시약 준비 <ol><li> BSA (0.5 %), 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 PBS를 포함하는 버퍼를 확인합니다. 공기 거품이 맥 분리 열을 차단할 수 있기 때문에, 버퍼는 2-8 ° C에서 사용하기 전에 degassed하고 저장해야합니다. </li><li> 우리는 5 % 마우스 혈청을 포함하는 RPMI 1640 배지를 사용합니다. 문화 매체는 이러한 화합물은 세포 자극의 특이성을 변경하므로, BSA 또는 FCS를 포함해서는 안됩니다. </li><li> 마우스 IL - 17 분비 분석 - Miltenyi Biotec에서 셀 - 농축 및 탐지 키트. IL - 17 캐치 시약, IL - 17 탐지 항체 (비오틴), 안티 - 비오틴 - PE 및 안티 체육 MicroBeads : 키트는 다음과 같은 구성 요소가 포함되어 있습니다. </li></ol> Splenocytes을 자극 <ol><li> 이 프로토콜은 이러한 unstimulated splenocytes 및 T 세포에 대한 counterstain로 부정과 긍정적인 컨트롤의 존재에서 수행됩니다. 이 프로토콜은 살균 기술을 사용하여 수행됩니다. </li><li> gentleMACS ™의 Dissociator를 사용하여 격리되었다 마우스 splenocytes의 단일 세포 현탁액을 준비합니다. 세포의 농도는 세포 계수를 통해 미리 정해진해야합니다. 실온에서 10 분간 200 × g에서 펠렛은 세포. </li><li> 원심 분리 다음, 피펫을 사용하여 펠렛에서 뜨는을 대기음. 펠렛의 손실을 피하기 위해 튜브를 가만히 따르다하지 마십시오. </li><li> 이제 문화 매체에있는 세포를 resuspend 다음 잘 추가할 수 있습니다. ML 당 천만 세포 cm2 당 오백만 세포의 농도에 대한 충분한 매체를 추가합니다. </li><li> 우리 resuspended 세포에 면역 반응을 촉진하기 위해, 우리는 샘플을 ionomycin (1 μg / ML)와 PMA (10 NG / ML) 추가하고 부드럽게 최대 pipetting 아래로 혼합 솔루션을. 그러면 우물이 적절하게 표시됩니다. </li><li> 이제, 우리는 37 3 시간 동안 우리의 세포를 품어됩니다 ° C 자극 기간을 시작없이 믹싱과 함께. 자극의 시작에서 IL - 17 분석 3 시간 진행되므로 적절하게 계획이다. </li><li> 분비를 중지하려면, 전지가 얼음에 위치하고 부드럽게 감기 버퍼와 아래 pipetting하여 자극을 세포를 수집하고 있습니다. 세포는 다음 우물에서 튜브로 전송하고 두 번째 시간을 씻어 있습니다. </li><li> 모든 세포가 수집되는 것을 보장하기 위해, 그것은 현미경 아래에 접시를 확인하는 것이 좋습니다. 세포가 여전히 남아 첨부하면 감기 버퍼와 접시를 rinsing하여 남아있는 세포를 수집할 수 있습니다. 