この作業は、米国大豆委員会の助成金1940-352-0701-Cと米国農務省森林局の支援を受けました。AESのフィル・ハンフリーからのサポートと詳細情報に感謝します。

1.基板の準備
<ol><li>用途に適した基板表面を使用してください。木材の場合、これらのベニヤは合板および単板集成材(LVL)の製造に使用されるため、信頼できる生産者からの厚さ約0.6〜0.8 mmのスライスされたベニヤを使用してください。これらは、ベニヤサプライヤーから、厚さ0.6〜0.8mmのシートとして入手し、側面を305mmにカットします。一貫した基材は、その表面の滑らかさと一貫した厚さのためにハードメープル(Acer saccharum)面ベニヤであり、拡散多孔質で高弾性の広葉樹です。メープルフェースベニアはキャビネットの建設に一般的に使用され、通常は欠陥がありません。</li>
	<li>使用前に、積み重ねずに、21°C、相対湿度50%(RH)で少なくとも1日コンディショニングします。過度に波打っている、表面に凹凸がある、変色などの欠陥があるベニヤは避けてください。 注:他の木材種を使用して、これらの種との接着剤の接着性能を理解することができます。ただし、拡散多孔質広葉樹と、初期木材から後期木材への段階的な移行を伴う針葉樹は、それらの均一性のために推奨されます。木材は酸性または塩基性であるか、接着剤の硬化プロセスを変更する可能性のある抽出物が表面に含まれている可能性があるため、注意してください。さらに、切断時からベニヤ製造までの樹木の加工は、接着強度を変化させることができる12,13。ABESは少量の木材を使用しているため、木材の含水率やベニヤチェックの深さなど、他のテストで発生する木材の変動の影響を受けにくいです。</li>
	<li>ベニヤの側面にエッジに沿って緩んだ繊維がなく、サンプルの接着後の変更がないため、接着強度を過大評価する傾向があるため、接着製品に大きな接着剤の絞り出しがないことを確認してください。</li>
</ol>2. 標本の作製
<ol><li>木材標本を21°C、50%RHで少なくとも1日間コンディショニングします。ベニヤに亀裂、変色、または粒子の不規則性がないか、試験片を切断するときに避けてください。</li>
	<li>空気圧駆動の試験片切断装置が動作していることを確認してください。</li>
	<li>必要な試験片サイズ20 mm x 117 mmを厚さ0.6〜0.8 mmのメープルベニヤに切断する特殊なダイカッターを使用します(図1、 材料表)。<ol><li>ベニヤの木目が長尺方向と平行になるように、少なくとも150 mm x 300 mmのベニヤを切断刃の下に置き、空気圧ボタンを押して20 mm x 117 mmの各木片を切断します。</li>
		<li>切断刃の下のベニヤを切断されていない領域に移動し、ボタンをもう一度押して別の木片を切り取ります。ベニヤが完全に細かく切断されるまで続けます。 注意: 試験片の長方向が粒子方向と平行でない場合、試験中に接着部分から離れた木材に早期破壊が発生する可能性があります。</li>
	</ol></li>
	<li>木材以外の材料については、適切な技術を使用して標本を切断します。試料カッターで材料を切断できない場合は、材料を切断するものを使用して、必要なサイズに切断します。接合面積が小さいため、切断が正確であり、試験片がエッジに沿って接着面に破片がないことが重要です。</li>
</ol>3.機器の操作性
<ol><li>ボンディングプロセスでは、ABES機器が標準操作手順11に従って正しく動作していることを確認してください。サンプルの接着と破壊のためのABESユニットの前面の設定は、LPプレス0.2MPa、HPプレス0.2MPa、プル0.65MPa、および冷気0.2MPaです。</li>
	<li>圧力が低すぎると、グリップクランプとプラテンがサンプル上でゆっくりと閉じたり不均一になったりして、接着強度が正しくなくなるため、少なくとも0.62 MPa(90 psig)の空気供給圧力を使用してください(図2、上)。</li>
	<li>前のサンプルから絞り出された接着剤のプラテンをきれいにします。プラテンの温度を希望の温度に調整し、サンプルを接着する前に平衡化します。</li>
	<li>木材を接着するには、21°C、50%RHの部屋で機器を操作します。これが不可能な場合は、試験片のサイズが小さいために木材の水分が急激に変化するため、接着するまで調整された試験片をビニール袋に入れてください。</li>
	<li>キネティックキュアデータを取得するには、ASTM D7998-1911に概説されているように、機械的および電子的な速度がデータを正確に収集するのに十分になるように方法を設計してください。</li>
</ol>4. 接着剤による試料の接着
注:合板のようなラミネート接着剤からバインダー用途のスプレー可能な接着剤まで、粘度と固形分の割合に大きなばらつきがあるため、接着剤の塗布は木材接着剤にとって重要な問題です。木材接着剤は一般的に水性であるため、蒸発は小さな問題にすぎません。ただし、多孔質木材に水を染み込ませることが重要です。
<ol><li>研究中の接着剤5 mgを端子に0.5 cm広げて接着領域を覆い、他の試験片に移しますが、過度に絞り出すことはありません。比較的一定の接着剤の拡散率を得るには、木材標本を天秤に風袋引きし、接着剤を塗布した後に再計量します。</li>
