この蛍光顕微鏡法は、腸管上皮細胞内のサルモネラ菌表現型を自動的に定量化し、スケーラブルな分解能で多数の菌株のサルモネラ菌の研究を可能にします。私たちの方法は、定量的、ハイスループット、および自動化を同時に行うという利点があり、エリア分析とシングルセル分析の両方に依存しています。細胞内挙動は、多くの細菌の宿主と病原体の相互作用の中心です。
本手法はサルモネラ菌以外の細菌性病原体にも容易に適応でき、その病態解明に貢献します。画像を取得した後、取得を開いてシングルセル解析を実行します。イメージJのcziファイル。
画像をクリックして[カラー]を選択し、[チャンネルの分割]を選択して、チャンネルを分割します。セルセグメンテーションの場合は、C1取得タイトルウィンドウでZ平面画像を選択します。C1取得タイトルウィンドウを選択し、画像をクリックしてから複製をクリックします。
次に、選択したZ平面の番号を書き込みます。書く C1Zplane タイトルボックスに、チェックを外します スタックを複製、をクリックします OK 選択したZ平面画像のみを複製します。選択したZ平面画像を表示するC1Zplaneというウィンドウが開きます。
次に、[プロセス]を選択し、[コントラストを強化]をクリックして、取得したC1Zplane画像の画像のコントラストを高めます。飽和ピクセルを調整し、[正規化]をオンにして[OK]をクリックし、コントラスト強調手法を適用して、コントラスト正規化されたC1Zplane画像を取得します。プロセスに移動し、Find Maximaをクリックして、コントラスト正規化C1Zplane画像で上皮細胞をセグメント化します。
次に、すべての上皮細胞に1つの極大点のみを帰属させるには、プレビュー点の選択にフラグを付け、ノイズ許容度を設定します。C1Zplane のセグメント化された画像 (マークされた最大値ポイントごとに各セグメント化されたパーティクルを表示する新しいバイナリマスクのような画像) を取得するには、[エッジ最大値を除外]にフラグを付け、[出力タイプ]としてセグメント化されたパーティクルを選択し、[OK]をクリックします。次に、C1Zplaneのセグメント化された画像にセグメント化されたセルのマスクを作成します。「解析」をクリックしてから「パーティクルを解析」をクリックし、「マスクを表示」および「エッジで除外」オプションを選択します。
サイズ間隔を設定し、[OK]をクリックしてC1Zplaneセグメント化されたバイナリマスクのマスクを取得します。ルックアップ テーブルをクリックし、ツールバーの [ルックアップ テーブルの反転] を選択します。コントラスト正規化された C1Zplane 画像のしきい値を設定するには、画像に移動し、[調整]、[しきい値] の順に選択し、暗い背景を確認します。
自動しきい値設定をデフォルトに設定し、赤いオプションを選択します。セルが完全に赤くなり、背景が暗くなるまで、最小カットオフ値を調整します。[適用] をクリックして、コントラスト正規化された C1Zplane イメージを、セルが白、背景が黒のバイナリ画像に変換します。
さらに、C1Zplaneセグメント化されたバイナリマスクのマスクのセルセグメンテーションを修正するには、[プロセス]を選択し、[画像計算機]をクリックします。次に、画像 1 としてセグメント化された C1Zplane のマスクを選択し、ドロップダウンリストで操作 AND を選択し、画像 2 としてしきい値のコントラスト正規化された C1Zplane を選択します。OKをクリックすると、ImageJは出力画像にC1Zplaneセグメントのマスクの結果として自動的に名前を付けます。
C1Zplane のすべてのセグメント化されたセルを関心領域としてラベル付けするには、[解析]、[パーティクルの分析] の順にクリックします。前に示したようにサイズを調整し、[何も表示しない] オプションを選択します。[マネージャーに追加] をオンにして、すべてのパーティクルを ROI マネージャー ツールに追加します。
また、[エッジで除外]をオンにして、[OK]をクリックします。ROIデータをROIセル取得タイトルとして保存します。ROI マネージャー メニューを [詳細] をクリックし、[保存] を選択して zip を実行します。細胞セグメンテーションが終了したら、C2取得タイトルウィンドウで液胞サルモネラ菌を分析します。
