この研究は、クレムソン大学(1632881)に対するNSF EPSCoR研究インフラ補助金によって部分的に支援されました。さらに、この研究の一部は、Civitan国際研究センター、バーミンガム、ALによってサポートされました。著者らは、アラバマ大学バーミンガム小動物イメージング共有施設グラント[NIH P30 CA013148]のサービスと施設の使用を感謝して認めている。著者らは、ラジーヴ・チョプラの支援と指導を認めている。

著者らは開示するものは何もない。

ここでは、MRIガイダンスの有無にかかわらず頭蓋内ターゲティングのための2つの異なるトランスデューサーおよび方法を含む代替アプローチで、マイクロバブル支援FUS BBB開口部へのベンチトップアプローチについて説明した。現在、MRIガイド付きFUS BBBのオープンをラボに設置するために、ユーザーフレンドリーなインターフェイスで高度に標準化された再現性の高い結果を提供する優れたすぐに使用できるデバイスを購入するオプションがあります。しかし、多くのラボはそのような機器のコストのために準備されていません。したがって、このプロトコルの主な目標は、技術に関する専門知識を構築するために、任意のラボが確立できる開始点を提供することです。
FUS BBBの開口は現在広く使用されている技術であり、異なるグループが様々な薬剤および麻酔薬を利用する場合が多く、それぞれがBBBの開封および外挿の程度に影響を与える可能性があります。重要なことに、使用される特定の麻酔薬はBBB開口部の大きさに影響を及ぼす可能性があるため、このプロトコル38を実行する際にこれを考慮することが重要である。ここでは、麻酔薬イソフルランは、動物がプロトコルの長さのためにイソフルランの下で維持され、イソフルランガスのレベルが動物の呼吸速度および心拍数に基づいて容易に調節することができるので使用される。さらに、酸素を含むイオブルランは医療用空気よりもアクセスしやすいため、酸素を供給しました。しかし、医療用空気はより広範なBBB開口部39を可能にするかもしれない。MRI 造影剤の中には、このプロトコルに適しているものもあります。例えば、私たちの手の中では、EBD漏れが組織死後に明らかに存在していた場合でも、ガドテリドールはコントラスト強化を生み出さなかった。マイクロバブル製剤も重要である。ここでは、過フルトレン脂質微小球を使用します。パーフルトレンタンパク質A型マイクロバブルなどの他のマイクロバブル製剤は容易に入手可能であるが、使用されるマイクロバブルのタイプは結果15に影響を与える。
関数ジェネレーターのコントロールは、かなり異なる場合がありますので、手順 1 で示した設定を入力する方法については、マニュアルを参照してください。適切なコマンド電圧(関数発生器のピークまでのVピーク)は、トランスデューサの特性、RF増幅器ゲイン、トランスデューサへのRFアンプマッチング、動物の年齢とサイズ、マイクロバブルの種類と濃度、および所望の処理効果に強く依存します。ピークからピーク V までは試行錯誤で決まる必要があります。手順 1 で提案された設定から開始し、組織学的に効果を決定します。組織の損傷がある場合は、ピークVを10%下げてからもう一度試してください。同様に、BBBOがない場合はピークVを10%上げて、もう一度試してください。Vを高く設定しすぎると、低電力浸出器に損傷を与える可能性があります。これは、トランスデューサ面のひび割れまたは歪みとして明らかになります。トランスデューサの製造リードタイムは長くなる可能性があるため、起動時には複数のトランスデューサをバックアップとして購入することをお勧めします。超音波トランスデューサは、それらが不適切に一致している場合、アンプを損傷することができます。シンプルさと信頼性を確保するため、複雑な負荷を駆動できる堅牢なパワーアンプ(材料テーブルのRFパワーアンプなど)を使用することをお勧めします。高出力トランスデューサには一致回路が付属していますが、低電力浸漬トランスデューサは付属していません。推奨されるRFアンプは、不十分に一致したトランスデューサからの反射電力を処理できますが、この構成では一部のアンプが破損する可能性があります。また、ドライバとソフトウェアのインストール後に手順2.7で問題が発生した場合は、ソフトウェアで適切なシリアルポートが選択されていることを再確認してください。次に、別のシリアルケーブルを試してください。失敗した場合は、ローカルの IT サポートを求めます。
経験から、それは練習と脳領域ターゲティングのタイトな精度を達成するために複数の調整を必要とします。これは、初期の実験(図3)と最新の実験との間のターゲティングの違い(図5)で見ることができます。私たちは古典的な立体フレームを使用して実験を開始し、3Dプリンタへのアクセスがない場合、またはげっ歯類MRIへのアクセスがない場合は、ここにオプションとして含めます。しかし、MRI受託者と3D印刷可能フレーム(またはカスタムデザイン)を備えたMRI誘導が理想的な方法です。第一に、平均ラット脳アトラスに頼るのではなく、動物内の座標を収集することによって、動物間の個人差を説明する。さらに、MRIを使用すると、死後のEBD発現に頼るのではなく、生体内を標的とするFUSの位置を確認することができます。これは、AAV などの効果を 24 時間以上必要とするエージェントを配信する場合に重要です (図 5)。最後に、提供されたフレームホルダーは、任意のターゲット設定エラーを修正したり、座標をやり直すことなく、不十分なBBB開口部の後にFUSを繰り返すために、MRI後に同じ位置に動物を戻すことができます。ポータブル3Dプリントステレオタックスフレームは、200mm以上の明確なボアを持つ任意のMRIで使用することができます。
