再現性は、幹細胞由来の心筋細胞を誘導する際の大きな関心事です。これらの方法を用い、iPSから高純度かつ高品質の心筋細胞を生成し、機能研究に用いることができる。この技術の主な利点は、iPSC由来の心筋細胞の精製された高品質の製剤を得るための、シンプルで信頼性の高い、費用対効果の高い、非常に強力な方法です。
細胞の通過の場合、カルシウムとマグネシウムを含まないPBSを1ミリリットルで7〜10分間リンスしてから、PBSを1ミリリットルの経パ石培地に置き換えます。セルリフターを使用して、ウェルの底から細胞を静かに削り取り、滅菌2ミリリットルガラスピペットを使用して、切り離された細胞を機械的に解離します。顕微鏡下で見えるように細胞が小さなクラスターに持ち上げられたら、通過媒体を加えて細胞を1〜6回の比率で分割します。
次に、ヒト胚性幹細胞修飾マトリックスを6つのウェルプレートから吸引する。次に、1ミリリットルの受粉培地と解約細胞1ミリリットルを各ウェルに加え、心臓分化を開始する前に70〜80%の合流に達するまで細胞を成長させます。iPSC-CMを解離する少なくとも30分前に、個々のガラスカバースリップを70%エタノールで拭き取り、カバースリップを滅菌6ウェルプレートの個々のウェルに入れます。
カバースリップが乾燥したら、250〜300マイクロリットルのヒト胚幹細胞適格マトリックス溶液を各カバースリップの中央に直接加え、6つのウェルプレートを組織培養フードに入れる。代謝的に選択されたiPSC-CMを解き明かすために、35°Cで5分間の各ウェルにEDTAを含む無菌0.25%トリプシンの1ミリリットルを加え、1000マイクロリットルのピペットを使用して、単一の細胞懸濁液が達成されるまで細胞を機械的に解化する。無菌15ミリリットル円錐管で細胞を引っ張り、ウェルあたり2ミリリットルのRPMI 20培地でそれぞれをよく洗います。
次に、チューブにスケーションを加え、遠心分離によって細胞をペレットします。細胞濃度の250マイクロリットル当たり3倍の10〜5番目の細胞を達成するのに十分な量の培地で細胞を再懸濁する。溶液が均質に見えるまで細胞を解化するために1000ミリリットルのピペットチップを使用してください。
その後、250マイクロリットルの細胞を1000マイクロリットルのピペットチップに吸引し、溶液の全容を1つのヒト胚幹細胞修飾マトリックスコードカバースリップにゆっくりと分配する。すべての細胞を播種したら、一晩細胞培養インキュベーターにプレートを慎重に入れます。翌朝、各井戸にD7培地を2ミリリットル加えます。
選択したiPSC-CMが少なくとも3ヶ月に達すると、2マイクロリットルのFura-2 AMで37°Cで10分間細胞を処理し、カルシウム分析システムに電力を供給します。アークランプを起動し、ポンプから適切な入口とコンセントにチューブを接続し、刺激装置からチャンバーに電子線を接続します。チャンバーをシステムに置きます。
37°Cで流動インラインヒーターを通るProFusionチューブを37度温めたTyrodeの溶液で満たし、カメラとフレーミング開口寸法を調整して、背景領域を最小限に抑えます。iPSC-CMをまいたガラスカバースリップをチャンバーに締め、カバースリップの上に500マイクロリットルのタイロード溶液をそっと加えます。毎分1.5ミリリットルの速度でタイロードの溶液でチャンバーを熟読し始め、電気刺激器を使用して、4ミリ秒ごとに10ボルトの1ヘルツフィールド刺激でiPC-CMを3〜5分間ペースアップします。
すべての色素がチャンバーから洗い流されたら、カバースリップの左上領域に表示窓を調整し、記録を開始する。5〜10のピークの一貫したストリームを収集した後、一時停止をクリックして一時的に記録を停止し、記録を再開する前にカバースリップの反対側の端の隣接領域に顕微鏡ステージを移動します。10分間にわたってカバースリップ全体にわたってカルシウムトランシデンスをスキャンした後、メーカーの指示に従って適切な蛍光トレース分析ソフトウェアでデータを分析します。
このプロトコルは、時間の経過とともに培養中の心室、成人のような表現型を取得する非常に純粋な心筋細胞を生成する。心房および心室MLC2アイソフォームに対する免疫蛍光染色法によって評価されるように、このプロトコルによって生成される細胞の大部分は、心臓分化誘導後30日目の心房MLC2アイソフォーム陽性である。心室MLC2アイソフォームは、同じ時点で多くの数で表現されています。
培養時間が長くなるにつれて、MLC2アイソフォームへの完全な切り替えが観察される。これらのデータはまた、心房および心室MLC2マーカー発現細胞の割合のフロー細胞量測定法によっても確認した。カルシウム振幅は、90日目のiPSC-CMにおいて有意に増加し、成人ラットCMに対して観察されたのと同様である。
非心臓細胞を汚染すると、分化中のヒトiPSC-CMの機能的成熟に影響を与える可能性があることに注意することが重要です。さらに、iPSC-CMでカルシウム過渡を記録する場合、細胞が少なくとも200秒間一定の刺激下で摂氏37度で安定させ、記録を特定の時間枠に制限して再現可能な結果を確実に得る必要があります。iPSCが均質な形態を示すことを確認し、心臓分化を開始する前に細胞が70〜80%の合流度に成長することを忘れないでください。
未熟なiPS由来心筋細胞の純粋な品質は、実際の表現型を反映しないが、病気の表現型と誤解される可能性がある変化した機能的特徴を示す可能性がある。したがって、純粋で高品質の心筋細胞を得ることは、一貫した再現性のある結果を提供することが重要です。
