光遺伝学は、典型的な誘導物質と比較して、いくつかの化学物質およびタンパク質のより高い力価を達成するために使用されてきた。このプロトコルを使用すると、他の人は光ベースの制御で独自のプロセスを強化できます。光遺伝学制御は、非侵襲的であり、高度に調整可能であり、可逆的である。
これらの品質により、微生物プロセスの合理化された最適化が可能になり、三相発酵や多色制御などのユニークな機会も開かれます。新しい化学物質の場合、最適な光条件は異なります。したがって、このプロトコルのパラメータを使用して低生産が観察された場合は、異なる光条件をテストする必要があります。
まず、OptoINVRTプラスミドに必要なマーカーであるHIS3オキシトロフィーを有するサッカロミセス・セレビシエ株を取得することから始める。サッカロミセス・セレビシエに天然の遺伝子を制御しようとする場合、進行する前に遺伝子の内因性コピーが欠失していることを確認してください。株構築を開始するには、EZL439などのOptoINVRT7回路を含むプラスミドを線形化します。
EGA1プロモーターを光の中で抑制し、暗闇の中でそれを活性化する成分を含むEZL439を使用する場合は、Pme1制限部位で線形化する。標準的な酢酸リチウム形質転換法を用いて、プラスミドをHIS3栄養要求性株に組み込む。形質転換に続いて、細胞を150Gで1分間遠心分離する。
細胞を200マイクロリットルの新鮮なSC−HIS培地に穏やかに再懸濁する。細胞体積全体をSC-HIS寒天プレートにプレートし、コロニーが現れるまで摂氏30度で2〜3日間インキュベートする。標準的な酢酸リチウム形質転換プロトコルを使用してコンピテントセルを作製します。
PIGA1MまたはPIGA1Sプロモーターの下流に光遺伝学的に制御したい遺伝子を含むプラスミドで細胞を形質転換します。形質転換後、培養物を150Gで1分間遠心分離し、細胞ペレットを200マイクロリットルの新鮮なSCドロップアウト培地に穏やかに再懸濁する。酵母エキスペプトンデキストロース寒天プレート上に全細胞体積をプレートし、デルタ部位に組み込む場合は選択マーカーを含むプラスミドで形質転換すればSCドロップアウトプレートとする。
細胞を摂氏30度で一定の青色光の下で16時間インキュベートし、光遺伝学的に制御された遺伝子を抑制したままにする。波長465ナノメートルの光源を使用し、光強度が毎秒約80〜110マイクロモルになるように、プレートの上に約40センチメートルのLEDパネルを配置します。量子メーターを使用して強度を測定します。
デルタ部位に統合する場合は、1ミリリットルあたり400マイクログラムから1ミリリットルあたり1,200マイクログラムの間のゼオシン濃度の範囲を含む酵母エキスペプトンデキストロースプレート上にプレートを複製して、さまざまな統合コピー数を選択します。レプリカプレートを摂氏30度で、一定またはパルス状の青色光の下で、コロニーが現れるまで2〜3日間インキュベートする。予備スクリーニングを行うには、各プレートから8つのコロニーを選択し、それらを使用して、24ウェルプレートの個々のウェルに2%グルコースを添加したSC-HIS培地1ミリリットルを接種する。
一定の青色光照明下で毎分200回転で30°Cの振とうで細胞を一晩成長させる。翌日、各培養物をグルコース2%の新鮮なSC-HIS培地で希釈し、600ナノメートルで0.01〜0.3の範囲の光学密度値を取得し、光学密度が2〜9に達するまで摂氏30度の一定光またはパルス光下で毎分200回転の振とう条件で培養物を増殖させる。次に、プレートをアルミホイルで包み、ライトパネルをオフにし、毎分200回転で30°Cで4時間暗闇の中でプレートをインキュベートします。
24ウェルプレート内の培養物を234Gで5分間遠心分離し、2%グルコースを含む1ミリリットルの新鮮な合成完全ドロップアウト培地に細胞を再懸濁する。滅菌マイクロプレート封止テープを用いて目的物の蒸発を防ぐためにプレートを密封する。密封プレートを暗所で30°Cで毎分200回転で48時間振とう発酵させる。
発酵物を回収するには、プレートを234Gで5分間遠心分離し、800マイクロリットルの上清を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。目的の化学物質に応じて、高速液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー質量分析、または使用する機器に最も適したサンプル調製技術を使用した別の分析方法を使用して分析します。各プレートから8つのコロニーを選択し、それらを使用して、24ウェルプレートの個々のウェルに1ミリリットルのSC-HIS培地に2%グルコースを接種する。
暗所で30°Cで一晩中細胞を成長させ、毎分200回転の振とう。翌朝、各培養物を2%グルコースを含む新鮮なSC-HIS培地で0.1光学濃度に希釈する。プレートをアルミ箔で包んで光にさらされないようにし、30°Cの暗闇の中で培養物を毎分200回転の振とうで3つの光学密度に達するまで成長させます。
その後、プレートをパルス光の下で摂氏30度で12時間インキュベートし、毎分200回転振る。培養物を234Gで5分間遠心分離し、2%グルコースを有する新鮮なSC−HIS培地に再懸濁する。滅菌マイクロプレート封止テープを用いて目的物の蒸発を防ぐためにプレートを密封する。
密封したプレートを光で48時間、摂氏30度で毎分200回転で振とう発酵させる。光遺伝学的発酵を行った後、化学的生産を、2つの回路を用いて誘導時の細胞密度の範囲で試験した。OptoINVRT7回路は、OptoINVRT1および2回路と比較して、誘導値7.0および8.75の最適な細胞密度で乳酸およびイソブタノールの高力価を実証した。
OptoAMP回路を用いた発酵は、異なる光デューティサイクルによって定義される3つの段階で研究された。乳酸生産は、パルス増殖段階および完全に照射された誘導および生産段階を使用して最適化することができる。イソブタノール生産は、パルス成長相、完全照射誘導相、およびパルス生産相を用いて最適化された。
一方ナリンゲニン生合成は、パルス成長完全照射誘導および暗黒産生相を用いて最適に最適化された。OptoLACシステムは、IPDGによる化学的誘導を用いて達成されたものと同程度またはそれ以上の力価で転写因子FDERを産生するために大腸菌で使用されてきた。OptoLAC回路はメバロン酸塩を産生するために適用されており、その産生はIPDG誘導を用いて達成された力価を超えている。
バイオリアクターレベルでのメバロン酸塩生産は、マイクロプレートレベルを超えた細菌における化学的およびタンパク質産生に対する光遺伝学的調節のスケーラビリティおよび同調性を実証する。照明されたステップで光の強度が適切な範囲にあり、暗闇を必要とするステップで光の汚染が回避されていることを確認することが重要です。この技術は、酵母におけるイソブタノールの記録的な力価を達成し、光でコンソーシアム集団を安定化させ、合成光制御細胞小器官を使用して代謝フラックスを制御する方法を開いた。
