この研究は、助成金番号(NCI P30 CA023108およびNCI U54 CA151662)によって資金提供されました。

ダートマス大学のアニマルケアおよび使用プログラムは、米国実験動物ケア認定協会(iAAALAC)の認定を受けており、すべてのUDSAおよびNIH(実験動物福祉局)のガイドラインおよび規制に準拠しています。すべてのin vivo研究は、ダートマス大学施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。安楽死の手順は、動物の安楽死に関する2020年のAVMAガイドラインに準拠しています。
1. システムの計装/設計
<ol><li>カスタムAMFアンテナ(コイル)を閉ループになるように設計し、目的の磁場を作成するための形状を選択します。発電機の選択によるインダクタンス式と特性を使用して、互換性のあるコイルを設計し、目的のフィールドを生成します。in vitro実験とin vivo実験に異なるデザインを使用してください。</li>
	<li>AMFアンテナのインダクタンスが発電機の許容範囲内にあることを確認してください。コンデンサを加算または減算して、アンテナを発電機に一致(調整)します。</li>
	<li>in vitro実験では、内径2 cm、長さ14 cmの14ターンヘリカルコイルを設計し、1.5 mLチューブを含めることができ、複数のサンプルを同時に処理できます。コイルをビニールポリマーで絶縁し、ポリスチレンスペーサーを使用してコイルをチューブから分離します。設計仕様と考慮事項の詳細は、 補足ファイル1に記載されています。</li>
	<li>in vivo実験では、独自の設計情報を持つメーカーからカスタムメイドの全身ヘリカルコイルを入手してください。8 mm角のチューブ(コイルのボア内でより均一な磁場を作成するため)と、目的の治療領域にコンセントレータを使用します。コンセントレーターを長さ5.0cmにし、合計5回転させて内径3.6 cm、外径5.2 cmにし、目的の治療領域にその位置を配置します。コイルをポリカーボネートシェルで囲みます。</li>
	<li>電源として定格10kW以上の調整可能な電力と周波数を備えたAMF発電機を使用してください。インダクタンスは、電源とアンテナ/コイルを0.62〜1.18μHenries(μH)の範囲に一致させ、30〜300kHzの範囲の周波数を可能にします。50psiに調整された圧力ブーストポンプを介してリサイクル水を使用して発電機を冷却します。</li>
	<li>AMFアンテナを介して水で希釈された5.6%エチレングリコールベースの熱伝達流体をポンプで送る25トンの冷却能力チラーでコイルを冷却します。チラーの温度を、アンテナがサンプルを加熱または冷却しないように設定します。</li>
	<li>動物の収容のために、ホルダーとコイル表面の間に0.5cmのエアギャップがあるコイルの中央に吊り下げることができる管状ホルダーを構築します。コイルの周りのシェルを通して空気を循環させる調整可能な調整済みエアポンプを接続し、通常の動物のコア温度を維持するように設定します。麻酔器を動物の頭の近くの管状の動物ホルダーに接続して、麻酔が適切に行われるようにします。</li>
	<li>セル封じ込めのために、水浴からの水をチューブが配置されているスペーサーを通して循環させる装置を作成します。チューブが水に囲まれるようにこのウォーターバスの温度を37°Cに設定します。</li>
	<li>光ファイバープローブを使用して、腫瘍、動物のコア、および動物環境内の温度を監視したり、in vitro研究のために、細胞ペレットの温度とチューブの周囲の水をモニターしたりします。</li>
	<li>すべての実験で100nmサイズの磁性酸化鉄ナノ粒子を使用してください。 注:濃度と比吸収率(SAR)は、可能な加熱と熱線量に直接影響するため、ナノ粒子を選択する際に考慮しなければならない2つの特性です18。</li>
</ol>2.インビトロでの温熱療法
<ol><li>B16F10マウスメラノーマ細胞をRPMI培地で10%FBSおよび1%ペン/連鎖球菌で培養します。150, 000細胞/ウェルを6ウェルプレートにプレートし、2mLの完全培地を入れます。</li>
	<li>各ウェル、すなわち、mNPがなくAMFがない細胞、mNPがなくAMFがない細胞、mNPがなくAMFがない細胞、mNPとAMFがある細胞など、適切な治療法を決定します。 注:さらに、温熱療法を別の治療法と組み合わせる場合は、適切なコントロールがあることを確認してください。AMFは、必要な電力および冷却機能を備えた標準的な研究ベンチラボで実行されます。</li>
	<li>めっきの24時間後、前のステップで決定したように、mNPを適切なウェルに追加します。mNPを3 mgの鉄/ mLの濃度に添加します。.ストック培地/mNP溶液を作成するか(古い培地を除去し、この溶液を追加する)、またはmNPを直接穏やかに旋回させるプレートを追加して均質に分配することにより、mNPがウェル全体に分布していることを確認します。</li>
	<li>mNPを添加してから48時間後、ウェルが~80%コンフルエントになったら、培地を除去し、ウェルを新鮮な培地で洗浄して処理を開始します。メディアを取り出します。</li>
	<li>処理する各ウェルに0.5 mLのトリプシンを加え、穏やかに渦巻きます。顕微鏡を使用して、細胞が剥離していることを確認します。</li>
	<li>各ウェルに1 mLの培地を加えて、細胞を1.5 mLチューブに回収します。ウェルからすべての細胞を採取します(~1 x 106 細胞)。ウェルごとに明確にラベル付けされた個別のチューブを使用してください。</li>
	<li>チューブを60 x g で2〜3分間スピンして、細胞をペレット化させます。ペレットを培地に保持します。</li>
	<li>コイル内の水で満たされたスペーサーにチューブを配置します。培地および細胞ペレットが37°Cに維持されるように水浴の温度を設定する。 別々の光ファイバー温度プローブを使用して、チューブとウォーターバス内の温度を監視します。</li>
	<li>チラーの電源を入れ、クーラントがコイルを通って流れていることを確認します。電源をオンにし、目的のフィールドに対する最大値のパーセントを調整します。10 kWの発電機を動力源とする14ターンソレノイドコイルを165 kHzおよび23.87 kA / m(300 Oe)で操作します。</li>
	<li>別の光ファイバー温度プローブをチューブの1つに配置します。以前に決定されたプロトコル熱線量まで細胞を処理する。例は、43°Cで30分です(CEM43の30)。</li>
