マルチモーダル非線形光学顕微鏡を用いたナノ粒子の細胞取り込みの生体分子イメージング

私たちのプロトコルは、マルチモーダル、非線形、光学顕微鏡を提示し、癌細胞内の金ナノ粒子の化学的特異的イメージングを実行するためにそれを適用します。当社のイメージングシステムの主な利点は、細胞構造と金ナノ粒子の生体分子コントラストをマルチモーダルな方法でレビューするために使用できることです。まず、リモコンボックスを除くすべての機器のプラグをオンにします。

次に、ボックスの背面のスイッチを入れ、コントロールボックスのリモートライトが青色になったら、[操作の開始]を押します。その後、レーザー走査型顕微鏡のPCの電源を入れ、共焦点顕微鏡ソフトウェアを実行します。次に、コンピューターソフトウェアを使用して顕微鏡の光路を確認し、タッチスクリーンまたはリモコンノブまたはコンピューターソフトウェアを介して焦点を制御します。

ズーム、ピクセル単位の画像サイズ、ピクセル滞留時間など、ソフトウェアで目的の画像設定を選択し、ピクセル滞留時間が積分時間よりも長いことを確認します。水浸対物レンズの上に蒸留水の液滴を置き、レーザービームをサンプルに集束させ、コンデンサーとサンプルの間に集束させてイメージングします。次に、コンデンサーの高さをサンプルから約1ミリメートル上に調整して最大量の光を収集し、可動マウントに配置されたSRS検出器をビームパスから移動させて、白色光を使用してサンプルに焦点を合わせます。

ソフトウェア設定を使用して、ポンプビームを選択し、レーザー波長をCH振動の場合は802ナノメートル、アミドIピークの場合は898ナノメートルに変更し、ラマンシフトの大きな変化を説明します。ラマンシフトを微調整するには、原稿に記載されているようにSFTRUユニットの遅延段をスキャンします。ハイパースペクトル データ セットの場合は、[トリガー] タブを選択し、[ttl トリガーで開始] をクリックして、[フレームごとにトリガー] を選択します。

次に、[系列] タブで、時系列をオンに設定し、Z 系列をオフに設定します。さらに、ATMソフトウェアのステップ数と一致するように時系列のフレーム数を設定します。次に、ATMソフトウェアの[実行]タブに移動し、CHの遅延ステージ位置を90.25と92.25に設定し、アミドI領域をミリメートル単位で設定し、ハイパースペクトルスキャンの開始位置と停止位置に対応し、ステップ数がコンピューターソフトウェアのフレーム数と一致することを確認します。

正しい設定を確認した後、最初に[取得]に移動し、[スキャンの開始]をクリックして、コンピューターソフトウェアでハイパースペクトルスタックを開始します。次に、ATMソフトウェアで[開始]をクリックすると、選択した開始位置と停止位置の間の遅延ステージ位置が徐々に増加する一連の画像の収集が開始されます。次に、さまざまな遅延ステージ位置で時系列の画像を撮影して、ハイパースペクトルスキャンを生成します。

アナログユニットを使用して、SFTRUシステムとの間でTTL信号を送受信し、画像の取得と遅延ステージの動きを同期させます。CH振動領域のイメージングをアミドI振動領域に切り替えるには、レーザーソフトウェアのポンプ波長を802ナノメートルから898ナノメートルに変更します。さらに、ATM ソフトウェアのストークス分散設定を 30 ミリメートルから 5 ミリメートルに変更します。

ミラーマウントの下部ノブを調整して、ミラー角度を段階的に変更することにより、SFTRUボックス内のポンプビーム分散経路のミラーを微調整します。ポリスチレンミクロスフェアの化学的選択性を検証するために、ハイパースペクトル刺激ラマン散乱と自発ラマンスペクトルが記録されました。スペクトルは、相対強度に観察された違いを除いて同一であった。

4T1癌細胞の刺激ラマン散乱イメージングは、脂質、タンパク質、およびDNA生体分子の炭素-水素伸縮振動帯に対応する2,852,2,930および2, 968波数で行われた。金ナノ粒子を投与した4T1がん細胞のマルチモーダルイメージングを行い、がん細胞におけるナノ粒子分布を調べた。取得した誘導ラマン散乱画像は、CH2およびCH3チャネル、LysoTracker蛍光プローブ、およびオフレゾナンス刺激ラマン散乱チャネルについて取得されました。

覚えておくべき最も重要なことは、レーザーソフトウェアで振動領域、ポンプリファレンス、およびプロトコル中のストークス分散設定を変更することです。このシステムは、光学アライメントに影響を与えることなく、フェムト秒領域からピコ秒領域に簡単に切り替えることができます。この機能により、多光子コヒーレントラマン散乱およびポンププローブ分光法とその応用を行うことができます。

このマルチモーダルイメージングプラットフォームは、ナノメディシンへの新しい洞察を提供し、細胞、組織、および金ナノ粒子の分子イメージングへの道を開きます。