標的位置における血管分布に応じて、頭蓋骨の厚さ40、心室の存在、および他の要因はBBB開口部の程度が異なる場合がある。このため、フレームとフレームホルダーでターゲティングを繰り返す方法を提供しています。ターゲティングの精度は、ターゲットポインターに関してトランスデューサの焦点を一貫した位置に保つことに大きく依存します。このポインタの先端は、トランスデューサがXYZポジショナーに取り付けられているときに、トランスデューサの焦点の中心の空間内の位置を示す必要があります。磁石は、この共局在化を維持しながら、ポインタとトランスデューサを簡単に交換することができます。磁石の穴と突起は、できるだけ正確に一致する必要があります。この接続での変動は FUS フォーカスターゲティングの再現性を低下させます。しかし、ポインタ先端と超音波フォーカスの間には空間的なオフセットがあります。オフセットが一貫していることを確認したら、MR画像を用いて、得られたBBB開口位置(MRIコントラストの位置)と目的の位置のmmの差を算出することにより補正することができる。この違いは、NULL 位置に因数を入れることができます。正確さと再現性は、同じ超音波周波数を使用し、特定の実験のセットで同じようなサイズと年齢のラットを使用することからも大きな利益を得る。ラットの脳とラットの頭蓋骨による超音波減衰は、頻度によって変化し、頭蓋骨の大きさと頭蓋骨の厚さは年齢によって変化する。頭蓋骨はまた、超音波パルスに関して小さな空洞であり、事件超音波は、組織、頭蓋骨、周波数およびトランスデューサ40の位置に依存する複雑な音場を生成するために、頭蓋骨内の反射と相互作用する。
他の場所で述べたように、このプロトコルは、すでに購入可能な優れたMRI互換の商用ソリューションに代わる低投資を提供することを目的としています。コストを低く抑えることには、重要な制限があります。物理学と現在の最先端の技術に固有の制限もあります。驚くべきことに、これらの制限にもかかわらず、そして代表的な結果に示すように、我々はサブミリ波精度でラットの海馬に染料、粒子、およびウイルスの一貫した配信を達成することができる。最も重要な制限は、(1)FUS焦点の形状が介在組織、特に頭蓋骨の形状と厚さに依存することです。.}FUS処理を行うためにMRIから動物を除去する必要性はFUS焦点の局在および強度に関するリアルタイムのフィードバックを防ぐ。このリアルタイムのフィードバックがなければ、ターゲットの場所の各組み合わせの設定を確認するためにいくつかの実験を行う必要があります。設定が「ダイヤルイン」されると、我々は良好な繰り返し性を発見しました。(2)構築されたXYZの位置決めと受託者システムは、正確ながら、実験から実験までのポジショナの座標フレームに正確さを提供しない。XYZホームの相対的な位置、げっ歯類の頭蓋骨、フレームは実験から実験まで互いに相対的に移動できます。これは、ターゲット設定用のMRI画像、FUSフォーカスに対する空間内の既知の位置を持つターゲットポインタおよび受託者を使用して、MRI座標系がXYZポジショナーシステムと平行であることを保証し、実際の治療の前にテスト処理を行い、動物がフレームに再配置される必要がないように1つのセッション内で手順全体を行うことによって、回避されます。1つの受託者しか使用されないため、フレームの回転は修正できないため、フレームがMRIベッドとボアに対してレベルであることを確認することが重要です。要約すると、ポインタの位置は真のFUS焦点を示すものではないが、頭蓋骨が超音波トランスデューサーに対して回転しない場合、特定の脳位置に対してオフセットが一貫していることが判明した。また、BBB開口部とイメージングに対するガドブトロールの配信の一貫したタイミングは、特にMRIコントラスト変化がBBB開口部の量の代理として使用される場合、一貫した結果のために重要であることに注意してください (36を参照)。
まず、上記の低電力浸漬トランスデューサーを使用して、ラボでFUS BBBのオープンを開始しました。この手法を使い始めるには、手頃な価格の選択肢であることがわかりました。最も重要なことは、このプロトコルの適応は、ヒト30、32、41における経頭蓋FUSの現在の使用に起因して、この技術で行われる頭蓋内立体立体手術および前臨床研究に対する非侵襲的代替手段を提供し得る。ラボで確立されると、この技術は、立体外科の非侵襲的な代替として使用することができます。したがって、厳密に調査ツールを高度に翻訳されたツールに変換します。私たちの研究室では、この技術を使用して、ウイルスとナノ粒子のMRI誘導、局所的な送達を行い、目覚めのげっ歯類や非ヒト霊長類を自由に振る舞う際に使用できる新しい非侵襲的神経変調技術を開発します。現在の研究では、デザイナー受容体専用に設計されたデザイナードラッグ(DREADD)とX線などの高エネルギー粒子の低用量へのニューロンの感作に焦点を当てています。ラボはまた、治療中に動物を移動する必要性を排除し、リアルタイムのターゲティングフィードバックを可能にするために、人間の3 Tスキャナで実行することができるこのプロトコルの新しいバージョンに取り組んでいます。