	<li>チューブ内の培地に細胞を再懸濁し、新しい6ウェルプレートに再プレートします。新しいプレートに明確なラベルを付けます。目標は、収集されたすべての細胞(~1 x 106 セル)を再プレートすることです。 注:新しい6ウェルプレートを使用して、培養する細胞が処理を受けていることを確認する必要があります。古いプレートを使用した場合、トリプシン処理に成功しなかった細胞がプレートに残っている可能性があります。</li>
	<li>必要に応じて、次の実験手順のために、RNAまたはタンパク質発現分析のために細胞を溶解します。</li>
</ol>3.生体内温熱療法
<ol><li>細胞培養と接種<ol><li>B16F10マウスメラノーマ細胞をRPMI培地で10%FBSおよび1%ペン/連鎖球菌で培養します。希望する数の動物を接種するのに十分な細胞を提供するプレート/皿を使用してください。例えば、100, 000細胞で播種された10, 100 mmディッシュは、48時間以内に20匹のマウス注射に十分な細胞とコンフルエントになります。</li>
		<li>細胞をトリプシン処理し、純粋なRPMI培地(FBSまたはペン/連鎖球菌を含まない)を使用して収集します。</li>
		<li>細胞をカウントし、接種量とマウス数に基づいて、所望の細胞濃度の溶液を作成します。</li>
		<li>気化したイソフルランと酸素を使用して、6週齢の雌C57Bl / 6マウスを麻酔します。誘導されるまで、動物を5%イソフルランと95%酸素を含むプレキシガラスボックスに入れます。.誘導されたら、動物を取り除き、2%イソフルランでフェイスコーンを使用して、ステップ3.1.5-3.1.7および3.3.3-3.3.6を完了します。 注:治療中の麻酔には、内蔵の麻酔封じ込めを使用してください。マウス麻酔のための標準的な施設プロトコルに従ってください。動物実験の前に、適切なIACUCの承認を確認してください。麻酔後、動物をケージに戻し、回復を監視して合併症がないことを確認します。</li>
		<li>右反射神経に対する反応の欠如を確認します。</li>
		<li>電気かみそりを使用して右脇腹を剃ります。</li>
		<li>アルコールワイプで注射部位を清掃します。1〜2 x 106 細胞を注入し、28 G針を備えた100 μLのガラスシリンジを使用して、麻酔をかけた右脇腹の皮内に50 μLの培地に分散させます。</li>
	</ol></li>
	<li>腫瘍増殖/ナノ粒子注入<ol><li>ノギス(長さ、幅、深さ)を使用して腫瘍を3次元で測定し、(長さx幅x深さx深さx π)/ 6で体積を計算します。</li>
		<li>腫瘍体積が120 mm 3(+/- 20 mm3)に達したら、動物を研究対象にします。併用療法コホート(すなわち、対照、mNPH、放射線、および組み合わせ)を含む適切な対照群と治療群があることを確認して、研究を設計します。</li>
		<li>3.1.4で説明されているように、mNPを投与されるマウスを麻酔します。</li>
		<li>アルコールワイプでその領域をきれいにします。AMF治療の3時間前にmNPを腫瘍に注射します。用量が7.5mgの鉄/ cm3 の腫瘍であるような量を注入する。 注:ラボからの未発表データは、最大mNP取り込みが3〜6時間で起こることを示唆しています。</li>
	</ol></li>
	<li>AMF治療<ol><li>マウスを麻酔し、コア温度を維持するために加熱パッドに置きます。</li>
		<li>右反射神経に対する反応の欠如を確認します。マウスのイヤータグまたはその他の金属物を取り外します。</li>
		<li>潤滑された光ファイバー温度プローブをマウスの直腸にそっと置きます。</li>
		<li>カテーテルを腫瘍に挿入し、針を取り除きます。腫瘍からあまり突き出ないようにカテーテルを切断します。 注:光ファイバー温度カテーテルは、マウスが全身麻酔下にある間、つまり、腫瘍加熱手順中にのみカテーテルが所定の位置にある間に配置および除去されます。マウスには、手順時にNSAID鎮痛薬であるケトプロフェン(5 mg / kg)の単回皮下投与が与えられます。カテーテルの留置に関連する短期または長期の不快感または罹患率は観察されていません。</li>
		<li>3センサーの光ファイバー温度プローブをカテーテルに挿入します。カテーテルは、光ファイバー温度プローブセンサーを保護します。</li>
		<li>直腸および腫瘍内プローブを動物の尾にテープで固定して、それらが所定の位置に留まるようにします。</li>
		<li>マウスを50 mLチューブに入れ、頭を下に向けてください。チューブには、麻酔が接続されて配信される頭の近くに穴が必要です。</li>
		<li>セットアップされたコイル内にチューブを配置し、麻酔を再接続します。</li>
		<li>光ファイバー温度プローブをチューブに緩く配置して、環境温度を測定します。</li>
		<li>チラーの電源を入れ、クーラントが循環していることを確認します。</li>
		<li>コンピュータソフトウェアがさまざまな温度を表示していることを確認し、CEM43計算をリアルタイムで表示できるように記録を開始します。必要なCEM43は、以前に決定された用量です。 注意: 磁石をオンにする前に、金属物が急速に熱くなるため、動物に金属物が付着していないことを確認してください。さらに、部屋の全員がペースメーカーを持っていないこと、そして彼らがそこにいても安全であることを確認してください。</li>
		<li>低電力パーセンテージで磁石をオンにします。</li>
		<li>光ファイバー温度プローブが温度変化を記録していることを確認します。フィールドが増加するにつれてAMFがアクティブになると、温度は上昇します。動物のコア温度が38°Cのままであることを確認してください。 調整されたエアジャケットを使用してコア温度を調整します。</li>
		<li>腫瘍の温度レベルを制御する内蔵の制御ダイヤルを使用して、発電機の電源を変更することにより、磁場の強さを調整します。</li>
		<li>AMFを一度所望の用量で遮断することは、使用者によって予め決定されるように(例えばCEM43 40)、腫瘍内で達成される。</li>
		<li>AMFがシャットダウンしたら、コイルからチューブを取り外します。</li>
		<li>マウスをチューブから取り外し、さまざまなプローブとカテーテルを抽出します。必要に応じて、新しい金属製の耳タグで動物にタグを付けます。</li>
		<li>処理が完了したら、チラーをシャットダウンします。</li>
		<li>動物を麻酔から回復させ、合併症がないことを確認します。彼らの行動を監視して、正常に戻ることを確認します。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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著者は開示するものは何もありません。