まず、プロセスに移動し、画像計算機をクリックし、画像1としてC2取得タイトルを選択し、ドロップダウンリストで操作減算を選択します。次に、画像2としてC3取得タイトルを選択し、[ウィンドウの新規作成]にチェックを入れて[OK]をクリックします。Z スタック全体に減算を適用するには、「プロセススタック」ウィンドウで「はい」をクリックします。C2取得タイトルウィンドウの結果を複製するには、画像メニューをクリックし、複製を選択します。
次に、重複スタックを確認し、[OK]を押して、C2取得タイトル1ウィンドウの結果を取得します。C2取得タイトル1ウィンドウの結果にガウスぼかしを適用するには、プロセスに移動し、フィルターをクリックして、ガウスぼかしを選択します。Sigma の値は 2 のままにするか、カスタマイズします。
[OK]をクリックし、[プロセススタック]ウィンドウで[はい]をクリックして、Zスタック全体にガウスぼかしを適用します。C2取得タイトル1のガウスフィルタリング結果をC2取得タイトルの結果に減算するには、[プロセス]をクリックして[画像演算]を選択します。次に、C2取得タイトルの結果を画像1として選択し、ドロップダウンリストで減算操作を選択し、C2取得タイトル1の結果を画像2として選択して、[OK]をクリックします。[プロセススタック]ウィンドウで[はい]をクリックしてZスタック全体に減算を適用し、C2取得タイトルの結果としてImageJによって自動的に名前が付けられたウィンドウを取得します。
C2取得タイトルの結果の背景からサルモネラ菌を分離するには、画像をクリックし、[調整]を選択して[閾値]をクリックします。次に、暗い背景を確認し、自動しきい値を大津に設定します。サルモネラ菌が完全に赤く表示され、背景が暗くなるまで、最小カットオフ値を調整します。
[適用]をクリックすると、[バイナリに変換]という名前のウィンドウが開きます。黒い背景を確認し、[OK]をクリックします。C2取得結果標題バイナリウィンドウにおける細胞内サルモネラ菌フォーカス面に対応する中央のZ面を選択する。画像をクリックしてから [スタック] をクリックし、[スライスの設定] を選択します。
次に、選択したZ平面の番号を書き込み、[OK]をクリックします。次に、[分析] をクリックし、[測定値の設定] を選択して、各 ROI の記録する測定値を設定します。次に、各ROIの合計領域に対応する領域を確認します。各ROIのしきい値ピクセルが占める面積の割合を記録するには、[面積の割合]と[しきい値の制限]をオンにします。
ディスプレイラベルをチェックして、すべてのROIに画像タイトル、チャネル、Z平面、およびX / Y座標のラベルを付けます。選択した細胞内サルモネラ菌のZ平面を使用して、すべての単一細胞のラベル、面積、およびサルモネラ菌が占める面積の割合を記録します。ROIセル取得タイトルを開きます。
zip ファイルを作成するには、[ファイル] メニューをクリックし、[開く] を選択します。次に、ROIマネージャーメニューの[測定]をクリックします。出力は、選択した測定値を報告するテーブルです。
最後に、ファイルを選択し、結果ウィンドウで[名前を付けて保存]をクリックして、結果テーブルを保存します。サルモネラ菌の細胞浸潤、液胞負荷、細胞質ゾル過剰複製を上皮細胞内で可視化した。面積分析の結果、ネズミチフス菌の感染率はサルモネラダービー株の両株と比較して有意に高く、サルモネラ菌株の上皮細胞への定着能力の違いを検出するための面積分析の有効性が実証されました。
サルモネラダービーsipA欠失変異株は、サルモネラダービー野生型と比較して、ハイパーレプリケーション率の低下を示し、ハイパーレプリケーションの誘導におけるsipaの役割と一致しました。ネズミチフス菌とサルモネラダービー野生型の間に過剰複製の違いは観察されませんでした。シングルセル解析では、ネズミチフス菌と比較してサルモネラダービー株の感染細胞の割合に有意差は見られませんでした。
それ以外の場合、サルモネラダービー株は、ネズミチフス菌よりも有意に低い平均液胞負荷を生成しました。ネズミチフス菌とサルモネラダービー野生型の間に差は認められなかったが、サルモネラダービーsipAは過剰複製の有意な減少を示し、面積分析の結果と一致した。サルモネラ菌には、多様な病原性を持ついくつかの血清型が含まれています。
この高速かつ自動化された方法で多数の菌株を調べることは、この病原体の実際の病原性の可能性を理解するのに大きく貢献します。