	<li>小さな接着領域が使用され、強度は接着領域に対する引っ張り力として決定されるため、接着剤の分散、試験片を重ね、2つの試験片が整列していることを確認する際には細心の注意を払ってください(図2 下)。異なる接合領域を使用できますが、重ねせん断試験のメカニズムのばらつきにより、強度は必ずしも比較できるとは限りません。 注:文献では、接着剤の一貫性に応じて、接着剤を木材に塗布するいくつかの方法を推奨しています。当初推奨された接着剤塗布方法は、専用に設計されたマイクロスプレー装置10を使用していたが、これは乱雑で遅く、接着剤のレオロジーに大きく依存することがわかった。この方法は、パーティクルボードや配向性ストランドボードのバインダー用途で使用されるように、接着剤を個別のドットとして適用しましたが、印刷方法はより信頼性が高いようです14。マイクロピペット塗布法では、再現性のある量の接着剤10を供給することができるが、均等に分配することはやや困難である。スパチュラ法は、接着領域に接着剤を均一に分布させるために最も効果的であり、測定量を得るためのマイクロバランスが推奨されます11。</li>
	<li>最終強度データ<ol><li>試験片を120°Cで2分間接着し、接着中のホットプレスが木材を乾燥させるため、21°Cおよび50%RHで一晩コンディショニングします。木材を接着するには、ABESテスターのグリップを閉じてサンプルを所定の位置にロックし、サンプルがテスターと位置合わせされていることを確認します。次に、機械のスタートボタンを押して、120°Cのプラテンを重ねた部分を2分間押してから、プラテンを引っ込めてグリップを緩め、サンプルを除去できるようにします。 注意: 硬化の時間と温度は、用途と接着剤の化学的性質によって決まります。接合温度と時間は、異なる接合温度と時間を使用して最大強度の条件を決定することにより、強度が最高プラトーに達するように最適化する必要があります。木質接着の場合、乾式せん断強度のテストは価値がありますが、湿式試験は一般に接着耐久性を判断するためにより重要であり、サンプルを水に4時間の室温浸漬する必要があります。</li>
		<li>テストの場合は、ABESテスターのグリップを閉じてサンプルがテスターと位置合わせされていることを確認して、サンプルを所定の位置にロックします。次に、スタートボタンを押すと、機器の一方の端がサーボドライブを介して引っ張られ、サンプルのもう一方の端がグリップに取り付けられたロードセルを引っ張ります。この引っ張りは、結合が壊れるまで続きます。コンピューターは、サンプルが耐えることができる最大の力を記録し、それは接着強度として記録されます。<ol><li>乾燥したサンプルと水に浸したサンプルにも同じ手順を使用します。破断力を測定する際には、接着剤が非常に強い場合、木材が滑る可能性があるため、グリップが木材をしっかりと保持するように注意してください。サンプルが接着領域の外側で壊れた場合は、接着剤ではなく木材の強度を測定しているため、値を破棄します。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>運動強度の発達<ol><li>接着剤の強度発現率を決定して、大規模製品に必要なプレス時間を見積もります。温度と時間を変更することを除いて、手順4.3と同じ手順に従います。100°Cのプラテン温度で、10、30、60、90、120、150、180、および210秒の接着時間を使用して強度のテストを開始します。続いて、温度を10°C上げ、低い接合時間で強度対時間の直線部分がなくなるまで接合時間を繰り返します。</li>
		<li>接着後、プラテンを引っ込め、ABESの空冷機能を使用してサンプルを室温近くまで冷却し、サンプルの強度を測定します。低いプレス時間から始めて、後続のサンプルの時間を最初に増やすことにより、時間の増加が強度をほとんどまたはまったく増加させなくなるまで、強度対時間データを収集します。次に、より高い温度で同じシーケンスを実行すると、強度対時間および硬化速度のプロットが傾きとして得られます(図3)。 注意: 図3a10のフェノール接着剤データは、さまざまな時間での強度発現に対する温度の影響を示しています。図3bは、温度に対する回帰等温強度発現率を示しています。等温強度発現量を得るために、試験前に試料を冷却した。尿素ホルムアルデヒド15などのいくつかの接着剤は、劣化が起こり始める前に最適な接着時間と温度を持っています。この方法では、この問題を検出し、最適な条件を決定できます。</li>
	</ol></li>
	<li>耐熱性<ol><li>製品が特定の温度耐性を満たす必要がある場合は、接着されたサンプルをABESユニットにクランプします。プラテンをその温度、たとえば木材が劣化し始める220°Cに加熱した後、プレ接着サンプル上に2分間閉じてから開いて、4.3.2のように接着強度を測定し、接着温度120°Cと比較した接着剤の熱軟化を決定します。</li>