このシステムの設計と実装は、正確で再現性のあるin vitroおよびin vivo磁性ナノ粒子ハイパーサーミア実験を実施する能力を提供します。AMFの周波数と電界強度が磁性ナノ粒子の種類、濃度、および組織の位置と温度に適切に一致するようにシステムを設計することが重要です。さらに、リアルタイムで温度を正確に監視することは、安全性と正確な熱線量(43°C/ CEMでの累積等価分)の計算にとって非常に重要です。図 1に示すようにプローブを配置することで、 図2に示すように、熱線量と深部体温をリアルタイムで監視できます。
磁性ナノ粒子ハイパーサーミアの正確な送達の最初のステップは、動物とオペレーターにとって安全なシステムを構築することです。システムのすべてのコンポーネントは、運用と配信の観点からもよく理解する必要があります。この状況では、AMF渦電流の可能性を理解し、磁性粒子がどこにあるかを知ることを意味します。アンテナ、またはコイルは、フィールドの形状と強度の重要な要素であり、使用される冷却システムは、コイルの過熱を防ぐために重要です20。導体の外側の電界強度は、導体を流れる電流強度に正比例します。導体の周囲の空間の任意の点での磁場強度は、周囲の領域の導体によって生成される磁場のベクトル和です。磁場は電流の流れに対して直角に生成され、ビオ・サバール逆二乗法則21に従って、導体からの距離の関数として強度が指数関数的に減少します。したがって、正方形のチューブは、コイル内のより均一な磁場のためのin vivo温熱療法に使用されます。潜在的に臨床的に関連するシステムに必要な強度と体積の磁場を生成するには、高い電流が必要です。したがって、アンテナ設計は、かなりの電力レベルに対応できる必要があります。また、AMFアンテナは、インダクタンスが発電機の許容範囲内に収まるように設計する必要があります。通常使用される周波数では、電流の大部分はアンテナ導体の表面に流れるため、表面は抵抗加熱に影響を与えますが、表面の欠陥を排除することで最小限に抑えることができます。この抵抗加熱は、コイルと環境が過熱しないようにするためにコイル冷却システムが必要であることも意味します。
私たちのシステム設計の制限は、周波数と磁場の全範囲を許可しないことですが、細胞、げっ歯類、大型動物に適した磁場を生成することはできます。具体的には、誘導加熱システムから利用可能な最大電界強度は、アンテナ(コイル)に流れる電流に直接関係しています。AMF発電機の定格はキロワットで、利用可能な電圧に利用可能な電流(アンペア)を掛けて計算されます。したがって、500 V制限の10kWシステムの最大アンペア数は20 Aになります。コイルの設計は、どの制限に最初に到達するかを決定し、したがってシステムの制限を決定します。電流によって生成される磁場強度は、導体からの距離の関数として指数関数的に減少します。したがって、同じシステム上で動作する小径コイルと同じ形状の直径の大きいコイルは、コイルの中心での電界強度が低くなります。したがって、必要な磁場のサイズと強度は、AMFジェネレーターの容量によって制限されます。より大きなコイルを構築し、より多くの電力を使用すると、主に渦電流加熱などの追加の懸念が生じます。
このシステムを使用してユーザー、動物、およびシステム自体を保護する場合に対処する必要があるいくつかの安全上の懸念があります。第一に、麻酔の使用中は適切な室内換気を維持しなければならない。第二に、コイルに関連するすべての領域には、高生理食塩水混合物を含む金属や導体がないようにする必要があります。AMFを回避するときは、ユーザーは指輪やその他の宝石を取り外す必要があり、サンプルにはいかなる種類の金属も含まれていてはなりません。最も重要なのは、ペースメーカーやその他の埋め込み型デバイスや物体を使用している人は、AMFを回避する前に医師に相談する必要があります。システムを保護するために、電源が供給される前に発電機とコイルの冷却ニーズが満たされていることを確認するフェイルセーフシステムを使用する必要があります。さらに、赤外線カメラの概要を使用して、意図しない加熱を検出する必要があります。
in vitro研究の場合、従うべき最も重要なステップは、細胞内の鉄の濃度、細胞の濃度、AMFパラメータ、および熱線量評価です。細胞は、磁性ナノ粒子を上清、細胞、またはその両方に配置することにより、磁性ナノ粒子温熱療法で処理/加熱することができます。磁性ナノ粒子の加熱量は、磁性ナノ粒子/ Feのレベルに依存します。細胞のみを内在化した鉄で治療したい場合、私たちの経験では、個々の癌細胞は限られた数の磁性ナノ粒子しか取り込まず、取り込みが最適な場合でも、最適化されたAMFを使用しても、細胞を凝集/ペレット化して細胞加熱状況を作り出す必要があります。培地と細胞の温度を生物学的に関連するレベルに維持することも(加熱されていない場合)、真の加熱を正確に測定するために重要です。ここで説明する14ターンソレノイドコイルは、サンプルを熱制御された水柱に沈めることにより、生物学的に関連する温度を維持することを可能にします。
in vivo研究では、動物の深部温度を維持し、腫瘍内の温度を正確に測定することが重要な要素です。この動物の封じ込めシステムとコイルの設計は、コイル/電力設定による動物の環境の熱ドリフトを排除し、正常な深部体温を維持するのに役立ちます。体深部温度を維持することは、有意義な実験結果を得るために重要です。直腸プローブにより、動物の深部温度をリアルタイムで監視できます。麻酔下にあるとき、動物の深部温度は本質的に低下します。そこで、動物格納容器の周囲に温風を送り込み、コア温度を正常範囲内に維持する環境加熱システムを開発しました。正常なコア温度を維持することは、ハイパーサーミア治療の結果を正確に解釈し、環境要因を排除するために不可欠です。標的組織/腫瘍の複数の部位に温度モニタリングプローブを配置することは、達成された温度と熱線量を正確に評価するために重要です。磁性ナノ粒子を腫瘍内に均一に分布させることは不可能ではないにしても非常に困難であるため、複数の部位の加熱パラメータを知ることは、一貫した正確な組織/腫瘍の熱線量を達成するために不可欠です。インビトロおよびインビボ研究の濃度は可変であることに注意することが重要です。この変動は、細胞がmNPへのアクセスが多い細胞との細胞培養の境界が少ないため、より低い濃度を使用できるためです。in vivoでは、腫瘍の不均一性および複雑な3D形態のために、より高い濃度が必要である。したがって、in vivoとin vitroで同じ濃度の粒子を使用すると、細胞に取り込まれることがはるかに少なくなります。
この原稿では、磁性ナノ粒子温熱療法のための効果的で柔軟な交流磁場発生器およびコイルシステムを開発するために必要なパラメータと機器について説明します。このシステムは、インビトロおよびインビボ研究の両方に使用できます。このシステムは、局所的/標的化された温熱療法と正常組織の温存に効果的であり、他のAMF-mNP温熱療法システムと比較して魅力的です。これらの温熱療法は、さまざまなナノ粒子またはナノキャリアおよび補助治療を使用して、さまざまな用量の効果を調査するために変更することができます。組織の加熱、特に磁性ナノ粒子の加熱は非常に多くの変数の影響を受ける可能性があるため、調査ではパラメータを理解することが不可欠です。これらの基準が満たされれば、磁性ナノ粒子温熱療法は、独立したアジュバント腫瘍制御を含む、多くの分子、細胞、および臨床状況に対処することができる。ここで説明する方法は多大な労力を必要としますが、ガイドラインに従えば、mNP温熱療法の可能性を最大限に引き出すことができます。

