 E3 계란 물 속에 1.5 % 낮은 용융 점 아가로 오스 (LMP)를 준비하고 30 ° C의 물을 욕조에 솔루션을 유지. 두께 0.17mm의 유리 바닥을 가진 FluoroDish 조직 문화 요리 (세계 정밀 계측기)에 모자이크의 배아를 전송합니다. 단지 E3의 최소 금액이 적용되는 배아를 떠나 초과 E3 물을 제거합니다. 배아에 30-50 μl 녹인 1.5 % LMP를 추가합니다. 빨리 아가로 오스 솔루션 굳은하기 전에 가능한 한 유리 하단에 가까운 눈 또는 머리를 위치. 솔루션은 아래 냉각 후, 더 이상 장소에서 배아를 보호하는 추가 아가로 오스 솔루션을 추가합니다. 그런 다음, 2-3 ML E3 달걀 물로 확정 아가로 오스 블록을 담가. 2. 공촛점 이미징 공촛점 현미경을 위해, 큰 초점 심도있는 물이 침수 바뀌 목적은 (올림푸스, PlanApo, 40 X/0.90 WLSM, 일본)이 사용됩니다. 물방울이 목적에 추가하고 다음 목적에 FluoroDish 조직 문화 요리를 장소이기도합니다. 이미지 개발, 배아 5 분 간격의 사진을 복용하여 시간 경과 이미징을 수행합니다. 실험의 성격에 따라, 촬영 사이의 시간 간격을 조정해야합니다. 대표 결과 그림 2는 대표적인 24 HPF의 모자이크 zebrafish를 보여줍니다. GFP 표현이 녹색에서 기증자의 세포를 강조 표시합니다. 망막 neuroepithelial 세포가 망막 벽의 전체 두께에 걸쳐. 영화는 24 HPF에서 호스트 두뇌에 기증자 세포의 움직임을 보여줍니다. 공지 세포의 morphologies은 시간이 지남에 따라 변경합니다. <img src="/files/ftp_upload/1924/1924fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 이식 니들 팁 형태. A.는 바늘 끝의 beveled 오프닝은 불화 수 소산​​ 산성 세척 후 파편 무료되었습니다. B. 뾰족한 끝을 바늘 끝에 생성되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/1924/1924fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. GFP의 시각화 - 표현 24 HPF에서 키메라 zebrafish의 배아에서 기증자 세포를. 왼쪽 패널은 두뇌와 망막의 GFP 신호를 보여줍니다. 중앙 패널은 배아의 밝은 현장 사진입니다. 오른쪽 패널은 병합된 이미지를 보여줍니다. 영화 1. GFP 긍정적인 기증자 세포 이미징 개발 중에 뇌 세포 neuroepithelial의 morphologies의 광범위한 변화를 보여주는 살고 있습니다. 영화의 각 프레임은 24 일과 25 HPF 사이에 5 분마다 수집하고있는 것은. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/1924/1924_Wei_Movie1.wmv">동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

<ol>
	<li>Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+RPE+maintained+by+Nok+is+essential+for+retinal+epithelial+polarity+and+cellular+patterning+in+zebrafish.">Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish.</a> Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Danio+rerio).">A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> THE ZEBRAFISH BOOK. , (2007).</li><li>Ho, R. K., Kane, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+action+of+zebrafish+spt-1+mutation+in+specific+mesodermal+precursors.">Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors.</a> Nature. 348, 728-730 (1990).</li><li>Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+dou+yan+Mutation+Causes+Patterning+Defects+and+Extensive+Cell+Death+in+the+Retina.">Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina.</a> Developmental Dynamics. 236 (5), 1295-1236 (2007).</li></ol>

이 비디오에서는, 우리는 zebrafish의 망막과 두뇌 개발을 분석 blastomere 이식하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 또한 단순히 호스트 배아의 해당 위치로 기증자 blastomeres을 출시하여 다른 조직과 기관의 발전을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. GFP 분자와 라벨링은 형광 염료 복합 Dextran (호 케인 1990)와 라벨보다 깔끔한 배경을 산출. 죽은 기증자 세포에서 Dextran의 염료의 잔해가 있으므로 영상 (카탈라노 외., 2007)와 inferring, GFP보다 훨씬 더 오래 지속되기 때문입니다. 또한, GFP - 긍정적인 기증자의 세포는 Dextran의 염료를 포함하는보다 건강 있습니다.