基本的な神経科学の多くの発見にもかかわらず、神経発達および神経変性疾患の新たな治療法の数は比較的限られた1,2のままである。神経疾患に関与する遺伝子、分子および細胞回路のより深い理解は、現在の技術を有するヒトでは実現不可能な有望な治療法を示唆している3。効果的な治療は、多くの場合、脳浸透性と部位特異的な4、5、6、7、8である必要性によって制限されます。しかしながら、特定の脳領域への局所的な薬物送達の既存の方法(例えば、注射またはカニューレによる送達)は侵襲的であり、頭蓋骨9に作られる開口部を必要とする。この手術の侵襲性は、人間の脳への局所的な送達の日常的な使用を防ぎます.さらに、組織損傷および結果として生じる炎症反応は、脳内注射10に依存する基礎的および前臨床試験のためのユビキタスな交論である。血液脳関門(BBB)を越えて非侵襲的に薬剤を送達し、特定の脳領域に標的化する能力は、神経疾患の治療に大きな影響を与えると同時に、前臨床研究のための強力な治験ツールを提供する可能性がある。
最小限の組織損傷を伴うBBBを介して標的輸送の1つの方法は、経頭蓋集結超音波(FUS)をマイクロバブルと共にBBB11、12、12、13、14、15、16を局所的かつ一時的に開く。FUS BBBの開口は神経栄養因子17、18、19、遺伝子治療20、21、22、抗体23、神経伝達物質24、およびナノ粒子25、26、27、28、29などの脳領域を標的とする治療を局所化することによって、神経変性疾患、脳卒中および神経膠腫の治療に関する最近の注目を集めている。用途の広い範囲とその非侵襲的な性質30、31、FUS BBBの開口部は、日常的な立体的な頭蓋内注射に理想的な代替手段です。さらに、ヒト30,32における現在の使用により、この技術を用いた前臨床調査は高度に翻訳的であると考えることができる。しかし、FUS BBBの開設は、アクセシビリティの欠如のために基礎科学と前臨床研究において広く確立された技術ではありません。そのため、この技術の確立に関心のあるラボの出発点として、FUS BBBのオープンに対するベンチトップアプローチの詳細なプロトコルを提供します。
これらの研究は、高出力空気を支持するFUS特異的超音波トランスデューサーまたは低電力減衰集積超音波浸漬トランスデューサーのいずれかで行った。トランスデューサは、反応性負荷用に設計されたRFパワーアンプと標準のベンチトップファンクションジェネレータによって駆動されました。これらの項目の詳細については、 資料一覧を参照してください。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1437px;" width="1437">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Bubble shaker</td>
			<td style="width:240px;">Lantheus Medical Imaging</td>
			<td style="width:197px;">VMIX</td>
			<td style="width:729px;">VIALMIX, actiation device used to activate Definity microbubbles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Catheter plug/ Injection cap</td>
			<td>SAI infusion technologies</td>
			<td>Part Number: IC</td>
			<td style="width:729px;">Catheter plug/ Injection cap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Evans blue dye</td>
			<td style="width:240px;">Sigma</td>
			<td style="width:197px;">E2129-10G</td>
			<td style="width:729px;">Evans blue dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Function generator</td>
			<td style="width:240px;">Tektronix</td>
			<td style="width:197px;">AFG3022B</td>
			<td>Dual channel, 250MS/s, 25MHz</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FUS transducer, 1.1MHz</td>
			<td style="width:240px;">FUS Instruments</td>
			<td>TX-110</td>
			<td>1 MHz MRI-compatible spherically focused ultrasound transducer with a hydrophone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Heating pad for Mice and Rats</td>
			<td style="width:240px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:197px;">PS-03</td>
			<td>Heating pad- PhysioSuite for Mice and Rats</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Infusion pump</td>
			<td style="width:240px;">KD Scientific</td>
			<td style="width:197px;">780100</td>
			<td>KDS 100 Legacy Single Syringe Infusion Pump</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Kapton tape</td>
			<td style="width:240px;">Gizmo Dorks</td>
			<td>https://www.amazon.com/dp/B01N1GGKRC/ 
			ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_GbR7Db56HKD91</td>
			<td>Gizmo Dorks Kapton Tape (Polyimide) for 3D Printers and Printing, 8 x 8 inches, 10 Sheets per Pack</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low power immersion transducer, 1MHz</td>
			<td style="width:240px;">Olympus</td>
			<td>V303-SU</td>
			<td>Immersion Transducer, 1 MHz, 0.50 in. Element Diameter, Standard Case Style, Straight UHF Connector, F=0.80IN PTF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Magnet sets</td>
			<td style="width:240px;">WINOMO</td>
			<td>https://www.amazon.com/dp/B01DJZQJBG/ 
			ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_JYQ7DbM32E5QC</td>
			<td>WINOMO 15mm Sew In Magnetic Bag Clasps for Sewing Scrapbooking - 10 Sets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RF amplifier</td>
			<td style="width:240px;">E&#38;I</td>
			<td style="width:197px;">A075</td>
			<td>75W</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Tail vein catheter</td>
			<td style="width:240px;">BD</td>
			<td>382512/ Fisher Item: NC1228513</td>
			<td>24g BD Insyte Autoguard shielded IV catheters (non-winged)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Ultrasound contrast microbubbles</td>
			<td>Lantheus Medical Imaging</td>
			<td style="width:197px;">DE4, DE16</td>
			<td>DEFINITY (Perflutren Lipid Microsphere)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Ultrasound gel</td>
			<td style="width:240px;">Aquasonic</td>
			<td>https://www.amazon.com/dp/B07FPQDM4F/ 
			ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_D6Q7Db3J9QP7P</td>
			<td>Ultrasound Gel Aquasonic 100 Transmission 1 Liter Squeeze Bottle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Winged infusion sets, 22ga.</td>
			<td style="width:240px;">Fisher Healthcare</td>
			<td>22-258087</td>
			<td>Terumo Surflo Winged Infusion Sets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">motor controller software</td>