温熱療法は歴史的に、単独で、または他の治療法と組み合わせて、癌治療に使用されてきました。それは長い使用の歴史を持っていますが、この治療を提供するための最も有利な方法はまだ議論されており、病気の部位と場所に依存します。温熱伝導の方法には、マイクロ波、高周波、集束超音波、レーザー、および金属ナノ粒子(金や酸化鉄など)が含まれます1,2,3,4。これらの送達方法は、発熱レベルから数百°Cまでの範囲の治療温度につながる可能性があります。温熱療法の生物学的効果は、主に使用される温度と治療期間に依存します5。この論文と目的のために、磁性ナノ粒子ハイパーサーミア(mNPH)に焦点を当てています。この方法では、毒性のないFDA承認の酸化鉄ナノ粒子を使用して、焦点を絞って局所化し、十分に監視し、制御した温度変化を可能にします。
他の温熱療法の落とし穴の1つは、正確な細胞ターゲティングの欠如です。温熱療法は本質的に高い治療比を持たないため、慎重な体温測定とターゲティングが必要です6。mNPHは、mNPの全身的または腫瘍内注射を可能にし、mNPが位置する場所でのみ熱が発生するため、腫瘍に直接治療を標的にします。mNPHは、磁性ナノ粒子が細胞の内側または外側にある場合に有効です。癌治療の場合、mNPHの一般的な概要は、磁性ナノ粒子が注入され(腫瘍内または静脈内に)、次に交番磁場が印加され、ナノ粒子磁極が絶えず再整列し、ナノ粒子に関連する細胞および組織の局所的な加熱をもたらすことです7,8.ナノ粒子の体積と交流磁場(AMF)の周波数/強度を調整することにより、組織内で発生する温度を注意深く制御することができます。
この治療法は、より深い腫瘍がより強いAMFを必要とするため、渦電流加熱のリスクが高まるため、体表面近くの腫瘍でうまく機能します9。ハイパーサーミアが単剤療法として臨床的に使用されているという証拠がありますが、多くの場合、ハイパーサーミアは放射線療法または化学療法と組み合わされ、より標的を絞った抗がん効果につながります10,11,12。放射線療法と組み合わせて機能する温熱療法の臨床的証拠は、以前の出版物でレビューされています13。私たちの研究室では、mNPH法12,14,15を用いて、マウスからブタ、イヌの自然がんまで、さまざまな動物の治療に成功しています。このプロトコルは、単独で、または他の治療法と組み合わせて、局所的な温熱療法の効果を調査することに関心のある人のために設計されています。
温熱療法の最も重要な要素の1つは、標的/腫瘍組織に送達される熱線量をリアルタイムで測定および理解できることです。線量を計算および比較する標準的な方法は、43°Cでの加熱の累積等価分数のデモンストレーションによるものです。このアルゴリズムは、送達システム、最高温度および最低温度(特定の範囲内)、および加熱/冷却パラメータ5,16とは無関係の用量の比較を可能にする。CEM計算は、39〜57°C5の温度に最適です。たとえば、私たちが実施したいくつかの研究では、CEM43 30(つまり、43°Cで30分)の熱線量を選択しました。この線量を選択することで、単独で、または単回線量の放射線と組み合わせて、in vitroで安全で効果的な免疫遺伝学的効果を調べることができました17。
磁性ナノ粒子温熱療法では、適切な送達システムを構築する際に考慮する必要があるいくつかの要因があります。計装設計には、高電力で動作している場合でも磁場供給装置を冷却するためのチラーの使用や、すべての温度、電力評価、および制御システムがアクティブになっていない場合にシステムの電源がオンにならないようにするフェイルセーフ手順など、重要な安全要素が含まれています。さらに、in vivoとin vitroの両方の状況で考慮する必要がある重要な生物学的要因があります。培養細胞を使用する場合、結果に影響を与える可能性のある生理学的変化を避けるために、増殖培地で処理し、一定の生菌温度に維持する必要があります。個々のナノ粒子タイプについては、AMFベースの加熱パラメータを計算する際に比吸収率(SAR)を知ることが重要です。同様に、所望の加熱を達成するために必要な細胞および組織中のmNP/Fe濃度を知ることも重要である。in vivo法では、治療中は動物を麻酔下で維持し、治療中は動物の深部体温を正常なレベルに維持する必要があるため、細部にさらに注意を払う必要があります。麻酔下で起こるように、動物の体温を下げることを許容することは、治療される組織の熱線量に関して、全体的な結果に影響を与える可能性があります。
この原稿では、汎用性の高い磁性ナノ粒子ハイパーサーミアシステムの設計と構築に使用される方法と、考慮する必要のある重要な使用要因について説明します。記載されたシステムは、磁性ナノ粒子温熱療法の堅牢で、一貫性があり、生物学的に適切で、安全で、十分に制御された送達を可能にする。最後に、私たちが実施するmNPH研究には、放射線療法、化学療法、免疫療法などの他の治療法が含まれることが多いことに注意してください。これらの結果が意味のあるものであるためには、供給された熱が他のモダリティの有効性および/または安全性毒性(またはその逆)および動物の幸福にどのように影響するかを判断することが重要です。このため、前述の線量測定および治療状況のために、磁性ナノ粒子温熱療法の投与精度と連続的なコアおよびターゲット温度測定に厳密に注意を払うことが不可欠です。このプロトコルの目標は、安全で効果的な磁性ナノ粒子温熱療法の送達のための簡単で一貫した方法と説明を提供することです。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>.25% Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45000-664</td>
			<td>available from many companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf 22363204</td>
			<td>available from many companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16F10 murine melanoma cells</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-6475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57/Bl6 mice</td>
			<td>Charles river</td>
			<td>027C57BL/6</td>
			<td>6-week-old female mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chiller</td>
			<td>Thermal Care</td>
			<td>NQ 5 series</td>
			<td>chiller that cools the coil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coolant fluid</td>
			<td>Dow Chemical Company</td>
			<td>Dowtherm SR-1</td>
			<td>antenna cooling fluid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071</td>
			<td>available from many companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fiber optic probes, software and chassis</td>
			<td>FISO</td>
			<td></td>
			<td>FISO evolution software used to read the temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR camera</td>
			<td>Flir</td>
			<td></td>
			<td>infrared camera to monitor unintentional heating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iron oxide nanoparticles</td>
			<td>micromod Partikeltechnologie GmbH</td>
			<td>Bionized NanoFerrite</td>
			<td>dextran coated iron oxide nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse coil, solenoid</td>
			<td>Fluxtrol</td>
			<td>custom built</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45000-652</td>
			<td>available from many companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF generator</td>
			<td>Huttinger</td>
			<td>TIG 10/300</td>
			<td>power source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI media</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45000-396</td>
			<td>available from many companies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro and in vivo delivery of magnetic nanoparticle hyperthermia using a custom-built delivery system

