このアッセイにより、学生はビーズを異なる胚領域に移植することによって、細胞分化や形態形成などの多くの発生過程において特定の分子を見ることができます。このプロトコールは、任意の実験動物モデル、細胞培養、オルガノイドを含むオルガノタイプモデルに適用することができる。さらに、基本的な発生生物学を学生に教えるための有用な教育ツールです。
手順を実演するのは、研究室の学部生であるAlexandra Gonzales-Gonzalesです。まず、受精した白いレグホーン鶏の卵を、摂氏38度、相対湿度70%の加湿インキュベーターで尖った側面を下にして垂直に孵化させます。ハンバーガーとハミルトンによると、彼らが28番目の段階に達したら、インキュベーターから卵を取り出し、70%エタノールと交換して風乾させます。
その後、作業領域、顕微鏡、器具を70%エタノールで消毒します。次に、卵をろうそくで血管を識別し、胚を見つけます。胚を持たない卵子を捨てる。
歯のない鉗子の端を使って、卵の鈍い端をタップして窓を開き、1平方センチメートルの殻の部分を取り除きます。次に、卵をカートンまたはプラスチックホルダーに移し、実体顕微鏡の下に置きます。細かい外科用鉗子を使って、胚に接触する可能性のある卵殻の小さな部分を取り除き、それを穿刺して引き抜くことによって空気膜を除去します。
次に、細かい外科用鉗子を使用して、羊膜袋をわずかに引き裂き、絨毛膜の血管系を傷つけないように注意する。胚をin-ovoでステージングして、それらが所望のステージにあるかどうかを判断する。アフィゲルヘパリンビーズ調製のために、正方形のパラフィルムセクションを45ミリメートルのペトリ皿に収まるように切断する。
パラフィルムをペトリ皿の底に横切って置いた後、歯のない鉗子の端を使用して、各頂点を押して皿の底に固定する。次に、ピペットまたはヘラを用いて、ビーズをマイクロ遠沈管に移し、上清を沈降させてピすることにより、PBSで2回洗浄する。次いで、マイクロピペットを用いて、40〜50個のビーズをパラフィルムで覆われたシャーレの中心に移す。
顕微鏡下で、直径100マイクロメートルのアフィゲルまたはヘパリンビーズを30個選択します。ビーズのサイズは、28段階の胚の3桁目間を基準として用いた。ビーズは桁間よりも小さくなければなりません。
選択したビーズを取り囲む余分なPBSを慎重に除去した後、それらを2〜5マイクロリットルの処理溶液に浸します。ビーズを溶液中で室温で30分間インキュベートする。インキュベーション中、ビーズが乾燥するのを防ぐために、ビーズの周りに数滴のPBSまたは水をピペットでピペットして局所的な雰囲気を加湿し、蒸発を遅らせるためにパラフィルムで皿を覆う。
AG1X2ビーズ調製物を注ぐ。ヘラを使用してビーズをマイクロ遠沈管に移し、50マイクロリットルの処理溶液を所望の最終濃度で加える。チューブをホイルで包んで光から保護した後、ゆっくりと振とうしながらビーズを20分間インキュベートします。
インキュベーション後、ピペットを用いて、0.2%フェノールレッドを水に溶解した染色液中のできるだけ多くの処理溶液を、渦中で穏やかな攪拌で2分間除去する。染色後、色素を除去し、次いでビーズをPBSで2回洗浄して、残留色素を除去した。次に、マイクロピペットチップを用いて、40〜50個のAG1X2ビーズをパラフォームで覆われたペトリ皿の中心に移し、ビーズを5マイクロリットルのPBSに浸す。
次に、顕微鏡下で、直径100マイクロメートルの大きさのビーズを約30個選択します。選択したビーズを実験溶液にビーズの周囲に数滴のPBSまたは水で沈め、局所大気を加湿する。蒸発を遅らせるためにパラフィルムで皿を覆う。
胚を操作する前に、2つの実体顕微鏡をベンチトップに隣り合わせに配置します。次に、歯のない鉗子を使用して、残りの卵に窓を作ります。次に、顕微鏡下で、右後肢近くの羊膜を微細な外科的鉗子で引き裂く。
微細な鉗子を用いて、胚を羊膜で保持し、右後肢を露出させる。次に、細かいタングステン針を用いて、後肢の3桁目の桁間距離の遠位に穴を開ける。胚および露出した後肢を放出することなく、鉗子の先端の1つを使用して、他方の顕微鏡から一方の処理ビーズを採取する。
1つのビーズがその先端に付着するためには、鉗子が開いている必要があります。ビーズを後肢近くのひよこの胚に移し、桁間孔の上に配置します。ビーズが穴に入るまで鉗子を閉じてビーズに圧力をかけます。
その後、胚を解放し、卵殻の窓をテープで密封し、必要な段階に達するまで卵をインキュベーターに戻します。アッセイの有効性を確保するためには、ビーズを一貫して正確な場所に配置する必要があります。この研究では、浸したビーズを頂端外胚葉隆起の下の3桁目間距離に配置した。
胚をオーシャンブルーとアリザリンレッドで染色して、骨格要素の形成を証明し、細胞分化への影響を評価することができます。このアッセイは、ニュートラルレッドおよび遺伝子調節による細胞死の評価にも適しており、C2ハイブリダイゼーションを購入します。この実験ツールの主な利点は、浸したビーズの時間と場所を制御することです。
コアポジショニングと正確な発生タイミングを組み合わせることで、細胞分化プロセスを研究するための大きな可能性がもたらされます。