E3 달걀 물 : <ul><li> 5 MM NaCl </li><li> 0.17 MM KCl </li><li> 0.33 MM CaCl 2 </li><li> 0.33 MM MgSO 4 </li><li> 0.1 % 메틸렌 블루 </li></ul>

transplantation of gfp-expressing blastomeres for live imaging of retinal and brain development in chimeric zebrafish embryos

세포 embryogenesis 동안 자신의 위치와 속성에 광범위하게 변경합니다. 이러한 변경은 세포와 그 환경 사이의 상호 작용에 의해 규제됩니다. 다른 유전 배경의 세포 구성되어 있으며 키메라 배아는 관심의 유전자에 의해 중재 세포 세포 상호 작용을 연구하는 훌륭한 도구입니다. 초기 발달 단계에 zebrafish의 배아 투명성은 세포 수준에서 조직과 장기의 morphogenesis 직접 시각화 수 있습니다. 여기, 우리는 zebrafish 배아의 망막과 두뇌 키메라를 생성하고 기증자의 세포의 라이브 영상을 수행하는 프로토콜을 보여줍니다. 프로토콜은 이식의 바늘의 이식의 준비를 다루고 GFP - 표현 GFP - 부정적인 호스트 기증자 blastomeres를 라이브 공촛점 현미경 하에서 공여 세포 행동의 시험. 약간의 수정과 함께,이 프로토콜은 또한 zebrafish에서 다른 조직과 장기의 배아 발달을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 레이블 기증자 세포에 GFP를 사용하는 장점도 설명합니다.

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Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

우리는 embryogenesis 동안 라이브 이미징 세포 행동 키메라 zebrafish의 배아를 생성하는 프로토콜을 보여줍니다.

의 이식 GFP - 표현 키메라 Zebrafish의 태아의 망막과 두뇌 개발의 라이브 영상에 대한 Blastomeres을

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

transplantation-gfp-expressing-blastomeres-for-live-imaging-retinal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.6K 조회수.  University of Pittsburgh. 우리는 embryogenesis 동안 라이브 이미징 세포 행동 키메라 zebrafish의 배아를 생성하는 프로토콜을 보여줍니다.

비디오: Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

다중 광자 현미경으로 라이브 셀 이미징을위한 성인 형질 전환 Zebrafish의 망막의 Explants의 문화

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

연구

발생학

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced in vivo throughout the rapid developmental period. Multiple processes can be studied including cell proliferation, gene expression, cell migration and morphogenesis. Importantly, the generation of chimeras through transplantations can be easily performed, allowing mosaic labeling and tracking of individual cells under the influence of the host environment. For example, by combining functional gene manipulations of the host embryo (e.g., through morpholino microinjection) and live imaging, the effects of extrinsic, cell nonautonomous signals (provided by the genetically modified environment) on individual transplanted donor cells can be assessed. Here we demonstrate how this approach is used to compare the onset of fluorescent transgene expression as a proxy for the timing of cell fate determination in different genetic host environments.
In this article, we provide the protocol for microinjecting zebrafish embryos to mark donor cells and to cause gene knockdown in host embryos, a description of the transplantation technique used to generate chimeric embryos, and the protocol for preparing and running in vivo time-lapse confocal imaging of multiple embryos. In particular, performing multiposition imaging is crucial when comparing timing of events such as the onset of gene expression. This requires data collection from multiple control and experimental embryos processed simultaneously. Such an approach can easily be extended for studies of extrinsic influences in any organ or tissue of choice accessible to live imaging, provided that transplantations can be targeted easily according to established embryonic fate maps.

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Live tracking of individual WT retinal progenitors in distinct genetic backgrounds allows for the assessment of the contribution of cell non-autonomous signaling during neurogenesis. Here, a combination of gene knockdown, chimera generation via embryo transplantation and in vivo time-lapse confocal imaging was utilized for this purpose.

키메라 Zebrafish의 태아의 개별 망막 전구 세포의 형질 전환 유전자 발현의 생체 내 이미징에서 세포 비 자립적 영향을 연구하기 위해

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

실시간으로 개발을 시각화 하기 위해 다중 광자 시간 경과 영상: 마이그레이션 Zebrafish 태아 신경 크레스트 셀의 시각화

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

공촛점 현미경으로 Zebrafish 배아 뇌 영상 라이브

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

생물학

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

이식에 의해 키메라 Zebrafish의 배아를 생성

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

조직 타겟 배아 Chimeras : Zebrafish Gastrula 세포 이식

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound transgenic fish which express different fluorescent reporters in neighboring cell types provide a means of following cellular interactions 2 and/or tissue-level responses to experimental manipulations over time. In this video, we demonstrate methods that can be used for imaging multiple transgenically labeled cell types serially in individual fish over time courses that can span from minutes to several days. The techniques described are applicable to any study seeking to correlate the "behavior" of neighboring cells types over time, including: 1) serial 'catch and release' methods for imaging a large number of fish over successive days, 2) simplified approaches for separating fluorophores with overlapping excitation/emission profiles (e.g., GFP and YFP), 3) use of hypopigmented mutant lines to extend the time window available for high-resolution imaging into late larval stages of development, 4) use of membrane targeted fluorescent reporters to reveal fine morphological detail of individual cells as well as cellular details in larger populations of cells, and 5) a previously described method for chemically-induced ablation of transgenically targeted cell types; i.e., nitroreductase (NTR) mediated conversion of prodrug substrates, such as metronidazole (MTZ), to cytotoxic derivatives 3,5.
As an example of these approaches, we will visualize the ablation and regeneration of a subtype of retinal bipolar neuron within individual fish over several days. Simultaneously we will monitor several other retinal cell types, including neighboring non-targeted bipolar cells and potential degeneration-stimulated retinal stem cells (i.e., M&#971;ller glia). This strategy is being applied in our lab to characterize cell- and tissue-level (e.g., stem cell niche) responses to the selective loss and regeneration of targeted neuronal cell types.

