極薄ポリジメチルシロキサン マイクロ流体チップを用いた保水ライブ線虫個人の固定化

このプロトコルの利点の 1 つは、ワーム シートが扱いやすいということです。乾燥を防ぐ特徴を持ち、生きている動物にマイクロビーム照射を行い、いくつかの行動アッセイを行い、長期観察を行います。このワームシートのマイクロ流体チャネルが開いているため、動物を収集しやすくなります。

これらのワームシートは繰り返し使用することができ、より経済的になります。この技術を開発する際には、動物の一部だけを顕微鏡でマイクロビームで照射したいと考えていました。だから、私たちは動物を保持することができる明確な、非常に薄いチップが必要でした。

まず、薄くて透明なシートをステージに置き、ボトムカバーフィルムとして使用します。底面カバーフィルムに、平らなピンセットを使用して、ウォームシートをそっと置きます。6センチメートルの表面にバッファー溶液の少なくとも3つの液滴を置きます, 非処理ペトリ皿.

その後、培養プレートからプラチナピッカーを持ついくつかの大人のC.elegansを選びます。白金ピッカーで動物を液滴に移し、動物がバッファ内で泳いで細菌を取り除くようにします。動物を2つの別々の液滴で洗い、別の液滴で動物を洗い流します。

次に、バッファ溶液の液滴をワームシートの表面に置きます。洗浄した動物を緩衝液から取り出し、ワームシート上の液滴に移します。フラットピンセットを使用して、PSカバーフィルムをウォームシートの上に置き、シートの一方の端からもう一方の端までチャンネルを軽く押します。

または単に動物を液滴に落とし、カバーフィルムで穏やかに密封するので、液滴はカバーとワームシートの間にチャネル内の動物と広がります。1-2倍の倍率で顕微鏡で動きを確認して、動物が生きているか確認します。動物の位置を記録し、具体的には、各動物が囲まれているチャネルの数、およびチャネル内の各動物の位置をメモします。

固定化動物を収集するには、平らなピンセットを使用してウォームシートからカバーフィルムを取り除き、10〜15マイクロリットルのバッファー溶液を動物を囲むマイクロ流体チャネルの1つにドロップします。実体顕微鏡の下で、動物が回転し始めるのを観察します。その後、白金ピッカーを使用して水泳動物をピックアップし、アッセイプレートに移します。

先に実証したように動物を囲んだ後、花粉顕微鏡で動物の蛍光スポットを観察する。その後、映像集録を用いた画像カルシウムイオン波伝播を動的な活動を観察する。使用したワームシートを6センチメートルのシャーレの上に置き、約100マイクロリットルの滅菌された超純水をシートの上に置きます。

手袋をした指を使ってシートの表面に水を広げ、汚染物質を洗い流します。次に、使い捨てワイプを使用して、ワームシートから水分を取り除きます。70%エタノールの5ミリリットルをペトリ皿に分配し、手袋をした指を使ってワームシートにエタノールを広げます。

最後に、シートが乾燥した後、滅菌ペトリ皿の上にシートを置き、カバーします。このプロトコルを用いて、異なるカバーフィルムの適合性を調べた。PSフィルムを用いたマイクロ流体チャネルに同封された制御動物と動物との運動性に有意差はなかった。

これに対し、カバーガラスの下に同封された動物では運動性が有意に低下した。ペットフィルムに同封された動物の運動性も有意に低下した。マイクロ流体チャネルの密封のためにカバーフィルムを慎重に選択することが重要です。

このプロトコルを用いて、オンチップ固定化の3時間後に動物の移動アッセイを通じて、異なるカバーフィルムの適合性を評価した。この技術を用いて、マイクロビーム照射専用の超薄型湿式チップを開発する予定です。しかし、これらのワームシートは、すでに元のアプリケーションを超えてイメージングと行動アッセイに使用されています。