温熱療法は癌の治療に長い間使用されてきました。技術は、高温の鉄棒の腫瘍内挿入から、39°C(発熱レベル)から1,000°C(電気焼灼)の温度および数秒から数時間の治療時間での全身送達腫瘍抗体標的磁性ナノ粒子までさまざまです。温度-時間関係(熱線量)は、組織のアブレーションをもたらす高熱線量と、血流の増加、薬物の蓄積、免疫刺激などの亜致死効果をもたらす低熱線量での効果を決定します。現在最も有望な治療法の1つは、磁性ナノ粒子温熱療法(mNPH)です。この技術は、非侵襲的、非毒性の交流磁場で全身的または腫瘍内に送達され得る磁性ナノ粒子を活性化することを含む。磁性ナノ粒子のサイズ、構造、会合、および磁場の周波数と電界強度は、主要な加熱決定要因です。私たちは、大小動物モデルや培養細胞に再現性のある磁性ナノ粒子ハイパーサーミアを提供するための高度な機器と技術を開発しました。このアプローチは、複数の場所で継続的なリアルタイムの温度モニタリングを使用して、非標的組織の加熱を制限しながら、標的組織(腫瘍)または細胞に明確に定義された熱線量を送達することを可能にします。複数のサイトでの温度の正確な制御と監視、および業界標準のアルゴリズム(43°C/CEM43での累積等価分)の使用により、熱線量の正確な決定と定量化が可能になります。さまざまな温度、熱線量、生物学的効果を可能にする当社のシステムは、商業的買収と社内のエンジニアリングおよび生物学の開発を組み合わせて開発されました。このシステムは、エキソビボ、インビトロ、およびインビボ技術間の迅速な変換を可能にする方法で最適化されています。このプロトコルの目的は、再現性のある正確な磁性ナノ粒子療法(mNP)温熱療法を提供するための効果的な技術とシステムを設計、開発、および実装する方法を実証することです。