In this video, techniques for multicolor confocal time-lapse imaging and targeted cell ablation are provided. Time-lapse imaging is used to monitor the behavior of multiple cell types of interest in vivo. Targeted cell ablation facilitates the study neural circuit function and cell-specific neuronal regeneration paradigms.

트렌스 제닉 Zebrafish의 여러 가지 빛깔의 시간 저속 영상 : 타겟의 연결을 세포 절제에 의해 활성화 떠올리 망막 줄기 세포

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function. Our studies have found that dying cells send signals to their live neighbors to form and contract a ring of actin and myosin that ejects it out from the epithelial sheet while closing any gaps that might have resulted from its exit, a process termed cell extrusion1. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe a method to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis. To visualize extrusion, we inject a red fluorescent protein labeled probe for F-actin into one-cell stage transgenic zebrafish embryos expressing green fluorescent protein in the epidermis and induce apoptosis by addition of G418 to larvae. We then use time-lapse imaging on a spinning disc confocal microscope to observe actin dynamics and epithelial cell behaviors during the process of apoptotic cell extrusion. This approach allows us to investigate the extrusion process in live epithelia and will provide an avenue to study disease states caused by the failure to eliminate apoptotic cells.

Dying cells are extruded from epithelial tissues by concerted contraction of neighboring cells without disrupting barrier function. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe methods to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis at cellular resolution.

개발 Zebrafish의 표피에서 세포 압출의 라이브 영상

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

<meta charset="utf8"></head><body>재생 및 개발 연구를 위한 강력한 제브라피시 세포 이식

High-resolution Cell Transplantation in Embryonic and Larval Zebrafish

Development and regeneration occur by a process of genetically encoded spatiotemporally dynamic cellular interactions. The use of cell transplantation between animals to track cell fate and to induce mismatches in the genetic, spatial, or temporal properties of donor and host cells is a powerful means of examining the nature of these interactions. Organisms such as chick and amphibians have made crucial contributions to our understanding of development and regeneration, respectively, in large part because of their amenability to transplantation. The power of these models, however, has been limited by low genetic tractability. Likewise, the major genetic model organisms have lower amenability to transplantation. 
The zebrafish is a major genetic model for development and regeneration, and while cell transplantation is common in zebrafish, it is generally limited to the transfer of undifferentiated cells at the early blastula and gastrula stages of development. In this article, we present a simple and robust method that extends the zebrafish transplantation window to any embryonic or larval stage between at least 1 and 7 days post fertilization. The precision of this approach allows for the transplantation of as little as one cell with near-perfect spatial and temporal resolution in both donor and host animals. While we highlight here the transplantation of embryonic and larval neurons for the study of nerve development and regeneration, respectively, this approach is applicable to a wide range of progenitor and differentiated cell types and research questions.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 발달 및 재생 중 제브라피시 신경계의 세포 연결성 매핑

Here we present a protocol to transplant cells with high spatial and temporal resolution in zebrafish embryos and larvae at any stage between at least 1 and 7 days post fertilization.

배아 및 유충 제브라피시에서의 고분해능 세포 이식

Development and regeneration occur by a process of genetically encoded spatiotemporally dynamic cellular interactions. The use of cell transplantation ...

의 이식 GFP - 표현 키메라 Zebrafish의 태아의 망막과 두뇌 개발의 라이브 영상에 대한 Blastomeres을

요약

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다중 광자 현미경으로 라이브 셀 이미징을위한 성인 형질 전환 Zebrafish의 망막의 Explants의 문화

키메라 Zebrafish의 태아의 개별 망막 전구 세포의 형질 전환 유전자 발현의 생체 내 이미징에서 세포 비 자립적 영향을 연구하기 위해

실시간으로 개발을 시각화 하기 위해 다중 광자 시간 경과 영상: 마이그레이션 Zebrafish 태아 신경 크레스트 셀의 시각화

공촛점 현미경으로 Zebrafish 배아 뇌 영상 라이브

이식에 의해 키메라 Zebrafish의 배아를 생성

조직 타겟 배아 Chimeras : Zebrafish Gastrula 세포 이식

트렌스 제닉 Zebrafish의 여러 가지 빛깔의 시간 저속 영상 : 타겟의 연결을 세포 절제에 의해 활성화 떠올리 망막 줄기 세포

개발 Zebrafish의 표피에서 세포 압출의 라이브 영상

배아 및 유충 제브라피시에서의 고분해능 세포 이식

배아 및 유충 제브라피시에서의 고분해능 세포 이식