		<li>サンプルのプラテンを30分間閉じてから強度をテストして、接着剤が熱劣化しているかどうかの強度を判断することを除いて、このテストを繰り返します。プラテンの放出とテスト強度は、加熱前の値と比較したサンプルの耐熱性を決定します。この種の手順は、木材接着剤16を試験するために使用された。ABESは急速加熱を使用し、サンプルを別の機械に移動せずに高温中の強度を測定できるため、2つの故障モード(熱軟化または劣化)を区別するために使用できます。熱軟化は、加熱直後に強度損失を生じ、通常は回復可能である。化学的劣化は高温で時間の経過とともに徐々に起こり、冷却時に機械的強度を回復しません。 注:接着剤メーカーは、強度損失が熱軟化によるものか化学的劣化によるものかを区別する必要があります。他の熱分析を含め、軟化転移を測定できる方法は数多くありますが、機械的性質の変化と化学構造を区別できません。</li>
	</ol></li>
</ol>5. 接合面の破損画像解析
<ol><li>主な目的は接着強度または凝集力の発現率を決定することであるため、破損が接着剤内にあり、基板への接着(図4)または基板の破損ではないことを確認してください。基板の破損が発生した場合、接着剤は十分な強度を持っています。あるいは、バルク接着剤における凝集破壊は、接着弱さを示す。ただし、接着と接着剤の相間破壊のどちらを選択するかを決定することは困難な場合があります17。木材分析のために様々な方法が開発されている18。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lambuth, A., Pizzi, A., Mittal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+adhesives+for+wood.">Protein adhesives for wood.</a> Handbook of Adhesive Technology. , 457-477 (2003).</li><li>Keimel, F. A., Pizzi, A., Mittal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Historical+development+of+adhesives+and+adhesive+bonding.">Historical development of adhesives and adhesive bonding.</a> Handbook of Adhesive Technology. , 1-12 (2003).</li><li>Marra, A. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+some+process+variables+on+the+lap-shear+strength+of+aspen+strands+uniformly+coated+with+pmdi-resin.">The effect of some process variables on the lap-shear strength of aspen strands uniformly coated with pmdi-resin.</a> Wood and Fiber Science. 36 (2), 228-238 (2004).</li><li>Pizzi, A., Pizzi, A., Mittal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urea-formaldehyde+adhesives.">Urea-formaldehyde adhesives.</a> Handbook of Adhesive Technology. , 635-652 (2003).</li><li>O'Dell, J. L., Hunt, C. G., Frihart, C. 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R., Dunky, M., Rohumaa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+wood+bonds:+going+beyond+what+meets+the+eye.">Understanding wood bonds: going beyond what meets the eye.</a> Reviews of Adhesives and Adhesion. 6 (4), 369-440 (2018).</li><li>Frihart, C. R., Dally, B. N., Wescott, J. M., Birkeland, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-Based+Adhesives+and+Reliable+Rapid+Small+Scale+Bond+Strength+Testing.">Bio-Based Adhesives and Reliable Rapid Small Scale Bond Strength Testing.</a> International Symposium on Advanced Biomass Science and Technology for Bio-based Products. , (2009).</li></ol>