당신의 세포 현탁액의 모든 세포 대단히 짧은 시간은 미리 분리 필터를 사용하여 제거할 수 있습니다. </li></ol> 캐치 시약으로 세포를 라벨링 <ol><li> 그것은 IL - 17 - secreting 세포의 2 % 미만이있는 경우에는이 분석은 최적의 작동, 참고 파라마운트입니다. </li><li> IL - 17 secreting 세포의 농도가 적절하게 볼륨을 조절할 이상 2퍼센트 것으로 예상하는 경우. <img src="/files/ftp_upload/old/1037_2008_12_8_6/figure8.png" alt="그림 8" width="500" height="162" /></li><li> 이 절차의 함정 하나 가능성 BI 특정 항체가되므로 잘못된 반응을 생성, 비 secreting의 T 세포와 인접 림프구에서 분비 트랩 IL - 17에 바인딩 할 때 레이블링하는 동안 발생할 수있는 캐치 시약의 교차 오염이다. </li><li> 이 문제를 회피하기 위해서는 IL - 17의 보급을 저하이 교차 오염을 피하기 위해 아래 사전 추위 버퍼와 라벨 부착 및 작동하도록 냉각 세포에 중요합니다. 세포 차가운 유지 이외에, 그들은 정의 농도에 보관해야합니다. </li><li> 라벨 절차를 시작하기 위해, 우리는 15 ML closable 튜브 천만 세포를 사용합니다. 높은 세포 숫자가 사용할 수있다면, 간단하게 따라 모든 볼륨을 최대 규모. 최적의 세포 농도를 얻을되면 추위 버퍼 10 ML을 추가하여 세포를 씻으십시오. </li><li> 냉장 원심 분리기 10 분 (2-8 ° C) 300에서 전지 × g를 스핀 다운. </li><li> 원심 분리에 따라 완전히 피펫을 사용하여 표면에 뜨는를 대기음. 이 세포 손실 및 이란게 부정 확한 볼륨을 이끌로 뜨는을 가만히 따르다하지 마십시오. 감기 버퍼, 원심 분리하고, 열망의 10ml를 추가로 구성되어 세척 단계를 반복합니다. </li><li> 이제 원하는 순도의 펠렛을 가지고, 차가운 문화 매체 80 μL의 세포를 resuspend. 그들을 분류하기 위해, 우리는 이제 마우스 IL - 17 캐치 시약 20 μL를 추가합니다. </li><li> 얼음 5 분 동안 세포를 품어. </li><li> 얼음에 5 분 잠복기 후, 튜브를 제거하고 37 ° C 따뜻한 매체 10 ML에있는 세포를 희석. 다음 MACSmix 튜브의 회전에 튜브를 확보하고 37 튜브를 품어 ° C를 지속적으로 움직임에 따라 45 분. 37 온도를 증가하는 것은 ° C는 시토킨 분비를 다시 시작합니다. </li></ol> IL - 17 탐지 항체 (비오틴) 및 안티 - 비오틴 - PE와 세포를 라벨링 <ol><li> 37 ° C에서 45 분 분비 기간 후, 얼음에 즉시 튜브를 놓으십시오. 이것은 시토킨 분비를 중지합니다. 여기에서 그것에 얼음에 세포를 유지하는 것이 중요합니다.감기 버퍼로 작업하면 캐치 시약의 교차 오염을 방지합니다. </li><li> 2-8에서 300xg에서 추위 버퍼와 원심 분리기 ° 10 분 C로 튜브를 입력합니다. 완전히 뜨는을 대기음. 세척이 한 번 더 단계를 반복합니다. </li><li> 세포 펠렛은 추위 버퍼의 80 μL에 resuspended이며, 튜브는 얼음에 위치합니다. </li><li> 항체의 unspecific 바인딩을 방지하기 위해, 우리는 5 분 얼음에 10μl의 FcR 차단 시약과 부화를 추가하는 것이 좋습니다. 