			<td style="width:240px;">N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:729px;">custom software written in LabView for controlling the Velmex motor controller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">runtime environment for the motor controller software</td>
			<td style="width:240px;">National Instruments</td>
			<td>LabView runtime engine version 2017 or better</td>
			<td>https://www.ni.com/en-us/support/downloads/software-products/download.labview.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">3 axis Linear stage actuator (XYZ positioner)</td>
			<td style="width:240px;">Velmex</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">bolts</td>
			<td style="width:240px;">Velmex</td>
			<td>MB-1</td>
			<td>BiSlide Bolt 1/4-20x3/4&#34; Socket cap screw (10 pack), Qty:3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">motor controller</td>
			<td style="width:240px;">Velmex</td>
			<td>VXM-3</td>
			<td style="width:729px;">Control,3 axis programmable stepping motor control, Qty:1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mounting cleats</td>
			<td style="width:240px;">Velmex</td>
			<td>MC-2</td>
			<td>Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mounting cleats</td>
			<td style="width:240px;">Velmex</td>
			<td>MC-2</td>
			<td style="width:729px;">Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">usb to serial converter</td>
			<td style="width:240px;">Velmex</td>
			<td>VXM-USB-RS232</td>
			<td style="width:729px;">USB to RS232 Serial Communication Cable 10ft, Qty:1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">x-axis linear stage</td>
			<td style="width:240px;">Velmex</td>
			<td>MN10-0100-M02-21</td>
			<td style="width:729px;">BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">x-axis stepper motor</td>
			<td style="width:240px;">Velmex</td>
			<td>PK266-03A-P1</td>
			<td>Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">y-axis linear stage</td>
			<td style="width:240px;">Velmex</td>
			<td>MN10-0100-M02-21</td>
			<td>BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">y-axis stepper motor</td>
			<td style="width:240px;">Velmex</td>
			<td>PK266-03A-P1</td>
			<td style="width:729px;">Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">z-axis damper</td>
			<td style="width:240px;">Velmex</td>
			<td>D6CL-6.3F</td>
			<td style="width:729px;">D6CL Damper for Type 23 Double Shaft Stepper Motor, Qty:1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">z-axis linear stage</td>
			<td style="width:240px;">Velmex</td>
			<td>MN10-0100-M02-21</td>
			<td style="width:729px;">BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">z-axis stepper motor</td>
			<td style="width:240px;">Velmex</td>
			<td>PK266-03B-P2</td>
			<td style="width:729px;">Vexta Type 23T2, Double Shaft Stepper Motor, Qty:1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">3D printable files</td>
			<td style="width:240px;"></td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Immersion transducer mount and pointer</td>
			<td></td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td>https://www.tinkercad.com/things/cRgTthGXSRq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Stereotaxic frame</td>
			<td></td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td>https://www.tinkercad.com/things/ilynoQcdqlH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Stereotaxic frame holder</td>
			<td></td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td>https://www.tinkercad.com/things/aZNgqhBOHAX</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">9.4T small bore animal MRI</td>
			<td style="width:240px;">Bruker</td>
			<td style="width:197px;">Bruker BioSpec 94/20</td>
			<td>ParaVision version 5.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">AAV9-hsyn-GFP</td>
			<td style="width:240px;">Addgene</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Cream hair remover</td>
			<td style="width:240px;">Church &#38; Dwight</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td>Nair cream</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">gadobutrol MRI contrast agent</td>
			<td style="width:240px;">Bayer</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td>Gadavist (Gadobutrol, 1mM/mL)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Stereotactic frame</td>
			<td style="width:240px;">Stoelting</td>
			<td style="width:197px;">#51500</td>
			<td>not MRI compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">turnkey FUS delivery device</td>
			<td style="width:240px;">FUS Instruments</td>
			<td style="width:197px;">RK-300</td>
			<td style="width:729px;">ready to use MRI compatible FUS for rodents</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a benchtop approach to the location specific blood brain barrier opening using focused ultrasound in a rat model

