このプロトコルは、血液中の生体内と生体内の両方で高感度一酸化窒素センサーとしての血小板の潜在的な使用に対処する。酸化血小板一酸化窒素におけるリン酸化血管拡張体刺激性ホスホ蛋白質またはP-VASPセリン239の増加は、ナノモル系統における一酸化窒素の存在を検出する能力を含むいくつかの利点を有する。健康なドナーから30〜50ミリリットルの全血を採取してから2時間以内に、遠心分離のために適切な数の15ミリリットル円錐形管に血液の5ミリリットルのアリコートを加える。
プラスチック製のトランスファーピペットを使用して、上清の上部から血小板が豊富なプラズマを慎重に収集します。2番目の遠心分離を有するプラズマリッチな血小板をペレットにし、5ミリリットルのCGSバッファーでペレットを静かに洗浄する。400gで遠心分離機を室温で10分間行います。
遠心分離の終わりに、改変されたタイロードバッファーの3ミリリットルにペレットを再懸濁する。血球計を使用してカウントし、血小板懸濁液の密度を新鮮なタイロードバッファーで1ミリリットル当たり8番目の細胞の3倍に調整します。その後、血小板の懸濁液を摂氏37度で1時間インキュベートします。
一方、遠心分離によって全血サンプルのプレートフリー血漿層から赤血球を採取し、続いて5ミリリットルのPBSで4回の洗浄を洗浄する。最後の洗浄後、上清を捨て、ゴムストッパーで閉じたポリプロピレンボトルの適切な実験ヘマトクリットで、血漿が豊富な血小板の1ミリリットルと赤血球を混合します。ヘリウムガスタンクに接続された針を各セプタに挿入し、26個のゲージ針を挿入してガス出口を作ります。
その後、室温でボトルをゆっくりと旋回し、酸素計を使用して脱酸素プロセスの監視のための部分的な酸素圧を測定します。酸素減少率は、ヘリウム流量および攪拌速度に依存する。したがって、実験を開始する前に酸素化の時間を最適化する必要があります。
赤血球亜硝酸還元のために、10マイクロモルの最終濃度が達成されるように、中隔を通して亜硝酸塩をPRPおよびRBCの脱酸素サンプルに注入するためにマイクロシリンジを使用する。37°Cで少なくとも10分間サンプルをインキュベートし、各サンプルの1ミリリットルをマイクロ遠心チューブに移して遠心分離します。上清の上部から300マイクロリットルの血小板懸濁液を新しいマイクロ遠心分離チューブに移し、1~9%の割合で各チューブにクエン酸デキストロース酸を加えます。
血小板を再び遠心分離し、各チューブにプロテアーゼ阻害剤カクテル3を含む氷冷ライシス緩衝液の80マイクロリットルでペレットを再懸濁する。次に、各サンプルから15マイクログラムのタンパク質を2つの別々の10%SDS-PAGEゲルにロードします。ゲルを120ボルトで1.3時間実行します。
実行の終了時に、ゲルを個々の亜硝セルロース膜に移し、5%ノンファットドライミルクの適切な体積で非特異的結合を遮断する。適切な一次抗体を摂氏4度で一晩インキュベートし、その後室温で適切な二次型の大根ペルオキシダーゼ抗体を標識します。次に、膜をイメージャーで露出させ、適切な画像解析プログラムでバンド密度を定量化します。
健康な静脈血球サンプルは水銀の50〜80ミリメートルの間の部分的な酸素圧力値を有する。ヘリウムによる脱oxgenationは、酸素の分圧を10分以内に25ミリメートルの水銀に急速に減少させる。さらに、脱酸素時間の増加により、分酸素圧の減少を達成できる。
脱酸素の増加は、ますます赤い色の血漿によって示されるように、血化のレベルの増加につながります.これは脱酸素作用であり、ヘリウムなしで撹拌されたサンプル中のヘモ分解の欠如によって示されるようにそれ自体を攪拌することによって引き起こされない。血管拡張刺激性ホスホタンパク質またはVASPおよび血小板中のリン酸化VASP発現レベルは、いずれもウェスタンブロットによって検出された脱酸素サンプル中のヘマトクリットの増加に伴って減少した。
短命の一酸化窒素ドナーによる治療は、治療後10秒以内に血小板におけるリン酸化血管拡張剤刺激リンフォ蛋白発現を増加させる。さらに、リン酸化VASPまたはP-VASPのレベルは、既存のP-VASPレベルに影響を与えることなく血小板からRBCを分離するのに十分な時間があることを示す血小板が豊富な血漿を用いたNOドナーのインキュベーション後10分まで安定したままでした。亜硝酸塩はまた、脱酸素性RBCsの存在下で血小板のP-VASPレベルを増加させる。
ここでの総VASPに対するP-VASPの比率は、ヘマトクリットのレベルに依存する。VASPは血小板で高発現し、一酸化窒素の存在下で急速にリン酸化される。従って、このプロトコルは、種々の生理的刺激による一酸化窒素の誘導を研究するための方法を提供する。
この方法により、生体内で亜硝酸を吸入することにより、一酸化窒素刺激のマーカーとして血小板中のP-VASPの増加を利用しました。生物学的標本で血小板を使用して作業することは、常に適切な個人保護装置を使用して行われるべきであることを忘れないでください。