インビトロ研究 細胞は、磁性ナノ粒子/鉄とAMFの量と濃度が適切に一致している場合にのみ、所望の温度と熱線量を達成および維持します。磁性ナノ粒子を使用してin vitro(およびin vivo)で細胞を加熱する場合、内部化された磁性ナノ粒子を有する細胞で温熱を達成するためには、特定のレベルの細胞内mNP / Feが必要であり、mNP負荷細胞の数と近接性が必要になることに注意してください。標的細胞/組織内のmNP / Feのレベルが加熱効果を達成するのに十分である場合、磁場の周波数と強度を調整して、目的の温度と効果を達成できます。適切にメッキされれば、異なる用量とタイミングの間の遺伝的および分子的違いを調べるさらなる研究を追求することができます17。図1は、インビトロ法の概略 図 を表す。
これらのin vitroメソッドは、細胞のmRNAおよびタンパク質発現変化を調べるために使用できます。私たちの研究室の最近の例では、CEM43 30 mNPH処理、8 Gy放射線治療、および組み合わせ後の免疫遺伝学的差異が決定されました。免疫経路と細胞毒性経路の発現の類似点と相違点を特定し、効果の背後にあるメカニズムと、それらがどのように相乗的に組み合わされるかをよりよく理解することができました17。すべての実験では、さまざまな環境および加熱されたコントロールサンプルを利用します。対照は、温熱療法を受けている対照と比較して、異なるmRNAおよびタンパク質発現レベルを有する。
インビボ試験 in vivo研究では、追加の考慮事項があります。目標熱線量に関係なく、治療対象の動物の生理学的に許容可能なコア温度を維持することが絶対に不可欠です。.これは、深部体温がすぐに失われる可能性があるため、麻酔下のげっ歯類では困難な場合があります(加熱パッドなどの深部温度調節技術が必要になることがよくあります)。体温が正常よりも低いと、AMF-mNPHを過度に押し出す必要が生じる可能性があり、腫瘍内で特定の熱線量を達成しようとすると、非標的組織において許容できない影響をもたらす(非標的組織渦電流加熱はそのような可能性の1つである)。深部体温のわずかな偏差でさえ、腫瘍または正常組織に望ましくない生理学的合併症を引き起こす可能性があります。前述のように、繰り返しますが、正確で再現性のある加熱を行うには、mNP / Fe組織濃度、AMF周波数、および電界強度温度モニタリングパラメータと、ターゲット組織のサイズと深さを一致させることが不可欠です。測定可能な加熱を可能にするために、腫瘍内にmNPのベースライン濃度がなければなりません。熱のレベル/能力は、mNP組織濃度(mg Fe / g組織)および腫瘍内のそれらの相対分布だけでなく、AMFの頻度およびその後の電界強度にも依存する。上記のいずれかの変化は、組織内の達成可能な温度の異なる範囲につながる可能性があります。長年の経験を通じて、前臨床腫瘍治療に使用する濃度とAMFシステムの頻度と電界強度を最適化し、安全で効果的な活性化を可能にしました。すべての組織部位の温度/熱線量を測定することは不可能であるため、 図2に示すように、リアルタイムの有効性と安全性の評価を可能にする戦略的な場所にできるだけ多くの光ファイバー温度プローブを配置することも不可欠です。これらのプローブは、実験全体の温度の記録を可能にし、実験の正確な線量測定と熱履歴を可能にします。 図3 は、in vivo実験中に生成された曲線を示しており、温度を綿密に監視し、腫瘍の温度を所望の範囲内に維持するようにシステムを調整する機能を強調しています。 図4 は、in vivoの方法をまとめたものである。
これらのin vivo法は、in vitro法と同様に、異なる癌の種類、異なる温熱療法の用量、およびさまざまな組み合わせ治療を調査するために使用できます。たとえば、私たちの研究室での以前の研究では、温熱療法と化学療法の組み合わせを調査してきました12。また、有効性や分子機構の解明のために、数多くの温熱療法や放射線実験も行っています。これらの実験のための対照マウスは、温熱療法の実際の生成を除くすべての手順を受ける。 図5 には、in vitroおよびin vivo mNPハイパーサーミア処理(mNPH)後に発現差のある遺伝子を示す2つの火山プロットが含まれています。これらの図は、温熱療法の効果を監視するために分子技術を使用する方法の例です。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61413/61413fig01.jpg"> 図1:インビトロmNP温熱療法の概略図。 この回路図は、in vitro磁性ナノ粒子温熱療法の方法を示しています。加熱を確実に行うために、細胞は適切なmNP取り込みのために十分な粒子および時間を提供しなければならない。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61413/61413fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61413/61413fig02.jpg"> 図2:温度監視用のカテーテルの配置。 この図は、腫瘍および/または腫瘍領域のさまざまな場所で温度を記録するために光ファイバー温度プローブを収容するカテーテルの配置を示しています。この図は参考文献19から適応されています。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61413/61413fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61413/61413fig03.jpg"> 図3:マウス腫瘍の治療中のリアルタイムの温度モニタリング。 このグラフは、in vivo実験中に、腫瘍内の深部体温、環境温度、および複数の温度を監視できるリアルタイムの温度測定値を示しています。腫瘍内の温度の制御は、図の拡大部分の最小の大規模な変動によって実証されます。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61413/61413fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61413/61413fig04.jpg"> 図4:インビボmNPハイパーサーミア回路図。 この回路図は、生体内磁性ナノ粒子温熱療法の方法を示しています。十分なナノ粒子の注入、ならびに分布および吸収のための十分な時間は、所望の熱線量を供給する能力を保証する。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61413/61413fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61413/61413fig05.jpg"> 図5:遺伝子発現の違い。 インビトロ(A)およびインビボ(B)mNP温熱療法に続く遺伝子発現差。これらの火山プロットは、in vitroおよびin vivo mNPH法の両方について、log2のx軸に遺伝的変化を表し、y軸に有意性を示します。各円は異なる遺伝子を表し、20個の最も重要な発現差のある遺伝子が標識されています。遺伝子がx軸のゼロから離れるほど、倍率の変化が大きくなり、y軸の遺伝子が高いほど、p値は低くなります。どちらも同じ熱線量でしたが、in vivo温熱療法はin vitroよりも大きな遺伝子発現変化をもたらしました。これらのプロットは、記載されたプロトコルを用いて生成することができる生物学的データの例である。in vitro火山プロットは、ref.17から適応されています。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61413/61413fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル 1.<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61413/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