立体外科は、げっ歯類の脳への局在化した薬物および遺伝子送達のためのゴールドスタンダードである。この技術は、ターゲット脳領域への正確な局在化およびオフターゲットの副作用の減少を含む全身配信よりも多くの利点を有する。しかし、立体外科は非常に侵襲的であり、その翻訳効果を制限し、長い回復時間を必要とし、複数の脳領域を標的とする場合に課題を提供する。集中超音波(FUS)は、一過性のミリサイズ領域の血液脳関門(BBB)を開くために循環マイクロバブルと組み合わせて使用することができます。これにより、通常は BBB を横断できない全身配信エージェントの頭蓋内局在化が可能になります。この技術は、立体外科に対する非侵襲的な代替手段を提供する。しかし、これまで、この技術は、機器へのアクセスが限られているため、また標準化された方法により、神経科学の研究室ではまだ広く採用されていません。このプロトコルの全体的な目標は、手頃な価格で再現可能なFUS BBB開口部(BBBO)へのベンチトップアプローチを提供するため、任意のラボで簡単に採用することができます。

ここでは、マイクロバブルを用いた集結超音波が、低電力浸漬トランスデューサー(図3)とFUSトランスデューサ(図4)の両方で上記で指定されたパラメータを使用して局所的なBBB開口部を誘導できることを示す。まず、初期の実験において、低電力浸漬変換器を、前部(図3b)または内側(図3a)のいずれか1つの脳半球を対象とした。その後、動物を2時間後に灌流(図3a)または灌流なしで屠殺し(図3b)、10μm凍結脳切片を採取した。FUS BBBの開口は、EBD自己蛍光(励起:470および540nm、発光:680nm)の標的半球(白矢印図3aおよび3b)によって明らかであった。
私たちは、EBD自己蛍光を伴うBBB開口部の明確な視覚化のために動物を浸透させるのが最善であることを発見しました。しかし、BBBの開口部は血管をクリアすることなく視覚化することができます(図3b)。BBB開封後のEBDの細胞の取り込みとクリアランスは、BBBが開封されてから30分経過するとすぐに始まり、24時間37時間にわたって増加する。EBD自己蛍光を伴うBBB開口部の評価のためには、BBB開口部の15分から3時間の間に動物を犠牲にするのが最善である。最終的には、犠牲の時間は配信されたエージェントに依存します。例えば、AAV研究では、BBB開封後3週間およびAAV送達(図5c)が適切であり得る。
後の実験では、FUSトランスデューサーは海馬(図4a-c)または前帯状皮質(ACC)(図4 d-f)のいずれかを標的とし、EBDに加えて、MRI造影剤ガドブトロール(0.1mL/kg)を注射してBBB invivoの標的開放を確認するためにIVを注入した。図4bは、BBB開封および造影剤注射後1時間にガドブトロルコントラストが組織に入ったところの強化されたMRIコントラストを示す。FUS 手順 (図 4a,d)の前に取られた MRI プリスキャンと比較すると、このコントラストの変化が明らかになります。その後、動物はBBBの開封後1.5時間後に灌流によって屠殺され、10μmの凍結分が採取された。EBD自己蛍光は、FuS標的領域においてBBB開口部の位置をさらに示す明らかである(図4c,f)。この図は、MRI のコントラストが見えにくくなることがある(図 4bと図 4eの違い) を示しています。したがって、図4fの蛍光顕微鏡写真のようにEBD自己蛍光の可視化を用いてBBB開口部を確認すると有用である。
この技術が標的遺伝子送達AAV9-hsyn-GFPおよびガドブトロールコントラストに使用できるかどうかを評価するために、海馬でBBBが開いた直後にIV(滴下:1.32 x 1010 14 GC/mL、0.05 mL/kg)を注入した。次いで、動物をBBB開封30分後にMR画像化し、3週間後に灌流によって屠殺した。GFP発現の蛍光イメージングのために10μmのクライオセクションを採取した。BBBの開口部は、標的海馬におけるガドブトロールコントラストによって明らかであった(図5a,b)。また、緑色蛍光によって明らかな標的海馬におけるGFP発現により遺伝子送達が確認された(図5c)。この時点で、EBD はクリアされており、心室でのみ明らかです (図 5c)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61113/61113fig1.jpg"> 図1:FUSベンチトップのセットアップ(a)は、XYZポジショナー、トランスデューサの取り付けのための直径30mmのPVCパイプ、3Dプリントステレオタックスフレーム、および注入ポンプを含むFUSセットアップ。(b)PVCパイプの端部をキャップし、エポキシで磁石を取り付けます。(c)別の一致する磁石は、エポキシと高出力トランスデューサの上部中心に取り付けられています。(d)また、MRI受託者の上部と中央のポジショナーを無効にするためのポインタに、一致する磁石がもう1枚取り付けられています。(e)ポインタは最終的に高出力トランスデューサーに置き換えられ、水浴は超音波ゲルで動物の頭部に結合される。(f)低電力浸漬トランスデューサは、3DプリントされたトランスデューサクリップでPVCパイプに取り付けることができます。(g)位置決めの場合、トランスデューサは3Dプリントポインタに置き換えられ、ポジショナーはMRI受託者の上部と中央にnullされます。(h)静止した3Dプリントフレームホルダーは、複数のFUS処理が必要な場合に、動物をMRI後に同じ位置に戻すことができます。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61113/61113fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61113/61113fig2.jpg"> 図2:MRI誘導座標のMRI受託者を有する立体的フレーム。(a)動物は、まずMRI受託者を備えた3Dプリントステレオタックスフレームに配置される。(b)フレームはMRIベッド内に配置され、受託者(点線円)からターゲット脳領域までの距離は、側側/側腹孔(D/V)測定の両方のコロナ画像と、ロストラル/コーダル(R/C)測定の軸像を用いて測定され、内側/横(M/L)測定は両方の軸から収集することができる。動物はフレームに保管され、FUSステーションに移され、そこでポインタを使用して受託者の位置にあるXYZポジショナーを無効にします。その後、ポインターはトランスデューサに置き換えられ、収集された座標に基づいて移動できます。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61113/61113fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61113/61113fig3.jpg"> 図3:エバンスブルー染料(EBD)は、フュージョンの有無にかかわらずFUS BBBの開口を確認する。(a)10μm脳部の顕微鏡写真は、FUS BBBが開いた2時間後に、内側左半球を標的とした低電力浸漬トランスデューサーで開いた。これは、組織採取前に4%緩衝ホルマリンを浸透させた動物の代表的な画像である。BBBの開口は、EBD赤色自蛍光(矢印)によって明らかである。(b)FUS BBB開封後2時間前左半球を対象とした10μm脳部の顕微鏡写真。これは、組織採取前に浸透しなかった動物の代表的な画像であり、したがって、EBDは血管に残る。BBBの開口部は、EBDが血管(矢印)から漏れた場所で明らかである。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61113/61113fig3large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61113/61113fig4.jpg"> 図4:FUS BBB開口をガドブトロールMRIコントラストおよびEBD発現で確認した。 MR 画像の前 (a および d) と後 (b および e) BBB の開始後。ガドブトロールコントラスト強化は、生体内でBBB開口部の位置を確認します(b と e,矢印).(c)海馬におけるEBD自己蛍光(赤色)を用いたBBB開口のさらなる確認を示す10μm脳部(青DAPI核染色)。スケールバー;500 μm(f) 前帯状帯状皮質のBBB開口後の10μm脳部の顕微鏡写真(矢印)。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61113/61113fig4large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61113/61113fig5.jpg"> 図5:FUS BBB開口部を介して海馬へのAAV9-hsyn-GFPの局在的な送達。 MRI造影剤によるBBB開口のMRI確認は、コロナ(a)および軸方向(b)の両方でのMRIコントラスト(矢印)のT1重み画像である。(c)FUS標的海馬におけるGFP発現の組織学的確認(緑色)FUS BBB開封後3週間及びAAV9-hsyn-GFP IV注射。青は、全体的な細胞形態のDAPI核染色を示す。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61113/61113fig5large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