著者は開示するものは何もありません。

手順の重要なステップは次のとおりです:基板の選択、試料の準備、装置の操作性、およびサンプルの接着。
基板は強く、欠陥が最小限でなければなりません(滑らかで、平らで、ひび割れや変色はありません。サンディングされていない、回転式カットキャビネットは、サトウカエデ(Acer saccharum)を含む拡散多孔質広葉樹のベニヤに面することが好ましい。サンデ?...

木材接着は最大の単一接着剤市場であり、森林資源の効率的な利用につながっています。何世紀にもわたって、無垢材は家具建設を除いてほとんどの用途に使用されており、製品の使用中の耐久性以外の試験基準はありませんでした。しかし、接着木材製品は、バイオベースの接着剤を使用して、合板と集成材の梁から始めて、より一般的になりました1,2。当時は満足のいく製品でしたが、大豆、カゼイン、血液のりをホルムアルデヒドを含む合成接着剤に置き換えることで、特性が向上しました。これらの新しい接着剤のより高い性能は、ほとんどのバイオベースの接着剤で達成可能なよりも高い性能期待で定義された試験基準につながりました。合成接着剤はまた、パーティクルボードを形成するためのおがくず、さまざまな密度のファイバーボードを形成する繊維、配向性ストランドボードおよび平行ストランド木材を提供するチップ、合板および単板材を生成するベニア、ならびにフィンガージョイント材、集成材、クロスラミネート材、および木材Iジョイスト3。これらの各製品には、独自のテスト基準4があります。したがって、新しい接着剤の開発には、十分な強度を発現する可能性があるかどうかを判断するために、多くの配合作業と広範なテストが必要になる場合があります。この時間のかかるテストと、木材の特性と木材接着の複雑さ5により、新しい接着剤の開発が制限されていました。さらに、木材接着剤の機械的特性は、ニート6とは対照的に、木材表面間で硬化すると異なる場合があります。木材と接触した硬化は、接着剤と木材との複雑な相間および化学的相互作用に加えて、接着剤からの水および低分子量成分を逃がすことを可能にする3,7。
自動接着評価システム(ABES)の開発は、迅速かつ使いやすいため、木材接着剤の強度発現を理解するのに非常に役立ちました8,9,10。このシステムは、ラップせん断サンプルを結合し、結合を切断するために必要な張力下での力を測定する一体型ユニットです。その有用性は、このシステム11を使用するASTM法D7998-19の開発につながった。このシステムは、もともと温度と時間の関数として接着強度の発達を測定するために設計されましたが、硬化した接着剤の耐熱性を測定し、日常的な接着強度評価も行うことができます。ABESテストは、他のテストと同様に非常に便利な予備スクリーニングツールですが、制限があり、すべての特定の製品強度および耐久性テストに取って代わるものではありません。
ゲルタイムレオメトリーから示差走査熱量測定、動的機械分析、および多くの種類の分光法に至るまで、接着剤の硬化特性を測定する多くの手段がありますが、機械的強度の発達を測定するのはABES法だけです。これには、加熱、冷却、およびインプレース引張試験のために厳密に制御された機器が必要です11。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adhesive</td>
			<td>Supplied by user</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Normal supply house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mark II Automated Bonding Evaluation System (ABES-II)</td>
			<td>Adhesive Evaluation Systems Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatically driven sample cutting device</td>
			<td>Adhesive Evaluation Systems Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular spatula</td>
			<td>Normal supply house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood supply &#8211; Hard maple</td>
			<td>Besse Forest Products Group</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standard test method astm d 7998-19 for the cohesive strength development of wood adhesives

硬化した木材接着剤の特性は、木材への水やその他の成分の損失、接着剤の硬化に対する木材の影響、および木材間期に対する接着剤の浸透の影響のために研究が困難です。したがって、きちんとした接着フィルムの通常のテストは一般に有用ではありません。木材接着剤の接着強度のほとんどのテストは遅く、面倒であり、木材の影響を強く受ける可能性があり、硬化の動力学に関する情報を提供しません。ただし、試験方法ASTM D 7998-19は、木質結合の強度を迅速に評価するために使用できます。メープルフェースベニヤのような滑らかで均一で丈夫な木材表面と十分な接着圧力を使用することで、接着強度に対する接着力と木材強度の影響が減少します。この方法には、主に3つの用途があります。1つ目は、接着強度の発達に関する一貫したデータを提供することです。2つ目は、接着ラップせん断サンプルの乾式強度と湿式強度を測定することです。3つ目は、熱感度をすばやく評価し、熱軟化と熱劣化を区別することにより、接着剤の耐熱性をよりよく理解することです。

この手順は、林産物研究所でのタンパク質接着剤の研究に広く使用されています。2MPa未満の湿式接着強度は、さらなる木材接着試験を保証するには不十分であり、3MPaを超えることはさらなる試験の有望な結果であることが判明しました19。木材加工条件12、13の感度を実証するのに有用であることが示されている。さらなる例は、...

