活性汚泥粒子の大きさと形状は、排水処理の効率に不可欠です。しかし、彼らの測定はしばしばアドホックです。このプロトコルは、測定のための反復可能な、明確に定義された、半自動マブル測定を提供する。
このプロトコルの主な利点は、主観的かつ体系的なバイアスを低減しながら、幅広い形態に渡って大量の粒子を測定できることです。この技術は活性汚泥に焦点を当てていますが、技術的にはマイクロプラスチックのような同じ粒子形態を有するものは、この方法で測定することができます。初めてこのテクニックを試すときは、一度に1枚ずつプレートを作って、その1つのプレートを作る物理的な動きを練習してみてください。
また、顕微鏡で時間を取ってください。サンプリングとプレートの準備には、視覚的に最もよく伝達される多くの小さなテクニックが必要なため、この記事のビデオ版は重要です。また、再現性を確保するためには、プレートの良い写真を見せて見ることが重要です。
今日、このプロトコルを実証しているのは、私の研究室の博士候補生であるジョセフ・ウィーバーです。まず、反応器のよく混合された部分から代表的なサンプルを取得する。サンプルを軽く混ぜ、決定したサンプル量を15ミリリットルの遠心分離管にすぐに注ぎます。
次に、各サンプルに1%メチレンブルーの5マイクロリットルを加えます。キャップをキャップし、少なくとも3回チューブをそっと反転してサンプルを混合します。サンプルを少なくとも5分間、室温で30分以下に染色します。
染色したら、6.5~9ミリリットルの間にチューブの総体積を持って来るために、十分な量の7.5%の寒天と脱イオン水を遠心管に移します。その後、遠心分離管を要約し、少なくとも3回はそっと反転してサンプルを寒天に混ぜます。キャップを自分から離したまま、キャップを開きます。
各チューブのチューブの内容物を100ミリリットルのプラスチックシャーレに注ぎ、皿を優しく揺らし、完全で滑らかなコーティングと視覚的に均一な粒子の分布を達成します。寒天が固まるまで、プレートを室温で少なくとも5分間冷却します。10~20倍の倍率が可能なステレオ顕微鏡の顕微鏡ステージ上に、覆い隠されたプレートの表面を上に置きます。
LED照明器スタンドやライトプレートなどの機器を使用して、拡散光でも下からサンプルを照らします。画像キャプチャソフトウェアを開き、顕微鏡の光路が写真に設定されていることを確認します。次に、カメラリストから適切なカメラを選択します。
大きく、明確に定義されたエッジを持つ焦点面に複数の粒子が現れるように、顕微鏡を調整します。比較的深い焦点面を維持しながら、粒子を測定するために10〜20倍の倍率を使用してください。寒天プレートを一時的に取り外し、マイクロメーターをステージ上に置きます。
マイクロメーターの卒業が画像キャプチャソフトウェアに鋭く焦点を当てて表示されるまで、細かい焦点を調整します。そして、ミクロン比にピクセルを較正する。次に、ビューをクリックして実際のサイズを選択して、ズームを 100% に設定します。
次に、オプションを選択し、キャリブレーションに移動します。ここでは、マイクロメーターの長い軸に沿ってメインビューポートの赤いキャリブレーションバーを位置合わせします。垂直バーは、ゼロと200ミクロンの卒業を中心に。
[キャリブレーション]ダイアログボックスで、現在の倍率と実際の長さ200ミクロンを入力します。すでにキャリブレーションされている場合は、メニューバーから倍率を選択し、現在の倍率レベルを選択してキャリブレーションを確定します。測定メニューで、行に移動して任意の行を選択します。
マイクロメーターのゼロ卒業と長軸の交点をクリックします。その後、200ミクロンの線と長い軸の交差点をもう一度クリックします。正しいキャリブレーションは約200ミクロンで表示されます。