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In Vitro and In Vivo Delivery of Magnetic Nanoparticle Hyperthermia Using a Custom-Built Delivery System

このプロトコルは、高度な送達および監視システムを使用して、磁性ナノ粒子温熱の正確な送達に必要な技術と方法論を提示します。

特注送達システムを用いた磁性ナノ粒子温熱療法のin vitroおよびin vivo送達

Hyperthermia has long been used in the treatment of cancer. Techniques have varied from the intra-tumoral insertion of hot iron rods, to systemically ...

in-vitro-vivo-delivery-magnetic-nanoparticle-hyperthermia-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

4.2K ビュー.  Dartmouth College. このプロトコルは、高度な送達および監視システムを使用して、磁性ナノ粒子温熱の正確な送達に必要な技術と方法論を提示します。

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Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery. Fresh patient tissue obtained at the time of surgery is sliced and maintained in culture. The ex vivo model system allows for the physical delivery of genes into intact patient tissue and gene expression is analysed by bioluminescence imaging using the IVIS detection system. The bioluminescent detection system demonstrates rapid and accurate quantification of gene expression within individual slices without the need for tissue sacrifice. This slice tissue culture system may be used in a variety of tissue types including normal and malignant tissue and allows us to study the effects of the heterogeneous nature of intact tissue and the high degree of variability between individual patients. This model system could be used in certain situations as an alternative to animal models and as a complementary preclinical mode prior to entering clinical trial.

Ex Vivo Culture of Patient Tissue & Examination of Gene Delivery

This article describes the culture of patient tissue slices for gene delivery studies and subsequent analysis of gene expression using IVIS bioluminescence imaging.

遺伝子デリバリーの患者の組織及び審査のex vivoでの文化

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

医学

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

磁気共鳴イメージング、体積CT画像と超音波を用いた乳がんの骨転移のヌードラットモデルにおける血管新生のマルチモーダルイメージング

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue revascularization and cell survival. In addition, further observations revealed that specific stem cells, such as cardiac stem cells, mesenchymal stem cells and cardiospheres have the ability to integrate within the surrounding myocardium by differentiating into cardiomyocytes, smooth muscle cells and endothelial cells.
Here, we present the materials and methods to reliably deliver noncontractile cells into the left ventricular wall of immunodepleted mice. The salient steps of this microsurgical procedure involve anesthesia and analgesia injection, intratracheal intubation, incision to open the chest and expose the heart and delivery of cells by a sterile 30-gauge needle and a precision microliter syringe.
Tissue processing consisting of heart harvesting, embedding, sectioning and histological staining showed that intramyocardial cell injection produced a small damage in the epicardial area, as well as in the ventricular wall. Noncontractile cells were retained into the myocardial wall of immunocompromised mice and were surrounded by a layer of fibrotic tissue, likely to protect from cardiac pressure and mechanical load.

Intramyocardial cell delivery in murine models of cardiovascular diseases, such as hypertension or myocardial infarction, is widely used to test the therapeutic potential of different cell types in regenerative studies. Therefore, a detailed description and a clear visualization of this surgical procedure will help to define the limits and advantages of cardiovascular cell therapeutic analyses in small rodents.

心筋内細胞送達：マウスハーツの観測

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue ...

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these diseases. Chronic retinal diseases such as retinal oedema or neovascularization usually require multiple intraocular injections to effectively treat the condition. However, the risks associated with these injections increase with repeated delivery of the drug. Therefore, alternative delivery methods need to be established in order to minimize the risks of reinjection. Several other investigations have developed methods to deliver drugs over extended time, through materials capable of releasing chemicals slowly into the eye. In this investigation, we outline the use of Elvax 40W, a copolymer resin, to act as a vehicle for drug delivery to the adult rat retina. The resin is made and loaded with the drug. The drug-resin complex is then implanted into the vitreous cavity, where it will slowly release the drug over time. This method was tested using 2-amino-4-phosphonobutyrate (APB), a glutamate analogue that blocks the light response of the retina. It was demonstrated that the APB was slowly released from the resin, and was able to block the retinal response by 7 days after implantation. This indicates that slow-release drug delivery using this copolymer resin is effective for treating the retina, and could be used therapeutically with further testing.

This paper details how Elvax 40W can be used as a slow-release method for drug delivery to the adult rat retina. The protocol for preparing, loading, and delivering the drug-resin complex to the eye is described.