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Standard Test Method ASTM D 7998-19 for the Cohesive Strength Development of Wood Adhesives

木材の接着結合の乾燥強度と湿潤強度の両方を迅速かつ一貫して評価するための手順、ASTM D7998-19を紹介します。この方法は、温度と時間の関数としての強度発現または250°Cまでの強度保持に関する情報を提供するためにも使用できます。

木材接着剤の凝集力開発のための標準試験方法ASTM D 7998-19

The properties of cured wood adhesives are difficult to study because of the loss of water and other components to the wood, the influence of wood on the ...

standard-test-method-astm-d-7998-19-for-cohesive-strength-development

Research

JoVE Journal

Bioengineering

2.8K ビュー.  USDA, Forest Service. 木材の接着結合の乾燥強度と湿潤強度の両方を迅速かつ一貫して評価するための手順、ASTM D7998-19を紹介します。この方法は、温度と時間の関数としての強度発現または250°Cまでの強度保持に関する情報を提供するためにも使用できます。

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A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro follicle techniques provide a tool to model follicle development in order to investigate basic biology, and are further being developed as a technique to preserve fertility in the clinic1-4. Our in vitro culture system employs hydrogels in order to mimic the native ovarian environment by maintaining the 3D follicular architecture, cell-cell interactions and paracrine signaling that direct follicle development 5. Previously, follicles were successfully cultured in alginate, an inert algae-derived polysaccharide that undergoes gelation with calcium ions6-8. Alginate hydrogels formed at a concentration of 0.25% w/v were the most permissive for follicle culture, and retained the highest developmental competence 9. Alginate hydrogels are not degradable, thus an increase in the follicle diameter results in a compressive force on the follicle that can impact follicle growth10. We subsequently developed a culture system based on a fibrin-alginate interpenetrating network (FA-IPN), in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. This combination provides a dynamic mechanical environment because both components contribute to matrix rigidity initially; however, proteases secreted by the growing follicle degrade fibrin in the matrix leaving only alginate to provide support. With the IPN, the alginate content can be reduced below 0.25%, which is not possible with alginate alone 5. Thus, as the follicle expands, it will experience a reduced compressive force due to the reduced solids content. Herein, we describe an encapsulation method and an in vitro culture system for ovarian follicles within a FA-IPN. The dynamic mechanical environment mimics the natural ovarian environment in which small follicles reside in a rigid cortex and move to a more permissive medulla as they increase in size11. The degradable component may be particularly critical for clinical translation in order to support the greater than 106-fold increase in volume that human follicles normally undergo in vivo .

A new method for ovarian follicle encapsulation in a 3D fibrin-alginate interpenetrating network is described. This system combines structural support with proteolytic degradation to support the development of immature follicles to produce mature oocytes. This method may be applied to culture cell aggregates to maintain cell-cell contacts without limiting expansion.

タンパク質分解的に分解性3次元システムにおける卵胞のカプセル化と文化のための方法

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

生物工学

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

3D楕円体の生成のための簡単​​なハンギングドロップ細胞培養プロトコル

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium. We have developed tissue surface tensiometry (TST) specifically to measure the surface free energy of interaction between cells. The biophysical concepts underlying TST have been previously described in detail1,2. The method is based on the observation that mutually cohesive cells, if maintained in shaking culture, will spontaneously assemble into clusters. Over time, these clusters will round up to form spheres. This rounding-up behavior mimics the behavior characteristic of liquid systems. Intercellular binding energy is measured by compressing spherical aggregates between parallel plates in a custom-designed tissue surface tensiometer. The same mathematical equation used to measure the surface tension of a liquid droplet is used to measure surface tension of 3D tissue-like spherical aggregates. The cellular equivalent of liquid surface tension is intercellular binding energy, or more generally, tissue cohesivity. Previous studies from our laboratory have shown that tissue surface tension (1) predicts how two groups of embryonic cells will interact with one another1-5, (2) can strongly influence the ability of tissues to interact with biomaterials6, (3) can be altered not only through direct manipulation of cadherin-based intercellular cohesion7, but also by manipulation of key ECM molecules such as FN8-11 and 4) correlates with invasive potential of lung cancer12, fibrosarcoma13, brain tumor14 and prostate tumor cell lines15. In this article we will describe the apparatus, detail the steps required to generate spheroids, to load the spheroids into the tensiometer chamber, to initiate aggregate compression, and to analyze and validate the tissue surface tension measurements generated.

We describe a method of measuring binding energy, expressible as tissue surface tension, between cells within 3D tissue-like aggregates. Differences in tissue surface tension have been demonstrated to correlate with invasiveness of lung, muscle, and brain tumors, and are fundamental determinants of establishing spatial relationships between different cell types.

組織の表面張力測定ごとの集計凝集力の測定

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium.  We ...

Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level. However, this is not easily achieved because the small amount of labile mRNA present in a single cell (1-5% of 1-50pg total RNA, or 0.01-2.5pg mRNA, per cell 1) mostly degrades before it can be reverse transcribed into a stable cDNA copy. For example, using standard laboratory reagents and hardware, only a small number of genes can be qualitatively assessed per cell 2. One way to increase the efficiency of standard laboratory reverse transcriptase (RT) reactions (i.e. standard reagents in microliter volumes) comprising single-cell amounts of mRNA would be to more rapidly mix the reagents so the mRNA can be converted to cDNA before it degrades. However this is not trivial because at microliter scales liquid flow is laminar, i.e. currently available methods of mixing (i.e. shaking, vortexing and trituration) fail to produce sufficient chaotic motion to effectively mix reagents. To solve this problem, micro-scale mixing techniques have to be used 3,4. A number of microfluidic-based mixing technologies have been developed which successfully increase RT reaction yields 5-8. However, microfluidics technologies require specialized hardware that is relatively expensive and not yet widely available. A cheaper, more convenient solution is desirable. The main objective of this study is to demonstrate how application of a novel "micromixing" technique to standard laboratory RT reactions comprising single-cell quantities of mRNA significantly increases their cDNA yields. We find cDNA yields increase by approximately 10-100-fold, which enables: (1) greater numbers of genes to be analyzed per cell; (2) more quantitative analysis of gene expression; and (3) better detection of low-abundance genes in single cells. The micromixing is based on acoustic microstreaming 9-12, a phenomenon where sound waves propagating around a small obstacle create a mean flow near the obstacle. We have developed an acoustic microstreaming-based device ("micromixer") with a key simplification; acoustic microstreaming can be achieved at audio frequencies by ensuring the system has a liquid-air interface with a small radius of curvature 13. The meniscus of a microliter volume of solution in a tube provides an appropriately small radius of curvature. The use of audio frequencies means that the hardware can be inexpensive and versatile 13, and nucleic acids and other biochemical reagents are not damaged like they can be with standard laboratory sonicators.

We describe a novel method for increasing cDNA yield from single-cell quantities of mRNA in otherwise standard laboratory reverse transcription reactions. The novelty resides in the use of a micromixer, which utilizes the phenomenon of acoustic microstreaming, to mix fluids at microliter scales more effectively than shaking, vortexing or trituration.

アコースティックMicrostreamingを使用して標準的な実験系逆転写反応でmRNAの単セルの物理量からcDNA収量を増加させる

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level.  However, this is not easily achieved because the small amount of ...

Creating Transient Cell Membrane Pores Using a Standard Inkjet Printer

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor microfabrication.1-10 Recently, thermal inkjet printing has also been used for gene transfection.8,9 The thermal inkjet printing process was shown to temporarily disrupt the cell membranes without affecting cell viability. The transient pores in the membrane can be used to introduce molecules, which would otherwise be too large to pass through the membrane, into the cell cytoplasm.8,9,11
The application being demonstrated here is the use of thermal inkjet printing for the incorporation of fluorescently labeled g-actin monomers into cells. The advantage of using thermal ink-jet printing to inject molecules into cells is that the technique is relatively benign to cells.8, 12 Cell viability after printing has been shown to be similar to standard cell plating methods1,8. In addition, inkjet printing can process thousands of cells in minutes, which is much faster than manual microinjection. The pores created by printing have been shown to close within about two hours. However, there is a limit to the size of the pore created (~10 nm) with this printing technique, which limits the technique to injecting cells with small proteins and/or particles. 8,9,11
A standard HP DeskJet 500 printer was modified to allow for cell printing.3, 5, 8 The cover of the printer was removed and the paper feed mechanism was bypassed using a mechanical lever. A stage was created to allow for placement of microscope slides and coverslips directly under the print head. Ink cartridges were opened, the ink was removed and they were cleaned prior to use with cells. The printing pattern was created using standard drawing software, which then controlled the printer through a simple print command. 3T3 fibroblasts were grown to confluence, trypsinized, and then resuspended into phosphate buffered saline with soluble fluorescently labeled g-actin monomers. The cell suspension was pipetted into the ink cartridge and lines of cells were printed onto glass microscope cover slips. The live cells were imaged using fluorescence microscopy and actin was found throughout the cytoplasm. Incorporation of fluorescent actin into the cell allows for imaging of short-time cytoskeletal dynamics and is useful for a wide range of applications.13-15

A description of the methods used to convert an HP DeskJet 500 printer into a bioprinter. The printer is capable of processing living cells, which causes transient pores in the membrane. These pores can be utilized to incorporate small molecules, including fluorescent G-actin, into the printed cells.

標準的なインクジェットプリンタを使用して一時的な細胞膜孔を作成する

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor ...