그럼 우리가 얼음에 10 분간 비오틴과 부화 복합이다 마우스 IL - 17 탐지 항체 (비오틴) 20 μL를 추가합니다. </li><li> 다시 한번, 우리는 2-8에서 300xg에서 추위 버퍼와 원심 분리기 10 ML 추가 ° C, 10 분에 의해 전에했던 것처럼 세포를 씻으십시오. </li><li> 지금 뜨는을 대기음 차가운 버퍼 80 μl의 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 우리 이차 항체, 안티 - 비오틴 - PE 20 μL를 추가합니다. </li><li> 세포와 보조 항체 솔루션을 섞어서 다시 얼음에 10 분 동안 튜브를 품어. </li><li> 이 두 번째 배양이 완료되면, 10 ML 감기 버퍼와 원심 분리기로 세포를 씻어. </li><li> 펠렛은 이제 추운 버퍼 500 μL에 resuspended 수 있습니다. </li><li> 세포가 더 하류 분석을 위해 분리 수있다면, 그들은 자기 (磁 气) 안티 - PE - MicroBeads으로 표시하고 Mac에서 열 및 Mac에서 구분 기호를 사용하여 수동 또는 자동 분리 수 있습니다. </li><li> 우리는 이제 splenocytes의 라벨링을 완료 및 분석을위한 준비가되어있다. </li></ol> 외과 분석 <ol><li> 우리의 분석을 위해, 우리는 유동세포계측법에 의해 자극과 unstimulated splenocytes을 비교합니다. </li><li> 흐름 cytometric 분석하기 전에 전지가 죽은 세포 밖으로 게이트 0.5 μg / ML에서 propidium 요오드화물 물들일 수 있습니다. MACSQuant ™ 분석기는 각 샘플에 대한 200,000 개 셀 탑재되어 이제 샘플의 상대적인 항체 반응의 스캐터 플롯을 볼 줄 수 있습니다. 희귀 세포의 분석을 위해 두 가지 중요한 고려 사항 - IL - 17 양성 세포와 같은 - 유동세포계측법에 있습니다 : <ul><li> 앞으로 분산 비교 측면 스캐터 플롯에 lymphocytes에 게이트를 설정 </li><li> 그리고 죽은 세포 (propidium 요오드화물의 물들일)와 B - 세포 (unspecific 배경 얼룩의 원인이 될 수있는)가 게이팅 추가 검출의 감도를 향상시키기 위해 </li></ul></li><li> 우리는 T 세포와 B 세포를 감지하는 CD45R/B220-PerCP 항체를 감지하는 CD4 - APC 항체를 사용했습니다. 우리는 샘플의 전방 및 측면 산란 특성을 확인하고 림프구 인구에 게이트를 적용합니다. </li><li> 두 번째 게이트는 스테인드 죽은 세포와 스테인드 B 세포 (Y 축)를 참조하기 위해 적용되었습니다. 이러한 세포는 T 세포 분석에서 제외됩니다. </li><li> 이 예제에서, 어떤은 본질적으로 우리의 부정적인 제어이며, 우리는 unstimulated 샘플에서 거의 IL - 17 secreting의 CD4 양성 T 세포가있다는 것을 알 수 있습니다 - 약 0.003 % (그림 4). 자극 T 세포 인구를 살펴보면, 우리는 CD4의 상당수 긍정적인 T 세포를 볼 수 분비 IL - 17 - 분리하기 전에 0.367 % 정도 (그림 5A)와 Mac에서 기술 (그림 5B)와 자성 분리 후 60.76 %. </li></ol>