オブジェクト選択ボタンをクリックし、行をクリックして Delete キーを押し、確認ボックスで yes を押して、行を削除します。次に、寒天プレートを交換し、ファインフォーカスを調整して、イメージングソフトウェアの細部を最大限に引き出します。これを実現するには、まずカメラサイドバーのビット深度パネルでラジオボタンを選択して、許容最大値のビット深度を大きくします。
また、カメラサイドバーのカラーグレードパネルで適切なラジオボタンを選択して、グレースケール画像を取得するようにソフトウェアを設定します。今、露出とヒストグラムの間で開いているサイドバーパネルを折りたたみます。ゲインを 1 に減らし、クリアイメージがビューポートに表示されるまで露出を増やし、ヒストグラムがヒストグラム ボックスの両端でクリップされない分布として表示されるまで、露出を増やします。
ヒストグラムを調整して、露出を超えないようにします。カメラサイドバーのヒストグラムパネルで、ヒストグラムの左境界を下の値のすぐ外側にスライドさせ、右側の境界を最も大きな値のすぐ外側にスライドさせます。イメージを非圧縮 TIF ファイルとして保存します。
保存時にキャリブレーション情報ボックスをチェックして画像メタデータに倍率情報を含めます。プレートを下に移動する場合に左から右、右から左に交互に移動するパスに従って、前の画像と重ならない別の領域を選択します。分析のために、少なくとも 500 個の視覚的に推定されたパーティクルをキャプチャします。
GIT リポジトリを複製して、パーティクル分析コードを取得します。コマンド ラインで、ここに示すコマンドを入力して、最新バージョンのコードを取得します。複製されたリポジトリの最上位ディレクトリにある read me テキスト ファイルの指示に従って、分析コードをインストールします。
次に、処理するディレクトリをオプションのパラメータと共に一覧表示するテキスト ファイルを編集します。パラメーターと例のリストについては、例および分析サブディレクトリーを参照してください。ここで、ここで示すコマンドを入力して、コマンド ラインで分析を実行します。
フィジーパスは、imageJ-win64 のディレクトリです。exe が見つかりました。そして、解析設定を記述するテキストファイルの場所をparamsfileします。
実行可能ファイルの名前は、フィジーがインストールされているオペレーティング システムによって異なる場合があります。解析は自動的に実行され、画像のサイズと数に応じて数分から数時間かかります。次に、指定した出力ディレクトリのオーバーレイ サブディレクトリにある品質管理ファイルを調べます。
スプリアスミストまたは不十分にキャプチャされたパーティクルを持つ画像に注意してください。それです。これで、データは実験固有の分析と図形の生成の準備が整いました。
粒子の閾値法は完璧ではありませんが、許容可能な結果の例を次に示します。QC イメージを評価する際に、3 つの一般的なエラーが見つかりました。パーティクル境界に正確に適合しない、パーティクルを識別できなかった、アーティファクトが含まれる。
ここでは、2つの実験反応器間の粒子分布が、研究者によって指摘された定性的なメタデータと表示され、組み合わされる。このグラフは、この場合、リアクタは一般的に同様の粒径分布を持ち、時間が進むにつれてより大きな平均とより広い広いスプレッドに向かう傾向があることを示しています。この手順を行う場合、均一に分散した粒子を含む寒天の薄層でプレートを均一にコーティングすることが重要です。
練習し、時間をかけてください。この手順を超えて、興味深い粒子を寒天から切除し、研究することができました。データの観点から言えば、このプロトコルから得られるファイルは明確に定義されており、空は分析的に限界です。
この技術は、有酸素顆粒状汚泥に新しい洞察を提供する道を開いた。それは形態が非常に重要であり、標準的な方法でそれを測定することができました。廃水は生物学的に活性です。
バイオ安全レベル1のプラクティスが奨励されています。また、寒天はマイクロ波を介して泡立ち、遠心管を開けるとホット液滴を噴霧する方法。