The Portable Chemical Sterilizer (PCS), D-FENS, and D-FEND ALL: Novel Chlorine Dioxide Decontamination Technologies for the Military

There is a stated Army need for a field-portable, non-steam sterilizer technology that can be used by Forward Surgical Teams, Dental Companies, Veterinary Service Support Detachments, Combat Support Hospitals, and Area Medical Laboratories to sterilize surgical instruments and to sterilize pathological specimens prior to disposal in operating rooms, emergency treatment areas, and intensive care units. The following ensemble of novel, &#8216;clean and green&#8217; chlorine dioxide technologies are versatile and flexible to adapt to meet a number of critical military needs for decontamination6,15. Specifically, the Portable Chemical Sterilizer (PCS) was invented to meet urgent battlefield needs and close critical capability gaps for energy-independence, lightweight portability, rapid mobility, and rugged durability in high intensity forward deployments3. As a revolutionary technological breakthrough in surgical sterilization technology, the PCS is a Modern Field Autoclave that relies on on-site, point-of-use, at-will generation of chlorine dioxide instead of steam. Two (2) PCS units sterilize 4 surgical trays in 1 hr, which is the equivalent throughput of one large steam autoclave (nicknamed &#8220;Bertha&#8221; in deployments because of its cumbersome size, bulky dimensions, and weight). However, the PCS operates using 100% less electricity (0 vs. 9 kW) and 98% less water (10 vs. 640 oz.), significantly reduces weight by 95% (20 vs. 450 lbs, a 4-man lift) and cube by 96% (2.1 vs. 60.2 ft3), and virtually eliminates the difficult challenges in forward deployments of repairs and maintaining reliable operation, lifting and transporting, and electrical power required for steam autoclaves.

The Portable Chemical Sterilizer PCS, D-FENS, and D-FEND ALL: Novel Chlorine Dioxide Decontamination Technologies for the Military

The Portable Chemical Sterilizer (PCS) is a revolutionary, energy-independent, almost waterless sterilization technology for Army medical units. The PCS generates chlorine dioxide from dry reagents mixed with water on-site, at-will, and at point-of-use (PoU) in a plastic suitcase. The Disinfectant-sprayer for Foods and ENvironmentally-friendly Sanitation (D-FENS) and the Disinfectant for ENvironmentally-friendly Decontamination, All-purpose (D-FEND ALL) produce aqueous chlorine dioxide in a collapsible spray bottle and other potential embodiments. These versatile decontamination technologies kill microbes in myriad diverse Dual-use applications for military and civilian consumers.

ポータブル化学殺菌（PCS）、D-FENSおよびD-FEND ALL：小説二酸化塩素除染技術の軍事用

There is a stated Army need for a field-portable, non-steam sterilizer technology that can be used by Forward Surgical Teams, Dental Companies, Veterinary ...

Fabrication of Carbon Nanotube High-Frequency Nanoelectronic Biosensor for Sensing in High Ionic Strength Solutions

The unique electronic properties and high surface-to-volume ratios of single-walled carbon nanotubes (SWNT) and semiconductor nanowires (NW) 1-4 make them good candidates for high sensitivity biosensors. When a charged molecule binds to such a sensor surface, it alters the carrier density5 in the sensor, resulting in changes in its DC conductance. However, in an ionic solution a charged surface also attracts counter-ions from the solution, forming an electrical double layer (EDL). This EDL effectively screens off the charge, and in physiologically relevant conditions ~100 millimolar (mM), the characteristic charge screening length (Debye length) is less than a nanometer (nm). Thus, in high ionic strength solutions, charge based (DC) detection is fundamentally impeded6-8.
We overcome charge screening effects by detecting molecular dipoles rather than charges at high frequency, by operating carbon nanotube field effect transistors as high frequency mixers9-11. At high frequencies, the AC drive force can no longer overcome the solution drag and the ions in solution do not have sufficient time to form the EDL. Further, frequency mixing technique allows us to operate at frequencies high enough to overcome ionic screening, and yet detect the sensing signals at lower frequencies11-12. Also, the high transconductance of SWNT transistors provides an internal gain for the sensing signal, which obviates the need for external signal amplifier.
Here, we describe the protocol to (a) fabricate SWNT transistors, (b) functionalize biomolecules to the nanotube13, (c) design and stamp a poly-dimethylsiloxane (PDMS) micro-fluidic chamber14 onto the device, and (d) carry out high frequency sensing in different ionic strength solutions11.

We describe the device fabrication and measurement protocol for carbon nanotube based high frequency biosensors. The high frequency sensing technique mitigates the fundamental ionic (Debye) screening effect and allows nanotube biosensor to be operated in high ionic strength solutions where conventional electronic biosensors fail. Our technology provides a unique platform for point-of-care (POC) electronic biosensors operating in physiologically relevant conditions.