모든 프로토콜 및 데이터 시트 www.miltenyibiotec.com에서 구할 수 있습니다. 경고 시약은 나트륨 azide가 포함되어 있습니다. 산성 조건 하에서 나트륨 azide은 매우 독성 hydrazoic 산을 산출. Azide 화합물은 폐기 전에 물을를 실행에 희석해야합니다. 이러한주의 사항은 폭발 조건이 개발 있습니다 배관 예금을 피하기 위해 권장합니다.

TH17 세포는 적응 면역과 염증 반응에 중요한 역할을하고 면역 염증을 유발하는 측면에서 핵심적인 구성 요소입니다. 이 동영상 Miltenyi의 마우스를 사용하는 방법 문서를 IL - 17 분비 분석 - 세포 강화 및 탐지 키트 (PE). 이 절차를 수행할 때 그것은 당신의 시작 셀 준비 IL - 17 - secreting 세포의 빈도의 추정을하는 것이 중요합니다. 라벨 및 시토킨 분비 기간 동안 적절한 세포 농도가 중단의 다른 세포에 의해 교차 오염을 방지하고 안정적​​인 결과를 보장합니다.

<table><tbody><tr><td>Mouse IL-17 Secretion Assay Cell Enrichment and Detection Kit (PE) </td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-213</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Medium</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-440</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD4-APC</td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-611</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD8a-FITC</td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-605</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Propidium Iodide Solution</td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>FcR Blocking reagent, mouse </td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Dead Cell Removal Kit </td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>MACSmix Tube Rotator</td><td>Instrument</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>gentleMACS&amp;#8482; Dissociator</td><td>Instrument</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>autoMACS Pro Starting Kit</td><td>Instrument</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACS Columns</td><td>Tool</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACS Separator</td><td>Tool</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detection and isolation of viable mouse il-17-secreting t cells

맥스 시토킨 분비 분석 기술은 단일 세포 수준과 가능한 시토킨 - secreting 세포의 민감한 고립에서 분비 크린 시토킨의 검색이 가능합니다. IL - 17 - secreting 세포, 마우스 splenocytes의 단일 세포 현탁액 ° PMA / ionomycin와 C는 시토킨 분비를 유도하기 위해 37 준비와 자극입니다 레이블하기 위해. 분비 세포를 중지하기 위해서는 그것이 분비와 세포 표면 근처에 잡힌로 leukocytes의 세포 표면과 IL - 17 CD45에 바인딩 이중 특정 항체를 다음 얼음에 게재되고 IL - 17 캐치 시약에 노출되어 있습니다. 분비 그러면 37의 온도를 증가시켜 다시 시작 ° C와 IL - 17은 캐치 시약에 의해 갇혀있다. 분비 그런 다음 얼음에 세포를 배치하여 다시 중지됩니다. 함정 IL - 17을 감지하기 위해 세포는 비오틴에 복합 두번째 IL - 17 특정 항체 및 안티 - 비오틴 - PE 항체와 incubated 있습니다. 셀 이제 직접 유동세포계측법에 의해 분석이나 안티 - PE 복합 MicroBeads과 이후의 라벨링에 의해 분리 및 농축을위한 준비를하실 수 있습니다.

Watch this Scientific Journal Video about Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells at JoVE.com

Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells

이 절차를 자극시 IL - 17 분비 적극적으로 마우스 TH17의 leukocytes의 탐지 및 격리에 대해 설명합니다.

가능한 마우스 IL - 17 - Secreting의 T 세포 탐지 및 격리

The MACS Cytokine Secretion Assay technology allows detection of secreted cytokines on the single cell level and sensitive isolation of viable ...

<a class="grey_button" href="/video/1044">
ChineseVersion
</a>


<a class="grey_button" href="/video/1233">
JapaneseVersion
</a>

detection-and-isolation-of-viable-mouse-il-17-secreting-t-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

11.2K 조회수.  Miltenyi Biotec,GmbH.  ChineseVersion JapaneseVersion 

비디오: Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

분리 및 나이브 CD4 T 림프구의 TH17 분화

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

연구

면역학 및 감염병학

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH isotypes, such as IgA, IgE and IgG. Measurement of IgH CSR in vitro is a key method for the study of a number of biologic processes ranging from DNA recombination and repair to aspects of molecular and cellular immunology. In vitro CSR assay involves the flow cytometric measurement surface Ig expression on activated B cells. While measurement of IgA and IgG subclasses is straightforward, measurement of IgE by this method is problematic due to soluble IgE binding to Fc&#949;RII/CD23 expressed on the surface of activated B cells. Here we describe a unique procedure for accurate measurement of IgE-producing mouse B cells that have undergone CSR in culture. The method is based on trypsin-mediated cleavage of IgE-CD23 complexes on cell surfaces, allowing for detection of IgE-producing B lineage cells by cytoplasmic staining. This procedure offers a convenient solution for flow cytometric analysis of CSR to IgE.