マイクロバブル剤を用いた集中超音波は、血液脳関門を局所的かつ一過性に開くことができる。この技術は、血液脳関門を越えて幅広い薬剤を送達するために使用されてきた。この記事では、MRI ガイダンスの有無にかかわらずげっ歯類の脳へのローカライズされた配信のための詳細なプロトコルを提供します。

ラットモデルにおける集中超音波を用いた位置特異的血液脳関門開口へのベンチトップアプローチ

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

4.5K ビュー.  University of Alabama at Birmingham. マイクロバブル剤を用いた集中超音波は、血液脳関門を局所的かつ一過性に開くことができる。この技術は、血液脳関門を越えて幅広い薬剤を送達するために使用されてきた。この記事では、MRI ガイダンスの有無にかかわらずげっ歯類の脳へのローカライズされた配信のための詳細なプロトコルを提供します。

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Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

超音波血液脳関門の破壊とマンガン増強MRIを用いた脳機能イメージングの試み

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

神経科学

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the function of various brain regions for behavior or other experimental outcomes is to implement a localized ablation of function. In humans, patient populations with localized brain lesions are often studied for deficits, in hopes of revealing the underlying function of the damaged area. In rodents, one can experimentally induce lesions of specific brain regions.
Lesion can be accomplished in several ways. Electrolytic lesions can cause localized damage but will damage a variety of cell types as well as traversing fibers from other brain regions that happen to be near the lesion site. Inducible genetic techniques using cell-type specific promoters may also enable site-specific targeting. These techniques are complex and not always practical depending on the target brain area. Excitotoxic lesion using stereotaxic surgery, by contrast, is one of the most reliable and practical methods of lesioning excitatory neurons without damaging local glial cells or traversing fibers.
Here, we present a protocol for stereotaxic infusion of the excitotoxin, N-methyl-D-aspartate (NMDA), into the basolateral amygdala complex. Using anatomical indications, we apply stereotaxic coordinates to determine the location of our target brain region and lower an injection needle in place just above the target. We then infuse our excitotoxin into the brain, resulting in excitotoxic death of nearby neurons. While our experimental subject of choice is a rat, the same methods can be applied to other mammals, with the appropriate adjustments in equipment and coordinates.
This method can be used on a variety of brain regions, including the basolateral amygdala1-6, other amygdala nuclei6, 7, hippocampus8, entorhinal cortex9 and prefrontal cortex10. It can also be used to infuse biological compounds such as viral vectors1, 11. The basic stereotaxic technique could also be adapted for implantation of more permanent osmotic pumps, allowing more prolonged exposure to a compound of interest.

Targeted ablation of specific brain region(s) by infusion of an excitotoxin using stereotaxic coordinates is described. This technique could also be adapted for infusion of other chemicals into the rat brain.