ラット網膜へのエルバックス40Wを通じて徐放性ドラッグデリバリー：慢性症状の治療のための含意

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences between the murine and human respiratory systems, especially in their upper respiratory tracts (URT). In some models, these differences in the murine nasal cavity can have a significant impact on disease progression and presentation in the lower respiratory tract (LRT) when using intranasal instillation techniques, potentially limiting the usefulness of the mouse model to study these diseases. For these reasons, it would be advantageous to develop a technique to instill bacteria directly into the mouse lungs in order to study LRT disease in the absence of involvement of the URT. We have termed this lung specific delivery technique intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation. This noninvasive technique minimizes the potential for instillation into the bloodstream, which can occur during more invasive traditional surgical intratracheal infection approaches, and limits the possibility of incidental digestive tract delivery. IMIT is a two-step process in which mice are first intubated, with an intermediate step to ensure correct catheter placement into the trachea, followed by insertion of a blunt needle into the catheter to mediate direct delivery of bacteria into the lung. This approach facilitates a &#62;98% efficacy of delivery into the lungs with excellent distribution of reagent throughout the lung. Thus, IMIT represents a novel approach to study LRT disease and therapeutic delivery directly into the lung, improving upon the ability to use mice as surrogates to study human respiratory disease. Furthermore, the accuracy and reproducibility of this delivery system also makes it amenable to Good Laboratory Practice Standards (GLPS), as well as delivery of a wide range of reagents which require high efficiency delivery to the lung.

Intubation-mediated Intratracheal IMIT Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation of reagents is an excellent, noninvasive method for studying respiratory disease, as well as a method for instilling therapeutic reagents directly into the lung. It is a rapid and highly reproducible method which is suitable for preclinical testing.

挿管媒介気管内（IMIT）点眼：非侵襲的、肺特異的送達システム

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

マウス収縮圧力を測定するために子宮内テレメトリ<em&gt;インビボ</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

ヒト腫瘍異種移植片からマウス細胞の枯渇は大幅に標的細胞の下流分析を向上させます

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Using Multi-fluorinated Bile Acids and In Vivo Magnetic Resonance Imaging to Measure Bile Acid Transport

Along with their traditional role as detergents that facilitate fat absorption, emerging literature indicates that bile acids are potent signaling molecules that affect multiple organs; they modulate gut motility and hormone production, and alter vascular tone, glucose metabolism, lipid metabolism, and energy utilization. Changes in fecal bile acids may alter the gut microbiome and promote colon pathology including cholerrheic diarrhea and colon cancer. Key regulators of fecal bile acid composition are the small intestinal Apical Sodium-dependent Bile Acid Transporter (ASBT) and fibroblast growth factor-19 (FGF19). Reduced expression and function of ASBT decreases intestinal bile acid up-take. Moreover, in vitro data suggest that some FDA-approved drugs inhibit ASBT function. Deficient FGF19 release increases hepatic bile acid synthesis and release into the intestines to levels that overwhelm ASBT. Either ASBT dysfunction or FGF19 deficiency increases fecal bile acids and may cause chronic diarrhea and promote colon neoplasia. Regrettably, tools to measure bile acid malabsorption and the actions of drugs on bile acid transport in vivo are limited. To understand the complex actions of bile acids, techniques are required that permit simultaneous monitoring of bile acids in the gut and metabolic tissues. This led us to conceive an innovative method to measure bile acid transport in live animals using a combination of proton (1H) and fluorine (19F) magnetic resonance imaging (MRI). Novel tracers for fluorine (19F)-based live animal MRI were created and tested, both in vitro and in vivo. Strengths of this approach include the lack of exposure to ionizing radiation and translational potential for clinical research and practice.

Using Multi-fluorinated Bile Acids and In Vivo Magnetic Resonance Imaging to Measure Bile Acid Transport

Tools to diagnose bile acid malabsorption and measure bile acid transport in vivo are limited. An innovative approach in live animals is described that utilizes combined proton (1H) plus fluorine (19F) magnetic resonance imaging; this novel methodology has translational potential to screen for bile acid malabsorption in clinical practice.

多フッ素化された胆汁酸を用いて<em&gt;インビボ</em胆汁酸輸送を測定するために&gt;磁気共鳴イメージング

Along with their traditional role as detergents that facilitate fat absorption, emerging literature indicates that bile acids are potent signaling ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening pulmonary manifestations. Ivacaftor (IVA) and ivacaftor-lumacaftor (LUMA) combination are two new breakthrough CF drugs that directly modulate the activity and trafficking of the defective CFTR-protein. However, there is still a dearth of understanding on pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters and the pharmacology of ivacaftor and lumacaftor. The HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of the concentrations of ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate, and lumacaftor in biological fluids in patients receiving standard ivacaftor or ivacaftor-lumacaftor combination therapy has previously been developed by our group and partially validated to FDA standards. However, to allow the high-throughput analysis of a larger number of patient samples, our group has optimized the reported method through the use of a smaller pore size reverse-phase chromatography column (2.6 &#181;m, C8 100 &#197;; 50 x 2.1 mm) and a gradient solvent system (0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: held at 70% B; 2.7-2.8 min: 70-90% B; 2.8-4.0 min: 90% B washing; 4.0-4.1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: held at 40% B) instead of an isocratic elution. The goal of this study was to reduce the HPLC-MS analysis time per sample dramatically from ~15 min to only 6 min per sample, which is essential for the analysis of a large amount of patient samples. This expedient method will be of considerable utility for studies into the exposure-response relationships of these breakthrough CF drugs.

Ivacaftor and ivacaftor-lumacaftor combination are two new CF drugs. However, there is still a dearth of understanding on their PK/PD and pharmacology. We present an optimized HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of ivacaftor and its major metabolites, and lumacaftor.

Ivacaftor、主要な代謝産物および嚢胞性線維症患者の体液中の Lumacaftor の臨床サンプルの高スループット分析のための最適化された LC-MS/MS 法

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

体外血液脳関門ブタ脳血管内皮細胞に基づくモデルの確立のための改良法

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...