In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.

진정한 검출 마우스 B 리니지 세포를 IgE 항체가 발현

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

마우스 나이브 CD4<sup&gt; +</sup&gt; T 세포의 분리 및<em&gt; 시험관</em&gt; T 세포 하위 집합으로 차별화

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

마우스 수지상 세포 하위 집합의 분리를위한 효율적이고 높은 수율 방법

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance and homeostasis maintenance by regulating the immune response. The primary role of Treg cells is to suppress the proliferation of effector T (Teff) cells and the production of cytokines such as IFN-&#947;, TNF-&#945;, and IL-2. It has been demonstrated that Treg cells&#39; ability to inhibit the function of Teff cells is enhanced during persistent pathogen infection and cancer development. To clarify the function of Treg cells under resting or inflamed conditions, a variety of in vitro suppression assays using mouse or human Treg cells have been devised. The main aim of this study is to develop a method to compare the differences in phenotype and suppressive function between resting and activated Treg cells. To isolate activated Treg cells, mice were infected with lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) clone 13 (CL13), a chronic strain of LCMV. Treg cells isolated from the spleen of LCMV CL13-infected mice exhibited both the activated phenotype and enhanced suppressive activity compared with resting Treg cells isolated from na&#239;ve mice. Here, we describe the basic protocol for ex vivo phenotype analysis to distinguish activated Treg cells from resting Treg cells. Furthermore, we describe a protocol for the measurement of the suppressive activity of fully activated Treg cells.

Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from na&#239;ve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.

표현형 및 만성 림프 구성 맥락 수막염 바이러스에 감염된 마우스에서 고립 활성화 규제 T 세포의 기능 분석

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new transgenic reporter mouse model. We chose to visualize interleukin (IL) 22 gene expression because this cytokine has important activities in the intestine, where it contributes to repair tissues damaged by inflammation. Reporter systems offer considerable advantages over other methods of identifying products in vivo. In the case of IL-22, other studies had first isolated cells from tissues and then re-stimulated the cells in vitro. IL-22, which is normally secreted, was trapped inside cells using a drug, and intracellular staining was used to visualize it. This method identifies cells capable of producing IL-22, but it does not determine whether they were doing so in vivo. The reporter design includes inserting a gene for a fluorescent protein (tdTomato) into the IL-22 gene in such a way that the fluorescent protein cannot be secreted and therefore remains trapped inside the producing cells in vivo. Fluorescent producers can then be visualized in tissue sections or by ex vivo analysis through flow cytometry. The actual construction process for the reporter included recombineering a bacterial artificial chromosome that contained the IL-22 gene. This engineered chromosome was then introduced into the mouse genome. Homeostatic IL-22 reporter expression was observed in different mouse tissues, including the spleen, thymus, lymph nodes, Peyer&#39;s patch, and intestine, by flow cytometry analysis. Colitis was induced by T-cell (CD4+CD45RBhigh) transfer, and reporter expression was visualized. Positive T cells were first present in the mesenteric lymph nodes, and then they accumulated inside the lamina propria of the distal small intestine and colon tissues. The strategy using BACs gave good-fidelity reporter expression compared to IL-22 expression, and it is simpler than knock-in procedures.

We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.

기자 마우스를 사용하여 IL-22 발현 림프구의 시각화

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Isolation of Group 2 Innate Lymphoid Cells from Mouse Nasal Mucosa to Detect the Expression of CD226

With abundant research on group 2 innate lymphoid cells (ILC2s) published over the years, ILC2s are widely known to be implicated in regulating various pathological processes, including anti-helminth immunity, tissue repair, thermogenesis, and autoimmune diseases such as asthma and allergic rhinitis (AR). ILC2s permanently reside in peripheral tissues such as the skin, gut, lungs, and nasal cavity; however, there is limited information about their exact functions in nasal mucosal immunity. CD226 is an activating costimulatory molecule, mainly expressed on natural killer (NK) cells, T cells, and inflammatory monocytes. However, whether ILC2s express CD226 or play a role in the pathogenesis of ILC2s-related diseases remains unknown. Here, we established a method to isolate and identify ILC2s from the nasal mucosa and detected CD226 expression on ILC2s obtained from healthy and AR mice. Herein, we describe this protocol for the isolation and identification of ILC2s from mouse nasal mucosa, which will help explore the internal pathological mechanism of immunological disorders in nasal mucosal diseases.