大人のラットの特定の脳領域の興奮毒性病変に対する定位手術

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier (BBB). Rats with induced ischemic stroke were established and used as in vivo models to investigate the functional integrity of the BBB. Spectrophotometric detection of Evans blue (EB) in the brain samples with ischemic injury could provide reliable justification for the research and development of novel therapeutic modalities. This method generates reproducible results, and is applicable in any laboratory without a need for special equipment. Here, we present a visualized and technical guideline on the detection of the extravasation of EB following induction of ischemic stroke in rats.

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

The overall goal of this procedure is to provide a highly reproducible technique for in vivo assessment of the blood-brain barrier disruption in rat models of ischemic stroke.

虚血性脳卒中のモデルラットの血液脳関門の破壊のIn Vivo評価

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, very few have been widely accepted. Here, we propose&#160;a new procedure&#160;adapted from the well-known ex vivo brain slice technique, which offers a closer in vivo-like scenario than in vitro preparations, for investigating the early events triggering cell degeneration, as observed in Alzheimer&#39;s disease (AD). This variation consists of simple and easily reproducible steps, which enable preservation of the anatomical cytoarchitecture of the selected brain region and its local functionality in a physiological milieu. Different anatomical areas can be obtained from the same brain, providing the opportunity to perform multiple experiments with the treatments in question in a site-, dose-, and time-dependent manner. Potential limitations&#160;which could affect the outcomes related to this methodology are related to the conservation of the tissue, i.e., the maintenance of its anatomical integrity during the slicing and incubation steps and the section thickness, which can influence the biochemical and immunohistochemical analysis. This approach can be employed for different purposes, such as exploring molecular mechanisms involved in physiological or pathological conditions, drug screening, or dose-response assays. Finally, this protocol could also reduce the number of animals employed in behavioral studies. The application reported here has been recently described and tested for the first time on ex vivo rat brain slices containing the basal forebrain (BF), which is one of the cerebral regions primarily affected in AD. Specifically, it has been demonstrated that the administration of a toxic peptide derived from the C-terminus of acetylcholinesterase (AChE) could prompt an AD-like profile, triggering, along the antero-posterior axis of the BF, a differential expression of proteins altered in AD, such as the alpha7 nicotinic receptor (&#945;7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau), and amyloid beta (A&#946;).

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

We present a method which can&#160;provide further insights into the early events underlying neurodegeneration and based on the established ex-vivo brain technique, combining the advantages of in vivo and in vitro experiments. Moreover, it represents a unique opportunity for direct comparison of treated and untreated group in the same anatomical plane.

Ex Vivoラット脳切片を用いた神経変性疾患の主要なイベントを勉強する方法

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

A Human Blood-Brain Interface Model to Study Barrier Crossings by Pathogens or Medicines and Their Interactions with the Brain

The early screening of nervous system medicines on a pertinent and reliable in cellulo BBB model for their penetration and their interaction with the barrier and the brain parenchyma is still an unmet need. To fill this gap, we designed a 2D in cellulo model, the BBB-Minibrain, by combining a polyester porous membrane culture insert human BBB model with a Minibrain formed by a tri-culture of human brain cells (neurons, astrocytes and microglial cells). The BBB-Minibrain allowed us to test the transport of a neuroprotective drug candidate (e.g., Neurovita), through the BBB, to determine the specific targeting of this molecule to neurons and to show that the neuroprotective property of the drug was preserved after the drug had crossed the BBB. We have also demonstrated that BBB-Minibrain constitutes an interesting model to detect the passage of virus particles across the endothelial cells barrier and to monitor the infection of the Minibrain by neuroinvasive virus particles. The BBB-Minibrain is a reliable system, easy to handle for researcher trained in cell culture technology and predictive of the brain cells phenotypes after treatment or insult. The interest of such in cellulo testing would be twofold: introducing derisking steps early in the drug development on the one hand and reducing the use of animal testing on the other hand.

Here we present a protocol describing the setting of an in cellulo BBB (Blood brain barrier)-Minibrain polyester porous membrane culture insert system in order to evaluate the transport of biomolecules or infectious agents across a human BBB and their physiological impact on the neighboring brain cells.

病原体や医薬品との相互作用、脳によって障壁の交差を勉強する人間の血-脳インターフェイス モデル

The early screening of nervous system medicines on a pertinent and reliable in cellulo BBB model for their penetration and their interaction with the ...

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a physiological barrier preventing large molecules (&#62;500 Da) from entering the brain tissue. Microbubble-mediated focused ultrasound (FUS) can be used to induce a transient local BBB opening, allowing larger drugs to enter the brain parenchyma.
In addition to large-scale clinical devices for clinical translation, preclinical research for therapy response assessment of drug candidates requires dedicated small animal ultrasound setups for targeted BBB opening. Preferably, these systems allow high-throughput workflows with both high-spatial precision as well as integrated cavitation monitoring, while still being cost effective in both initial investment and running costs.
Here, we present a bioluminescence and X-ray guided stereotactic small animal FUS system that is based on commercially available components and fulfills the aforementioned requirements. A particular emphasis has been placed on a high degree of automation facilitating the challenges typically encountered in high-volume preclinical drug evaluation studies. Examples of these challenges are the need for standardization in order to ensure data reproducibility, reduce intra-group variability, reduce sample size and thus comply with ethical requirements and decrease unnecessary workload. The proposed BBB system has been validated in the scope of BBB opening facilitated drug delivery trials on patient-derived xenograft models of glioblastoma multiforme and diffuse midline glioma.