高イオン強度ソリューションで感知するためのカーボンナノチューブ高周波ナノエレクトロニクスバイオセンサーの作製

The unique electronic properties and high surface-to-volume ratios of single-walled carbon nanotubes (SWNT) and semiconductor nanowires (NW) 1-4 make them ...

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is strongly regulated by the surrounding flow and nutritional environment. Biofilm growth also increases the heterogeneity of the local microenvironment by generating complex flow fields and solute transport patterns. To investigate the development of heterogeneity in biofilms and interactions between biofilms and their local micro-habitat, we grew mono-species biofilms of Pseudomonas aeruginosa and dual-species biofilms of P. aeruginosa and Escherichia coli under nutritional gradients in a microfluidic flow cell. We provide detailed protocols for creating nutrient gradients within the flow cell and for growing and visualizing biofilm development under these conditions. We also present protocols for a series of optical methods to quantify spatial patterns in biofilm structure, flow distributions over biofilms, and mass transport around and within biofilm colonies. These methods support comprehensive investigations of the co-development of biofilm and habitat heterogeneity.

Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.

バイオフィルムと生息地異質の共同開発を特徴付けるための方法

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues. 
To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRP&#945; and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.
Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.

This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.

心臓細胞療法のメカニズムを研究するために定義されたヒューマン・エンジニア心臓組織の構築

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic physiological tear volumes.7 The traditional model also lacks the natural tear flow component and the blinking reflex, both of which are defining factors of the ocular environment. The development of a novel model is described in this study, which consists of a unique 2-piece design, eyeball and eyelid piece, capable of mimicking physiological tear volume. The models are created from 3-D printed molds (Polytetrafluoroethylene or Teflon molds), which can be used to generate eye models from various polymers, such as polydimethylsiloxane (PDMS) and agar. Further modifications to the eye pieces, such as the integration of an explanted human or animal cornea or human corneal construct, will permit for more complex in vitro ocular studies. A commercial microfluidic syringe pump is integrated with the platform to emulate physiological tear secretion. Air exposure and mechanical wear are achieved using two mechanical actuators, of which one moves the eyelid piece laterally, and the other moves the eyeballeyepiece circularly. The model has been used to evaluate CLs for drug delivery and deposition of tear components on CLs.

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Current in vitro models for evaluating contact lenses (CLs) and other eye-related applications are severely limited. The presented ocular platform simulates physiological tear flow, tear volume, air exposure and mechanical wear. This system is highly versatile and can be applied to various in vitro analyses with CLs.

木材接着剤の凝集力開発のための標準試験方法ASTM D 7998-19

要約

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この動画の章

タンパク質分解的に分解性3次元システムにおける卵胞のカプセル化と文化のための方法

3D楕円体の生成のための簡単なハンギングドロップ細胞培養プロトコル

組織の表面張力測定ごとの集計凝集力の測定

アコースティックMicrostreamingを使用して標準的な実験系逆転写反応でmRNAの単セルの物理量からcDNA収量を増加させる

標準的なインクジェットプリンタを使用して一時的な細胞膜孔を作成する

ポータブル化学殺菌（PCS）、D-FENSおよびD-FEND ALL：小説二酸化塩素除染技術の軍事用

高イオン強度ソリューションで感知するためのカーボンナノチューブ高周波ナノエレクトロニクスバイオセンサーの作製

バイオフィルムと生息地異質の共同開発を特徴付けるための方法

心臓細胞療法のメカニズムを研究するために定義されたヒューマン・エンジニア心臓組織の構築

開発

木材接着剤の凝集力開発のための標準試験方法ASTM D 7998-19

要約

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タンパク質分解的に分解性3次元システムにおける卵胞のカプセル化と文化のための方法

3D楕円体の生成のための簡単​​なハンギングドロップ細胞培養プロトコル

組織の表面張力測定ごとの集計凝集力の測定

アコースティックMicrostreamingを使用して標準的な実験系逆転写反応でmRNAの単セルの物理量からcDNA収量を増加させる

標準的なインクジェットプリンタを使用して一時的な細胞膜孔を作成する

ポータブル化学殺菌（PCS）、D-FENSおよびD-FEND ALL：小説二酸化塩素除染技術の軍事用

高イオン強度ソリューションで感知するためのカーボンナノチューブ高周波ナノエレクトロニクスバイオセンサーの作製

バイオフィルムと生息地異質の共同開発を特徴付けるための方法

心臓細胞療法のメカニズムを研究するために定義されたヒューマン・エンジニア心臓組織の構築

開発

3D楕円体の生成のための簡単なハンギングドロップ細胞培養プロトコル