Group 2 innate lymphoid cells (ILC2s), implicated in type 2 inflammation, mainly participate in response to helminth infection, allergic diseases, metabolic homeostasis, and tissue repair. In this study, a procedure to isolate ILC2s from murine nasal mucosa and detect the expression of CD226 is demonstrated.

CD226의 발현을 검출하기 위해 마우스 비강 점막에서 그룹 2 선천성 림프 세포 분리

With abundant research on group 2 innate lymphoid cells (ILC2s) published over the years, ILC2s are widely known to be implicated in regulating various ...

급성 LCMV 감염에서 Early Follicular Helper T-Cell Commitment의 해독

Accessing Early Differentiation of Virus-Specific Follicular Helper CD4+ T Cell in Acute LCMV-Infected Mice

Follicular Helper T (TFH) cells are perceived as an independent CD4+ T cell lineage that assists cognate B cells in producing high-affinity antibodies, thus establishing long-term humoral immunity. During acute viral infection, the fate commitment of virus-specific TFH cells is determined in the early infection phase, and investigations of the early-differentiated TFH cells are crucial in understanding T cell-dependent humoral immunity and optimizing vaccine design. In the study, using a mouse model of acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection and the TCR-transgenic SMARTA (SM) mouse with CD4+ T cells specifically recognizing LCMV glycoprotein epitope I-AbGP66-77, we described procedures to access the early fate commitment of virus-specific TFH cells based on flow cytometry stainings. Furthermore, by exploiting retroviral transduction of SM CD4+ T cells, methods to manipulate gene expression in early-differentiated virus-specific TFH cells are also provided. Hence, these methods will help in studies exploring the mechanism(s) underlying the early commitment of virus-specific TFH cells.

저자 스포트라이트: 급성 LCMV 문제에서 TFH 세포 분화의 경로 규명

The current study showcases protocols for assessing the early fate commitment of virus-specific TFH cells and manipulating gene expression in these cells.

급성 LCMV에 감염된 마우스에서 바이러스 특이적 여포 도우미 CD4+ T 세포의 조기 분화에 접근

Follicular Helper T (TFH) cells are perceived as an independent CD4+ T cell lineage that assists cognate B cells in producing high-affinity antibodies, ...

가능한 마우스 IL - 17 - Secreting의 T 세포 탐지 및 격리

필기록

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

분리 및 나이브 CD4 T 림프구의 TH17 분화

진정한 검출 마우스 B 리니지 세포를 IgE 항체가 발현

마우스 나이브 CD4

마우스 수지상 세포 하위 집합의 분리를위한 효율적이고 높은 수율 방법

표현형 및 만성 림프 구성 맥락 수막염 바이러스에 감염된 마우스에서 고립 활성화 규제 T 세포의 기능 분석

기자 마우스를 사용하여 IL-22 발현 림프구의 시각화

CD226의 발현을 검출하기 위해 마우스 비강 점막에서 그룹 2 선천성 림프 세포 분리

급성 LCMV에 감염된 마우스에서 바이러스 특이적 여포 도우미 CD4⁺ T 세포의 조기 분화에 접근

급성 LCMV에 감염된 마우스에서 바이러스 특이적 여포 도우미 CD4⁺ T 세포의 조기 분화에 접근

급성 LCMV에 감염된 마우스에서 바이러스 특이적 여포 도우미 CD4⁺ T 세포의 조기 분화에 접근