The blood-brain barrier (BBB) can be temporarily disrupted with microbubble-mediated focused ultrasound (FUS). Here, we describe a step-by-step protocol for high-throughput BBB opening in vivo using a modular FUS system accessible for non-ultrasound experts.

げっ歯類における血液脳関門開口のためのハイスループット画像誘導定型神経ナビゲーションと集中超音波システム

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

Targeted Neuronal Injury for the Non-Invasive Disconnection of Brain Circuitry

Surgical intervention can be quite effective for treating certain types of medically intractable neurological diseases. This approach is particularly useful for disorders in which identifiable neuronal circuitry plays a key role, such as epilepsy and movement disorders. Currently available surgical modalities, while effective, generally involve an invasive surgical procedure, which can result in surgical injury to non-target tissues. Consequently, it would be of value to expand the range of surgical approaches to include a technique that is both non-invasive and neurotoxic.
Here, a method is presented for producing focal, neuronal lesions in the brain in a non-invasive manner. This approach utilizes low-intensity focused ultrasound together with intravenous microbubbles to transiently and focally open the Blood Brain Barrier (BBB). The period of transient BBB opening is then exploited to focally deliver a systemically administered neurotoxin to a targeted brain area. The neurotoxin quinolinic acid (QA) is normally BBB-impermeable, and is well-tolerated when administered intraperitoneally or intravenously. However, when QA gains direct access to brain tissue, it is toxic to the neurons. This method has been used in rats and mice to target specific brain regions. Immediately after MRgFUS, successful opening of the BBB is confirmed using contrast enhanced T1-weighted imaging. After the procedure, T2 imaging shows injury restricted to the targeted area of the brain and the loss of neurons in the targeted area can be confirmed post-mortem utilizing histological techniques. Notably, animals injected with saline rather than QA do demonstrate opening of the BBB, but dot not exhibit injury or neuronal loss. This method, termed Precise Intracerebral Non-invasive Guided surgery (PING) could provide a non-invasive approach for treating neurological disorders associated with disturbances in neural circuitry.

The goal of the protocol is to provide a method for producing non-invasive neuronal lesions in the brain. The method utilizes Magnetic Resonance-guided Focused Ultrasound (MRgFUS) to open the Blood Brain Barrier in a transient and focal manner, in order to deliver a circulating neurotoxin to the brain parenchyma.

脳回路の非侵襲的切断に対する標的ニューロン損傷

Surgical intervention can be quite effective for treating certain types of medically intractable neurological diseases. This approach is particularly ...

Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples

One of the most common causes of morbidity and mortality worldwide is ischemic stroke. Historically, an animal model used to stimulate ischemic stroke involves middle cerebral artery occlusion (MCAO). Infarct zone, brain edema and blood-brain barrier (BBB) breakdown are measured as parameters that reflect the extent of brain injury after MCAO. A significant limitation to this method is that these measurements are normally obtained in different rat brain samples, leading to ethical and financial burdens due to the large number of rats that need to be euthanized for an appropriate sample size. Here we present a method to accurately assess brain injury following MCAO by measuring infarct zone, brain edema and BBB permeability in the same set of rat brains. This novel technique provides a more efficient way to evaluate the pathophysiology of stroke.

This protocol describes a novel technique of measuring the three most important parameters of ischemic brain injury on the same set of rodent brain samples. Using only one brain sample is highly advantageous in terms of ethical and economic costs.

げっ歯類の脳サンプルの単一のセットで脳卒中後脳浮腫、梗塞ゾーンおよび血液脳関門破壊を測定する

One of the most common causes of morbidity and mortality worldwide is ischemic stroke. Historically, an animal model used to stimulate ischemic stroke ...

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a combination of focused ultrasound (FUS) induced blood-brain barrier opening (FUS-BBBO), gene delivery with adeno-associated viral (AAV) vectors, and activation of cellular signaling with engineered, chemogenetic, protein receptors and their cognate ligands. With ATAC, it is possible to transduce both large and small brain regions with millimeter precision using a single noninvasive ultrasound application. This transduction can later allow for a long-term, noninvasive, device-free neuromodulation in freely moving animals using a drug. Since FUS-BBBO, AAVs, and chemogenetics have been used in multiple animals, ATAC should also be scalable for the use in other animal species. This paper expands upon a previously published protocol and outlines how to optimize the gene delivery with FUS-BBBO to small brain regions with MRI-guidance but without a need for a complicated MRI-compatible FUS device. The protocol, also, describes the design of mouse targeting and restraint components that can be 3D-printed by any lab and can be easily modified for different species or custom equipment. To aid reproducibility, the protocol describes in detail how the microbubbles, AAVs, and venipuncture were used in ATAC development. Finally, an example data is shown to guide the preliminary investigations of studies utilizing ATAC.

This protocol delineates steps necessary for the gene delivery through focused ultrasound blood brain barrier (BBB) opening, evaluation of the resulting gene expression, and measurement of neuromodulation activity of chemogenetic receptors through histological tests.